Размещено на http://www.allbest.ru/

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования

"Сибирский государственный медицинский университет"

Министерства здравоохранения Российской Федерации

Кафедра фармацевтической химии

Курсовая работа

Анализ новых классов антибиотиков. Получение и стандартизация

Выполнила: студентка гр. 3205

Кондратьева К.В.

Проверила: доктор фармацевтических наук

профессор Ермилова Е.В.

Томск 2016

Содержание

• Введение
• 1. Общая характеристика
• 2. Получение антибиотиков
• 3. Новые антибиотики
• 4. Стандартизация
• 4.1 Качественное определение
• 4.2 Количественное определение
• 4.2.1 Химические методы
• 4.2.2 Оптические методы
• 4.2.3 Электрохимические методы
• 4.2.4 Радиоактивные изотопы в анализе антибиотиков
• Заключение

Введение

Внедрение в медицинскую практику таких мощных лекарственных средств, как антибиотики, было настоящей революцией в лечении инфекционных заболеваний. Однако по мере их применения ответной реакцией патогенных микроорганизмов была выработка устойчивости к антибиотикам. В настоящее время в медицине все острее встает проблема антибиотикорезистентности возбудителей, и одним из направлений решения этой проблемы является изыскание новых соединений, преодолевающих лекарственную устойчивость патогенных микроорганизмов, которые могли бы пополнить существенно уменьшившийся арсенал эффективных лекарственных средств.

Проблема быстрого распространения антибиотикорезистентности среди патогенных микроорганизмов носит глобальный характер. По данным ВОЗ, с 2000 по 2013 годы в мире описано только 22 новых антибиотика, одобренных национальными агентствами для проведения клинических испытаний. Из них новыми природными антибиотиками были только 2, а 10 представляют продукты трансформации ранее описанных природных антибиотиков и 10 соединений синтезированы искусственно. Такое незначительное количество новых антибактериальных соединений, доведенных до стадии клинических исследований, требует внедрения новых подходов к изысканию новых природных антибиотиков.

Если рассматривать антибиотики в качестве химического оружия у образующих их организмов для межвидовой борьбы, то наиболее перспективным источником штаммов-продуцентов является такой сложный биоценоз, как почва, которая, действительно, была на протяжении десятилетий основным объектом поиска продуцентов новых антибиотиков, поскольку она представляет собой сложное сообщество организмов разных систематических групп, из которых самыми перспективными и хорошо изученными продуцентами антибиотиков были актиномицеты. В настоящее время поиск расширяется, и исследуются самые разнообразные биоценозы, например, донные отложения, микрофлора кишечника беспозвоночных, симбионты морских организмов, эндобионты растений и др.

1. Общая характеристика

Антибиотики относятся к наиболее часто используемым препаратам для лечения инфекционных заболеваний человека и животных и в большинстве развитых стран занимают ведущее место по объему производства и потребления среди всех других групп лекарственных веществ.

Классификация антибиотиков

По направленности действия антибиотики можно разделить на следующие основные группы:

1) Антибактериальные антибиотики:

· активные в отношении грамположительных микроорганизмов;

· широкого спектра действия;

· противогрибковые.

2) Противоопухолевые антибиотики.

3) Противовирусные антибиотики.

По спектру антибактериального действия:

1) Антибиотики узкого спектра действия:

· угнетающие грамположительные бактерии и грамотрицательные кокки: соли бензилпенициллина, бициллины, оксациллин, макролиды, линкомицин, фузидин, ванкомицин, ристомицин, цефалоспорины I-го поколения;

· угнетающие грамотрицательные бактерии: полимиксины, азтреонам, цефалоспорины III-го и IV-го поколений;

2) Антибиотики широкого спектра действия - действуют одновременно на грамположительные и грамотрицательные микроорганизмы: ампициллин, карбенициллин, цефалоспорины II-го поколения, хлорамфеникол, тетрациклины, аминогликозиды, рифамицины, имипенем.

По химической структуре:

· бета-лактамы (пенициллины, цефалоспорины, карбапенемы, монобактамы)

· гликопептиды (ванкомицин, тейкопланин)

· аминогликозиды (стрептомицин, мономицин, канамицин, неомицин - I-го поколения; гентамицин и т.д. - II-го поколения)

· тетрациклины

· макролиды (и азалиды)

· линкозамиды

· левомицетин (хлорамфеникол)

· рифамицины

· полипептиды

· полиены

· разные антибиотики (фузидиевая кислота, фузафунжин и др.)

