Характеристика, класифікація та особливості використання біосенсорів в медичній сфері

Размещено на http://www.allbest.ru

Размещено на http://www.allbest.ru

Вступ

Основною причиною різкого збільшення зацікавленості та досліджень в галузі біосенсорів в останні два десятки років є їх висока специфічність та чутливість, що досягається завдяки використанню біологічних молекул та систем. Біосенсор - це аналітичний прилад, що містить в своєму складі біологічний чутливий елемент (фермент, антитіло, ДНК, клітинні органели, клітини чи шматочки тканин) поєднаний з перетворювачем (електрохімічним, оптичним, калориметричним чи акустичним). Вимірювання концентрації мішені аналізатор виконує кількісним перетворенням параметрів реакції у кількісний електричний чи оптичний сигнал.

Найбільш важливими властивостями будь-якого біосенсору є його специфічність та чутливість аналізатора відносно мішені. Специфічність біосенсора цілком керується властивостями біологічного компоненту, тому що саме тут речовина контактує з сенсором. Чутливість цілого приладу залежить як від біологічного компоненту так і від перетворювача, тому що тут має бути чудова взаємодія між біомолекулою та аналізуємою речовиною, а також дуже висока ефективність наступного визначення реакції перетворювачем. В порівнянні з хімічними сенсорами набагато вигіднішими є біологічні сенсори, висока специфічність яких є результатом оптимального молекулярного розпізнавання. Це найкраще можна показати на прикладі взаємодії антиген-антитіло (Ат-Аг), де антитіло може розпізнати та приєднати відповідний антиген з надзвичайно високою специфічністю.

Найменші хімічні зміни в молекулярній структурі Аг можуть сильно зменшити спорідненість до Ат (яке мало перехідну реакційність). Наприклад, ферменти, як глюкозоксидаза, будуть розпізнавати свій природній субстрат (глюкозу в даному випадку) з набагато більшою спорідненістю, ніж інший компонент у реакційному середовищі. Хімічно подібні молекули (інші малі цукри) можуть проявляти деяку активність, якщо присутні в достатньо високій концентрації. Рівень специфічності, та в багатьох випадках чутливості, розпізнавання та вимірювання, що був досягнутий в біосенсорах, набагато перевищує той, що існує в переважній більшості хімічних сенсорів.

Висока специфічність біомолекул та біологічних систем, що стосується міжмолекулярних взаємодій, може бути використана в біосенсорних приладах лише при наявності високоефективного сполучення між біологічним компонентом та компонентом перетворювача. Ряд потенційних біологічних компонентів та подібний ряд перетворювачів можуть бути використані в біосенсорах (Таблиця 1), що робить дійсно необхідним міждісциплінарний підхід у розробці та дослідженнях в цій області. Багато в області перетворювачів вже зроблено, але вона вимагає подальшого розвитку та оптимізації. На практиці широкий ряд оптичних та електрохімічних технологій було використано в поєднанні з біологічним аналізом.

Таблиця 1. Основні компоненти біосенсорів

Біомолекули та біологічні системи, що застосовуються в біосенсорах, можуть бути розділени на наступні головні групи:

1. Ферменти.

2. Антитіла.

3. Клітини.

4. Рецептори.

5. Нуклеїнові кислоти.

Інші перелічені класи біологічних компонентів, розглянутих в табл. 1 (наприклад, органели, тканини, мембранні системи), знаходять тільки обмежене застосування в галузі біосенсорів.

1. Біологічний матеріал в біосенсорах

1.1 Ферментні біосенсори

Головну частину досліджень та розробок в області біосенсорів пов'язано з ферментами. Вони зручні для використання в біосенсорах як довготривалі визначники концентрації аналізуючих речовин. Серед широкого спектру ферментних біосенсорів основною рисою є перетворення ферментом аналізуючої речовини на певний продукт, який можна визначити. Цей продукт повинен мати певну електроактивність (наприклад, редокс-активність) чи оптичні якості (наприклад, флуоресценцію чи поглинання). Ферментні сенсори першого типу називаються ферментними електродами, другого типу - ферментними оптродами.

