Размещено на http://www.allbest.ru/

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Красноярский государственный медицинский университет имени профессора В.Ф. Войно-Ясенецкого»

Министерства здравоохранения Российской Федерации

Фармацевтический колледж

ДИПЛОМНАЯ РАБОТА

по специальности 31.02.03 Лабораторная диагностика

Тема: Методы скринингового обследования доноров на гемотрансмиссивные инфекции (гепатит С)

Выполнила: Сахипова Гульнара Кашивовна

Руководитель: Букатова Елена Николаевна

Работа допущена к защите ЦМК

«Лабораторных и санитарно-гигиенических дисциплин»

Красноярск

2015

ВВЕДЕНИЕ

В современном мире все большую актуальность набирают проблемы вирусных заболеваний. Существует ряд вирусов, которые вызывают наиболее тяжелые органические поражения, такие как иммунодефицит, цирроз или рак печени и т.д. К таким вирусам относится вирус гепатита С.

Актуальной проблемой здравоохранения остаются вирусные гепатиты. В крае ежегодно регистрируется до 2,5 тысяч случаев заболеваний острыми и хроническими вирусными гепатитами, в 2013году зарегистрировано 2 476 случаев, в течение 9мес. 2014г. - 2 089 случаев вирусных гепатитов.

К сожалению, многие люди, имеющие данное заболевание даже не подозревают что стали носителями этого вируса.

На современном этапе развития медицины и диагностики, выявить гепатит С довольно легко, но часто остается невыясненным путь заражения.

Для трансфузиологии выявление больных гемотрансмиссивными инфекциями, такими как гепатит С, крайне важно, т.к под удар ставится не только жизнь донора но и реципиента. Скрининг доноров проводится методом ПЦР диагностики, иммуноферментного анализа и иммунофлюоресценции.

ГЛАВА 1 ТЕОРЕТИКО-МЕТОДИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ РАЗВИТИЯ ГЕПАТИТА С У ДОНОРОВ

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ

Уровень медицины в мире, на данный момент достаточно высок, но до сих пор человечеству не удалось найти альтернативу продуктам донорской крови.

Донорская кровь ежедневно требуется многим людям и количество доноров и реципиентов продолжает расти. Но вместе с ростом нужды в крови и ее компонентах, растет и риск заражения гемотрансмиссивными инфекциями, такими как гепатит С.

Кровь одного донора, благодаря разделению ее на компоненты, может передаваться 4-5 пациентам, именно поэтому важность выявления доноров, инфицированных вирусом гепатита С, переоценить невозможно.

Количество больных гепатитом С в России составляет около 5 миллионов человек, и эта цифра растет, поэтому своевременные скрининговые обследования доноров и населения в целом могут значительно улучшить ситуацию по заболеваемости в стране.

Своевременное выявление доноров инфицированных вирусом гепатита С, путем скрининговых обследований.

Задачи

- Анализ путей передачи гепатита С

- Изучение методов скринингового обследования доноров

- Сделать сравнительную характеристику тест-систем ИФА

Объект исследования- доноры

Предмет исследования -гемотрансмиссивные инфекции (гепатит С)

ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ

Вирусный гепатит С - инфекционное заболевание, вызываемое РНК-содержащим вирусом протекающее преимущественно как хроническая инфекция. Врачи назвали этот вирус «Ласковый убийца».

Уже давно было замечено, что при строгом отборе доноров (зараженные гепатитом В от донорства отстранялись) при переливании их крови у 5 --8% реципиентов почему-то возникал вирусный гепатит (хотя при самых тщательных лабораторных исследованиях у них не было обнаружено маркеров гепатитов А и В). В 1988--1989 гг. был выделен вирус, ответственный за этот тип гепатита, который вскоре получил название -- вирус гепатита С.

Вирусный гепатит вызывается вирусами из разных семейств, но все они облигатно паразитируют в печени (вирусы попадают, размножаются и поражают исключительно ткань печени и никакую другую).

Все вирусные гепатиты являются антропонозами (источник инфекции - больной человек), а также вызываю развитие общей интоксикации. По своим медицинским и социально-экономическим характеристикам он входит в десятку наиболее распространенных инфекционных болезней населения современной России.

Вирусный гепатит С является одной из важнейших проблем мирового здравоохранения. Инфекция, вызванная вирусом гепатита С, часто протекает латентно, характеризуется минимальными клиническими проявлениями.

Гепатит С нередко диагностируется случайно, и во многих случаях пациенты остаются недообследованными.

Наиболее важно определять латентные формы гепатита С у доноров, т.к при донорстве один донор-носитель может заразить инфекцией много людей, таким образом повысить заболеваемость гепатитом в целом.

По данным Национальных служб здоровья частота обнаружения маркёров ВГС среди доноров крови варьируется от 0,2 % в странах Северной Европы до 1,2 % в Южной Европе, 3-6 % в Японии и 10-20 % в странах Африканского континента.

В России -- 1-5 %: более высокий процент в районах Сибири и Дальнего Востока. В Прибалтике -- 1-3 %; в Республиках Средней Азии и Молдове -- 5-12 %.(http://oneve.clan.su/news/gepatit_s/2013-06-30-110)

В сознании большинства людей есть представление о том, что гепатит С -- это неизлечимое заболевание печени, которое передается при использовании внутривенных наркотиков. И единственная задача терапии -- это подавить вирус. Поэтому когда человек впервые узнает, что у него гепатит С, обычно он шокирован и у него возникает много вопросов.

ЭТИОЛОГИЯ

Изначально считалось, что этиология вирусных гепатитов едина, но со временем были выделены различные вирусы, играющие роль в развитии инфекционных гепатитов.

На сегодняшний день наиболее изучены пять видов вирусных гепатитов (А, В, С, D, E), этиология которых различна.

Вирусный гепатит С относится к флавовирусам, представляет собой небольшой (30-40 нм в диаметре), покрытый оболочкой вирус (рис.1). Он является РНК-содержащим.

Геном представлен одноцепочечной положительно заряженной РНК, которая кодирует 3 структурных и 5 неструктурных белков вируса.

Рисунок 1 - Схема строения вируса гепатита С

Согласно разным классификациям определяют 6, 11 и более генотипов ВГС и более 80 субтипов (рис.2).

