Совершенствование технологии культивирования штамма женьшеня, разработка капель для приема внутрь и буккальных пленок на его основе

Размещено на http://www.allbest.ru/

Совершенствование технологии культивирования штамма женьшеня, разработка капель для приема внутрь и буккальных пленок на его основе

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

женьшень препарат иммуномодулирующий адаптогенный

Актуальность работы

По данным ВОЗ в настоящее время в комплексной терапии и профилактики различных заболеваний актуальным остается вопрос разработки новых препаратов растительного происхождения. Наибольший интерес представляют фитопрепараты, обладающие иммуномодулирующим и адаптогенным действием.

Природные запасы лекарственных растений сокращаются вследствие часто неправильной и нерегламентированной их заготовки. Некоторые лекарственные растения на территории России не произрастают или произрастают в ограниченном количестве, что определяет потребность в импортировании сырья. Решение проблемы бесперебойного обеспечения фармацевтической промышленности растительным сырьём возможно благодаря применению метода культуры изолированных органов, тканей и клеток высших растений, который характеризуют следующие преимущества: возможность получения экологически чистой биомассы ценных и редких лекарственных растений, не произрастающих на территории РФ, или имеющих ограниченный ареал и подлежащих охране; осуществлять направленный биосинтез биологически активных веществ (БАВ), а также трансформировать дешевые предшественники в ценный продукт; возможность создавать принципиально новые целевые продукты, превосходящие традиционные по своим показателям качествам (Носов А.М., 1991, 2011, Лутова Л.А., 2003).

Биотехнология растительных клеток и тканей достигла к настоящему времени высокого технического уровня, пригодность его для решения ряда биологических, ботанических и медицинских проблем не вызывает сомнения, практическое использование его также перспективно (Строгов С.Е., 2007). Важнейшими условиями для промышленного выращивания штаммов-продуцентов БАВ является высокая продуктивность, стабильность и экономичность за счет возможности культивирования на простых питательных средах.

Культивируемые in vitro клетки растений, являясь моделью живой биосистемы, могут с успехом использоваться для решения важных теоретических, а также практических задач в медицине.

Цель и задачи исследования

Совершенствование технологии выращивания биомассы штамма женьшеня Panax ginseng C. A. Mey (сем. Araliaceae), а также разработка состава и технологии капель для приема внутрь и буккальных пленок на основе водных извлечений из биомассы селективной клеточной линии женьшеня

Для достижения поставленной цели необходимо было решить ряд задач:

1. Оптимизировать технологию выращивания штамма женьшеня на модифицированных питательных средах с получением селективной клеточной линии.

2. Оценить стабильность селективной клеточной линии по основным показателям качества с паспортизацией полученной линии.

3. Показать возможность использования растительных клеток in vitro как модели для оценки влияния наноматериалов на биосистемы на примере углеродных нанотрубок (УНТ).

4. Научно обосновать и экспериментально разработать способ получения водных извлечений из биомассы селективной линии как матрицы для получения новых лекарственных средств (ЛС).

5. Разработать состав и технологию жидкой лекарственной формы - капель для приема внутрь на основе водного извлечения.

6. Разработать состав и технологию буккальных пленок на основе водного извлечения.

7. Предложить показатели качества и разработать НД на капли для приема внутрь и буккальные пленки.

Научная новизна

1. Усовершенствована технология культивирования штамма женьшеня, в результате которой получена новая селективная гормононезависимая по кинетину клеточная линия. Доказана стабильность полученной селективной клеточной линии по основным показателям качества на протяжении пяти лет.

2. Показана возможность применения полученной селективной клеточной линии, как модели живой биосистемы при модификации питательных сред с использованием высокоэффективных экологически чистых стекловидных минеральных добавок «AVA» (ЗАО «Агровит»), а также как тест-системы для оценки безопасности использования наноматериалов, на примере УНТ.

3. Научно обоснована и экспериментально разработана технология водного извлечения из биомассы селективной клеточной линии женьшеня, примененного в качестве матрицы для получения новых лекарственных средств.

4. Впервые на основе водного извлечения из биомассы селективной клеточной линии женьшеня разработаны капли для приема внутрь и буккальные пленки. Установлены показатели качества новых лекарственных средств.

Практическая значимость

1. Предложена комплексная технология выращивания биомассы женьшеня на модифицированной питательной среде, позволяющая повысить эффективность процесса культивирования на 40% (за календарный год) за счет сокращения цикла культивирования на 10 суток. Разработан паспорт на полученную клеточную линию. В производственных условиях в ХБО при РАН «Фирма Вита» доказана воспроизводимость и эффективность разработанной технологии (Акт апробации от 15.09.2011г.).

2. Показана возможность использования культивируемых in vitro клеток, как биологической модели для оценки влияния наноматериалов (УНТ) и минеральных стекловидных добавок «AVA» (Акт апробации от 24.09.2009г.) на жизнеспособность и физиологическую активность клеток.

3. Разработана технология водного извлечения из биомассы женьшеня, как матрицы для получения новых ЛС с обогащенным содержанием БАВ.

4. Подобраны составы и разработаны технологические схемы производства капель для приема внутрь и буккальных пленок. Разработана НД на данные ЛС.

5. Результаты выполненной работы используются в учебном процессе ГБОУ ВПО СПХФА Минздравсоцразвития России при изучении дисциплины «Биотехнология растительных тканей» по специальности 240901 «Биотехнология», при обучении слушателей и интернов на факультете дополнительного профессионального образования (ФДПО) (Акт о внедрении от 19.04.2011г.).

