Определение содержания копропорфиринов в моче

Размещено на http://www.allbest.ru/

МИНОБРНАУКИ РОССИИ

Санкт-Петербургский государственный электротехнический университет

«ЛЭТИ» им. В.И. Ульянова (Ленина)

Кафедра БТС

Курсовой проект

по дисциплине «Медицинские приборы, аппараты, системы и комплексы»

Тема: Определение содержания копропорфиринов в моче

Студент гр. 2081 Глушенко И.В.

Преподаватель Садыкова Е.В.

Санкт-Петербург 2016



СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

1. ВИД АНАЛИЗА, ПОДЛЕЖАЩИЙ ПРИБОРНОМУ ОСНАЩЕНИЮ

2. ПРОЦЕДУРА АНАЛИЗА

3. СТРУКТУРНАЯ СХЕМА РАЗРАБОТАННОЙ СИСТЕМЫ С ПОЗИЦИИ БТСЛА

4. КРИТЕРИИ ДЛЯ ВЫБОРА АНАЛИЗАТОРА

5. МЕТОД ИЗМЕРЕНИЯ И ПЕРВИЧНЫЙ ПРЕОБРАЗОВАТЕЛЬ

6. ЦЕПЬ ВТОРИЧНЫХ ПРЕОБРАЗОВАТЕЛЕЙ

7. РЕГИСТРАЦИЯ, ОТОБРАЖЕНИЕ И ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ИНФОРМАЦИИ

8. ПУТИ АВТОМАТИЗАЦИИ ПРОЦЕССА АНАЛИЗА

9. ИСТОЧНИКИ ОШИБОК

10. СПОСОБ ПОВЕРКИ АНАЛИЗАТОРА

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ



ВВЕДЕНИЕ

Порфирины представляют собой циклические соединения, образованные четырьмя пиррольными кольцами, связанными между собой метенильными мостиками [3].

Встречающиеся в природе порфирины являются соединениями, у которых восемь атомов водорода порфиринового ядра замещены боковыми группами, строение и относительное расположение которых, определяют отличие порфиринов друг от друга рис. 1.1 [5].

Рис. 1.1 Молекулярная структура некоторых порфиринов

Изомеров копропорфиринов типа III больше чем типа I так, как биологически важные порфирины, гемоглобин, миоглобин и т.д., являются изомерами типа III.

Самый большой клинический интерес из всех порфиринов представляют копропорфирины и уропорфирины, так как при порфириях наблюдается значительное увеличение экскреции этих соединений. Экскреция копропорфирина также увеличивается при лейкозах, анемиях, заболеваниях печени, ожогах, инфекционных заболеваниях, выраженном дефиците железа, при отравлениях мышьяком, этанолом, свинцом.

Копропорфирины растворимы в смеси эфира и ледяной уксусной кислоты. Уропорфирины в этой смеси нерастворимы, но частично растворимы в этилацетате. Полученные растворы при облучении УФ дают характерное красное флуоресцентное свечение. Эти свойства копропорфиринов можно использовать для количественного определения содержания их в моче.

Максимум поглощения всех порфиринов находится около 400нм. Спектр флуоресценции сильно зависит от величины pH раствора. При pH?6 один из максимумов интенсивности флуоресценции копропорфирина III приходится на 690нм.



1. ВИД АНАЛИЗА, ПОДЛЕЖАЩИЙ ПРИБОРНОМУ ОСНАЩЕНИЮ

моча анализатор флуоресценция копропорфирин

Вид анализа.

Определение содержания копропорфиринов в моче.

Название анализатора.

Флуориметр.

Назначение анализатора.

Для измерения флуоресценции раствора копропорфиринов.

Область применения анализатора.

Применяется для определения концентрации компонентов биологических жидкостей и клеток, основанный на измерении интенсивности флуоресцентного излучения при оптическом воздействии на жидкую биологическую пробу с последующей обработкой результатов [1].

Группа.

Внутренняя, флуориметрия.

Тип пробы.

Биологическая. Моча человека.

2. ПРОЦЕДУРА АНАЛИЗА

Материалы и реактивы необходимые для определения содержания копропорфиринов в моче представлены в таблице 2.1.

