Характеристика медицинского препарата "Ритуксимаб" и исследование его токсичности при лечении неходжкинских лимфом

Размещено на http://www.allbest.ru

Размещено на http://www.allbest.ru

Введение

Аутоиммунные заболевания включают более 80 нозологических форм и относятся к числу наиболее распространенных и тяжелых болезней человека, частота которых в популяции составляет 5-8%. Для лечения аутоиммунных заболеваний используется широкий спектр препаратов, обладающих противовоспалительной (глюкокортикоиды - ГК), цитотоксической или иммуносупрессивной (в низких дозах) активностью, большая часть из которых создавалась для лечения злокачественных новообразований или подавления отторжения трансплантата. Рациональное применение этих препаратов на ранних этапах болезни, в сочетании с экстракорпоральными методами очищения крови в период обострения, позволило существенно улучшить непосредственный и отдаленный прогноз, однако во многих случаях не позволяет контролировать прогрессирование заболевания, развитие угрожающих для жизни осложнений или ассоциируется с тяжелыми побочными эффектами.

Среди разнообразных иммунных нарушений, лежащих в основе развития аутоиммунных заболеваний, изучение дефектов В-клеточной регуляции вызывает особый интерес, в том числе и с точки зрения разработки новых патогенетически обоснованных подходов к лечению . В-лимфоциты - клетки иммунной системы, участвующие в развитии и поддержании адаптивного иммунитета, образуются из гемопоэтических предшественников в костном мозге в течение всей жизни человека, участвуют в поддержании иммунологической толерантности к собственным антигенам (аутоантигенам). Дефект В-клеточной толерантности приводит к синтезу аутоантител, которые, активируя эффекторные звенья иммунного ответа, индуцируют развитие воспаления и деструкции тканей организма человека. Однако значение В-клеток в развитии аутоиммунных заболеваний не исчерпывается только синтезом «патогенных» аутоантител. Установлено, что нарушение В-клеточной ко-стимуляции Т-лимфоцитов играет фундаментальную роль в развитии аутоиммунных реакций и может развиваться на самых ранних стадиях патологического процесса до клинической манифестации и заболевания. Кроме того, по данным клинических и эпидемиологических исследований, у пациентов с аутоиммунными ревматическими заболеваниями наблюдается увеличение риска развития В-клеточных неходжскинских лимфом. Все это вместе взятое делает В-клетки перспективными терапевтическими «мишенями» при аутоиммунных заболеваниях.

1. Неходжкинские лимфомы

Неходжкинские лимфомы - это группа онкологических заболеваний, поражающих лимфатическую систему. В эту группу входит около 30 заболеваний. Локализуются они в лимфатических узлах, но могут поражать также костный мозг и кровь.

Признаки.

Для всех неходжкинских лимфом характерно увеличение лимфатических узлов. Обычно в первую очередь увеличиваются подмышечные, шейные и паховые узлы. В отличие от инфекционных заболеваний, увеличенные лимфоузлы безболезненны, и не уменьшаются при приеме антибиотиков. Это сопровождается жаром, усталостью, слабостью, ночным обильным потоотделением. Аппетит при этом снижается, пациент начинает терять вес.

Лимфома может проявляться увеличением селезенки или печени. При этом пациента беспокоят чувство переполнения желудка, и затруднение дыхания, кашель.

Симптомами неходжкинских лимфом могут быть также боли в костях, сыпь, твердые образования под кожей.

Но бывает и так, что заболевание протекает бессимптомно. В этом случае его может заподозрить только врач в ходе планового обследования.

Описание.

В России ежегодно диагностируется около 25 000 случаев лимфом. 12 % из них - болезнь Ходжкина, остальные - неходжкинские лимфомы. Средний возраст страдающих неходжкинскими лимфомами - 50-60 лет, у детей эти заболевания встречаются редко. Мужчины заболевают обычно чаще женщин.

Главная задача лимфатической системы человека - это борьба с инфекциями. Борется он с ними при помощи специальных клеток - лимфоцитов. Они бывают нескольких типов - Т-лимфоциты, В-лимфоциты и NK-лимфоциты (нормальные киллеры). Основная их масса находится в лимфатических узлах, однако есть они и в крови, и в селезенке, и в костном мозге.

Неходжкинская лимфома начинается с того, что в ДНК одного лимфоцита происходит мутация, в результате которой появляется поколение неполноценных лимфоцитов. И в этом случае лимфатическая система уже не может работать как прежде. В зависимости от того, лимфоцит какого типа мутировал, выделяют Т-клеточные и NК-клеточные лимфомы, образованные, соответственно, из Т-лимфоцитов и NK-лимфоцитов (15 % случаев всех неходжкинских лимфом) и В-клеточные лимфомы, образованные из В-лимфоцитов (85 % случаев всех неходжкинских лимфом).