Рисунок 2- Генотипы гепатита С

Установлены существенные географические различия в распространении разных генотипов. Так в Японии, на Тайване и Китае преимущественно регистрируются генотипы 1b, 2а и 2b, тип 1b даже называют “японским”.

В США преобладает 1а -- “американский” генотип.

На Ближнем Востоке и в Юго-Восточной Азии -- 4-й генотип.

В Европейских странах преобладают в основном 2-й и 3-й генотипы, в Южной Европе возрастает доля генотипа 1b.

На Африканском континенте встречаются все генотипы.

В нашей стране чаще всего регистрируется 1b, далее с убывающей частотой 3а, 1а и 2а.

Изучение и определение генотипа НСV у больного имеет практическое и прогностическое значение, так как установлено, что лица, инфицированные определенными генотипами НСV, в частности 3-м и 4-м, плохо поддаются лечению реафероном.

По сравнению с НВV HCV менее устойчив к физико-химическим воздействиям.

ЭПИДЕМИОЛОГИЯ

Источником инфекции являются больные острым и хроническим гепатитом С и вирусоносители. Вирус гепатита С попадает в кровь парентеральным путем (кровь и ее препараты, использование медицинских инструментов, контаминированных НСV; гемотрансфузии, инъекции при посещении стоматолога и гинеколога, оперативном вмешательстве, зондовом обследовании и т.д. ).

К группе риска относятся больные, находящиеся на гемодиализе (инфицированность составляет 25-50 %), страдающие гемофилией (70-80 %) и другими заболеваниями крови, получающие плазму, гемоконцентраты, иммуноглобулины.

Предполагается передача половым путем и от матери плоду (пери- и постнатальное инфицирование).

После обеспечения полной безопасности донорской крови большинство случаев гепатита С будет обусловлено несоблюдением санитарно-гигиенических правил наркоманами, вводящими наркотики внутривенно (повторное использование нестерильных шприцев и игл, нестерильная фильтрация вводимых препаратов и др.).

По сравнению с ВГВ, распространение ВГС происходит менее интенсивно. Считают, что риск инфицирования вирусом гепатита С составляет при переливании крови 55 %, при введении наркотиков внутривенно - 20 %, при гемодиализе 12 %, при сексуальных контактах со многими партнерами - около 7 %, у медицинских работников - около 6 %. (http://www.med2000.ru/n5/n99.htm - Медицинская библиотека)

Описано несколько случаев профессионального заражения гепатитом С у медицинских работников с передачей HCV при случайных уколах использованными иглами, хотя такие случаи наблюдаются весьма редко по сравнению, например, с профессиональным заражением медработников вирусом гепатита В.

Серологическое наблюдение за врачами и медсестрами, с которыми произошли такие несчастные случаи, показали, что сероконверсия (сероконверсия- появление в сыворотке в связи с инфекцией или иммунизацией специфических антител в количестве, позволяющем их выявить с помощью современных иммунологических методов) при заражении ВГС происходит относительно нечасто от 0 % до 10%.

Не имеется убедительных доказательств эффективности пассивной иммунопрофилактики после несчастного случая, поэтому особое внимание медицинские работники должны уделять соблюдению универсальных мер предосторожности и использованию индивидуальных защитных средств.

Регистрируются как индивидуальные, так и групповые случаи ВГС. Показателем широты распространения вируса гепатита С служит выявление антител к нему. По оценкам ученых, на долю вирусного гепатита С в структуре вирусных гепатитов в нашей стране приходится 5-15 %.

До настоящего времени отсутствуют убедительные выводы о частоте передачи HCV половым путем. Результаты большинства исследований, проведенных в странах Европы и Северной Америки, показали очень низкую распространенность гепатита С среди половых партнеров людей, инфицированных вирусным гепатитом С (ВГС).

Вероятнее всего, передача ВГС половым путем действительно имеет место, но происходит относительно редко. Тем не менее из-за большого числа половых контактов между партнерами со стабильными и продолжительными сексуальными отношениями общее число новых случаев заражения ВГС половым путем может быть в конечном счете достаточно велико.

Кроме того, ограниченные исследования, проведенные в Европе и США, продемонстрировали, что передача ВГС от инфицированных родителей к их детям бытовым путем происходит редко или вообще не имеет места.

КЛИНИЧЕСКАЯ КАРТИНА

Отличительной особенностью ВГС является многолетнее латентное или малосимптомное течение, большей частью остающееся нераспознанным, в дальнейшем бурно развивающееся до цирроза печени и первичной гепатоцеллюлярной карциномы (ГЦК).

В многолетнем течении заболевания разграничивают три фазы: острую, латентную и фазу реактивации.

Острая фаза

Острый гепатит С клинически неотличим от других вирусных гепатитов. Продромальный период характеризуется неспецифическими симптомами со стороны желудочно-кишечного тракта: тошнотой, рвотой, болями в животе. Затем может появиться желтуха.

Считается, что на один случай заболевания, протекающего с желтухой, приходятся два случая безжелтушного гепатита. При безжелтушном течении гепатита С в большинстве случаев остается нераспознанным при отсутствии каких-либо жалоб или протекает под маской других болезней органов пищеварения: гастритов, язв, холециститов и прочих. Некоторые пациенты жалуются на боли в суставах. Очень характерным симптомом является мучительный кожный зуд на ногах и туловище без каких-либо высыпаний на коже.

Инкубационный период длится в среднем 6-8 недель с возможными колебаниями от 2-4-х недель до 4-6 месяцев и больше.

В этот момент регистрируется первый пик повышения печёночных ферментов. На 3-4 недели раньше анти-ВГС-IgG обнаруживаются анти-ВГС-IgM. РНК вируса с помощью ПЦР определяется через 1-3 недели после инфицирования.

Латентная фаза

Соответствует хроническому течению ВГС- инфекции при полном или почти полном отсутствии клинических проявлений. Может продолжаться многие годы, в среднем 15-20 лет.

Важно отметить существенные отличия хронического носительства вирусного гепатита В и С. Латентная стадия гепатита С является предстадией фазы реактивации инфекционного процесса с развитием хронического гепатита. В то время как хроническое носительство HBsAg, крайне редко является предстадией хронического гепатита В.

Фаза реактивации

Соответствует началу хронической стадии ГС с последующим развитием цирроза печени (в 25-50 % случаев) и гепатокарциномы.