2. Получение антибиотиков

Получение препаратов антибиотиков сложный и многоступенчатый процесс, который можно свести к следующим основным этапам:

1. Изыскание микроорганизмов-антагонистов в природе и выделение их в чистую культуру;

2. Изучение спектра действия и определение антибиотической активности выделенных культур;

3. Подбор условий культивирования;

4. Первичная идентификация антибиотика;

5. Выделение и химическая очистка антибиотика, а так же сравнение полученного антибиотика по биологической активности с уже известными препаратами;

6. Изучение механизма действия, биологические и клинические испытания;

7. Получение из исходных, природных культур новых более высокопроизводительных штаммов;

8. Разработка лабораторной технологии получения антибиотика, создание опытных и пилотных установок;

9. Разработка промышленной технологии;

Методы получения антибиотиков путем химического синтеза чрезвычайно сложны и не могут конкурировать с их биосинтезом методами биотехнологии. Существует несколько способов получения как природных, так и полусинтетических антибиотиков.

Первый способ получения - направленный биосинтез антибиотиков, осуществляется путем культивирования (прямой ферментации) подходящего микроорганизма - продуцента. Точный механизм индуцирования первичными метаболитами генов, кодирующих синтез ферментов вторичного метаболизма, до конца не расшифрован, однако известно, что биосинтез антибиотиков, как и любых других вторичных метаболитов, начинается в фазе замедленного роста клеточной популяции (конец трофофазы) и достигает максимума в идиофазе. Считают, что в конце трофофазы (середина и конец стационарной фазы) в клетках и культуральной среде происходит накопление избыточных количеств продуктов первичного метаболизма, некоторые из которых выступают в роли индукторов вторичного метаболизма, освобождающих гены вторичного метаболизма из-под влияния катаболитной репрессии. Другим, важным стрессовым фактором, индуцирующим гены вторичного метаболизма, является резкое уменьшение содержания или полное исчерпание в питательных средах легкоусваиваемого компонента - глюкозы, что заставляет клетки переключаться на усвоение более сложных субстратов (другие моносахариды, дисахариды, полисахариды). Необходимость синтеза большого количества индуцибельных ферментов в условиях нехватки питания и как следствие промежуточных метаболитов, существенно дезорганизует процессы нормального метаболизма и запускает различные механизмы адаптации, в том числе и синтеза антибиотиков.

Биосинтез антибиотиков может дополнительно стимулироваться за счет других стрессовых воздействий (изменение температуры, рН и др.), а так же добавлением в культуральную среду некоторых веществ, которые называют предшественниками. Молекула вещества - предшественника (обычно достаточно простая по строению) может является структурным фрагментом молекулы антибиотика или быть промежуточным метаболитом в его синтезе. Установлено, что синтез этой молекулы является обычно самой медленной, лимитирующей стадией всего многостадийного синтеза молекулы антибиотика.

Второй способ получения антибиотиков - мутасинтез, состоит в использовании для их биосинтеза так называемых "блокированных" мутантов, у которых в результате мутации изначально отсутствует (блокировано) определенное звено в цепи реакций, ведущих к синтезу антибиотика. Такие блокированные мутанты не способны образовывать молекулу антибиотика целиком. Получение таких мутантов осуществляется обычно методами генной инженерии. Сущность метода состоит в том, что в питательную среду, где осуществляется культивирование таких блокмутантов, в идиофазе вводят различные мутасинтоны D* (вещества близкие по структуре соединению D, синтез которого блокирован). Поскольку для ферментов вторичного метаболизма характерна низкая субстратная специфичность, то эти аналоги блокированного предшественника антибиотика могут быть трансформированы ферментной системой клеток блок-мутантов в аналоги самого антибиотика - вещества E*.Этот процесс носит название мута­ционный биосинтез, или мутасинтез.

Подходящие мутасинтоны могут быть получены методами химического синтеза или биосинтеза.