Самая распространенная лимфома - диффузная крупноклеточная В-клеточная лимфома (ККЛ), заболевание этого подтипа регистрируют примерно в 30% всех случаев неходжкинских лимфом.

Почему происходит эта мутация, пока неизвестно. Однако врачи предполагают, что причина - пестициды и гербициды. Предполагается, что причиной этих лимфом могут быть и вирусы, такие как, например,вирус Эпштейна-Барр или ВИЧ. Подозревают в причастности к развитию неходжкинских лимфом и Helicobacter pylori. По наследству эти заболевания не передаются. Однако есть некоторые наследственные факторы, увеличивающие риск развития неходжкинских лимфом.

Риск развития неходжкинской лимфомы возрастает с годами. Так, среди молодежи в возрасте 20-24 лет частота заболеваемости 2,4 человека на 100 000 населения. Среди пожилых людей в возрасте 60-64 лет частота заболеваемости выше - примерно 46 случаев на 100 000 человек. А среди пациентов 80-84 лет

От стадии и категории зависит выбор лечения пациента.

Диагностика.

Для постановки правильного диагноза необходимо пройти осмотронколога, сдать общий и биохимический анализы крови, общий анализ мочи, анализ крови на антитела к вирусам гепатита В и С.

Также делают ультразвуковое исследование лимфатических узлов, комплексное ультразвуковое исследование внутренних органов,рентгенографию легких, пункцию лимфатических узлов, пункцию костного мозга.

Лечение.

Для лечения неходжкинских лимфом используют химиотерапию, лучевую терапию и трансплантацию стволовых клеток. Также может применяться и выжидательная тактика. Химиотерапия - это воздействие на организм сильнодействующих препаратов с высоким уровнем токсичности. Делают это для того, чтобы уничтожить раковые клетки, однако при лечении страдают и здоровые клетки. Обычно курс лечения состоит из четырех различных препаратов. Лечение проводится циклами.

Лучевая терапия применяется, если заболевание локализовано в одной области тела. Излучение направляется только на пораженный орган, остальные органы пациента надежно защищаются специальным экраном. Однако для лечения лимфом этот метод используется редко, так как лимфомы быстро метастазируют.

Трансплантацию стволовых клеток проводят, если лимфомы устойчивы к терапии или при рецидивах заболевания.

Профилактика.

Профилактики неходжкинских лимфом на сегодня не существует, так как неизвестны точные причины развития этой группы заболеваний.

2. Ритуксимаб

Первым и пока единственным анти-В-клеточным препаратом, разрешенным к применению в клинической практике, является ритуксимаб (Rituximab, МабТера «Ф. Хоффман-Ля Рош Лтд.»).

Ритуксимаб -- противоопухолевое средство из группы моноклональных антител.

Представляет собой синтетические (генно-инженерные) химерные моноклональные антитела мыши/человека, обладающие специфичностью к CD20 антигену, обнаруживаемому на поверхности нормальных и малигнизированных В-лимфоцитов. По структуре ритуксимаб относится к иммуноглобулинам класса G1 (IgG1 каппа), его молекула содержит мышиные вариабельные фрагменты легких и тяжелых цепей и человеческий постоянный сегмент. Ритуксимаб состоит из 2 тяжелых цепей из 451 аминокислот и 2 легких цепей из 213 аминокислот и имеет молекулярную массу примерно 145 кД. Аффинность ритуксимаба к CD20 антигену примерно 8 нМ. Химерные анти-CD20 антитела продуцируются находящимися в питательной среде клетками млекопитающих (культура клеток китайского хомячка), в которые был внедрен полученный путем генной инженерии химерный ген.

Выбор CD20 молекулы в качестве мишени для моноклональных антител связан с особенностями дифференцировки В-клеток, которые в процессе созревания от стволовых клеток в плазматические клетки проходят несколько последовательных стадий, для каждой из которых характерна экспрессия определенных мембранных молекул (рис. 1). Экспрессия CD20 наблюдается на мембране «ранних» и зрелых В-лимфоцитов, но не стволовых, «ранних» пре-В, дендритных и плазматических клеток. Поэтому их истощение не отменяет регенерацию пула В-лимфоцитов и не влияет на синтез иммуноглобулинов плазматическими клетками. Кроме того, CD20 не высвобождается с мембраны В-лимфоцитов в кровяное русло и поэтому не блокирует взаимодействие ритуксимаба с В-клетками, что увеличивает эффективность терапии. Полагают, что способность ритуксимаба элиминировать В-клетки реализуется за счет нескольких механизмов, в том числе комплемент-зависимой и антитело-зависимой клеточной цитотоксичности, а также индукции апоптоза . В свою очередь истощение В-клеток может оказывать существенное влияние на основные механизмы развития аутоиммунных заболеваний человека и имеет серьезное патогенетическое обоснование:

* ослабление антиген-презентирующей функции В-клеток в отношении индукции пролиферации и синтеза цитокинов CD4+ Т-клетками;

* деструкция аберрантных ростковых центров, что приводит к снижению образования аутоантиген-специфичных В-клеток памяти, плазматических клеток и синтеза антител;

* истощение предшественников плазматических клеток, что приводит к подавлению синтеза антител и образования иммунных комплексов;

* модуляция активности других аутореактивных клеток за счет нарушения функции Т-клеток;

* активация Т-регуляторных клеток (CD4+ CD25+).

В настоящее время возможность эффективного контроля аутоиммунных патологических состояний путем истощения (и/или модуляции функции) В-клеток доказана в клинических исследованиях. Об этом свидетельствует высокая эффективность ритуксимаба при наиболее распространенном и тяжелом аутоиммунном ревматическом заболевании - ревматоидном артрите, что послужило основанием для регистрации препарата для лечения этого заболевания.

В последние годы очень быстро накапливается клинический опыт применения ритуксимаба для лечения других аутоиммунных заболеваний человека. Следует особо подчеркнуть, что в большинстве случаев ритуксимаб назначали пациентам с очень тяжелым течением болезней, которые были резистентны к стандартной глюкокортикоидной и цитотоксической терапии, внутривенному иммуноглобулину, экстракорпоральным методам очищения крови, нередко по жизненным показаниям.

Токсичность ритуксимаба.

Результаты исследований.

Результаты сравнительных исследований острой по подострой токсичности ритуксимаба у лабораторных животных с определением максимально переносимой дозы, токсичной дозы и органов мишеней токсического воздействия

Ритуксимаб -- препарат химерных моноклональных антител мыши/человека, состоящих из постоянного сегмента человеческого иммуноглобулина IgG1 и вариабельных сегментов мышиных антител, аффинных к CD20 антигену В-лимфоцитов. Ритуксимаб очень специфичен. Он связывается только с человеческим антигеном CD20 и не действует на CD20-клетки мышей. Таким образом, изучение препарата в исследованиях на лабораторных животных затруднено. Учитывая это, нами выполнены исследования общей острой и подострой токсичности препарата у животных. Тем не менее, специфическая токсичность препарата исключена дальнейшими клиническими и пострегистрационными исследованиями. Таким образом, токсичность препарата следует оценивать по совокупности данных, а не только по результатам токсикологических исследований на животных.

По данным исследований острой и подострой токсичности у мышей, максимальная переносимая доза препарата составляет 200 мг/кг. Сравнительные исследования для разных препаратов ритуксимаба не проводились. Однако токсикологические исследования проведены таким образом, что данные о безопасности препарата, полученные для разных препаратов, можно сравнивать между собой.

Острая токсичность. Было сформировано 4 группы мышей по 5 животных одного пола в каждой. Мыши получали однократную дозу Редитукса в размере 0 (буферный раствор препарата), 25, 75 и 200 мг/кг. Далее животные наблюдались в течение 14 дней после инъекции. Фиксировались данные о смертности, клинических проявлениях токсичности, массе тела и макроскопических патологоанатомических изменениях. После однократного внутривенного введения Редитукса в дозе до 200 мг/кг случаев смерти мышей не было. Таким образом, уровень препарата, не вызывающий видимого эффекта (NOEL), для мышей превышает 200 мг/кг.

Подострая токсичность. Целью исследования была оценка общей токсичности при многократных внутривенных инъекциях препарата белой домовой мыши с однонедельными промежутками между инъекциями. Было сформировано 4 группы мышей по 6 животных одного пола в каждой. Дополнительная группа из 5 мышей одного пола использовалась в качестве контрольной. Животные получали Редитукс в дозах 0 (буферный раствор препарата), 25, 75 и 200 мг/кг один раз в 7 дней, всего 3 инъекции. Фиксировались следующие данные: смертность, клинические проявления токсичности, масса тела, количество потребляемой пищи, данные лабораторных анализов, вес органов и макроскопические патологоанатомические изменения. Многократное (3 раза) внутривенное применение Редитукса хорошо переносилось и не вызвало ни одного смертельного случая у домовых мышей в дозе до 200 мг/кг. Редитукс не оказывал влияние на массу тела животного, аппетит, общий и биохимический анализ крови и вес органов, а также не приводил к каким-либо макроскопическим патологическим изменениям.