Таблица 2.1 Перечень используемых материалов и реактивов при проведении анализа

№	Наименование	Состав	Объём
1	Проба	утренняя моча	5мл
2	Ледяная уксусная кислота	СН3СООН	0,2мл
3	Диэтиловый эфир	(C2H5)2O	5мл



Дополнительное оснащение, оборудование и материалы для проведения этого анализа сведены в таблицу 2.2.

Методика проведения анализа описана в таблице 2.3.

Таблица 2.2 Перечень дополнительного оснащения (оборудования) и материалов для проведения анализа

№	Наименование	Характеристики	Применение
1	Набор пипеток	Объём дозирования 0,2мл, 2мл, 5мл	Для дозирования проб и реагентов, для отбора супернатанта
2	Пробирки с притёртой пробкой	Объём пробирки 15-20мл	Для проведения реакции
3	Мешалка (можно заменить энергичным ручным встряхиванием)	Тип мешалки любой (возможность работы с пробирками из №2), частота встряхиваний/колебаний не менее 60 в минуту	Для проведения реакции
4	Кювета спектрофотометрическая ПС	10х10х45мм	Для проведения измерения
5	Флуориметр		Для проведения измерения
6	Калибратор	Проба или искусственный материал с известным содержанием копропорфирина	Для нахождения зависимости флуоресценции от содержания копропорфирина

Таблица 2.3 Группы операций и преобразований лабораторного исследования

Этап	Группа	Содержание операций и преобразований	Объект преобр.	Примеры конкретных операций
Доаналитический	1	Подготовка к проведению анализа	Нет	Подготовить все реагенты и материалы, включить всё оборудование.
Аналитический	пробоподготовка	2	Мерные операции	БП, реагенты	1. Внести пипеткой в пробирку 5мл мочи. 2. Добавить в пробирку 0,2мл ледяной уксусной кислоты. 3. Внести пипеткой в пробирку 5мл диэтилового эфира. Плотно закрыть пробирку крышкой.
		3	Направленные воздействия, приводящие к изменениям свойств или агрегатного состояния вещества	БП, реагенты	1. Установить пробирку на мешалку. Запустить мешалку на 3 минуты. 2. Снять пробирку с мешалку и оставить для разделения реакционной смеси на 5 минут.
		4	Мерные операции	ПП, реагенты	Отобрать пипеткой 2мл супернатанта из пробирки и перенести его в кювету с крышкой.
Аналитический	контакт с ИП	5	Погружение ИП, заполнение реакционного объёма и т.п.	КПИВ	1. Возбуждение флуоресценции в супернатанте облучением его от источника света с длиной волны 405нм. 2. Приём светового потока на длине волны 690нм.
	измерение	6	Линейные и нелинейные преобразования, получение числового значения ФП	Сигналы ИП	Измерение интенсивности флуоресценции супернатанта.
Постаналитический	7	Обработка и интерпретация результатов	МБП	Зависимость флуоресценции от концентрации аналита заносится в память анализатора после калибровки с помощью двух калибраторов. Содержание аналита в пробе выдаётся исходя из этой зависимости.



3. СТРУКТУРНАЯ СХЕМА РАЗРАБОТАННОЙ СИСТЕМЫ С ПОЗИЦИИ БТСЛА

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 3.1 Структурная схема разработанной БТСЛА

Биологический объект - человек.

Биологическая проба - порция мочи.

Средство отбора пробы - стерильный контейнер для биопроб.

Средства пробоподготовки - реагенты, дозатор, мешалка.

Анализатор - флуориметр, длина волны возбуждения 405нм, длина волны флуоресценции 690нм.

Информационное устройство - экран анализатора или принтер.

Врач - лечащий врач.

Средство воздействия - лечение больного.



4. КРИТЕРИИ ДЛЯ ВЫБОРА АНАЛИЗАТОРА

Медицинские задачи.

Проведение профилактических осмотров работников вредных производств, важный этап обеспечения безопасности на производстве и охраны труда и здоровья работающих [2].

Определение концентрации копропорфиринов моче является самым быстрым и простым способом определения степени отравления свинцом или другими веществами. Повышение концентрации в моче происходит уже через пятнадцать минут после отравления.

Внешние условия эксперимента.

При проведении профосмотров анализ проводится в условиях клинико-диагностической лаборатории. При необходимости возможна эксплуатация в «полевых» условиях, для проведения экстренных анализов.