Большой интерес как исходные вещества (синтоны, билдинг-блоки, темплейты, шаблоны) для синтеза различных модификаций природного антибиотика представляют продукты его неполного синтеза. Используя методы биотрансформации и химического синтеза в такие молекулы можно вводить разнообразные фрагменты, отличные от того, который имелся в природной молекуле.

Так, мутанты Nocardia mediterranei, у которых нарушена способность к алкилированию, образуют аналог предшественника рифамицина в - рифамицин SV, который служит исходным веществом для получения многих синтетических рифамицинов (препараты для лечения туберкулеза и проказы).

Иногда активностью могут обладать и сами продукты неполного синтеза некоторых антибиотиков (получение различных производных эритромицина).

Третий способ - получение гибридных антибиотиков, основан на использовании генетических гибридов продуцентов. В клетках таких микроорганизмов присутствуют ферменты, катализирующие одновременный параллельный синтез нескольких близких по структуре антибиотиков целиком или их отдельных частей. Вследствие низкой субстратной специфичности этих ферментов возможен "перехват" ферментами одного пути синтеза промежуточных метаболитов другого процесса. В результате может образоваться новый антибиотик, структура которого будет близка, но полностью не похожа ни на один из исходных антибиотиков. Примером является синтез различных антибиотиков актинородинового ряда.

Четвертый способ - заключается в биотрансформации природных антибиотиков или синтетических структур, с целью получения более активных соединений. Особенно успешны подобные разработки в области биосинтеза полусинтетических пенициллинов и цефалоспоринов. Получение новых более эффективных аналогов пенициллина основано на изменении природы его ацильной группировки при сохранении в неизменном виде ядра пенициллина - 6-аминопенициллановой кислоты (6-АПК). Структура 6-АПК очень неустойчивой к действию кислот и щелочей, поэтому ее получение путем химического гидролиза пенициллинов приводит к большим потерям продукта и очень невыгодно. Более удобным является гидролиз в мягких условиях природных пенициллинов с помощью специфического фермента - пенициллинацилазы, образующейся с высоким выходом в процессе ферментации ряда штаммов микроорганизмов. Именно этот способ наиболее широко применяется сейчас в промышленности. Ацилазы различают по их субстратной специфичности. Поскольку реакции гидролиза амидов и сложных эфиров являются обратимыми, то некоторые из ацилаз способны катализировать и обратные реакции - процессы ацилирования аминогруппы 6-АПК с образованием модифицированного пенициллина. Таким путем, а так же используя химический синтез, было получено более 40 000 полусинтетических пенициллинов. Во многих случаях 6-АПК не выделяют из культуральной жидкости, например при превращении бензилпенициллина в ампициллин, что значительно удешевляет процесс за счет снижения потерь и уменьшения числа операций.

По объему выпускаемой продукции промышленное производство антибиотиков является одним из самых крупных биотехнологических производств. Процесс протекает в аэробных условиях и является очень энерго- и материалоемким.

3. Новые антибиотики

микроорганизм патогенный антибиотический

В 2010 г. на рынке появился антибактериальный препарат тигециклин (Тигацил, Phazer), относящийся к новой фармакологической группе глицилциклинов. Он обладает широким спектром активности в отношении аэробных и анаэробных грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов. Тигециклин проявляет активность в отношении мультирезистентных штаммов, таких как MRSA, VRSA, VRE, Enterobacter spp., продуцирующих беталактамазы расширенного спектра. Также тигециклин обладает активностью в отношении внутриклеточных микроорганизмов. Принципиальное значение для урологии имеет наличие природной резистентности к тигециклину у P. aeruginosa. В организме человека менее 20% введенного тигециклина подвергается метаболизму. Около 59% назначенной дозы выводится через кишечник (при этом большая часть неизмененного тигециклина поступает в желчь), а 33% выводится почками. Дополнительные пути выведения - глюкуронизация и экскреция неизмененного тигециклина почками. Общий клиренс тигециклина после внутривенной инфузии составляет 24 л/ч. Тигециклин характеризуется полиэкспоненциальным выведением из сыворотки, средний терминальный T1/2 из сыворотки после назначения повторных доз составляет 42 ч., однако наблюдаются значительные индивидуальные различия. Препарат назначается в виде внутривенной капельной инфузии продолжительностью 30-60 минут. Начальная доза для взрослых составляет 100 мг, далее по 50 мг через каждые 12 часов. По мнению производителя курс лечения должен составлять 5-14 дней.

