Полиморфизмы генов системы гемостаза у лиц с отягощенным наследственным анамнезом по тромбофилии

Размещено на http://www.allbest.ru/

Полиморфизмы генов системы гемостаза у лиц с отягощенным наследственным анамнезом по тромбофилии

Долгих Т.И., Мироненко М.М., Утянская И.Г.

АННОТАЦИЯ

Целью настоящего исследования явилось определение молекулярно-генетических основ развития тромбофилических состояний у лиц молодого возраста для разработки индивидуального плана их диспансерного наблюдения. У лиц с отягощенным наследственным анамнезом по тромбофилии наиболее часто встречается гетерозиготное носительство мутантных генов протромбина, проконвертина и ингибитора активатора плазминогена [1,2]. Специфические комбинации полиморфизмов гена PAI-I с F V Лейден, F VII -10976A, GpIIIa-1565С и MTHFR -677Т могут иметь самостоятельное прогностическое значение [8,9].

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА. молекулярный генетический полиморфизм

Генетический полиморфизм, тромбофилии, гены системы гемостаза.

ВВЕДЕНИЕ

Несмотря на значительные успехи современной медицины, тромбофилические состояния по-прежнему представляют глобальную медико-социальную проблему, являясь основной причиной смертности и инвалидизации в индустриально развитых странах [1, 4, 5, 6, 7].

Исследования последних лет существенно расширили представления о молекулярных механизмах формирования тромбофилических состояний [8]. Во многом это объясняется успехами в изучении такой фундаментальной составляющей эндогенного риска, как генетическая предрасположенность.

Необходимость использования принципиально новых подходов при изучении основ генетической предрасположенности к тромбозу диктуется существующей на сегодняшний день концепцией о полигенном характере тромбофилий, которая постулирует наличие в подавляющем большинстве случаев тромбофилических состояний не одного, а нескольких генетических вариантов, независимо или синергично модифицирующих риск развития заболевания [9]. Клиническая манифестация является результатом взаимодействия нескольких мутантных генов. Эти взаимодействия приводят к разной степени выраженности клинических проявлений у различных индивидов от фетоплацентарной недостаточности до тромбоэмболии легочной артерии [1,2].

В этой связи, особый интерес уделяется изучению аллельного полиморфизма генов системы гемостаза у лиц, имеющих отягощенный наследственный анамнез по тромбофилии, что и определило цель и задачи настоящего исследования.

Целью исследования явилось определение молекулярно-генетических основ развития тромбофилических состояний у лиц молодого возраста для разработки индивидуального плана их диспансерного наблюдения.

Задачи исследования:

1. Изучить частоты встречаемости аллельных вариантов генов FV, FVII, ITGB3, FII, MTHFR, PAI-1 у здоровых лиц молодого возраста (от 25 до 30 лет) с отягощенным наследственным анамнезом по тромбофилии.

2.Определить вклад ген-генных взаимодействий в развитие предрасположенности к тромбофилическим состояниям.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исследование носило характер аналитического, одномоментного, ретроспективного. Объектом настоящего исследования явились 82 человека в возрасте от 25 до 30 лет (средний возраст - 26 ± 3,4). Основными критериями включения в исследование являлись: отягощенный наследственный анамнез по тромбофилии у пробандов со стороны родственников 1 и 2 степени родства, отсутствие клинико-лабораторных признаков нарушения системы гемостаза у пробанда. По результатам клинико-анамнестического исследования было сформировано 2 группы. Группу 1 составили 52 человека с отсутствием клинико-лабораторных признаков нарушения системы гемостаза, но с наличием у родственников 1 и 2 степени родства: инфаркта миокарда (n = 15), острого нарушения мозгового кровообращения (n = 13), тромбоза мезентериальных сосудов (n = 4), тромбоэмболии легочной артерии (n = 1), варикозной болезни вен (n = 14), фетоплацентарной недостаточности (n = 31), внутриутробной гибели плода (n = 8), привычного невынашивания беременности (n = 7), отслойки плаценты (n = 4), гестоза (n = 32), эклампсии (n = 3).

Группу сравнения составили 30 человек, имеющие клинические проявления тромбофилии (варикозная болезнь вен (n = 29), фетоплацентарная недостаточность (n = 25), внутриутробная гибель плода (n = 2), привычное невынашивание беременности (n = 3), отслойка плаценты (n = 4), гестоз (n = 26)). Группы однородны по возрастно-половому составу.

Всем обследуемым проводилось молекулярно-генетическое исследование венозной крови, полученной путем пункции локтевой вены и стабилизированной 2,5% раствором ЭДТА в соотношении 10:1. Образцы геномной ДНК выделяли из лейкоцитарной фракции с использованием комплекса реагентов «SNP-экспресс» (производство компании «Литех», Москва).