Апробация работы

Основные результаты диссертационной работы прошли апробацию на научно-практической конференции «Фармация из века в век» (СПб, 2008), научно-практической конференции «Актуальные вопросы клиники, диагностики и лечения в многопрофильных учреждениях» (СПб, 2009), межвузовской научной конференции студентов и молодых ученых «Фармация в XXI веке: эстафета поколений» (СПб, 2009), 64-ой региональной конференции «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции» (Пятигорск, 2009), международной конференции с элементами научной школы для молодежи «Инновационные материалы и технологии в химической и фармацевтической отраслях промышленности» (Москва, 2010), научно-практической конференции, посвященной 65-летию факультета промышленной технологии лекарств (СПб, 2010), 5-ой Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Здоровье - основа человеческого потенциала: проблемы и пути их решения» (СПб, 2010), 9-ой научно-практической конференции «Исследование, разработка и применение высоких технологий в промышленности» (СПб, 2010), конференции «Фармация и общественное здоровье» (Екатеринбург, 2010), 66-ой региональной конференции «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции» (Пятигорск, 2011), XV Международном Съезде «Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения Фитофарм-2011» (Нюрнберг, 2011), Международная конференция «Topics in experimental evolution of organisms» (Алушта, 2011).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 20 научных работ, из них 5 в журналах, входящих в «Перечень ведущих рецензируемых научных журналов, рекомендованных ВАК».

Связь задач исследования с планом фармацевтических наук

Работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ ГБОУ ВПО СПХФА Минздравсоцразвития России по направлению «Инновационные технологии лекарственных средств на основе клеточных культур и перспективных видов лекарственного растительного сырья» (№ государственной регистрации 01200955007).

Положения, выносимые на защиту

1. Технология культивирования биомассы растительных тканей на модифицированных питательных средах с получением селективной гормононезависимой по кинетину клеточной линии женьшеня, позволившая значительно сократить время культивирования, удешевить производство и повысить качество биомассы по содержанию действующих веществ.

2. Возможность использования полученной селективной клеточной линии, как модели биосистемы для оценки влияния наноматериалов на морфолого-физиологические, биохимические и фитохимические характеристики изолированных клеток растений.

3. Технология получения водного извлечения из селективной клеточной линии женьшеня, позволившая увеличить в 2,3 раза содержание водорастворимых полисахаридов по сравнению со спирто - водным извлечением.

4. Обоснование и разработка состава, технологии и стандартизация капель для приема внутрь на основе водного извлечения из биомассы женьшеня.

5. Обоснование и разработка состава, технологии и стандартизация буккальных пленок на основе водного извлечения из биомассы женьшеня.

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы (глава 1), экспериментальной части (главы 2-7), общих выводов, списка литературы и приложений. Работа изложена на 169 страницах машинописного текста, содержит 45 таблиц, 26 рисунков. Список литературы включает 153 источника, в том числе 36 на иностранных языках.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Введение

Во введении изложены актуальность, цель и задачи исследования, научная и практическая значимость работы.

Глава 1. Обзор литературы

Обзор литературы посвящен рассмотрению современных направлений развития биотехнологии. Обсуждены области применения нанобиотехнологии в медицине и фармации. Проанализирована возможность получения новых селективных клеточных линий женьшеня с исключением различных компонентов питательной среды, что удешевляет производство, но при этом сохраняет ценность биомассы. Показана эффективность применения изолированных растительных клеток, как модели живой системы.

Представлен обзор иммунопрепаратов на фармацевтическом рынке России. Приведена номенклатура капель для приема внутрь и трансдермальных терапевтических систем (ТТС), в том числе пленок на основе лекарственного растительного сырья (ЛРС). Показана перспективность данных лекарственных форм в качестве иммунопрепаратов.

Представлен обзор по вспомогательным веществам, используемым в технологии ТТС.

Глава 2. Материалы и методы исследования

В главе описаны методы и приборы, использованные для анализа биомассы женьшеня, водных извлечений из биомассы женьшеня и лекарственных средств на их основе.

Для выявления анатомо-морфологических особенностей селективной клеточной линии женьшеня использовали просвечивающий электронный микроскоп JEM-100C (JEOL, Япония).

Для идентификации, разделения и количественного определения основных БАВ - суммарной гликозидной фракции (СГФ), гликопептидного комплекса (ГПК) и водорастворимых полисахаридов (ВРП) использовали химические, спектральные и хроматографические методы анализа.

Воздушно-сухая биомасса, экстрагенты и вспомогательные вещества, использованные в технологии капель для приема внутрь и буккальных пленок, по показателям качества отвечали требованиям ГФ XI, ГФ XII, ФС или соответствующей НД. Экспериментальная оценка безопасности образцов извлечений выполнена согласно «Методическим указаниям по изучению общетоксического действия фармакологических веществ. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ».

Микробиологическая чистота капель для приема внутрь была определена в соответствии с требованиями ГФ XII.

Сроки годности лекарственных средств были определены соответствии с требованиями ГФ XII.

Результаты исследований обрабатывали с использованием математической статистики с установлением регрессионных связей между технологическими факторами и выходными параметрами. Корреляционный и факторный анализы проводили с использованием пакета прикладных программ Statgraphics и Microsoft Excel для персонального компьютера.