Технические средства.

Флуориметр в проходящем свете.

Уровень подготовки персонала.

Работать на анализаторе может любой медицинский работник, прошедший предварительное обучение работе на данном приборе.

5. МЕТОД ИЗМЕРЕНИЯ И ПЕРВИЧНЫЙ ПРЕОБРАЗОВАТЕЛЬ

Исследуемые характеристики объекта.

Определяется концентрация копропорфирина в моче.

Физический (физико-химический) принцип метода.

Флуоресценция - физический процесс, разновидность люминесценции. Флуоресценцией обычно называют излучательный переход возбуждённого состояния с самого нижнего синглетного колебательного уровня S₁ в основное состояние S₀ рис. 5.1 [4]



Рис. 5.1 Упрощённая диаграмма Яблонского.

Квантовый выход флуоресценции показывает, с какой эффективностью проходит данный процесс. Квантовый выход флуоресценции может быть рассчитан по формуле:

(5.1)

где Ц - квантовый выход флуоресценции;

Г и k_nr - константы скорости излучательной и безызлучательной дезактивации возбуждённого состояния.

Квантовый выход можно представить, как отношение количества испускаемых и поглощаемых фотонов. Тогда его формула выглядит так:

(5.2)

где N_em - количество испускаемых в результате флуоресценции фотонов;

N_abs - общее количество поглощаемых фотонов.

Методические приёмы, характерные для технической реализации данного метода исследования.



Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 5.2 Цепь первичных преобразований анализатора

Тип зондирующего воздействия и измерительный эффект.

Таблица 5.1 Преобразования пробы

Тип	№	Способ	Реализация
Воздействие на пробу	1	Механический	К пробе добавляются реагенты
	2	Механический и химический	Проба перемешивается с реагентами
	3	Механический	Смесь разделяется отстаиванием
	4	Механический	Отбирается супернатант
	5	Оптический	Облучается супернатант
Измерительный эффект	6	Оптический	Измеряется флуоресценция

Технические характеристики излучателя.

Таблица 5.2 Основные характеристики излучателя Ondax's SureLock™ 405nm [6]

Параметр	Минимум	Норма	Максимум	Единицы измерения
Выходная мощность		12/25/40		мВт
Длина волны излучения	404,5	405	405,5	нм
	405,5	406	406,5	нм
Рабочий ток		45/55/75	65/75/100	мА
Рабочее напряжение		5,4	6,5	В
Рабочая температура	0	25	60	єC

Рис. 5.3 Спектр излучения

Тип измерительного преобразователя.

Фотодиод с близкой к максимальной чувствительности на длине волны 690нм и минимальной на длине волны возбуждения 405нм.

Технические характеристики первичного преобразователя.

Таблица 5.3 Основные характеристики преобразователя VEMD5060X01 [7]

Параметр	Условия измерения	Значение	Единицы измерения
Прямое напряжение	Iпр=50 мА	0,8	В
Обратное напряжение	Iобр=100 мА; E=0	> 20	В
Обратный темновой ток	Vобр=10 В; E=0	0,2	нА
ЭДС	E=1 мВт/см2; л=950 нм	350	мВ
Ток КЗ	E=1 мВт/см2; л=950 нм	26	мкА
Максимум чувствительности		820	нм
Спектральный диапазон		350-1070	нм



Рис. 5.4 Спектральная чувствительность VEMD5060X01

6. ЦЕПЬ ВТОРИЧНЫХ ПРЕОБРАЗОВАТЕЛЕЙ

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 6.1 Структурная схема цепи вторичных преобразователей

Фотодиод преобразует падающий на него свет в электрический ток. Для дальнейшей обработки ток надо преобразовать в напряжение и усилить. Световой поток флуоресценции слабый, при высоком уровне возможных помех. Поэтому для усиления сигнала от фотодиода лучше всего подойдёт стандартная схема измерительного усилителя на трёх ОУ. Только её надо изменить с учётом того что измерять необходимо ток, а не напряжение. Изменённая схема представлена на рис. 6.2.



Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 6.2 Усилитель-преобразователь тока фотодиода

Для схемы на рис 6.2 зависимость выходного напряжения от тока фотодиода будет такой:

где V_вых - напряжение на выходе усилителя;

I_D - ток фотодиода.