Гидродокс - это новый антибиотик в линейке продуктов "Хювефарма", содержащий в качестве действующего вещества доксициклина гиклат. Доксициклин, входящий в состав препарата Гидродокс, - это полусинтетический антибиотик (бактериостатик) тетрациклинового ряда, который обладает широким спектром действия, в том числе против Mycoplasma gallisepticum spp. и Pasteurella multocida. Доксициклин способен хорошо связываться с белками плазмы крови, гораздо лучше, чем любой антибиотик из тетрациклинового ряда, при этом он обладает длительным временем полувыведения у животных, в 10 раз лучше растворим в жирах, поэтому он быстрее и равномернее всасывается; единственный из группы, обладающий постантибиотическим эффектом, выраженным легочным тропизмом. Препарат достигает очень высоких концентраций в репродуктивных органах (эффективность при респираторных инфекциях и в репродуктивном тракте) и обладает некоторыми противовоспалительными свойствами.

Тедизолид (компания Cubist)

Тедизолид рекомендован для одобрения Совещательным комитетом по антиинфекционным препаратам FDA (FDA Anti-Infective Drugs Advisory Committee). По данным клинических исследований тедизолид продемонстрировал эквивалетную линезолиду клиническую и микробиологическую эффективность в лечении бактериальных инфекций кожи и мягких тканей, вызванных различными микроорганизмами, включая MRSA. Тедизолид, назначаемый 1 раз в сутки в течение 6 дней, оказался сопоставим по эффективности с применением линезолида 2 раза в сутки на протяжении 10 дней.

Оритаванцин (компания Medicine Group)

По данным рандомизированного исследования III фазы было продемонстрировано, что новый липогликопептид оритаванцин, назначаемый однократно, не уступает ванкомицину в лечении бактериальных инфекций кожи и мягких тканей.

Цефтолозан/тазобактам (компания Cubist)

Данная комбинация нового цефалоспорна цефтолозана и ингибитора в-лактамаз тазобактама продемонстрировала высокую эффективность в отношении бактерий, вызывающих инфекции мочевыводящих путей и интраабдоминальные инфекции, особенно против Pseudomonas aeruginosa, БЛРС-продуцирующих штаммов Escherichia coli и Klebsiella pneumoniae.

Цефтобипрол (компания Basilea)

Цефтобипрол является представителем нового 5 поколения цефалоспоринов и обладает уникальной для в-лактамов активностью в отношении метициллинорезистентных штаммов S. aureus. Цефтобипрол показал сопоставимую эффективность с комбинацией цефтазидим + линезолид в лечении нозокомиальной пневмонии, за исключением вентилятор-ассоциированной пневмонии. В настоящее время цефтобипрол одобрен для использования в Европе, но не зарегистрирован пока в США.

В марте 2009 г. цефтобипрола медокарил зарегистрирован на фармацевтическом рынке России (Зефтера®, номер регистрационного удостоверения ЛСР-002180/09 от 20.03.2009 г.).

В России зарегистрирован первый цефалоспорин V поколения с анти-MRSA-активностью.

Деламанид (компания Otsuka)

Деламанид - новый противотуберкулёзный препарат, который недавно одобрен в Европе. Деламанид может использоваться как часть режима лечения пациентов, у которых туберкулёз резистентен к другим противотуберкулёзным препаратам.

4. Стандартизация

4.1 Качественное определение

Задача качественно анализа определить неизвестный антибиотик встаёт как при изучении новых антибиотиков, так и в практике, если нужно показать присутствие антибиотика в фармацевтических препаратах. Обе задачи требуют совершенно различных методов. Самым надёжным методом идентификации антибиотика является определение его инфракрасного спектра. Результаты здесь абсолютно однозначны. Только после измерения инфракрасного спектра можно с полной уверенностью судить об отличии или идентичности двух антибиотиков различного происхождения. Поскольку инфракрасным спектрофотометром оснащена не каждая лаборатория, то для идентификации антибиотиков были разработаны системы простых химических реакций, довольно надёжных для идентификации известных антибиотиков.