Длительное наблюдение за больными с ГС показало, что хронический гепатит обнаруживается при биопсии, в среднем, через 10-15 лет после трансфузии, а цирроз -- через 20-25 лет. Однако у отдельных больных с особо агрессивным течением заболевания цирроз может сформироваться менее чем за 2 года.

Среди больных циррозом печени анти-ВГС обнаруживают в 45-65 % случаев без наличия HBsAg и в 5-10 % случаев -- совместно с HBsAg.

Исследования, проведённые по определению анти-ВГС и РНК ВГС у больных с гепатоцеллюлярной карциномой, продемонстрировали важную роль ВГС в развитии этого заболевания.

Во время стадии реактивации больные жалуются на быструю утомляемость, недомогание, нарушение сна, наблюдается ухудшение аппетита и потеря веса. Объективным признаком является увеличение и уплотнение печени, нередко в сочетании с увеличением селезёнки.

Важнейшим критерием оценки хронического ГС является динамический контроль за анти-ВГС-IgM. Они всегда регистрируются в фазу обострений.

ДИАГНОСТИКА

В отличие от вируса гепатита В, в диагностике которого учитываются антигенные и антительные маркеры, при гепатите С методом ИФА улавливаются только антитела. Антигены ВГС, если и попадают в кровь, то в количествах, которые практически не улавливаются.

Антигены ВГС могут быть обнаружены в биоптатах печени при использовании иммунногистохимических методов исследования. Это существенно ограничивает возможности оценки течения и активности инфекционного процесса.

Недавно появились указания о разработке нового подхода к индикации антигенов HCV в крови. Первым этапом является освобождение антигенов из клеточных структур путем лизирования сыворотки, вторым -- улавливание антигенов с помощью специфических моноклональных антител. Внедрение этого метода в клиническую практику призвано существенно обогатить возможности диагностики и контроля за течением ВГС.

Анти-HCV в своем большинстве не свидетельствуют о продолжающейся репликации вируса, не характеризуют ее активность, могут соответствовать постинфекции. Приходится так же учитывать, что у реципиентов, которым была перелита инфицированная кровь, могут обнаруживаться анти-HCV донора, при однократной индикации не обязательно свидетельствующие о посттрансфузионном заражении ВГС.

У больных хроническим ВГС анти-HCV обнаруживаются в крови не только в свободной форме, но и в составе циркулирующих иммунных комплексов. Их содержание относительно большее при развитии HBV/HCV микст - гепатита.

Для скрининговой индикации анти-HCV используют метод ИФА, а в качестве подтверждающего референс-теста метод иммуноблота (RIBA).

Тест-системы 2-го поколения позволяют улавливать антитела к белкам в разных зонах генома, причем не только неструктурной, но и структурной области. Их преимуществом является, прежде всего, высокая специфичность, а также возможность более полного представительства антигенного спектра HCV. Использование тест-систем 2-го поколения позволило существенно улучшить отбор доноров и уменьшить угрозу развития посттрансдиффузного ВГС.

Вместе с тем и при использовании тест-систем 2-го поколения не исключены ложноотрицательные результаты, в частности, у больных с необычными для данного региона генотипами HCV. Наиболее совершенны тест-системы 3-го поколения.

Информативность исследований существенно повышается при комплексной оценке широкого спектра анти-HCV, обязательно в условиях динамического контроля.

Такая система наблюдения позволяет уловить изменения соотношения антител к разным антигенам HCV. Кроме того, оценка результатов только разовых исследований не всегда убедительна с учетом возможности латентной фазы.

Такой подход, в частности, оказался особенно важным для разграничения острой фазы ВГС от хронической.

В латентную фазу анти-HCV класса IgM практически не улавливаются. Они вновь появляются во время обострений, большей частью в сочетании с повышением АлАТ. Отметим, что при HCV-инфекции динамический контроль за АлАТ существенно дополняет оценку динамики анти-HCV и является важным критерием характеристики течения болезни.

Обнаружение в крови HCV-РНК является основным критерием, характеризующим вирусемию, свидетельствующую о продолжающейся активной репликации HCV.

В связи с малым содержанием РНК для контроля может быть использован только метод ПЦР. Определение HCV-РНК в крови называют “золотым стандартом” диагностики ВГС. Только на основе определения HCV-РНК стало возможным генотипирование вируса, существенно повысившее информативность лабораторного исследования больных.

В острую фазу гепатита С РНК выявляется в крови уже через 1-2 недели после заражения, т.е. задолго до появления анти-HCV.

Отечественные иммуноферментные тест-системы для диагностики ГС

В настоящее время Российскими фирмами представлено около 15 зарегистрированных тест-систем, имеющих фармакопейные статьи и прошедших государственные испытания.

Все тест-системы имеют утверждённые фармакопейные статьи и разрешены к применению приказами Минздрава РФ.

Тест-система “РекомбиБест-анти-ВГС” успешно прошла испытания в Болгарии (показала результаты, сопоставимые с зарубежными диагностикумами), в Бразилии, Китае и Польше.

Тест-система “РекомбиБест анти-ВГС” представляет собой двухпланшетный набор и используется для массового скрининга. Набор рассчитан на 192 анализа, включая контроли. Диагностикум предназначен для выявления антител (класса IgG) в сыворотке (плазме) крови доноров и для дифференциальной диагностики вирусных гепатитов.

ПЦР диагностика гепатита С

Это исследование крови, позволяющее выявить непосредственно генетический материал вируса гепатита (каждый вирус -- это одна частица РНК).

Качественный анализ указывает на наличие вируса в крови. Данный тест необходимо проводить всем пациентам, у кого обнаружены антитела к гепатиту С. Его результат может быть «обнаружено» или «не обнаружено». Референсные значения (значение, которое должно быть в норме) -- «не обнаружено». Результат «обнаружено» может свидетельствовать о том, что вирус размножается и инфицирует все новые клетки печени.

Стоимость ПЦР анализа составляет от 1000 руб. до 5000 руб., выполняется от одних суток до недели.

Стоимость ПЦР зависит от применяемых реактивов.

Срок выполнения анализа, зависит от количества пациентов и от вида возбудителя, так например для выявления вируса гепатита С требуется 24 часа, а для выделения возбудителя хламидийной инфекции 36 часов.