Відомі також три інші типи ферментних сенсорів, це: ферментні термістори (де теплота, що виділяється під час каталізованої ферментом реакції, вимірюється та пов'язується з концентрацією аналізуючої речовини); інгібіторні ферментні сенсори (де аналізуюча речовина інгібує специфічну ферментну реакцію, змінюючи електрохімичний чи оптичний сигнал, з чого виходить, що аналізуєма речовина не є субстратом ферменту); і, нарешті, новий тип ферментних оптродів, в яких сигнал виникає з самого ферменту або з асоційованої біомолекули (наприклад, коферменту), а не з продукту ферментної реакції. Певною метою в розробці ферментних біосенсорів є використання високої специфічністі та чутливості, що слугує прикладом фермент-субстратної взаємодії, як основи для визначальної та вимірювальної системи. Взаємодія між ферментом та його субстратом спричиняє витрату субстрату та утворення продуктів. Це ефетивно використовується, коли перетворювач фіксує певну властивість продукту та генерує сигнал. Цей принцип ілюструє більшість ферментних біосенсорів.

1.2 Імуносенсори

Висока специфічність та висока чутливість, яка характеризує реакцію антиген-антитіло, були використані в різного роду лабораторних тестах, які використовували антитіла (імуноаналіз). Імуноаналіз - це багатоступінчатий лабораторний тест, який базується на розпізнаванні та зв'язуванні антигена з антитілом. На відміну від імуноаналізу, де можливе використання сигнал-генеруючих міток, калібрувальних графіків та спеціальних операцій з середовищем (таких, як обробка зразка, оптимізація рН, певна послідовність дій, період витримування 5-30 хв.), справжні імуносенсори ідеально характеризуються притаманною сигнал-генеративною властивістю, можливістю визначати антиген менше ніж за 2-3 хв. та деякою оберненістю.

Головною метою в розробці імуносенсорів є створення більш простих Ат-базованих тестів, які б поєднували чутливість та специфічність лабораторного імуноаналізу зі зручним обслуговуванням сенсорних приладів. Це дасть змогу проводити аналіз поза межами великих медичних установ. Лімітуючим фактором в створенні дешевих біосенсорів є те, що цілий прилад може бути використаний лише тільки раз. На практиці зараз впроваджуються імуносенсори, в яких використовуються замінні чіпи з біологічним матеріалом.

1.3 Біосенсори, що містять інтактні клітини

Сенсори, які містять цілі клітини називаються цілоклітинними біосенсорами. Нижче перелічені властивості інтактних клітин, що можуть бути використані в біосенсорах:

а) Клітини чутливі до цілої низки речовин.

б) Ферменти, що містяться in situ мають оптимальну біологічну активність, на відміну від ферментів in vitro.

в) Низька ціна препаратів (можливість росту в культурі).

Майже всі відомі цілоклітинні біосенсори містять прості бактерійні чи клітини водоростей; тваринні та рослинні клітини більш складні і набагато менш стійкі in vitro. Відомо, що всі цілоклітинні біосенсори базуються на електрохімічних перетворювачах. За допомогою таких біосенсорів можна визначити амінокислоти (наприклад, аргінін), пестициди та інші інгібітори. Нещодавно стало відомо про біосенсор базований на оптичному перетворювачі в поєднанні з пігментованими клітинами.

Суттєвими недоліками клітинних біосенсорів є:

o Швидка загибель клітин, що витрачають електрони, отримані в процесі життєдіяльності, на ініціацію сигналу.

o Втрата переносників сигналу - медіаторів через дифузію.

Нещодавно українськими вченими був розроблений кондуктометричний біосенсор, що базується на метилотрофних дріжджах Candida boidinii 706, за допомогою якого можна визначати етанол.