Глава 3. Получение селективной клеточной линии и совершенствование технологии культивирования биомассы женьшеня

Культивирование штаммов предполагает использование сложных многокомпонентных питательных сред, содержащих определенный набор минеральных солей, витаминов, стимуляторов роста, что значительно усложняет технологический процесс.

Нами была изучена возможность получения селективной клеточной линии штамма женьшеня на питательной среде, в которой одновременно отсутствует нитрат аммония и стимулятор роста - кинетин.

Для исследований были выбраны следующие питательные среды: по прописи Мурасиге-Скуга (MS) и модифицированная среда (MS) с исключением нитрата аммония и кинетина. На протяжении 10-12 пассажей проводили отбор только тех клеток, рост которых на селективной среде не уступал или превосходил контроль по накоплению биомассы и содержанию основных действующих веществ. В результате была получена селективная клеточная линия женьшеня (СД) и дана ее характеристика.

Анатомо-морфологическое исследование полученной клеточной линии показало, что культура на 90 % состоит из тонкостенных паренхимных клеток с целлюлозными оболочками, на 3-5% из образовательных, меристематических клеток и небольшого числа, не более 1-2%, слабо лигнифицированных проводящих трахеид с характерными простыми или окаймленными порами и очень длинными тонкостенными волокнами.

Для изучения динамики роста определяли показатели накопления сырой и сухой биомассы женьшеня СД каждые 5 суток. Исследования были выполнены на протяжении 2006, 2007 и 2008 годов. Динамика накопления сухой биомассы СД представлена на рис.1.



Рисунок 1 - Динамика накопления сухой биомассы селективной (СД) линии женьшеня

При сравнительном изучении ростовых характеристик селективной линии (СД) и контроля (КД) было установлено, что за календарный год проходит 14 пассажей СД и 10 пассажей КД. При этом повышается эффективность процесса культивирования на 40%, так как сокращается цикл на 10 суток, а прирост биомассы не уступает контрольному штамму (рис.2).

Рисунок 2 - Сравнительная характеристика селективной и контрольной линии женьшеня по количеству пассажей за календарный год

Проведенные исследования по совершенствованию технологии позволили значительно сократить время культивирования, удешевить производство и повысить качество биомассы по содержанию действующих веществ.

Одним из основных признаков стабильности штамма является сохранение показателей роста при многократной рекультивации. Стабильность СД по накоплению биомассы была доказана на протяжении 5 лет.

Результаты проведенного товароведческого анализа биомассы селективной клеточной линии женьшеня представлены в табл. 1.

Таблица 1 - Товароведческий анализ биомассы (СД) женьшеня

Наименование показателя	Селективная линия женьшеня (СД)	Требования НД*
Влажность, %	6,040,27	не более 8
Зола общая, %	8,770,59	не более 13
Экстрактивные вещества, извлекаемые: - спиртом этиловым 20 об.% - спиртом этиловым 40 об.% - спиртом этиловым 70 об.% - водой очищенной	41,17+2,06 46,502,61 46,87+2,34 44,74+1,98	не менее 40
Водорастворимые полисахариды, %	5,72±0,62	не менее 5
Суммарная гликозидная фракция, %	1,87+0,09	не менее 1,5
Гликопептидный комплекс, %	2,50+0,13	-
Требования НД*- ВФС на биомассу женьшеня

Т.о., биомасса женьшеня СД по показателям качества соответствует требованиям НД. На селективную клеточную линию женьшеня составлен паспорт. Разработанная технология выращивания культуры прошла апробацию в производственных условиях в ХБО при РАН «Фирма Вита».

Питательная среда для выращивания растительных тканей in vitro является сложной и многокомпонентной, что значительно усложняет их культивирование в промышленных масштабах. Причем для разных культур этот состав может сильно отличаться, но обязательными компонентами являются минеральные соли. Поэтому нам представлялось интересным замена многокомпонентного минерального состава питательной среды на новый класс высокоэффективных экологически чистых стекловидных минеральных добавок «AVA» на основе метафосфатов калия, магния, кальция, легированных микроэлементами: Mn⁺², Zn⁺², Cu⁺², Co⁺², B^-2. Нами были использованы образцы со следующими торговыми названиями:

	образец - 1	образец - 2	образец - 3
Торговое название	«AVA-1 Универсал»	«AVA с гуматом» (3% гумата)	«AVA с мочевиной» (15% карбамид мочевины)

Все используемые модификации добавки «AVA» были внесены в экспериментальные среды в концентрации 1 г/л. Рост культур на различных вариантах экспериментальных сред проходил по характерной «S»- образной кривой с сокращением «lag»- периода с 5 дней (контроль) до 3 дней (опытные варианты).

Накопление ГПК в биомассе КД и СД на всех вариантах питательных сред с «AVA» были или на уровне таковых в контроле, или даже превышало эти показатели в вариантах среды с образцом-2 (табл. 2).