Исследован аллельный полиморфизм 6 генетических маркеров тромбофилии (таблица 1), которые условно можно разделить на 3 группы:

Таблица 1

Аллельный полиморфизм генов системы гемостаза

1) полиморфизм генов, кодирующих компоненты плазменного звена гемостаза (факторы II, V, VII свертывания крови, ингибитор активатора плазминогена типа I - PAI-1);

- Мутация гена протромбина (II фактор свертывания) G20210A характеризуется заменой нуклеотида гуанина на аденин в позиции 20210. Особенностью данной мутацией является то, что замена нуклеотида располагается в 3'-нетранслируемом участке. Это означает, что нуклеотидная последовательность измененного участка не участвует в кодировании аминокислотной последовательности гена протромбина. Поэтому никаких химических изменений самого протромбина при наличии данной мутации не возникает. При наличии данной мутации обнаруживаются повышенные количества химически нормального протромбина [3,7,8] .

- Мутация гена V фактора свертывания крови (мутация Лейдена) характеризуется заменой нуклеотида гуанина на аденин в позиции 1691. Это приводит к замене аминокислоты аргинина на аминокислоту глутамин в позиции 506 в белковой цепи проакцелерина, являющейся продуктом этого гена [1].

- Полиморфизм гена VII фактора приводят к снижению секреции фактора VII в кровь и к снижению активности фактора VII. Полиморфизм Arg353Gln заключается в замене аргинина на глутамин в позиции 353. Замена одной аминокислоты на другую в цепочке белка обусловлено точечной заменой в позиции 10976 цепочки гена гуанина на аденин [3, 8].

- Полиморфизм гена PAI-1 был выявлен в промоторной (регуляторной) области и известен как полиморфизм 4G/5G. В промоторной области гена PAI-1 есть участок, который может содержать последовательность либо из 4-х оснований гуанина (4G), либо из 5 оснований гуанина (5G). Это является классическим примером полиморфизма по типу инсерция/делеция (INS/DEL). Поскольку у человека имеется 2 экземпляра каждого гена (один от матери, один от отца) в популяции возможны 3 варианта генотипа: 5G/5G, 5G/4G, 4G/4G [7].

2) полиморфизм генов, кодирующие компоненты тромбоцитарных рецепторов, опосредующих процессы адгезии и агрегации кровяных пластинок (ITGB3).

Один из полиморфизмов гена ITGB3 заключается в точечной замене в позиции 1565 цепочки гена цитозина на тимин [3].

3) полиморфизм генов, вовлеченных в патогенез эндотелиальной дисфункции (MTHFR).

Наиболее изученный полиморфизм гена MTHFR является вариант, в котором цитозин в позиции 677, относящейся к 4-му экзону, заменен на тимидин, что приводит к замене аминокислотного остатка аланина на остаток валина в сайте связывания фолата. Такой полиморфизм MTHR обозначается как мутация C677T. Присутствие в геноме Т-аллеля, особенно в гомозиготной форме, коррелирует с риском развития тромботических осложнений [1,2].

Амплификацию участков геномной ДНК, содержащих указанные полиморфизмы, осуществляли на основе технологии полимеразной цепной реакции (ПЦР). Идентификацию аллельных вариантов, обусловленных точечными нуклеотидными заменами, осуществляли с помощью аллель-специфической ПЦР с использованием наборов компании «Литех», (г. Москва). После проведения 37 циклов ПЦР на термоциклере «Терцик» продукты амплификации анализировали с помощью электрофореза в 3% агарозном геле. Фрагменты ДНК визуализировали в проходящем ультрафиолетовом свете после окрашивания геля бромистым этидием в концентрации 1 мкг/мл.

Статистическая обработка результатов проводилась на персональном компьютере. Частоты встречаемости аллелей и генотипов определяли прямым подсчетом. Различия частот генотипов и аллелей в исследованных группах определяли с помощью метода ч² с поправкой Йетса. Анализ ассоциативных связей внутри генотипических сочетаний проводили с помощью точного критерия Фишера.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

В таблице 2 представлены результаты анализа распределения аллелей и генотипов изученных полиморфизмов ДНК у пациентов группы 1 и группы 2.

У лиц с отягощенным наследственным анамнезом по тромбофилии наиболее часто встречаются гетерозиготное носительство мутантных генов протромбина, проконвертина и ингибитора активатора плазминогена (28,8%, 32,7%, 23,1% соответственно).

Выявлены статистически значимые различия между группой 1 и 2 частоты встречаемости полиморфизма генов фактора V и MTHFR (таблица 2). Статистически значимых различий других полиморфизмов генов системы гемостаза между группами выявлено не было.

Гораздо информативнее для анализа патогенеза раннего развития тромботических состояний оказалось изучение ген-генных взаимодействий. Установлено, что для части ген-генных взаимодействий наличие тромбофилии модифицировало эффект влияния сочетаний полиморфизмов (таблица 3).