Кроме метода ПЦР для выявления РНК ВГС также используется метод транскрипционной амплификации (ТМА), обладающий лучшей чувствительностью, однако этот метод в России пока не распространен.

Количественный анализ ПЦР (вирусная нагрузка) -- это тест на концентрацию вируса (виремию) в крови.

Вирусная нагрузка -- это количество единиц генетического материала (вирусной РНК), которая присутствует у Вас в определенном объеме крови (обычно это 1 мл, что соответствует 1 кубическому сантиметру).

Это количество выражается в цифрах, единицы измерения МЕ/мл (международные единицы на миллилитр).

РЕКОМЕНДАЦИИ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ДОСТОВЕРНЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ ПРИ ПОСТАНОВКЕ ИФА

Для правильного и точного проведения ИФА необходимо строго соблюдать инструкции по применению тест-системы, соблюдение сроки и условия хранения наборов и отдельных компонентов тест-систем. Так же необходимо проводить периодический контроль работы оборудования, исключить возможности смешивания компонентов из наборов разных серий.

При проведении ИФА лаборант должен быть внимателен и сосредоточен.

Так как ИФА-тест- системы предусматривают одновременную работу с большим количеством исследуемых образцов, возможна путаница при их внесении в лунки планшета. Для того чтобы свести к минимуму такую возможность, рекомендуется перед началом анализа заполнить протокол исследования (рис.3), в котором на схеме планшета отразить предполагаемую последовательность внесения образцов.

Такая схема поможет лаборанту контролировать себя в ходе работы.

По окончании исследования в протокол рекомендуется также внести результаты анализа (например, вклеить распечатку с принтера спектрофотометра). Таким образом, Вы получите документ, удобный для сохранения информации о проведённом исследовании.

КОНТРОЛЬ РАБОТЫ ОБОРУДОВАНИЯ

1. Автоматические пипетки.

Допустимая погрешность измерения объёмов автоматическими пипетками при выполнении ИФА -- 5 %. Ежемесячно необходимо проводить контроль точности работы пипетки.

2. Термостаты.

Показания внешнего термометра, встроенного в термостат, (при наличии такового) иногда могут не соответствовать истинной температуре на полках прибора. Поэтому необходимо периодически проводить контроль работы термостата, помещая ртутный термометр внутрь его камеры на том уровне, где обычно размещают планшеты.

Допустимые отклонения -- ±2 °С.

3. Автоматические промыватели планшетов (вошеры).

Все лунки планшета должны равномерно заполняться промывающим раствором в требуемом объёме и полностью опорожняться.

Для предупреждения возможности некачественной работы автоматических и ручных промывателей необходимо ежедневно по окончании работы промывать их дистиллированной водой.

4. Спектрофотометры планшетные (ридеры, иммуноферментные анализаторы).

Спектрофотометры используются для получения количественной оценки результатов анализа, поэтому они подлежат периодическому (не реже одного раза в год) контролю.

В повседневной практике ИФА нужно помнить о том, что спектрофотометру для выхода на рабочий режим необходим прогрев.

5. Дистилляторы.

Дистиллированная вода -- единственный компонент, который не входит в состав диагностического набора.

Необходимо регулярно измерять значение рН дистиллированной воды, которое должно быть в пределах 5-5,5 ед.

Причинами несоответствия рН данным значениям могут быть:

· чрезмерно сильный напор воды, не позволяющий пройти цикл очистки;

· загрязнение (пророст) шлангов и бутыли, в которую собирается вода;

· загрязнение самого дистиллятора.

Для предотвращения этих причин необходимо отрегулировать поток воды. Регулярно (каждые 2-3 дня) тщательно промывать шланги и ёмкость для сбора дистиллированной воды.

ПРОФИЛАКТИКА

Нерешенность проблемы терапии ВГС дополнительно обуславливает первостепенное значение предупреждения его развития.

Парентеральный механизм заражения и множественность путей передачи определяют общность программы профилактических мероприятий при всей группе сывороточных гепатитов.

При ВГС особенно актуальны мероприятия, направленные на предупреждение пострансфузионного заражения. К ним относится, прежде всего, неукоснительное выполнение предусмотренной системы отбора доноров.

Факторами передачи ВГС могут явиться гемоконцентраты - VШ и IX факторы свертывания крови, столь необходимые больным гемофилией. Нарушение технологии их приготовления и недостаточная инактивация вирусов нередко приводит к заражению.

Обязательное тестирование на анти-HCV препаратов крови в значительной мере блокировало возможность пострансфузионного заражения.

Принципиально важен поиск путей предупреждения заражения HCV у наркоманов с внутривенным введением наркотиков. Это сложная социальная проблема.

3-й путь профилактики - повышение невосприимчивости населения при HCV, в отличие от HBV, решения пока не получил.

Трудности создания вакцины против HCV определяются генетической гетерогенностью HCV: огромным количеством генотипов и субтипов. В разных странах мира ведутся интенсивные исследования по созданию вакцины против ВГС.

Таким образом, несмотря на многочисленные работы по исследованию вирусологических клинических особенностей вирусного гепатита С, остаются нерешенными вопросы ранней диагностики, лечения и путей распространения острых и хронических форм HCV инфекции.

ГЛАВА 2 МЕТОДЫ СКРИНИГ-ОБСЛЕДОВАНИЙ ДОНОРОВ НА ГЕМОТРАНСМИССИВНЫЕ ИНФЕКЦИИ (ГЕПАТИТ С)

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ

Моя практическая работа была направлена на изучение методов выявления маркеров гемотрансмиссивных инфекций (гепатит С) у доноров.

По статистике за 2013 год в РФ показатель заболеваемости острыми вирусными гепатитами (ОВГ) составил - 12,2 случаев на 100 тысяч населения, что выше уровня 2012 года в 3,5 раза (4,6 на 100 тысяч населения).

Показатель на 100 тыс. населения составил в Красноярском крае - 1,26) (http://ru42.fmbaros.ru/activities/sancondition/index.php?id_4=3196&print=1

Доклад о санитарно-эпидемиологической обстановке на территории ЗАТО г. Зеленогорск за 2013 год).

Последнее время по неофициальным источникам в РФ зарегистрировано много случаев инфицирования людей после гемотрансфузии.