1.4 Біосенсори, що містять молекулярні рецептори

Біосенсорів цього типу відомо порівняльно мало, в основному, через проблему абсолютної ізоляції та стабілізації молекул в надзвичайному середовищі. Біосенсор такого типу може мати оптичний перетворювач і базуватися, наприклад, на ацетилхоліновому рецепторі нікотину або на електрохімічному перетворювачі і базуватися на зміні потенціалу мембрани, внаслідок обміну подібних речовин (наприклад, рибофлавіну та його аналогу (F), де чутливість сенсора може складати від 0.1 до 2Ч10-6 М рибофлавіну). Подальший прогрес можливий в цій галузі біосенсорів лише за підримки молекулярної біології у підвищенні якості і стабільності рецепторів, що можна використовувати in vitro.

1.5 Нуклеінові кислоти в біосенсорах

Біосенсори, які містять одноланцюгові молекули ДНК звичайно називають “ДНК-зондами” чи “ДНК-пробами”, вони використовуються при виявленні таких генетичних хвороб, як серповидна клітинна анемія, фенілкетонурія та ін. Значні успіхи досягнуті при виявленні патогенних мікроорганізмів за допомогою “ДНК-проб” в біологічних рідинах, харчових продуктах, оточуючому середовищі. Біосенсори на основі рідких кристалів суперспіральних молекул ДНК викликають особливу увагу через можливість існування кільцевих молекул ДНК у різних формах, що різняться за своїми властивостями, до того ж існування цих форм цілком залежить від зовнішніх факторів. Під дією ферментів (нуклеаз та рестриктаз) рощеплюється суперспіральна упаковка молекул і відбувається перебудова кристалів, що проявляється аномальною оптичною активністю дослідної дисперсії. Цей біосенсор використовується для визначення агентів, що руйнують суперспіральну ДНК. Серед широкого різноманіття біосенсорів хочу ще окремо згадати світлочутливі біосенсори, як яскравий приклад використання біологічного матеріалу. Світлочутливі біосенсори - це прилади, що містять в якості робочого матеріалу ті чи інші фоточутливі біологічні структури (макромолекули, фоторецепторні мембрани) і призначені для реєстрації, перетворювання та зберігання оптичної інформації. Відправним пунктом та стимулом до розробки та створення таких сенсорів слугують дані про високу квантову ефективність, чутливість та широкий динамічний діапазон природніх світлочутливих систем, що беруть участь в таких процесах, як зір, фотосинтез та ін. Важливу роль в створенні молекулярних приладів відіграють біомолекули, а саме, природні хромофор-білкові комплекси, що містяться в фоторецепторних та енергоперетворюючих мембранах.

2. Перетворювачі різних типів, що використовуються в біосенсорах

2.1 Електрохімічні біосенсори

Електрохімічні біосенсори являють собою електрохімічні перетворювачі в поєднанні з ферментами. Ферментні електроди були найпершими описані в літературі та розроблені на комерційному доступному рівні. Ферментні реакції можна вимірювати використовуючи амперометричні, потенціометричні та кондуктометричні біосенсори. Амперометричні біосенсори вимірюють електричний струм, коли напруга виникає між робочим електродом та електродом порівняння. З хімічного боку також впливають окисно-відновні реакції, що викликають струм. Найбільш поширенним прикладом такого роду аналізу є визначення глюкози з використанням глюкозоксидази:

Глюкоза + Кисень ---- Глюконолактон + Перекис водню

Зміну концентрації кисню можна визначити за допомогою кисневого електроду Кларка, на якому кисень проникає крізь напівпроникну мембрану, щоб відновитися на платиновому електроді. Навпаки, зміна концентрації перекису водню спостерігається при окисленні на платиновому електроді. Обидва ці підходи мають фундаментальні недоліки. Атмосферний кисень може вносити похибки, до того ж важливим є не допустити впливу інших електроактивних компонентів. Щоб уникнути похибок, в ферментних реакціях, використовують альтернативні джерела електронів. Ці акцептори електронів відомі як медіатори, що переносять електрони між реагентами та електродом. Прикладом такого медіатору слугує залізо (Fe/Fe3+):

Глюкоза + 2Fe+ ------ Глюконолактон + 2Fe + 2H+

Залізо окислюється на аноді, щоб відновитися в реакції. Сенсор не є чутливим до кисню. Найвища межа лінійного ряду може бути підвищена використанням мембрани, яка б лімітувала рівень дифузії глюкози до електрода так, що б кінетика зворотньої реакції не залежала від константи спорідненості (Km) ферменту. Принцип медіаторного амперометричного біосенсору було використано для ряду аналізів, вимірюючих спирт, СО, D-галактозу, гліколат та L-амінокислоти.