Таблица 2 - Показатели накопления действующих веществ в биомассе КД и СД женьшеня при выращивании на экспериментальных средах с «AVA»

Вариант среды	штамм	ГПК, %	ВРП, %
Контроль	КД	2,5+0,1	8,0+0,4
Образец-1		2,4+0,1	4,2+0,2
Образец-2		2,6+0,1	3,5+0,2
Образец-3		2,4+0,1	5,2+0,3
Контроль	СД	2,6+0,1	9,0+0,5
Образец-1		2,4+0,1	8,9+0,4
Образец-2		2,7+0,1	5,5+0,3
Образец-3		2,5+0,1	6,8+0,3

Можно предположить, что более высокое содержание таких микроэлементов как Cu⁺², Zn⁺², Fe⁺³, в добавке «AVA» по сравнению с питательной средой (MS), повлияло на усиление синтеза этих веществ. Наличие гуминовых кислот (образец-2) активизировало синтез гликозидов.

Эффективность использования минеральных стекловидных добавок «AVA» в технологии выращивания культуры показана в условиях ЗАО «Агровит».

Глава 4. Применение штаммов женьшеня, как модели биосистемы, для оценки влияния наноматериалов

Штаммы длительно культивируемых in vitro растительных клеток могут быть рассмотрены как модель биосистемы для оценки экологической и медицинской безопасности при использовании наноматериалов.

Объектом наших исследований являлись УНТ - смешанный наноуглеродный материал фуллероиного типа, подвергнутый дополнительной глубокой очистке (Алексеев О.В. и др. 2005, Letenko D.G., 2007).

Были рассмотрены варианты питательной среды (MS) с добавлением следующих компонентов, содержащих УНТ.

Вариант 1 - вода очищенная с УНТ в концентрации 10^-4 г/л;

Вариант 2 - вода очищенная с УНТ в концентрации 10 -⁵г/л;

Вариант 3 - вода очищенная с УНТ в концентрации 10^-6 г/л;

Вариант 4 - раствор минеральных солей с УНТ в концентрации 10 -⁵г/л.

Контроль - питательная среда (MS).

Для равномерного распределения УНТ растворы обрабатывали ультразвуком в течение 15 минут. В сосуды с контрольной и экспериментальными питательными средами стерильно вносили посадочный материал - биомассу СД.

Установлено, что накопление биомассы в исследуемых вариантах питательной среды практически не отличалось от контрольного варианта.

С целью изучения влияния УНТ на активность ферментов-антиоксидантов, как показателей физиологического состояния клеток, была определена биохимическая характеристика биомассы СД (табл.3).

Таблица 3 - Содержание ферментов-антиоксидантов в биомассе СД при культивировании на средах с УНТ

Вариант	СОД, Ус.Ед/г	Каталаза, Ус.Ед/г	Белок, мг/г	ДНК, мг/г	РНК, мг/г
Контроль	91,5+4,6	125,0+6,1	2,30+0,11	0,06+0,01	0,15+0,01
Вариант 1	90,3+4,5	99,8+5,0	2,10+0,11	0,05+0,01	0,12+0,01
Вариант 2	98,1+4,9	140,0+7,0	2,45+0,13	0,05+0,01	0,10+0,01
Вариант 3	90,5+4,5	120,0+6,0	2,52+0,13	0,06+0,01	0,13+0,01
Вариант 4	101,0+5,1	110,1+5,5	2,53+0,13	0,07+0,01	0,12+0,01

При этом не отмечено каких-либо значительных отличий в содержание ферментов антиоксидантной защиты в клетках, как при культивировании в контрольном варианте, так и на экспериментальных средах.

В процессе роста клеток СД на питательной среде с УНТ также не выявлены изменения в каталитической активности основных ферментов-антиоксидантов, характерных для штамма женьшеня (Кириллова Н.В., 2005).

Для выявления влияния УНТ на уровень синтеза БАВ биомассы женьшеня культивируемой на экспериментальных средах были определены показатели БАВ - ГПК и ВРП в течение трех пассажей (рис. 3).

Рисунок 3 - Содержания ГПК и ВРП в биомассе женьшеня, культивируемой на питательных средах, содержащих УНТ

Из анализа полученных данных, видно, что от содержания УНТ в питательной среде уровень ГПК и ВРП значительно менялся. В варианте 2 содержание ГПК было близко к контрольному. В остальных вариантах оно снизилось на 50 %. Интересно отметить, что в варианте 4 содержание ВРП было таким же как в контроле, а концентрация ГПК снизилась в два раза. Возможно, что макро- и микроэлементы (Fe, Mn, Mo, Zn и другие) могут взаимодействовать с УНТ, образуя металлокомплексы, которые могут присутствовать в цитоплазме клеток и оказывать влияние на метаболизм гликозидов и полисахаридов.

Т.о., полученные данные показывают, что способ введения УНТ в питательные среды при культивировании клеток имеет принципиальное значение.

При дальнейшем культивировании до девятого пассажа на питательной среде (вариант 2) происходило повышение ГПК на 36%, а ВРП - на 32%. Это говорит об адаптации клеток к новым условиям и свидетельствует, что УНТ не проявляют токсического влияния и таким образом, растительная клетка может быть использована как модель биосистемы.

Для оценки безопасности применения УНТ были проведены исследования хронической токсичности извлечений из биомасс, выращенных на средах, содержащих УНТ.

Экспериментальную оценку проводили при курсовом внутрижелудочном введении самцам белых беспородных крыс с массой тела 140-160 г в возрасте 14-16 недель. В задачу исследования входила оценка вероятного токсического действия на органы и ткани лабораторных животных в хроническом эксперименте при пероральном введении исследуемых образцов.