Таким образом, исследование доноров на гемотрансмиссивные инфекции имеет большое значение.

Очень важно, так же, соблюдение правил подготовки гемокомпонентов, в частности проведение карантина крови и ее компонентов.

Цель карантинизации - получение вирусобезопасной донорской плазмы в условиях выдержки ее в замороженном состоянии при температуре - 40 градусов С, в течении вероятного серонегативного периода (6 месяцев) и изъятия брака плазмы по результатам исследования донорской крови при последующих плазмадачах.

Часто, по разным причинам, кровь не прошедшая карантин, попадает к реципиентам и это становится причиной заражения последних гемотрансмиссивными инфекциями, такими как гепатит С.

Например, 15 апреля 2013 года, в Санкт- Петербурге годовалой девочке экстренно сделали переливание крови, после чего выяснилось, что эта кровь была получена от ВИЧ инфицированного донора. «Со станции переливания крови должна приходить специальная бумага - извещение о том, что кровь может быть использована. Для детей специальная ускоренная программа идет, так как детям нужна свежая кровь экстренно. Врач, воспользовавшись программой, спешил и не совсем внимательно посмотрел. При более внимательном использовании программы было видно, что кровь эта плохая, и так получилось, что ребенку перелили инфицированную кровь», - рассказала старший помощник прокурора Санкт-Петербурга Марина Николаева. (http://www.1tv.ru/news/health/230863)

Моя работа была направлена на то, чтобы:

1. Изучить методы скрининг обследований доноров на гемотрансмиссивные инфекции (гепатит С)

2. Выяснить насколько соблюдаются правила подготовки гемокомпонентов к безопасной гемотрансфузии.

Я проходила практику в Красноярском краевом центре крови №1.

Нормативные документы, регламентирующие работу лабораторий в Красноярском краевом центре крови №1:

- СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности и возбудителями паразитарных болезней»

- СП 3.1.958-00 «Профилактика вирусных гепатитов. Общие требования к эпидемиологическому надзору за вирусными гепатитами»

- Приказ МЗ РФ от 30.07.2001 г. №292 «О применении в практике здравоохранения иммуноферментных тест-систем для выявления поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg) и антител к вирусу гепатита С (анти-ВГС) в сыворотке крови человека»

- Федеральный закон от 20.07.2012 N 125-ФЗ (ред. от 04.06.2014, с изм. от 06.04.2015) "О донорстве крови и ее компонентов"

Поправки к этому закону отменили платное донорство, для того чтобы снизить количество доноров из группы риска заражения гемотрансмиссивными инфекциями, т.к за вознаграждение, кровь сдавали неблагополучные слои населения (наркоманы, алкоголики, люди без определенного места жительства). Поэтому было принято решение о том, что донорство должно быть безвозмездным.

Для выявления зараженной гепатитом С крови в Красноярском краевом центре крови №1 используют методы иммуноферментного анализа (ИФА), полимеразной цепной реакции (ПЦР) и иммунофлюоресцентного анализа.

Для выявления антител к гепатиту С методом ИФА используется набор реагентов «Бест анти-ВГС-спектр».

Бест анти-ВГС-спектр представляет собой набор реагентов, основой которого являются рекомбинантные антигены ВГС.

Основным свойством набора является способность выявлять в сыворотках (плазме) крови человека антитела( IgG и IgM) к разным антигенам ВГС за счет их взаимодействия с антигенами, иммобилизированными на поверхности лунок планшета.

Образование комплекса «антиген-антитело» выявляют с помощью иммуноферментного коньюгата.

При работе с исследуемыми сыворотками и контрольными образцами следует соблюдать меры предосторожности, принятые при работе с потенциально инфекционным материалом:

- работать в резиновых перчатках

- не пипетировать растворы ртом

- все использованные материалы дезинфицировать в соответствии с требованиями СП 1.3.2322-08 и МУ - 287-113

Так же необходимо тщательно соблюдать описанные ниже требования, для избегания искажения результатов ИФА.

- Для приготовления растворов и проведения ИФА следует использовать чистую мерную посуду и автоматические пипетки с погрешностью не более 5%.

- Желательно использовать свежеотобранные образцы сыворотки (плазмы) крови. Допускается использование образцов, хранившихся при 2-8 °C не более 5 суток.

- Сыворотки, содержащие взвешенные частицы, могут дать неправильный результат. Такие образцы перед использованием следует центрифугировать 10-15 минут при 3000 об/мин.

- Нельзя использовать проросшие, гемолизированные, гиперлипидные сыворотки или подвергавшиеся многократному замораживанию и оттаиванию.

- Перед постановкой реакции все компоненты тест-системы необходимо выдержать не менее 30 мин при комнатной температуре.

- Лиофилизированные компоненты должны быть восстановлены, как минимум, за 15 минут до их использования.

- Растворы тетраметилбензидина (ТМБ) и коньюгата в рабочем разведении готовить непосредственно перед использованием. Необходимо исключить воздействие прямого света на ТМБ.

- При промывке лунки (стрипа,планшета) заполнять полностью, не допуская переливания промывочного раствора через края лунок, и не касаясь лунок наконечником пипетки. Время между заполнением и опорожнением лунок должно быть не менее 30 секунд.

- При использовании автоматического или ручного промывателя необходимо следить за состоянием емкости для промывочного раствора и соединительных шлангов: в них не должно быть «заростов». Раз в неделю желательно емкость для промывочного раствора и шланги промывать 70% спиртом.

- Не допускать высыхания лунок стрипов между отдельными операциями.

- При постановке ИФА нельзя использовать компоненты из наборов разных серий или смешивать их при приготовлении растворов.

- Запрещается повторно использовать планшет для предварительного нанесения сывороток.

- При приготовлении растворов и проведении ИФА следует использовать одноразовые наконечники для дозаторов.

- Посуду (ванночки), используемые для работы с растворами коньюгата и ТМБ, не обрабатывать дезинфицирующими растворами и моющими средствами.

Регистрация оценка результатов.

Результаты ИФА регистрировать с помощью спектрофотометра, измеряя оптическую плотность.

Для интерпретации результатов исследования использовать коэффициент позитивности (КП), который считается для каждого антигена.

Если КП для каждого антигена меньше 1, исследуемый образец расценивать как отрицательно реагирующий и не имеющий антител.