Для быстрого качественного определения антибиотиков в фармацевтических препаратах очень удобна осциллографическая полярография. При хорошо подготовленной аппаратуре можно за несколько минут идентифицировать большинство применяемых антибиотиков. Практически наиболее важным являются разграничение тетрациклиновых антибиотиков от хлорамфеникола, а также проверка состояния и чистоты пенициллиновых препаратов, причём важно быстро установить, до какой степени препарат разложился.

Другим быстрым физическим методом идентификации антибиотиков является определение показателя преломления твёрдого вещества. В табл. 4. приведены величины показателей преломления для обычно применяемых антибиотиков в твёрдом состоянии.

Практическую ценность представляет разница между показателем преломления хлортетрациклина и окситетрациклина, на основе которой можно эти два антибиотика различить. Очень специфическими являются микробиологические методы идентификации антибиотиков. Для этого применяются штаммы, специфически резистентные к данному антибиотику, или же так называемые зависимые штаммы, т.е. такие, рост которых обусловлен присутствием определяемого антибиотика. Этот метод особенно надёжен, однако изыскание или выведение таких штаммов является обычно очень трудоёмким делом.

Многие антибиотики, как, например, пенициллин, стрептомицин, эритромицин, бацитрацин, неомицин, полимиксин и т. д., не являются химически индивидуальными веществами, а представляют собой смесь нескольких структурно сходных веществ. Бумажная хроматография и электрофорез на бумаге позволяют выделить эти составные части и отделить их количественно.

Для изучения антибиотиков можно применять нисходящую, восходящую и горизонтальную хроматографию. Выбор системы растворителей зависит от химической природы антибиотика.

Зоны отдельных антибиотиков выявляются на хроматограммах или электрофотограммах чаще всего биоавтографически, т. е. методом, подобным определению антимикробной активности антибиотиков чашечным методом. Хроматограмму на узкой полоске фильтровальной бумаги после её высушивания кладут на лоток с твёрдой агаровой средой, засеянной суспензией тест-микроба. Лоток помещают на несколько часов в термостат при 37 градусах. В ходе инкубации микроб, посеянный на агар, вырастает, так что агар мутнеет и становится молочно-белым. Он не растёт, однако, вокруг тех мест полосок фильтровальной бумаги, где находятся антибиотически активные вещества. В этих местах остаются чистые прозрачные округлые зоны, которые с первого же взгляда указывают на расположение антибиотически активных составных частей первоначальной смеси. Измеряя диаметр прозрачной зоны, можно установить и количество соответствующей составной части путём сравнения этого диаметра с диаметром зоны стандарта, хроматографируемого одновременно с анализируемыми образцами.

Этот метод применяют для обнаружения антибиотиков и витаминов с той лишь разницей, что витамины выявляются положительно, т. е. микроб растёт лишь в местах, где имеется витамин. Главным достоинством биоавтографии является её чувствительность, которая значительно превосходит чувствительность всех цветных реакций. В этом с нею сравним лишь метод флюоресценции. Это, однако, не говорит о том, что при хроматографировании антибиотиков для их обнаружения не применяют цветные реакции с помощью химических веществ. Этот способ применяют тогда, когда хотят определить составную часть антибиотика, химически подобную ему, но биологически неактивную.

Если же образец, помимо антибиотика, содержит ещё большое количество солей или иных примесей, то бумажная хроматография может и не дать хороших результатов. В этих случаях можно прибегнуть к электрофорезу на бумаге или же сочетать электрофорез с хроматографией.

Бумажная хроматография и электрофорез незаменимы при контроле процесса получения антибиотиков путём ферментации. Их главным достоинством является то, что они одинаково хорошо пригодны как для неочищенных растворов, так и для очищенных веществ. Это обусловлено прежде всего специфичностью биоавтографического метода. Ещё большее значение, нежели для технологии, имеет бумажная хроматография для изыскания и изучения новых антибиотиков.