В результате эксперимента были получены следующие результаты:

- образцы не оказывали токсического воздействия на динамику массы опытных животных;

- изменения состава крови не свидетельствовали о токсическом действии исследуемых образцов;

- изученные образцы при введении крысам в течение 25 дней не оказывали кардиотоксического действия;

- в эксперименте не было выявлено повреждающего действия образцов на мочевыделительную систему животных;

- исследуемые образцы не оказывали повреждающего действия на органы и ткани подопытных животных.

Следовательно, извлечения из биомассы, выращенной на средах с УНТ, не оказывают токсического действия на животных.

Т.о., рассматривая растительную клетку как модель биосистемы и анализируя ее по основным маркерам морфолого-физиологического и биохимического состояния, показана возможность оценки рисков использования наноматериалов, на примере УНТ.

Глава 5. Разработка технологии водных извлечений на основе биомассы женьшеня

БАВ биомассы женьшеня СД имеют полярную природу, поэтому была разработана технология водных извлечений из биомассы женьшеня.

При разработке оптимальных условий проведения стадии экстрагирования ЛРС были изучены технологические свойства биомассы женьшеня СД в сравнении с биомассой, выращенной на стандартной питательной среде (КД).

Результаты анализа технологических свойств биомассы женьшеня представлены в таблице 4.

Таблица 4 - Технологические свойства биомассы женьшеня

Наименование показателя	Селективная линия женьшеня (СД)	Контрольная линия женьшеня (КД)
Насыпная масса, г/см3	0,50±0,03	0,49+0,02
Фракционный состав, % частицы: >2,0 мм,<3,0 мм >1,0 мм,<2,0 мм >0,5 мм,<1,0 мм <0,5 мм	86,94 3,70 0,17 9,19	87,89 3,50 0,15 8,45
Средний диаметр частиц, мм	0,48±0,03	0,48±0,03
Сыпучесть, г/с	5,90±0,34	5,87+0,35
Коэффициент поглощения сырья: - водой очищенной - спиртом этиловым 40об.%	3,40±0,17 3,33+0,15	3,39+0,16 3,34+0,15

Был проведен комплекс исследований и выбран наиболее эффективный режим экстрагирования биомассы женьшеня СД и установлены следующие технологические параметры процесса:

- размер частиц биомассы - от 2,0 мм до 3,0 мм;

- экстрагент - вода очищенная;

- соотношение сырье : водное извлечение - 1:50;

- предварительное набухание сырья в течение 30 минут;

- метод экстракции - мацерация при комнатной температуре в течение 30 минут с перемешиванием (n=400 об/мин).

На рис.4 представлена кинетическая кривая экстрагирования биомассы женьшеня СД

Рисунок 4 - Кинетическая кривая экстрагирования биомассы женьшеня СД методом мацерации при перемешивании, n=400 об/мин.

Установлено, что при данных технологических параметрах процесса водное извлечение из биомассы женьшеня СД содержит ВРП в 2,3 раза больше, чем спирто - водное извлечение. Качественное исследование методом ТСХ водных извлечений из биомассы женьшеня СД и контрольного штамма женьшеня, показало полное совпадение всех пятен по значениям Rf.

Для увеличения срока хранения водного извлечения в качестве консерванта вводили сорбат калия в количестве 0,1%.

Было наработано 3 партии водных извлечений из биомассы женьшеня СД, которые были стандартизованы по показателям качества (табл.5).

Таблица 5 - Стандартизация извлечений из биомассы женьшеня СД, полученных при установленных параметрах ведения процесса экстракции

Показатель	Партия 1	Партия 2	Партия 3
Внешний вид (прозрачность, цвет)	прозрачная жидкость, желто-оранжевого цвета	прозрачная жидкость, желто-оранжевого цвета	прозрачная жидкость, желто-оранжевого цвета
Запах, вкус	специфичный, приятный	специфичный, приятный	специфичный, приятный
Содержание ГПК, %	0,047+0,002	0,047+0,002	0,046+0,002
Содержание ВРП, %	0,242+0,012	0,246+0,012	0,248+0,012
Масс. Доля сухого остатка, %	46,17+2,31	46,13+2,31	46,10+2,30

Т.о., в результате исследований были определены технологические, фитохимические показатели биомассы, а также разработаны оптимальные условия получения водного извлечения из селективной клеточной линии женьшеня. Полученное водное извлечение, обогащенное ВРП, может служить матрицей для получения новых ЛС иммуномодулирующего действия.

Глава 6. Разработка состава и технологии капель для приема внутрь

Капли для приема внутрь на основе растительных экстрактов представляют особый интерес, т.к. данная лекарственная форма удобна в применении и имеет сравнительно высокую биодоступность. При исследовании фармацевтического рынка РФ было выяснено, что основными производителями капель для приема внутрь являются фармацевтические компании Германии. Перспективной являлась разработка отечественных капель для приема внутрь на основе водного извлечения из биомассы женьшеня.

По результатам ряда проведенных опытов был выбран следующий состав капель для приема внутрь, который представлен в табл. 6.

Таблица 6 - Состав капель для приема внутрь на основе водного извлечения из биомассы женьшеня СД

Наименование компонента	Содержание компонента, %
Водное извлечение из биомассы женьшеня СД	99,45
Глицин (корригент вкуса)	0,30
Фруктоза (корригент вкуса)	0,25

На сегодняшний день ОФС на капли для приема внутрь отсутствует, поэтому был разработан проект НД, в котором предложены основные показатели качества этой лекарственной формы. Полученные капли для приема внутрь были проанализированы по следующим показателям: органолептические свойства (прозрачность и цветность, запах, вкус), рН водного раствора, микробиологическая чистота, а также подлинность и количественное содержание основных действующих веществ - ВРП и ГПК (табл.7).