Потенціометричний ферментний електрод характеризується тим, що різниця потенціалів формується на чутливому елементі і вона вимірюється дуже чутливим приладом, до того ж не виникає току крізь мембрану і тому рівень дифузії не є важливим. Потенціометричні сенсори, що використовуються в біосенсорах, включають іоноселективні електроди, газочутливі електроди та польові транзистори. Іоноселективні та газочутливі електроди вже широко застосовуються в клінічному аналізі і знайшли місце в біосенсорах. Водневий іоноселективний електрод (рН-електрод) був використаний для аналізу пеніциліну, з використанням ферменту беталактамази, яка перетворює пеніцилін на пеніцилову кислоту. Електрод рН визначає концентрацію кислоти. Амонійний іоноселективний електрод було використано в поєднанні з імобілізованою уреазною мембраною для визначення сечовини в крові.

Польовий транзистор (ПТ) - це перетворювач, в якому провідність напівпровідникового матеріалу контролюється електричним полем. В нормі тут наявний лише незначний струм між джерелом та витоком, але зміна напруги відповідної полярності та величини на затворі призводять до виникнення струму між джерелом та витоком. Іоноселективний польовий транзистор (ІСПТ) включає іоноселективну мембрану, яка дозволяє прохід тільки одному типу іонів. рН-чутливий ПТ був використаний в поєднанні з ферментами, такими як беталактамаза та глюкозооксидаза, для розпізнавання пеніциліну та глюкози, як і очікувалося.

2.2 Оптичні біосенсори

Оптоволоконні проби та сенсори мають виключну роль в медицині для in vivo та in vitro аналізу. Вони є дійсно безпечними та біосумісними для використання всередині людського тіла. Чутливі до змін рН барвники, такі як бромотімол синій та бромокрезол зелений, були імобілізовані у поєднанні з відповідними ферментами на прозорих мембранах, які використовувалися на твердофазних оптоелектронних сенсорах. Ферменти, що використовувалися - це пеніцилаза, уреаза та глюкозоксидаза. Коли проходила ферментна реакція, спостерігали зміни кольору барвника. Це фіксувалося з використанням світла відповідної довжини хвилі. Цей та інші методи, базовані на рН, страждають від притаманної їм проблеми - буферних властивостей та рН біологічних рідин.

Чутливість може бути підвищена, якщо дослідити зміни, які мають місце з боку оптоволокна чи світловоду і підвищити площу поверхні, що придатна для біологічного компоненту біосенсора. Світло передається по світловоду через велику кількість внутрішніх відбивань. При кожному відбитті частина світла (зникаюча хвиля) виходить до оточуючого середовища навколо провідника. Зникаюча хвиля забирає тільки фракцію з хвилі світла на поверхню, а потім знову повертається до провідника. Зміни в оптичних якостях поверхні світловода можуть певним чином вплинути на світло, що проходить по ньому. Зникаюча хвиля відчуває вплив тільки на дуже маленькій дистанції від світловода і тому на неї не впливає оточуюче середовище. Це допомагає подолати деякі проблеми з аналізом непрозорих та забарвлених розчинів, які часто не можливо виміряти в клінічному аналізі, через проблеми зі спектрофотометрією. Імуноглобулін людини (IgG) було виміряно приєднанням антисироватки до поверхні світловода та завдяки його здатності реагувати з антигеном (IgG). Підвищення кількості комплексів антисироватка-антиген викликає зміни в складі світла, що визначається фотодетектором під певним кутом до напрямку світла, що проходить крізь світловод.