4.2 Количественное определение

В процессе производства требуется определить содержание антибиотика в культуральной жидкости в ходе ферментации, во всех промежуточных продуктах при выделении и очистке и, наконец, в готовом препарате. Для этого применяют большое количество самых разнообразных биологических и химических методов

4.2.1 Химические методы

Химические методы используются для анализа антибиотиков очень редко. Практически это будет лишь несколько методов, применяемых для пенициллина. Они основаны на поглощении йода продуктами гидролиза пенициллина. Эти методы в различных модификациях применяются в практике при контроле ферментации и экстракции пенициллина. При более старом способе с применением щелочного гидролиза необходимо было экстрагировать пенициллин из культуральной жидкости амилацетатом при рН=2,0 и температуре 0°, затем из амилацетата экстрагировать его фосфатным буфером при рН=7,8 и только с этим экстрактом производить непосредственное йодометрическое определение. Более новый метод, про котором пенициллин разрушается кислотой, позволяет проводить работу прямо с культуральной жидкостью без экстракций.

Пенициллин можно определять также ацидометрически после его расщепления до пенициллоиновой кислоты, при этом из в-лактамного кольца пенициллина освобождается одна свободная карбоксильная группа, которую можно титровать; в-лактамное кольцо пенициллина можно расщепить либо щёлочью, либо пенициллиназой. Этот метод, однако, нельзя применять для нативного раствора, который содержит множество посторонних веществ, делающих точное ацидометрическое титрование невозможным.

4.2.2 Оптические методы

Колориметрия и спектрофотометрия в видимом свете

Сюда относятся наиболее часто применяемые методы количественного определения антибиотиков. Основным достоинством колориметрических методов определения являются их простота, скорость и сравнительно высокая точность, недостатком их малая специфичность.

Для колориметрического определения антибиотики превращают в окрашенные производные. При этом используют цветные реакции либо с самими антибиотиками, либо с продуктами их расщепления. Например, тетрациклиновые антибиотики образуют окрашенные комплексы с хлорным железом в кислой среде. Стрептомицин расщепляют едким натром до мальтола, который даёт цветную реакцию с хлорным железом или с реактивом Фелинга. Антибиотики группы фенола или ароматических аминов со свободным орто- или пара-положением можно обычно перевести в азокрасителе путём реакции с диазониевыми солями. Так можно определять, например, тетрациклиновые антибиотики.

Некоторые антибиотики можно перевести в соединения с каким-либо красителем, затем выделить эти вещества из реакционной смеси и определить колориметрически. Так можно определять пенициллин с помощью N-(1-нафтил-4-азобензол)-этилендиамина.

Спектрофотометрия в ультрафиолетовом свете

Спектральный анализ имеет большие возможности, нежели колориметрия. Большинству антибиотиков свойствен характерный спектр поглощения в ультрафиолетовой области, и поэтому определять их спектрофотометрически можно непосредственно. Недостатком является то, что присутствие посторонних веществ мешает определению в значительно большей мере, нежели при колориметрии или спектрофотометрии в видимом свете, и поэтому определять антибиотики этим методом можно лишь в отдельно чистых образцах.

Можно повысить специфичность метода и сделать его применимым к менее чистым препаратам путём измерения экстинкции при двух различных длинах волн, из которых одна находится на максимуме, а другая ? при соседнем минимуме кривой экстинкции антибиотика. Этим путём зачастую удаётся установить влияние среды. Важно, чтобы все измерения проводились при строго определённом рН, поскольку спектр поглощения антибиотика в ультрафиолетовом свете очень сильно зависит от рН среды.

Инфракрасная спектроскопия

Этот метод является специфичным для качественного определения антибиотика. Его можно, однако, очень хорошо использовать и для количественного определения. Обычно достигается точность, равная точности спектрофотометрии в ультрафиолетовом свете, а в некоторых случаях даже ещё более высокая (±1%). Можно производить количественный анализ как растворов, так и твёрдых веществ. При анализе веществ в растворах необходимо выбрать подходящий растворитель, который сам бы не поглощал инфракрасные лучи в данной области. Обычно это бывает сероуглерод или же галоидопроизводные углеводородов. Поэтому антибиотик нужно иметь в такой форме, чтобы его можно было в этих веществах растворить. Если же подходящий растворитель найти не удаётся, можно провести спектрофотометрическое определение вещества в твёрдом состоянии. Твёрдые вещества либо таблетируют с бромистым натрием. Либо суспендируют в масле: измерение поглощения производят в тонких слоях этой суспензии.