Таблица 7 - Показатели качества капель для приема внутрь на основе водного извлечения из биомассы женьшеня СД

Наименование показателя	Метод определения	Значение параметра
Описание	Визуальный	Прозрачная жидкость желто-коричневого цвета со специфичным вкусом и запахом
Подлинность	Метод ТСХ	Соответствует
рH	Потенциометрический	4,8 - 5,2
Количественное содержание ВРП	Гравиметрический	0,081+0,004%
Количественное содержание ГПК	Спектрофотометрический	0,042+0,002%
Микробиологическая чистота	Микробиологический	Общее микробное число не более 104 в 1мл, отсутствие бактерий E.coli и Salmonella sp. в 1г, отсутствие в 1г St.aureus.

Т.о., на основе водного извлечения из биомассы женьшеня СД разработан состав жидкой ЛФ - капли для приема внутрь. Установлен срок хранения ЛФ при температуре 8-15°С, в защищенном от света месте - 1 год (срок наблюдения 1,5 года).

Разработана технологическая схема получения капель для приема внутрь, которая представлена в приложении А.

Глава 7. Разработка состава и технологии буккальных пленок

Фитопленки (ФП) относятся к аппликационным лекарственным формам и предназначены для введения в организм через кожу или слизистые БАВ растительного происхождения (Мизина П.Г., 2000). ФП имеют ряд преимуществ: удобство применения, пролонгированное действие, технологичность, безопасность, возможность сочетания различных групп действующих веществ, из-за малых доз БАВ сведены до минимума побочные эффекты, в случае необходимости доза БАВ может быть увеличена путём нанесения дополнительной пленки, возможность использования в любых ситуациях, многостороннее и мягкое действие фитокомплексов.

С целью выбора рационального состава пленочной матрицы было изучено 40 композиций, включающих различные сочетания активируемых слюной полимеров природного и синтетического происхождения (натрия альгинат, желатин, производные целлюлозы, поливиниловый спирт и другие). Количество пленкообразователя подбиралось опытным путем.

Критериями оценки пленочных матриц на первом этапе являлись результаты оценки их органолептических свойств: однородность, отсутствие микротрещин, разрывов, прозрачность, отсутствие пузырьков, запах, вкус, а также хорошее отставание от подложки (Блинова О.А., 2008). Также у матриц пленок выбранных составов определяли функциональные свойства, а именно: толщина, время растворения, pH водного раствора, время удерживания (рис.5) и эластичность (рис.6)

Рисунок 5 - Результаты определения времени удерживания матриц пленок Рисунок 6 - Результаты исследования эластичности матриц пленок

В выбранные матрицы в качестве терапевтически активного компонента вводили стандартизованное водное извлечение из биомассы женьшеня СД в количестве 60% от объема поливочного раствора. В табл. 8 приведен состав пленок, на основе выбранных матриц с водным извлечением из биомассы женьшеня СД.

Таблица 8 - Составы изучаемых пленок, на основе выбранных матриц с водным извлечением из биомассы женьшеня СД

№ пленки	Содержание компонентов, %
	МЦ	ПВС	Na-КМЦ	Желатин	Глицерин	Извлечение из биомассы женьшеня СД	Вода очищенная
12	-	-	1,0	2,0	2,0	60,0	до 100,0
14	-	-	2,0	2,0	1,0	60,0	до 100,0
17	2,0	2,0	-	-	1,0	60,0	до 100,0
18	1,0	2,0	-	-	1,0	60,0	до 100,0

У полученных пленок определяли функциональные свойства, результаты оценки представлены в табл. 9.

Таблица 9 - Оценка функциональных свойств ФП с извлечением из биомассы женьшеня СД

№ пленки	Время удерживания, мин по МЦ	Толщина, мм	Время растворениямин.	рH водного раствора	Эластичность %, по ПВС
Стандарт 1	70,00	-	-	-	-
Стандарт 2	-	-	-	-	100
12	95,0+0,5	0,5+0,1	120,0+0,5	6,1+0,1	97+5
14	55,0+0,5	0,5+0,1	120,0+0,5	6,5+0,1	70+5
17	61,3+0,5	0,6+0,1	105,0+0,5	6,3+0,1	75+5
18	117,0+0,5	0,5+0,1	135,0+0,5	6,4+0,1	55+5

Установлено, что все 4 состава пленок имеют близкое по значению время растворения в пределах от 105,0 до 135,0 минут. Максимальное время удерживания наблюдается у пленки №18, а максимальная эластичность - у пленки № 12.

На основании оценки функциональных свойств пленок с водным извлечением из биомассы женьшеня СД нельзя было сделать однозначный выбор состава пленки с наилучшими свойствами. Поэтому пленки, выбранных четырех составов, подвергали «тесту на растворение» (Блинова О.А., 2008) по основному действующему веществу (рис.7).

Рисунок 7 - Кинетика высвобождения ГПК из пленок

На основании зависимости высвобождения ГПК из пленок от времени, представленной на рисунке, установлено, что состав матрицы пленки значительно влияет на высвобождение действующего вещества из пленки.