Так, обращало на себя внимание, что в группе 1 у всех носителей мутантного аллеля -675 5G в гене PAI-1 (n=20) не было клинических проявлений тромбофилии. Однако, у родственников 1 и 2 степени родства имелись различные тромбофилические состояния в анамнезе. 33% пациентов с мутацией в гене PAI-I одновременно являлись гетерозиготами по аллелям генов V, VII. факторов, GpIIIa и MTHFR. Таким образом, было установлено наличие достоверной положительной ассоциации (p<0,05) между мутацией гена PAI-I и гетерозиготным носительством аллелей F V Лейден, F VII -10976A, GpIIIa-1565С и MTHFR -677Т в группе 1. Это позволяет сделать предположение о существовании определенного патогенетического механизма развития тромбофилических состояний при комбинации этих генетических вариантов.

Таблица 2

Распределение полиморфизмов ДНК в исследуемых группах.

^* различия между группой 1 и группой 2 статистически значимые

^{* * *} (р<0,0005), ^{* * **} (р<0,00005).

Таблица № 3

Ген-генные ассоциации в исследуемых группах.

ВЫВОДЫ

Претромботическое состояние любого звена системы гемостаза, обусловленное аллельным полиморфизмом генов протромбина (20210А), V фактора (аномалия Лейдена), метилентетрагидрофолатредуктазы (677C/Т), VII фактора (10976 G/А), тромбоцитарного рецептора гликопротеина GpIIIa (1565T/С), ингибитора активатора плазминогена (-675 4G/5G), является приоритетной причиной тромбофилических состояний у лиц молодого возраста с отягощенным наследственным анамнезом по тромбофилии.

специфические комбинации полиморфизмов гена PAI-I с F V Лейден, F VII -10976A, GpIIIa-1565С и MTHFR -677Т могут иметь самостоятельное прогностическое значение у лиц с отягощенным наследственным анамнезом по тромбофилии.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Наличие отягощенного наследственного анамнеза по тромбофилии у лиц молодого возраста является показанием к детальному молекулярно-генетическому обследованию их с целью разработки индивидуального плана диспансерного наблюдения.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1) Макацария А.Д., Бицадзе В.О. Тромбофилические состояния в акушерской практике. - М.: РУССО, 2001. - 704 с.

2) Макацария А.Д., Пшеничникова Е.Б., Пшеничникова Т.Б., Бицадзе В.О. Метаболический синдром и тромбофилии в акушерстве и гинекологии. - М.: МИА, 2006. - 477 с.

3) Озолиня Л.А., Патрушев Л.И., Шполянская Н.Ю. и др. Распространенность мутаций в генах фактора V (G1691A, LEIDEN), протромбина (G20210A) и метилентетрагидрофолатредуктазы среди беременных московской популяции (G677Т) и их связь с патогенезом // Тромбоз, гемостаз и реология. - 2001. - № 1. - С. 7-9.

4) Сеидова Г.Б. Метаболический синдром у женщин в различные возрастные периоды.- СПб.: Издательский дом СПбМАПО, 2005. - 439 с.

5) Alessi M., Lijnen H. et al. Adipose tissue and atherothrombosis // Pathophysiol., Haemost., Thromb. - 2003/2004. - № 33. - P. 290-291.

6) Brunzell J.D., Hokanson J.E. Dyslipidemia of central obesity and insulin resistance // Diabetes Care. - 1999. - № 22. - P. 10-13.

7) Eriksson P., Reynisdottir S., Lonngvist F. et al. Adipose tissue secretion of plasminogen activator ingibitor-1 in non-obese individuals // Diabetologia. - 1998. - № 41. - P. 65-71.

8) Dahlbдck B. Advances in understanding pathogenic mechanisms of thrombophilic disorders//Blood. - 2008. - Vol.112. - P.19-27.

9) Franchini M, Mannucci PM. Interactions between genotype and phenotype in bleeding and thrombosis//Haematologica. - 2008. - Vol.93(5). - P.649-52.

Авторы:

/Т.В. Долгих/

/М.М. Мироненко/

/И.Г. Утянская/

Мироненко Мария Михайловна, 644099, г. Омск, ул. Красный путь, 18-98, т. 89139641871, эл. адрес: dr_mmm@rambler.ru.

SUMMARY

We investigated molekular-genetic bases of development thrombophilia of young to determine their individual plan of follow up. Persons with burdened hereditary anamnesis of thrombophilia more often have heterozygotic mutant genes prothrombin, proconvertin and plasminogen activator inhibitor. Association polymorphic gene PAI-I with F V Leiden, F VII-10976A, GpIIIa-1565С and MTHFR-677T can have independent prognostic significanse.

Размещено на Allbest.ru