Для количественного определения необходимо знать плотность слоёв этой суспензии. Её определяют путём добавления известного количества кристаллического вещества, например б-аланина, к суспензии антибиотика и измерения экстинкции при одном из максимумов поглощения добавленного вещества.

Флюорометрия

Это один из наиболее чувствительных методов определения антибиотиков, приближающийся по своей чувствительности к биологическим методам. Главной областью его применения являются тетрациклиновые антибиотики, которые сами по себе флюоресцируют жёлтым светом в умеренной щелочной среде; однако обычно измеряется синяя флюоресценция их продуктов разложения в щелочной среде. Хлортетрациклин инактивируют щелочами, например 0,2 М тринатрийфосфатом, оставив смесь стоять в течение 30 минут при комнатной температуре, в то время как тетрациклин кипятят при этом в течение более продолжительного времени.

Антибиотики, которые сами по себе не флюоресцируют и не образуют флюоресцирующих продуктов разложения, можно тем не мене определять флюорометрически путём соединения с подходящим флюоресцирующим веществом и выделения подходящего дополнительного соединения.

Оптическое вращение

Поляриметрические методы дают очень надёжные результаты применительно к концентратам оптически активных антибиотиков, если только они не слишком сильно окрашены. Вследствие удобства работы они получили очень широкое применение как обычные методы контроля, в особенности при выделении стрептомицина. Для определения антибиотиков в культуральной жидкости они непригодны, поскольку в этих случаях они малочувствительны.

Сконструирован автоматический регистрирующий поляриметр, при помощи которого изучена кинетика разрушения пенициллина кислотами.

4.2.3 Электрохимические методы

Антибиотики, являющиеся кислота или основаниями, можно титровать потенциометрически. Эти методы применяют сравнительно редко, поскольку с такими антибиотиками редко приходится иметь дело в этих формах. Исключение составляет, например, пенициллин.

Хлоргидраты тетрациклиновых антибиотиков имеют сильно кислотные свойства, напротив, основность этих антибиотиков очень слаба. Поэтому хлоргидраты можно титровать непосредственно алкалиметрически. После подтитровки хлоргидрата достижения степени диссоциации свободной амфотерной формы антибиотика на кривой потенциометрического титрования можно ясно видеть резкое изменение потенциала.

Намного большую точность и значительно более широкие возможности имеет потенциометрическое титрование в неводных растворителях. Так, например, слабоосновные антибиотики, как тетрациклины, а также эритромицин и карбомицин, можно определять с помощью титрованного раствора хлористой кислоты в диоксане. Напротив, антибиотики с кислотными свойствами, пусть даже и очень слабыми, удаётся титровать в среде безводных оснований, например, в триэтаноламине.

Эти методы выгодны тем, что они являются универсальными для целой группы антибиотиков. Конечно, они могут применяться исключительно лишь для чистых веществ и готовых препаратов.

Полярография

Антибиотики, содержащие в своей молекуле восстанавливающиеся группы например, нитрогруппы, кетогруппы, примыкающие к одной или более двойной связи, альдегидные группы, карбоксильные группы, примыкающие к двойным связям либо имеющие хиноподобную структуру, могут быть восстановлены на ртутном капельном электроде и могут поэтому определяться полярографически. Сюда относятся прежде всего хлорамникол, далее все тетрациклиновые антибиотики, стрептомицин, все хиноновые антибиотики, цитринин.

Другие антибиотики, напротив, окисляются на ртутном капельном электроде и могут поэтому давать анодную волну, которая также может служить для их количественного определения. Примером является гентизиловый спирт, производное гидрохинона.

Антибиотики, которые сами по себе полярографически неактивны, можно перевести несколькими способами в полярографически активные вещества. Так, например, пенициллин гидролизуется сначала щёлочью или пенициллиназой и далее в кислой среде до диметилцистеина. Эта аминокислота, содержащая группу SH, даёт хорошо измеряемую волну в кобальтовом растворе Брдички.

Очень ценна с аналитической точки зрения полярография хлорамникола. Этот антибиотик можно количественно определять полярографическим методом в биологическом материале, как-то: в крови и моче человека, в кутьтуральной жидкости.