Максимальное высвобождение ГПК из пленки в среду растворения наблюдали при испытании пленки №12. За 120 минут в среду растворения переходит 93,5 % ГПК, что обеспечивает достаточную пролонгацию высвобождения действующих веществ. В результате проведенных исследований был выбран следующий состав буккальных пленок (табл.10).

Таблица 10 - Состав буккальной пленки с извлечением из биомассы женьшеня СД

Наименование компонента	Содержание компонента, %
Na-КМЦ	1,0
Желатин	2,0
Глицерин	2,0
Водное извлечение из биомассы женьшеня СД	60,0
Вода очищенная	до 100,0

Качественное исследование методом ТСХ пленки и водного извлечения из биомассы женьшеня СД показало полное совпадение пятен по значениям Rf.

В таблице 11 представлены показатели качества буккальных пленок.

Таблица 11 - Показатели качества буккальных плёнок на основе водного извлечения из биомассы женьшеня СД

Показатель	Результаты испытаний
Органолептические свойства	Однородные прозрачные пластины светло-коричневого цвета размером 2*1*0,5 см. Запах и вкус специфические.
Эластичность	Высокоэластичные
Время удерживания, мин	Не менее 90
Средняя масса, г	0,052±0,003
Растворимость, мин	120 ±5
рН водного раствора	6,0-6,5
Количественное содержание ГПК, %	0,044±0,002

Для обеспечения качества производства ЛФ были проведены дополнительные исследования на гигроскопичность. Изучение гигроскопичности буккальных пленок показало, что они гигроскопичны при относительной влажности воздуха 40-100%, при влажности 0-7% они теряют влагу. Таким образом, оптимальное значение относительной влажности воздуха при хранении плёнок составляет 20%-30%.

Установлен срок хранения пленок при температуре 8-15°С, в защищенном от света месте - 1 год (срок наблюдения 1,5 года). На буккальные пленки разработан проект ФСП. Разработана технологическая схема получения буккальных пленок (приложение Б).

ВЫВОДЫ

1.В результате оптимизации параметров культивирования биомассы женьшеня на питательной среде с исключением нитрата аммония и стимулятора роста получена селективная гормононезависимая по кинетину клеточная линия. Совершенствование технологии выращивания биомассы штамма женьшеня позволило повысить эффективность процесса культивирования на 40% за календарный год, удешевить производство и повысить качество биомассы по содержанию действующих веществ.

2.Разработана технология выращивания полученной селективной клеточной линии биомассы женьшеня (СД), обеспечивающая стабильность по накоплению биомассы при многократных рекультивациях на модифицированной питательной среде в течение 5 лет и воспроизведение продуктивности культуры в производственных условиях. Разработана НД (паспорт) на полученную селективную клеточную линию женьшеня (СД).

3.Установлена возможность использования клеточной линии женьшеня, как модели биосистемы для оценки влияния УНТ на морфолого-физиологические, биохимические и фитохимические характеристики изолированных клеток растений. В результате фармакологических исследований на животных извлечений из биомасс, выращенных на средах, содержащих УНТ, показано отсутствие токсического действия.

4. Теоретически обоснована и экспериментально разработана технология экстрагирования биомассы женьшеня СД водой очищенной (1:50) с получением водного извлечения, содержащего водорастворимых полисахаридов в 2,3 раза больше, чем в спирто - водном извлечении.

5. Впервые разработан состав и технология жидкой лекарственной формы на основе водного извлечения из биомассы женьшеня СД - капли для приема внутрь.

6.Впервые на основании оценки функциональных свойств обоснован и разработан состав и технология аппликационной ЛФ - буккальные пленки на основе водного извлечения из биомассы женьшеня СД.

7.Предложены показатели качества и разработаны НД на капли для приема внутрь и буккальные пленки. Определены условия и сроки годности разработанных ЛФ в условиях естественного хранения.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Технология выращивания клеточных линий Panax ginseng, P. quinquefolius (Araliaceae) /Л.И.Слепян, Н.В.Кириллова, М.А.Стрелкова, О.Н.Громова и др.// Растительные ресурсы. - 2005. - Т.41 - Вып.3 - с.46-52.

2 Использование минеральной добавки «AVA» в условиях культуры in vitro штамма Panax ginseng, P. quinquefolius и Polyscias filicifolia (Araliaceae) /Л.И.Слепян, М.А.Стрелкова, Н.С.Кузьмина, О.Н.Громова и др.// Растительные ресурсы. - 2007. - Т.43 - Вып.4 - с.111-118.

3 Громова, О.Н. Банк штаммов лекарственных растений сегодня и его перспективы в биотехнологии XXI века /Л.И.Слепян, Н.В.Кириллова, М.А.Стрелкова, А.Л.Марченко, В.А.Федотова, О.Н.Громова, Н.С. Кузьмина// Фармация из века в век: сборник научных трудов. Часть IV. Биохимические, биотехнологические исследования /Санкт- Петербургская государственная химико-фармацевтическая академия. - СПб. : СПХФА, 2008. - С.80-84.

4 Громова, О.Н. Разработка технологии нового препарата на основе водного извлечения из биомассы женьшеня Panax ginseng C.A.Mey /А.Л.Марченко, О.Н.Громова, Л.И.Слепян, Т.С.Потехина// Фармация из века в век: сборник научных трудов. Часть II. Фармацевтическая технология/Санкт-Петербургская химико-фармацевтическая академия.-СПб.:СПХФА, 2008.-С.84-87.