3. Выбор экспериментальной модели

Обоснование выбора экспериментальной модели для изучения токсичности на основании а) способности ритуксимаба связываться с CD20 рецепторами В-лимфоцитов; б) характера воздействия Редитукса и Мабтеры на ткани по данным о перекрестной реактивности

Ритуксимаб очень специфичен. Он связывается только с человеческим антигеном CD20 и не действует на CD20-клетки мышей. Выбранная экспериментальная модель нацелена на выявление непредвиденного токсического эффекта препарата. Выбор экспериментальной модели в первую очередь определялся необходимостью оценить максимальную переносимую дозу ритуксимаба. Однако результаты исследований на животных нельзя экстраполировать на человека, т.к. любые животные, кроме яванского макака, не являются репрезентативной моделью.

Согласно опубликованным данным (Scientific Discussion, EMEA, 2005), ритуксимаб высоко специфичен к антигенам CD20 В-лимфоцитов. В токсикологических исследованиях, проведенных на яванском макаке, не выявлено иных фармакологических эффектов препарата, кроме ожидаемого истощения пула В-клеток в периферической крови и лимфоидной ткани. Кроме указанного действия препарата других патофизиологических и гистопатологических изменений не выявлено. В частности, не было отмечено влияния препарата на гемопоэз. В исследованиях препарат не влиял на Т-клетки и другие CD20-отрицательные лимфоциты. Препарат не влияет на функцию CD20-отрицательных плазматических клеток, которые вырабатывают антитела.

Ритуксимаб не связывается с CD20 рецепторами В-лимфоцитов мышей. Однако нами продемонстрирована способность препарата связывается с этим рецептором в клеточной линии человеческих лимфобластоидных клеток, экспрессирующих CD20 антиген (линия Wil-2S, источник -- American Type Culture Collection, США) Способность ритуксимаба связываться с CD20 рецептором количественно оценивалась по графику относительной интенсивности флуоресценции в зависимости от логарифма концентрации антитела. Анализ проводился четырехпараметрической программой аппроксимации кривой по точкам (SoftMax Pro). График 1 отражает связывание препарата с CD20 рецепторами клеток линии Wil2-S. Относительная интенсивность флуоресценции снижается по мере увеличения концентрации антитела.

Тест связывания CD20 рецепторов измеряет аффинность ритуксимаба к человеческим В-клеткам линии Wil-2S, экспрессирующим CD20 антиген. Тест основан на дозозависимой конкуренции молекул ритуксимаба с биотинилирированным препаратом Мабтера за CD20 рецепторы на поверхности клеток линии Wil-2S. Степень связывания биотинилинированного препарата Мабтера затем измеряется в проточном цитометре с использованием конъюгата стрептавидин-фикоэритрина.

По данным литературы, ритуксимаб обладает высокой специфичностью к В-клеткам человека и приводит к истощению их пула. Для демонстрации этого эффекта мы использовали ex vivo тест истощения пула В-клеток с кровью человека. Ex vivo тест истощения пула В-клеток проводится путем инкубации 90 мкл цельной человеческой крови от здоровых добровольцев с 10 мкл разведенного ритуксимаба в течение 4 часов при температуре 37 °С, после чего с помощью проточной цитометрии измеряется уменьшение количества CD19-положительных лимфоцитов. Перед проведением проточной цитометрии кровь обрабатывается антителами анти-CD45, меченными флуоресцеинизотиоционатом (FITC), для окраски всех лейкоцитов (эти антитела связываются с антигеном, экспрессируемым всеми лейкоцитами) и антителами анти-CD19, меченными фикоэритрином (PE), для специфической окраски В-клеток. Эритроциты подвергаются лизису, а лейкоциты фиксируются. В каждом образце определяется доля CD19-положительных клеток при прохождении через проточную ячейку цитометра. Доля CD19-положительных клеток в образце мононуклеаров периферической крови, инкубированных с раствором без ритуксимаба, принимается за 100 %.

Однако доклинических исследований, демонстрирующих перекрестную реактивность препаратов, проведено не было. По мнению доктора Редди, такие исследования, хотя и представляли бы определенную ценность, для развития препарата не имеют большого значения, т.к. исследования на мышах не позволяют прогнозировать действие препаратов у человека из-за высокой специфичности ритуксимаба к CD20-положительным клеткам человека.