Результаты анализа считать положительными, если значение КП ?1.

КП удобная и простая величина для наблюдения заболевания в динамике.

В различных лабораториях используются разные тест- системы и методы выявления антител в гепатиту С, с разными реактивами и на разных анализаторах.

От оборудования и тест- систем , иногда зависит точность результатов.

Для того, чтобы проанализировать различные тест-системы, используемые в лабораториях города приведена таблица взятая с сайта Красноярской краевой ассоциации лабораторной диагностики (http://www.clinlab.ru/win/Krasnojarsk/default.htm; olhkset@online.ru - Ольховский Игорь Алексеевич, исполнительный директор Красноярской краевой АМЛД).

Таблица 1- Сравнительная оценка тест-систем ИФА на антитела к вирусу гепатита С

1. Критерии “технологичности”
Наименование т/системы и производитель	Срок годности ( мес)	Кратность предварительного разведения сыв-ток	Кратность и количество отмывок	Общая длительность процедуры инкубации	Количество контрольных лунок	Отношение ОП контроля (+) к контролю (-)	Итоговый рейтинг
ВГС-ДСМ (к.2) ЗАО МБС (Новосибирск)	6	2,5	3/11	95	7	5	8
ГепаСкрин -ДСМ- стрип(к.1) ЗАО МБС (Новосибирск)	4	5	3/11	95	7	5	10
ИФА-антиHCV НПК Препарат (Н-Новгород)	6	6	3/11	75	4	5	2
ИФА- анти ВГС Имбио (Н-Новгород)	6	20	3/11	60	6	5	1
Гепа-скрин? (к.2) ЗАО Вектор-МайСтар (Новосибирск)	4	10	3/15	85	5	3	11
ИФА- антиHCV Диагностические системы (Н-Новгород)	4	5	3/9	80	8	4	9
ГепаСтрипС Ниармедик (Москва)	9	10	2/10	120	5	4,2	3
Рекомби-Бест анти ВГС ЗАО Вектор-Бест (Новосибирск)	6	10	3/11	80	5	4	5
ИФА- анти ВГС НПП Аквапаст (С-Петпрбург) и Имбио (Н-Новгород)	6	6	3/12	95	5	6,6	6
ВГС-ДСМ (к.1) НИКТИ БАВ (Бердск)	6	6	3/12	95	5	6,6	7
HCV-Ab Лабметод (Москва)	18	100	2/12	105	4	4	4

2. Критерии надежности и качества
Наименование т/системы и производитель	№ серии	Количество тестируемых сывороток	Чувствительность	Специфичность	Диагностическая эффективность	Итоговый рейтинг
ВГС-ДСМ (к.2) ЗАО МБС (Новосибирск)	22	174	91,66	100	95,40	3
ГепаСкрин -ДСМ- стрип(к.1) ЗАО МБС (Новосибирск)	19	89	90,0	93,10	91,01	6
ИФА-антиHCV НПК Препарат (Н-Новгород)	11	174	85,41	100	91,95	7
ИФА- анти ВГС Имбио (Н-Новгород)	6	174	47,91	98,71	70,69	11
Гепа-скрин? (к.2) ЗАО Вектор-МайСтар (Новосибирск)	60	174	79,16	98,71	87,93	9
ИФА- антиHCV Диагностические системы (Н-Новгород)	12	89	76,66	96,55	83,15	10
ГепаСтрипС Ниармедик (Москва)	131098	127	98,68	97,56	98,43	1
Рекомби-Бест анти ВГС ЗАО Вектор-Бест (Новосибирск)	211	174	93,75	98,71	95,98	2
ИФА- анти ВГС НПП Аквапаст (С-Петербург) и Имбио (Н-Новгород)	14	85	94,4	93,87	94,12	4
ВГС-ДСМ (к.1) НИКТИ БАВ (Бердск)	26	85	94,29	98,0	92,13	5
HCV-Ab Лабметод (Москва)	Е2000 СВ	85	77,77	95,91	88,24	8

Анализируя таблицу можно сделать вывод, что в Красноярском краевом центре крови №1 используются тест-системы, которые обладают высокой специфичностью и чувствительностью.

Чувствительность- это способность диагностического метода давать правильный результат, который определяется как доля истинно положительных результатов среди всех проведенных тестов.

Специфичность - это способность диагностического метода не давать при отсутствии заболевания ложноположительных результатов, который определяется как доля истинно отрицательных результатов среди здоровых лиц в группе исследуемых.

Так же результаты ИФА зависят от фазы течения заболевания.

Таблица 2- ИФА диагностика гепатита С

ИФА-диагностика гепатита С
Варианты	Анти- IgM	Анти- core-IgG	Анти- NS-IgG	Интерпретация результатов ИФА
I	+	+	-	Возможно, острый гепатит С
II	-	+	-	1. Выздоровление (пастинфекция) 2. Стадия перехода в ХГС (латентную фазу)
III	-	+	+	1. Выздоровление (пастинфекция) 2. Латентная фазаХГС
IV	+	+	+	1. Обострение в латентнуюфазуХГС 2. Фаза реактивацииС

Критерии разграничения фаз заболевания необходимо рассматривать только в совокупности и в динамике, так как близкие результаты разовых исследований могут соответствовать как острой, так и хронической стадии инфекционного процесса.

Важное значение имеет предположительный учёт давности болезни.

Если результаты ИФА сомнительны, используется метод ПЦР диагностики. ИФА и ПЦР применяются в соотношении 50/50.

Т.к метод ПЦР диагностики является дорогостоящим, его применяют только для подтверждения и проверки результатов ИФА.

Одним из самых современных методов выявления инфицированности образцов донорской крови является метод ПЦР диагностики - полимеразная цепная реакция.

Исследование методом ПЦР имеет ряд преимуществ перед привычными способами, так как данный метод ПЦР диагностики позволяет специфично увеличивать (амплифицировать) в сотни раз участок ДНК возбудителя заболевания в исследуемом образце.

Теоретически метод ПЦР диагностики позволяет обнаружить даже единственную копию чужеродной ДНК в образце, что позволяет говорить об отсутствии у него предела чувствительности.

Кроме высокой чувствительности, исследование методом ПЦР имеет абсолютную специфичность, то есть если метод ПЦР диагностики выполнен правильно, то он не дает ложноположительных результатов. Таким образом, чтобы выявить возбудителя и определить его природу более точно, нужно вместе с обычными анализами сдать анализ ПЦР.