5 Громова, О.Н. Препараты на основе биомассы штамма женьшеня /О.Н.Громова, А.Л.Марченко, Л.И.Слепян// Фармация.-2009. - № 3.-С. 38-40.

6 Громова, О.Н. Водные извлечения из биомассы женьшеня с германийорганическим соединением /О.Н.Громова, Л.И.Слепян// Вестник российской ВМА. - 2009.- №1(25).- С.268.

7 Громова, О.Н. Использование ультразвуковой экстракции в технологии получения водных извлечений из штамма женьшеня /О.Н.Громова// Материалы межвузовской научной конференции студентов и молодых ученых посвященной 90-летию СПХФА ”Фармация в XXI веке: эстафета поколений“ 23.04.09-24.04.09 /Санкт- Петербургская государственная химико-фармацевтическая академия. - СПб.: СПХФА, 2009. - С. 155-156.

8 Громова, О.Н. Стабильность клеточных линий растений семейства Araliaceae /О.Н.Громова, Л.И.Слепян// Сборник научных трудов: “Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции” / Пятигорская государственная фармацевтическая академия. - Пятигорск, 2009 - Вып. 64. - С. 28-29.

9 Громова, О.Н. Разработка технологии буккальных фитопленок на основе извлечений из биомассы женьшеня /О.Н.Громова, А.В.Басевич// Материалы международной конференции с элементами научной школы для молодежи “Инновационные материалы и технологии в химической и фармацевтической отраслях промышленности” - Москва, 2010. - С.35-36.

10 Громова, О.Н. К созданию инновационного иммуностимулирующего препарата на основе водного извлечения из биомассы Panax ginseng C. A. Mey в виде буккальных биорастворимых пленок /О.Н.Громова, А.В.Басевич, Л.И.Слепян// Сборник научных трудов: “Научно-практическая конференция посвященная 65-летию факультета промышленной технологии лекарств” /Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая академия. - СПб, 2010.-С. 40-45.

11 Громова, О.Н. Биомассы штамма женьшеня, как перспективное лекарственное сырье в технологии иммунотерапевтических лекарственных средств /Л.И.Слепян, О.Н.Громова// Труды пятой Всероссийской научно-практической конференции с международным участием: “Здоровье - основа человеческого потенциала: проблемы и пути их решения” /Санкт-Петербург.-2010. - С. 353-354.

12 Оценка безопасности углеродных нанотрубок при культивировании штамма женьшеня. Сообщение 1 /Л.И.Слепян, И.Е.Каухова, О.Н.Громова и др.// Межрегиональный тематический сборник научных трудов, посвященный 200-летию со дня рождения российского гения медицины и хирургии Н.И.Пирогова “Актуальные проблемы клинической и экспериментальной патологии”.-Рязань.-2010. - С.141-151.

13 Оценка безопасности УНТ при культивировании штамма женьшеня. Сообщение 2 /Л.И.Слепян, И.Е.Каухова, О.Н.Громова и др.// Сборник трудов 9-ой международной научно-практической конференции “Исследование, разработка и применение высоких технологий в промышленности”.-Санкт-Петербург.-2010.-С.426-431.

14 Громова, О.Н. Разработка технологии получения водных извлечений из биомассы Panax ginseng C.A.Mey (Araliacaea) /О.Н.Громова// Материалы ежегодной конференции “Фармация и общественное здоровье”. - Екатеринбург. - 2010. - С. 227-230.

15 К разработке состава биогеля для приема внутрь /А.В.Басевич, О.Н.Громова, А.С.Буркутбаева и др.// Сборник научных трудов: “Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции” / Пятигорская государственная фармацевтическая академия. - Пятигорск, 2011 - Вып. 66. - С. 235-236.

16 Взаимное влияние на рост и биологически активные вещества элиситоров гриба Trametes pubescens и штамма женьшеня /Л.И.Слепян, О.Н.Громова, И.Е.Каухова и др.// Сборник научных трудов: “Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции” / Пятигорская государственная фармацевтическая академия. - Пятигорск, 2011. - Вып. 66. - С. 316-317.

17 Громова, О.Н. Технология водных препаратов из биомассы штамма женьшеня /Л.И.Слепян, О.Н.Громова// Сборник научных трудов: “Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции” / Пятигорская государственная фармацевтическая академия.-Пятигорск, 2011-Вып.66.-С.251-253.

18 Банк клеток лекарственных растений - надежность сохранения биосистемы /Л.И.Слепян, И.Е.Каухова, О.Н.Громова и др.// Сборник научных трудов “Актуальные проблемы биологии и экологии”.-Санкт-Петербург.-2011.-С.346-353.

19 Gromova, O.N. Bank of medicinal plant cell cultures as a model of innovative phytobiotechnology /L.I.Slepyan, I.E.Kaukhova, O.N.Gromova, N.S.Kusmina// 15^thInternational Congress Phytopharm 25-27 Juli. -Nuremberg, Germany.-2011. - p.53.

20 К истории банка клеток лекарственных растений СПХФА /Л.И.Слепян, И.Е.Каухова, О.Н.Громова и др.// Сборник Международной конференции «Topics in experimental evolution of organisms». - Киев, 2011. - Т.11. - 584с.

ПРИЛОЖЕНИЕ

Технологическая схема капель для приема внутрь

Технологическая схема получения пленок

Размещено на Allbest.ru