Современная промышленность выпускает измерительные усилители на трёх ОУ со всеми резисторами обвязки в одном корпусе. Функциональная схема одного из таких усилителей показана на рис. 6.2 [8].



Рис. 6.2 Функциональная схема MAX4194

В анализаторе применён МК ATMega168 со встроенным АЦП.

Таблица 6.1 Основные характеристики АЦП ATMega168 [9]

Параметр	Значение
Разрядность	10 бит
Время преобразования	13-260 мкс
Входное напряжение	0-Vcc В
Опорное напряжение	1,1 В или внешний источник

Функциональная схема АЦП приведена на рис. 6.3.



Рис. 6.3 Функциональная схема АЦП ATMega168

7. РЕГИСТРАЦИЯ, ОТОБРАЖЕНИЕ И ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ИНФОРМАЦИИ

Измеряемый физический параметр.

Световой поток флуоресценции раствора копропорфиринов.

Итоговый медико-биологический показатель.

Содержание копропорфирина в моче выраженное в наномолях. Норма 50-350 нмоль в сутки.

Анализатор разрабатывается с возможностью работы не только в условиях КДЛ, но и в «полевых» условиях. Его конструкция максимально упрощена, а для питания прибора используются сменные батареи или аккумуляторы. Поэтому из устройств отображения информации предусмотрен только ЖК-экран. Встроенное печатающее устройство не применяется из-за большого энергопотребления, но есть возможность подключения внешнего принтера.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 7.1 Структурная схема анализатора

Все обозначения на структурной схеме анализатора сведены в таблицу 7.1.

Таблица 7.1 Спецификация структурной схемы

№	Обозначение на структурной схеме	Блок анализатора	Реализация
1	И	Монохроматический излучатель	Лазерный диод на 405нм
2	К	Кюветное отделение	Место для установки кюветы с защитой от внешнего освещения
3	Ф	Фильтр	Интерференционный фильтр на 690нм
4	Д	Фотоприёмник	Фотодиод
5	УП	Усилитель-преобразователь ток-напряжение	Измерительный усилитель на ОУ
6	АЦП	Аналогово-цифровой преобразователь	Модуль АЦП в микроконтроллере
7	ОУ	Устройство обработки и управления	Микроконтроллер
8	Э	Устройство отображения	ЖК-дисплей
9	БП	Блок питания	Импульсный преобразователь напряжения аккумуляторных батарей

8. ПУТИ АВТОМАТИЗАЦИИ ПРОЦЕССА АНАЛИЗА

Данный анализ невозможно автоматизировать так как в процедуре применяются ледяная уксусная кислота и диэтиловый эфир. Эти вещества, особенно диэтиловый эфир, требуют осторожности при обращении. Эфир легко испаряется, он пожаро- и взрывоопасен. Оба вещества представляют опасность для человека.

9. ИСТОЧНИКИ ОШИБОК

Таблица 9.1 Основные ошибки при проведении анализа копропорфирина в моче

Этап анализа	Причина ошибки	Типичные ошибки
Преаналитический	Нарушение условий взятия биопробы	Приём пищи; курение; физическая нагрузка перед сдачей биопробы
	Нарушение условий хранения и транспортировки пробы	Перегрев или многократное замораживание биопробы; попадание веществ извне; большое время доставки
Аналитический	Ошибки в подготовке к анализу	Применение реагентов, неуказанных в методике; неверные значения калибраторов
	Нарушение процедуры анализа	Ошибка в пропорциях реагентов; изменение времени проведения анализа; пропуск или лишние этапы анализа; несоблюдение последовательности этапов
	Ошибки, связанные с оснащением и/или с оборудованием	Грязные пипетки, флаконы и/или кюветы; неправильная работа анализатора
Постаналитический	Ошибка в выдаче результата. Эта ошибка может иметь начало на преаналитическом этапе	Неправильная связь между биопробой и результатом анализа

10. СПОСОБ ПОВЕРКИ АНАЛИЗАТОРА

Таблица 10.1 Операции поверки

№	Наименование операций	Номер пункта методики
1	Внешний осмотр	3.1
2	Проверка работоспособности	3.2
3	Определение метрологических характеристик	3.3

При отрицательных результатах поверки по какому-либо пункту настоящей методики дальнейшая поверка анализатора прекращается, и он признается прошедшим поверку с отрицательным результатом.