Еще один метод выявления инфицированных доноров-иммунофлюоресцентный анализ, или реакция иммунофлюоресценции (РИФ).

Основан на взаимодействии антигенов с антителами, но реагент при этом помечен красителем, светящимся в ультрафиолетовых лучах. Светящиеся комплексы антиген-антитело хорошо видны при флюоресцентной микроскопии. Анализ проводят тремя способами:

1. Прямая реакция иммунофлюоресценции

Анализ предназначен для определения антигенов. К исследуемому материалу добавляют люминесцентные сыворотки, содержащие меченые антитела. Образовавшиеся иммунные комплексы выявляют с помощью флюоресцентного микроскопа.

2. Непрямая реакция иммунофлюоресценции

Анализ проводят для выявления антител к определенному антигену. Реагентом является немеченый антиген, который связывается с антителами, содержащимися в исследуемом материале.

Затем добавляют реагент с мечеными антиантителами, т. е. антииммуноглобулинами. Иммунные комплексы взаимодействуют с ними и светятся при микроскопии.

3. Конкурентная реакция иммунофлюоресценции

Анализ назначают для выявления антигенов. Реагентом являются антитела, к которым добавляют исследуемый материал с антигенами и дополнительный реагент (стандартные меченые антигены).

Меченые антигены вступают в реакцию с антителами в первую очередь, конкурируя, таким образом, с немечеными антигенами. Образовавшиеся иммунные комплексы светятся при микроскопии, причем по их количеству можно определить содержание антигена в исследуемом материале.

Помимо аналитической работы, я выполняла другие методики, используемые при обследовании доноров.

Название исследования	Количество проб
Определение группы крови прямой реакцией с помощью моноклональных цоликлонов	120
Определение резус -фактора с помощью моноклонального цоликлона	120
Определение антигена системы Kell с помощью моноклонального цоликлона	120
Центрифугирование проб, отделение сыворотки крови для биохимического исследования	80
Постановка СОЭ в анализатор	20
Исследование крови на анализаторе (Hb, er, tr, лейкоциты)	80

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

скрининг обследование донор гепатит

Вирус гепатита С попадает в кровь парентеральным путем (кровь и ее препараты, гемотрансфузии.). При проведении гемотрансфузий существует высокий риск инфицирования гемотрансмиссивными инфекциями.

Для профилактики и диагностики гепатита С у доноров, в Красноярском краевом центре крови №1 используется достаточно много взаимозаменяемых и дополняющих методов, таких как ИФА, ПЦР и иммунофлюоресцентный анализ. Они отличаются высоким уровнем специфичности и чувствительности.

Так же проводятся мероприятия для снижения риска передачи возбудителей гемотрансмиссивных инфекций, путем проведения карантина крови, проведения скрининговых обследований доноров на гемотрансмиссивные инфекции и путем привлечения к донорству людей, регулярно проходящих медицинские осмотры (студенты, рабочие, медицинские работники).

Так же я изучила преимущества и недостатки методов ИФА и ПЦР.

На результат иммуноферментного анализа влияют различные факторы:

-Фаза течения заболевания

- Используемые реактивы (серия, производитель)

Но метод ИФА является более доступным для массовых обследований, в отличии от ПЦР диагностики, которая является дорогостоящей, но дает более точные и четкие результаты, без влияния на них различных факторов.

Для ПЦР-анализа пригоден любой материал, в том числе и гистологические препараты. Количество исследуемого материала, как правило, составляет несколько десятков микролитов.

Высокая чувствительность метода позволяет контролировать эффективность проводимого лечения.

Но наряду с достоинствами имеется определённый недостаток, который можно охарактеризовать как технологический.

Подразумеваются повышенные требования к оснащению лаборатории, качеству тест-наборов и строжайшее соблюдение регламента исследования во избежание получения ложных результатов.

Решение проблемы качества анализов возможно при соответствующей квалификации персонала и обязательной сертификации лаборатории.

Различные тест- системы обладают разной чувствительностью и специфичностью, а от них в свою очередь зависит точность и правильность анализа. Это особенно важно при скрининг обследованиях доноров, больных гемотрансмиссивными инфекциями, на ранних стадиях.

Проходя практику в Красноярском краевом центре крови №1 я убедилась, что реактивы, используемые там, для скрининга доноров, являются высокочувствительными и специфичными.

ОБЗОР ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Вирусные гепатиты: клиника, диагностика, лечение

АвторыН. Д. Ющук, Е. А. Климова, О. О. Знойко, Г. Н. Кареткина, С. Л. Максимов, И. В. Маев

Библиография: Вирусные гепатиты : клиника, диагностика, лечение / Н. Д. Ющук, Е. А. Климова, О. О. Знойко, Г. Н. Кареткина, С. Л. Максимов, И. В. Маев. - М. : ГЭОТАР-Медиа, 2014. - 160 с. (Библиотека врача-специалиста).

Год издания:2014

2. http://medi.ru/doc/15b1801.htm

Вирусные гепатиты в России: официальная статистика и экономические потери

И.Л. Шаханина, О.И. Радуто

Центральный НИИ эпидемиологии МЗ РФ, Москва

3. http://simptomed.ru/articles/gepatit_s-legko_zarazitsya_i_vozmozhno_li_vilechitsya

Гепатит С - легко заразиться, и возможно ли вылечиться?

4. http://www.hv-info.ru/info/statyi/gepatit-s/69-2015-02-14-10-47-02.html

Гепатит С хронический. Проблема и ее решение.

5. http://www.protivgepatita.ru/

Межрегиональная общественная организация

содействия пациентам с вирусными гепатитами

6. http://www.hcv.ru/hepatits/index.html

7. http://simptomed.ru/articles/gepatit_s-legko_zarazitsya_i_vozmozhno_li_vilechitsya

8. Инфекционные болезни у детей

АвторыУчайкин В.Ф., Нисевич Н.И., Шамшева О.В.

Библиография:Инфекционные болезни у детей: учебник. Учайкин В.Ф., Нисевич Н.И., Шамшева О.В. 2013. - 688 с.: ил.