Результаты исследований репродуктивной токсичности препарата у животных обоих полов.

Согласно стандартам ВОЗ и Европейского агентства оценки медицинских продуктов (EMEA), на этапе доклинических исследований исследование влияния препаратов подобных ритуксимабу на репродуктивную функцию и развитие плода проводить не обязательно.

Исследование перекрестной реактивности Редитукса и Мабтеры. Сравнительное исследование иммунотокичности (Редитукс в сравнении с Мабтерой) с помощью теста нейтрализующей активности антител

По данным различных литературных источников, ритуксимаб специфично связывается с эпитопом CD20 антигена на поверхности В-лимфоцитов человека. Антиген CD20 экспрессируется как на нормальных В-лимфоцитах, так и на опухолевых В-клетках лимфом. Антиген отсутствует на пре-В-клетках и на плазматических клетках.

Ритуксимаб не связывается с В-клетками мышей, поэтому иммунологическая реакция в организме животного не соответствует реакции в организме человека. По этой причине мы не изучали иммунологический аспект токсичности препарата в наших исследованиях. Изучение антигенных свойств ритуксимаба в таких доклинических исследованиях не имеет никакой прогностической ценности для человека.

В наших клинических исследованиях изучалось появление нейтрализующих антител к препарату: нейтрализующие антитела после лечения Редитуксом не выявлены.

4. Доклинические исследования

ритуксимаб противоопухолевый моноклональный лимфома

Процесс создания лекарства очень долгий и трудоемкий. Он включает в себя множество испытаний в центре доклинических исследований, без которых невозможно появление препарата на рынке. Именно доклинические исследования лекарственных препаратов являются основой для проведения в дальнейшем клинических испытаний.

Этот этап включает в себя определение:

· общей токсичности;

· репродуктивной токсичности

· терратогенности;

· аллергенности;

· иммуннотоксичности;

· фармакокинетики;

· фармакодинамики;

· мутагенности;

· канцерогенности.

Проводятся доклинические исследования на животных, чтобы минимизировать вероятность неблагоприятных реакций при испытании на людях. Именно доклиника дает возможность определить показания к применению препаратов, противопоказания и побочные эффекты, чтобы в дальнейшем определиться с объемом клинических испытаний и самой возможностью их проведения.

Особенности проведения доклинических исследований лекарственных препаратов.

Исследование оригинальных препаратов включает в себя общую и специфическую токсичность, а также фармакодинамику и фармакокинетику. При проведении доклинических исследований лекарственных средств-дженериков ограничиваются лишь общей токсичностью и фармакокинетикой (в некоторых случаях дополнительными исследованиями).

Кроме того, на доклинике определяют дозозависимость эффектов лекарства. Именно доклиническое исследование на животных дает возможность узнать максимально возможную безопасную дозу, а также целесообразность ее повышения. Проведение доклинических исследований обязательно сопровождается подробным отчетом обо всех важных аспектах проведенной работы, в том числе информация об использованных животных, способы введения лекарства, применяемые концентрации, а также обработанные данные полученных результатов. Также обосновываются предполагаемые дозы для будущих клинических испытаний.

Эффективность и безопасность российского биоаналога ритуксимаба показана в доклинике.

Доклинические исследования проводятся в соответствии с международными требованиями, предъявляемыми к изучению данного класса препаратов, на яванских макаках (Macaca fascicularis), чувствительных к действию ритуксимаба. В ходе экспериментов показано, что действие биоаналога ритуксимаба полностью идентично действию препарата сравнения (Мабтера) - их внутривенное введение приводит к одинаковому дозозависимому снижению числа CD20 позитивных В-лимфоцитов в крови, не вызывая нарушения функции жизненно важных органов. Ранее была показана полная идентичность физико-химических свойств разработанного компанией «БИОКАД» биоаналога и препарата Мабтера.

Объем продаж ритуксимаба в России составляет более 4,5 млрд. рублей (150 млн. долларов) в год. Закупка данного лекарственного средства в основном производится за счет средств федерального бюджета в рамках программы «7 нозологий». Реализация данного проекта позволит прекратить закупки ритуксимаба за рубежом. Прямая экономия средств государственного бюджета в результате 100% замещения импортируемого оригинального препарата составит более 1,5 млрд. рублей в год в ценах 2010 г. Кроме того, локализация производства лекарственных средств на основе моноклональных антител увеличит поступление налогов в бюджеты и внебюджетные фонды в размере от 0,5 млрд. рублей ежегодно.

Размещено на Allbest.ru