1 Требования безопасности

Требования безопасности должны соответствовать рекомендациям, изложенным в Руководстве по эксплуатации анализатора.

К проведению поверки допускаются лица, имеющие техническое образование, изучившие руководство по эксплуатации и методику поверки и имеющие навык работы с прибором.

Для получения данных, необходимых для поверки, опускается участие в поверке оператора, обслуживающего анализатор (под контролем поверителя).

2 Условия поверки

2.1 При проведении поверки должны быть соблюдены следующие условия:

диапазон температуры окружающей среды - (20 5) С;

диапазон атмосферного давления - от 84 до 106,7 кПа;

диапазон относительной влажности воздуха - от 45 до 80 %.

2.2 Механические воздействия, наличие пыли, агрессивных примесей, внешние электрические и магнитные поля (кроме земного) и отклонения от рабочего положения не допускаются.

3 Проведение поверки

3.1 Внешний осмотр.

3.1.1 При внешнем осмотре должно быть установлено:

соответствие маркировки анализатора технической документации.

отсутствие внешних повреждений и загрязнений, влияющих на работоспособность анализатора;

чёткость всех надписей;

исправность органов управления.

3.2 Проверка работоспособности.

3.2.1 Проверка работоспособности (самотестирование прибора) производится автоматически после включения питания. В случае успешного прохождения самотестирования на дисплее появляется цифра 0.

3.3 Определение метрологических характеристик.

3.3.1 Определение концентрации пробы

3.3.1.1 Получить супернатант с калибратором или любой доступной пробой.

3.3.1.2. Установить кювету в анализатор и провести серию из не менее пяти измерений, с перерывами между измерениями каждый не менее трёх минут.

3.3.2 Определение СКО при измерении концентрации.

СКО при измерении концентрации, выраженное в процентах, определяется на основе данных, полученных в п.3.3.1.2 по формуле:



(10.1)

где S_r -

C_ср - среднее значение концентрации всей серии измерений;

С_i - концентрация при i-ом измерении;

n ? 5 - число измерений.

Анализатор считается прошедшим поверку по п.3.3.2, если значение относительного СКО не превышает 5%.

4. Оформление результатов поверки

4.1 Анализаторы, удовлетворяющие требованиям настоящей методики поверки, признаются годными.

4.2 При положительных результатах поверки оформляется свидетельство о поверке установленной формы.

4.3 Анализаторы, не удовлетворяющие требованиям настоящей методики, к дальнейшей эксплуатации не допускается и на них выдаётся извещение о непригодности.



СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ

1. ГОСТ 18996-80. Анализаторы биологических жидкостей медицинские. Термины и определения.

2. Методы лабораторных исследований, используемые при диспансеризации рабочих с вредными условиями труда. Методические рекомендации. - М., 1980. 75 с.

3. Биохимия. Учебник / под ред. Е. С. Северина М., ГЭОТАР-МЕД, 2014. 768.

4. Флуоресценция // Википедия. URL: https://ru.wikipedia.org/wiki/Флуоре-сценция (дата обращения: 11.10.2016).

5. Showing metabocard for Coproporphyrin III // HMDB. URL: http: //www.hmdb.ca/metabolites/hmdb00570 (дата обращения: 11.10.2016).

6. SureLock™ 405nm Wavelength Stabilized Laser Diode // ONDAX. URL: http://www.ondax.com/products/surelock-wavelength-stabilized-lasers/surelock-wavelength-stabilized-collimated-to-can-lasers/surelock%E2%84%A2-405nm-wavelength-stabilized-laser-diode (дата обращения: 12.10.2016).

7. VEMD5060X01 // VISHAY. URL: http://www.vishay.com/ppg?84278 (дата обращения: 12.10.2016).

8. MAX4194 Micropower, Single-Supply, Rail-to-Rail, Precision Instrumentation Amplifiers // Maxim Integrated. URL: https://www.maximintegrated.com/en/products/analog/amplifiers/MAX4194.html (дата обращения: 12.10.2016).

9. ATMega 168 // Microchip. Atmel. URL: http://www.atmel.com/ru/ru/devices/ATMEGA168.aspx (дата обращения: 12.10.2016).

Размещено на Allbest.ru