Год издания:2013

9. http://vseopecheni.ru/gepatit/Gepatit-S/

10. http://www.profiz.ru/sec/4_2009/gepatit_C/ -Распространение гепатита С в России становится социальной проблемой

Петр Григорьевич ДЕРЯБИН, лауреат Государственной премии России, профессор, заместителя директора НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН

11. http://www.who.int/ru/ - ВОЗ

12. http://www.gepatit.com/c/

13. Инфекционные болезни и эпидемиология

Авторы Покровский Валентин Иванович, зав. кафедрой эпидемиологии ММА им. И.М. Сеченова, проф., акад. РАМН Пак Сергей Григорьевич, зав. кафедрой инфекционных болезней ММА им. И.М. Се ченова, проф., член-корр. РАМН, заслуженный деятель науки РФ Бойко Николай Иванович, проф. кафедры эпидемиологии ММА им. И.М.Сеченова Данил кии Борис Кириллович, доц. кафедры инфекционных болезней ММА им. И.М. Сеченова

14. Инфекционные болезни и эпидемиология: Учебник / В.И. Покровский, С.Г. Пак, Н.И. Брико, Б.К. Данилкин. - 2-е изд. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2007. - 816 с.: ил.

15. Схемы лечения. Инфекции / Под ред. С. В. ЯковлеC92 ва. -- М.: Литтерра, 2005. -- 288 с. -- (Серия «Схемы лечения»).

16. http://www.remedium.ru/drugs/detail.php?ID=64327

Современная диагностика гепатита С и интерпретация результатов выявления маркеров инфицирования

17. http://patologii.net/89-etiologiya-virusnyh-gepatitov-virusy-v-etiologii-gepatitov.html

18. http://www.vector-best.ru/publ/doc/gepat_c.htm

ПРИЛОЖЕНИЕ 1

Рисунок 3- Набор реагентов для определения антител ВГС иммуноферментным методом

ПРИЛОЖЕНИЕ 2

Рисунок 4-анализатор для постановки СОЭ

ПРИЛОЖЕНИЕ 3

Рисунок 5

Рисунок 5, 6- анализатор для иммунофлюоресцентного метода исследования, используемый в Красноярском краевом центре крови №1

ПРИЛОЖЕНИЕ 4

Приложение N 1

к Правилам клинического использования

донорской крови и (или) ее компонентов,

утвержденным приказом Министерства

здравоохранения Российской Федерации

от 2 апреля 2013 г. N 183н

Рекомендуемый образец

Протокол трансфузии (переливания)

донорской крови и (или) ее компонентов

1. Ф.И.О. реципиента: _______________ N медицинской карты: ________________

2. Дата трансфузии (переливания) донорской крови и (или) ее компонентов: "__" _______________ 20__ г.

3. Время начала трансфузии (переливания) донорской крови и (или) ее компонентов реципиенту: _______________________________________

4. Время окончания трансфузии (переливания) донорской крови и (или) ее компонентов реципиенту: ______________________________________

5. Группа крови реципиента: ____________________________________

6. Резус-принадлежность: ______________________________________

7. Фенотип: ________________________________________________

8. Определение резус-принадлежности реципиента проводилось:

в лаборатории/экспресс-методом: __________________________

9. Исследование антител выявлены/не выявлены: ____________

10. Медицинские показания к проведению трансфузии (переливания) донорской крови и (или) ее компонентов: ______________________________________________________________________________________ Hb __________ Ht ________________

11. Трансфузионный анамнез: трансфузии были/не были: ______________________

12. Трансфузии по индивидуальному подбору в прошлом: были/не были ____________________________________________________________________________________

13. Реакции и (или) осложнения, возникшие у реципиента в связи с трансфузией (переливанием) донорской крови и (или) ее компонентов: ___________________________________________________________________________________

14. Акушерский анамнез (количество беременностей): ________________________

15. Особенности течения (самопроизвольные аборты, гемолитическая болезнь новорожденного и другое): ______________________________________________________________________________________________________________

16. Макроскопическая оценка крови и (или) ее компонента: пригодна к переливанию/не пригодна к переливанию: ________________________________________________________________________________________________

17. Данные с этикетки контейнера с кровью и (или) ее компонентом: _________

18. Наименование компонента крови: ________________________________________

19. Наименование организации, заготовившей донорскую кровь и (или) ее компоненты: _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

20. Дата заготовки донорской крови и (или) ее компонентов: ________________

21. Срок годности донорской крови и (или) ее компонентов: _________________

22. N контейнера донорской крови и (или) ее компонентов: __________________

23. Объем донорской крови и (или) ее компонентов (мл): ____________________

24. Код донора крови и (или) ее компонентов (ФИО донора): _________________

25. Группа крови донора крови и (или) ее компонентов: _____________________

26. Резус-принадлежность донора крови и (или) ее компонентов: _____________

27. Перед трансфузией (переливанием) донорской крови и (или) ее компонентов проведены контрольные проверки показателей:

Группа крови реципиента ___________ Резус-принадлежность реципиента _______

Группа крови донора <*> _________ Резус-принадлежность донора <*> _________

28. При определении показателей использовались реактивы ______________________________________________________________________________________________ (наименование с указанием серии и срока годности)

29. Проведены пробы на индивидуальную совместимость <*>: ______________________________________________________________________________________________________________________________________________________ указать метод, используемые реактивы (наименование, серию, срок годности), результат проведения каждой пробы

30. Биологическая проба: __________________________________________________ указать метод, результат проведения пробы

31. Способ трансфузии (переливания) донорской крови и (или) ее компонентов: ___________________________________________________________________________

32. Осложнения во время трансфузии (переливания) донорской крови и (или) ее компонентов: ______________________________________________________________

33. Наблюдение за состоянием реципиента:

	Артериальное давление, мм. рт.ст.	Частота пульса, уд./мин.	Температура, °C	Диурез, цвет мочи
Перед переливанием
Через 1 час после переливания
Через 2 часа после переливания
<**> Через 3 часа после переливания

34. Врач, проводивший трансфузию (переливание) донорской крови и (или) ее компонентов: _________________________________________________________

(ФИО) (подпись)

<*> Указывается при проведении трансфузии (переливания) эритроцитсодержащих сред.

<**> Указывается при проведении трансфузии (переливания) донорской крови и (или) ее компонентов в амбулаторных условиях.

Размещено на Allbest.ru