Інший чутливий оптичний біосенсор використовує поверхневий плазмонний резонанс (ППР), ППР - це рух електронів на поверхні металевого провідника, викликаний дією світла певної довжини хвилі під певним кутом. На дифракційній гратці це має ефект поглинання світлової енергії при певній довжині хвилі, яке залежить від діелектричної константи покриття у контакті з металевою поверхнею. Це викликає появу смуги в спектрі, отриманому з дифракційної гратки. Діелектрична константа залежить не тільки від змін іонного поглинання на поверхні, але і від природи біологічних молекул, що посадженні на поверхню.

2.3 Калориметричні біосенсори

Багато ферментних реакцій є екзотермічними, і теплота, що виділяється протягом реакції, може бути виміряна термістором чи чутливими до температури напівпровідниковими приладами. Більшість ферментних реакцій супроводжується виділенням тепла на рівні 5-100 кДж/моль та типовою зміною температури, яку на рівні 10-2оС можна зафіксувати. Цей принцип покладений в проточну модель широкого ряду аналізів клінічно важливих речовин.

Фермент був імобілізований на маленьких часточках у колонці, що сполучається з термістором чи оточує його. Об'єми зразка має бути не менше 10мл і система має здатність аналізувати до 30 зразків за годину. Ферментний термістор для розпізнавання алкоголю в крові, в якому алкоголь оксидаза імобілізована на скляних кульках на проточній системі, що контролюється термістором. Система, яка була використана для аналізу алкоголю в крові, може розпізнавати до 0.2ммоль/л метанолу, етанолу чи бутанолу з лінійністю до 2ммоль/л. Нажаль, фермент, що був використаний, не розрізняє спирти.

Альтернативне використання термісторних приладів має місце в імуносорбентному аналізі, який має назву - “Термометричний ферментноміточний імуносорбентний аналіз” (TELISA). Колонка заповнена імуносорбентом (антитіло, імобілізоване на Сефарозі CL 4B). Дослідний антиген поглинається, а мічений антиген вивільняється до потоку. При наявності субстрату порція міченого антигену зв'язується і викликає виділення теплоти. Ця система здатна до визначення 10-10 М (5мг/л) сироваточного альбуміну людини і загальний час такого аналізу (враховуючи регенерацію) складає 10 хвилин. Калориметричні прилади можуть бути мініатюризовані, при використанні інтерферометрії. Ця технологія полягає у зсуву по фазі світла у визначаючому проміні відносно перевіряючого. Оптичне волокно може бути розширене під дією теплоти, що виділяється під час ферментної реакції, і це дає зміну у фазі світла. Система дуже чутлива до маленьких змін температури.

біосенсор потенціометричний ферментний імуносорбентний

2.4 Мікрогравіметричні та акустичні біосенсори

П'єзоелектричні кристали можуть бути використані як гравіметричні біосенсори в імуноаналізі. Перемінний струм подається крізь п'єзоелектричний матеріал, наприклад, кварцевий кристал, викликаючи певні механічні зміни. На певній частоті коливань виникає механічний чи акустичний резонанс. Частота цього резонансу залежить від маси поверхні кристалу. Кварцевий п'єзоелектричний кристал може бути покритий Ат чи Аг, для аналізу комплементарних Аг чи Ат. Сполучення, що має місце, викликає зміну у масі на поверхні кристалу. Ця зміна у масі визначається зміною у частоті резонансу кристалу.

3. Використання біосенсорів в клінічній діагностиці

Біосенсори - маленькі, акуратні, швидкі та недорогі аналітичні інструменти. Деякі ферментні електроди вже завоювали місце в світовій клінічній практиці як неперевершені аналізітори глюкози та сечовини. Біологічний компонент дає йому специфічність, але дещо обмежує у стабільності ферментів та оптимальності середовища, що повинні мати місце в ферментних та імунних дослідних системах. Біосенсори завжди економні у використанні біологічного матеріалу. Чутлива ділянка ферментного ПТ складає (0.5мм) і вимагає дуже мало ферменту. Це може допомогти заощадити кошти, коли потрібен дорогий фермент.