Следующей областью применения полярографии являются тетрациклиновые антибиотики. Их можно определять количественно в готовых продуктах и в фармацестических препаратах. При соответствующем выборе среды можно определять количественно соотношение хлортетрациклина и окситетрациклина. Однако количественный анализ смеси хлортетрациклин и окситетрациклина лучше всего удаётся колориметрическим методом. В культуральной жидкости тетрациклиновые антибиотики определить нельзя, поскольку в этом случае определению мешает выделение водорода, катализируемое белками и другими веществами, присутствующими в фильтрате культуральной жидкости.

Амперметрическое (полярометрическое) титрование

Каждый антибиотик, который осаждается полярографически активными веществами, можно титровать амперметрически. Определение это является более точным, однако значительно менен специфичным, чем обычная непосредственная полярография. Эти методы до настоящего времени применялись очень мало.

Кондуктометрия

Для прямого определения активности антибиотических препаратов можно использовать кондуктометрическое титрование. Этот метод до сего времени применялся очень мало, хотя несомненно, что на его основе возможно со временем обогатить анализ антибиотиков несколькими точными микроопределениями. Чаще кондуктометрия используется для определения зольности готовых антибиотических препаратов либо для контроля десорбции антибиотиков из ионообменных колонок особенно стрептомицина.

4.2.4 Радиоактивные изотопы в анализе антибиотиков

В области антибиотиков сфера применении радиоактивных и тяжёлых изотопов необычайно широка. Меченые препараты можно одинаково широко применять как для аналитического контроля производства, так и для решения основных проблем действия антибиотиков на микроорганизм и макроорганизм, для объяснения механизмов всасывания, циркуляции, накопления и выделения антибиотиков в теле. В области фармакологии и биохимии антибиотиков с помощью изотопов были достигнуты ценные результаты.

Приготовление антибиотика, меченного изотопом, производится в процессе биосинтеза путём, в общем сходным с получением обычного антибиотика. Возможность специфической метки (локализации изотопа в одном определённом, заранее известном месте молекулы антибиотика) имеется лишь тогда, когда точно известен предшественник антибиотика и когда этот предшественник можно специфически пометить. Такая возможность имеется у бензилпенициллина, предшественник которого фенилуксусная кислота с каким-либо изотопом углерода в карбоксильной группе легко доступен. Если теперь при ферментации мы введём в качестве предшественника меченную таким образом фенилуксусную кислоту, то мы получим специфически меченный пенициллин.

Определение антибиотиков при помощи препаратов, меченных изотопами, проводят обычно методом разбавления изотопов. Этот способ применим для анализа образца любой химической природы, если только из него можно получить хотя бы небольшое количество чистого антибиотика. Например, к культуральной жидкости прибавляют заранее известное количество чистого меченого антибиотика с известной удельной радиоактивностью. При этом меченый препарат в определённой степени разбавляют антибиотиком, содержащимся в образце. Затем из жидкости выделяют антибиотик и несколько раз перекристаллизовывают до постоянно удельной радиоактивности. Поскольку изотопы нельзя определить простыми физическими методами, степень разбавления меченого препарата, содержащегося и в выделенном антибиотике, а также его удельная радиоактивность будут обратно пропорциональны содержанию антибиотика в культуральной жидкости.

Заключение

В заключении стоит отметить, что в настоящее время накоплено достаточно большое количество знаний об особенностях жизнедеятельности микроорганизмов, имеется большой выбор стратегий и методов поиска новых антибактериальных препаратов.

Тем не менее, к сожалению, подавляющее большинство публикаций, посвященных синтезу антимикробных препаратов, в российских журналах по медицинской и фармацевтической химии, описывают, как правило, химическую часть и общую противомикробную активность веществ, оставляя в тени механизмы, обеспечивающие антимикробную активность нового вещества, их стандартизацию и получение. Однако, очевидно, что в научном поиске новых веществ с антибактериальной активностью необходимо использовать методы не только медицинской химии, но и молекулярной биологии, генетики и других биологических дисциплин, основные направления. И поскольку крупные фармацевтические компании отказываются от разработок антибиотиков, на сегодняшний день большая надежда в области поиска новых антибиотиков сегодня возлагается на небольшие некоммерческие научные группы, которые имеют частичное государственное финансирование.

Размещено на Allbest.ru