Флуктуації температур можуть вносити похибки в деякі вимірювання і ця проблема має бути розвґязана. До того ж, існують певні проблеми з аналізом непрозорих або забарвлених зразків. На данний момент можна виміряти такі розчини тільки за допомогою технології зникаючих хвиль. Але не зважаючи на ці проблеми, більшість перетворювачів використовуються в міцних сенсорних системах та електронному обладнанні, враховуючи специфіку їх обслуговування. Зниження ціни на електронні компоненти повинно стати гарантом виробництва біосенсорів недорогими та у великій кількості. Нажаль більшість біосенсорів перебувають у стані розробки і велика частина можливої інформації є таємною. Небажаним є використання біосенсорів у клінічній практиці, якщо є хоч якісь проблеми з їх обслуговуванням, вони підлягають подальшій розробці.

Але всеж таки біосенсори можуть віднайти наступні ммісця застосування:

o самообстеження пацієнта

o аналізи, що виконуються в приймальні лікаря

o in vivo моніторинг

o проведення імуноаналізу швидше ніж звичайно

o незалежне від централізованих лабораторій самообстеження

o адаптація до зниження фінансування медичних установ.

Провадяться роботи по впровадженню імплантованих біосенсорів. За допомогою таких біосенсорів можна визначати потрібні дози ліків. Ці біосенсори найбільш привабливі до лікування діабету. Вони можуть бути використані в поєднанні з дозаторами інсуліну або простіше, з гіпоглікаемічною контрольною системою. Використання імплантованих біосенсорів було перевірено на тваринах та людях, і це показало що їх можна використовувати, результати зіставимі з отриманими ex vivo.

Є певні вимоги до використання імплантованих біосенсорів:

1. Подолання здатності тіла віддаляти будь-який інородний матеріал через формування протеінових оболонок.

2. Стерилізація приладу без пошкодження аналітичних властивостей.

3. Стійкість до впливу внутрішніх речовин.

4. Уникання будь-якого електричного розряду.

5. Прилад не має викликати будь-якої токсичної відповіді організму.

6. Надійність від пошкоджень, що можуть викликати попадання маленьких часточок до кровообігу.

7. Прилад має бути дуже маленьким та зручним, щоб його можна було розташувати в середині людського тіла без будь-якого дискомфорту.

Більшість публікацій про імплантовані біосенсори повґязується з електродними приладами. Оптоволоконні датчики вже завойували своє місце у медицині і широко використовуються для внутрішніх обстежень людського тіла. Вони ізольовані від будь-якого електричного контакту з тілом. Біосенсори були комерційно-доступними в клінічному аналізі з 1970 року, але вони рідко застосовуються. Сучасні технологічні розробки обіцяють використати їх потенційні можливості на повну силу та зробити революцію в клінічному аналізі. Біосенсори виходять за межі лабораторій, з їх професійним персоналом, до звичайних споживачів.

Висновки

1. Біосенсори - це надзвичайно чутливі та специфічні прилади, що досягають такого рівня чутливості завдяки використанню біологічного матеріалу в поєднанні з надзвичайно тонкими за будовою перетворюючими компонентами.

2. В складі біосенсорів може бути використаний найрізноманітніший біологічний матеріал, від простої біомолекули до цілого організму.

3. У створенні біосенсорів використовуються різноманітні фізикохімічні методи, що включають у себе електрохімію, хімію полімерів, волоконну оптику, імунологію, біохімію та молекулярну біологію.

4. Біосенсори можуть бути використані в широкому спектрі наук. Вони можуть бути використані в медицині для самообстеження та самоконтролю пацієнтами, для моніторингу навколишнього середовища, для контролю за якістю харчових продуктів. Але особливу увагу привертає придатність деяких типів біосенсорів для використання in vivo.

5. Отже, біосенсори є надзвичайно вдалим досягненням сучасної науки і перед цією галуззю лежить необмежене поле діяльності.

Размещено на Allbest.ru