Порушення NO-залежної регуляції скорочувальних реакцій серця та судин за умов експериментального цукрового діабету

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ ім. О.О. БОГОМОЛЬЦЯ

УДК 616.379-008.64+616.12-008.092

14.03.04 - Патологічна фізіологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Порушення no-ЗАЛЕЖНої регуляції скорочувальних реакцій судин та серця за умов експериментального цукрового діабету

ПРИСЯЖНА

ОЛЕКСАНДРА ДМИТРІВНА

Київ

2006



ДИСЕРТАЦІЄЮ Є РУКОПИС

Роботу виконано у відділі фізіології кровообігу

Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця

Науковий керівник: член-кореспондент НАН України,

доктор медичних наук професор

Сагач Вадим Федорович

заступник директора Інституту фізіології

ім. О.О. Богомольця НАН України з наукової роботи

завідувач відділу фізіології кровообігу

Офіційні опоненти: доктор медичних наук

Нещерет Олександр Павлович

Інститут ендокринології та обміну речовин

ім. В.П. Комісаренка АМН України

провідний науковий співробітник

доктор медичних наук професор

Французова Стелла Борисівна

Національний медичний університет ім.О.О.Богомольця.

зав. лабораторією патологічної фізіології та фармакології

кровообігу науково-дослідного лабораторного центру

Провідна установа: Інститут геронтології АМН України, лабораторія фізіології.

Захист відбудеться " 20 " червня 2006 р. о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.198.01 при Інституті фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України за адресою: 01024,

м. Київ, вул. Богомольця 4.

З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці Інституту фізіології

ім. О.О. Богомольця НАН України за адресою: 01024, м. Київ,

вул. Богомольця 4.

Автореферат розісланий " 15 " травня 2006 р.

Учений секретар

Спеціалізованої вченої ради Д 26.198.01 Сорокина-Маріна З.О.

Доктор біологічних наук



ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. Діабетична ангіо- та кардіоміопатія є розповсюдженими ускладненнями цукрового діабету, що негативно впливають на якість життя хворих. До 75% усіх випадків смерті хворих на цукровий діабет обумовлені ускладненнями з боку серцево-судинної системи. Такі дані вказують на необхідність пошуку механізмів розвитку порушень скорочувальних реакцій серця і судин та можливих шляхів їх корекції.

Дисфункція ендотелію відіграє значну роль у порушенні судинної реактивності за умов таких патологічних станів як атеросклероз, артеріальна гіпертензія, ішемія - реперфузія, хвороба Паркінсона, а також у процесі старіння [T.F. Luscher et al., 1986; R.M. Palmer et al., 1987, 1988; R.J. Gryglewski et al., 1988, 1995; S. Moncada et al., 1991; J.R. Vane 1993; В.Ф. Сагач та ін., 1993, 1998, 2000; В.В. Фролькіс, В.В. Безруков та ін., 1994, 2003; О.О. Мойбенко та ін. 1997, 2004]. На сьогоднішній день показано, що основною ланкою патогенезу діабетичної ангіопатії є ендотеліальна дисфункція [F. Cosentino, 1998; J. Calles-Escandon et al., 2001; A.S. De Vriese et al., 2000]. За умов цукрового діабету спостерігаються множинні порушення функції ендотелію, більшість з яких можуть бути пов'язані з гіперглікемією [S. Makimattila et al., 1996; L. Rodriguez-Manas et al., 2003] та основним механізмом глюкозотоксичності - оксидативним стресом. Однак, багато питань щодо шляхів порушення судинних реакцій залишаються невирішеними.

Дослідження механізмів порушення серцево-судинної реактивності та виявлення можливих шляхів попередження та корекції таких порушень є актуальною метою. Результати таких досліджень можуть бути корисними для подальшого впровадження в клінічну практику.

Мета і завдання роботи. Мета роботи полягала у дослідженні механізмів порушення скорочувальних реакцій судин та серця за умов експериментального цукрового діабету та у пошуку шляхів їх корекції. Відповідно до обраної мети були поставлені наступні завдання:

Дослідити скорочувальні реакції та ефективність використання кисню судинними гладенькими м'язами та міокардом контрольних та діабетичних щурів. Оцінити зміни характеру реперфузійних порушень скорочувальної активності міокарда за умов цукрового діабету.

Виміряти активність синтаз оксиду азоту та аргінази, вміст стійких метаболітів оксиду азоту та карбаміду в судинах та серці щурів з експериментальним цукровим діабетом. Дослідити порушення скорочувальних реакцій судин та міокарда за умов пригнічення синтезу оксиду азоту.

Виміряти вміст дієнових кон'югатів в серці та судинах щурів з експериментальним цукровим діабетом. Показати вплив оксидативного стресу на скорочувальні реакції серця та судин.

Провести дослідження з метою корекції порушень серцево-судинної реактивності за умов експериментального діабету шляхом застосування попередника біосинтезу оксиду азоту L-аргініну та антиоксиданту мелатоніну.

Об'єкт дослідження: серцево-судинна система за умов експериментального цукрового діабету.

Предмет дослідження: скорочувальні реакції та киснева вартість роботи судинних гладеньких м'язів та міокарда.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Тема дисертаційної роботи затверджена на засіданні Вченої Ради Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця (протокол №4 від 6.03.2003). Робота виконана в рамках плану наукових досліджень відділу фізіології кровообігу Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця за темою "Вивчення ролі ендотеліальних факторів та вільних радикалів кисню в реактивності серцево-судинної системи" (№ державної реєстрації 0103U003285), а також частково в рамках програм "Дослідження молекулярних механізмів - проявів функціонування геному, що зумовлюють специфічність діяльності фізіологічних систем організму в нормі та патології" (№ державної реєстрації 0102U002472) та "Інгібітори відкриття мітохондріальної пори як засіб корекції порушень функції серцево-судинної системи" (№ державної реєстрації 0104U008943). За проведення наукових досліджень по темі "Функціональний стан ендотелію коронарних судин в умовах експериментального цукрового діабету" автору була надана стипендія імені М.М. Сиротініна у галузі патофізіології 2005 року Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця.

Наукова новизна одержаних результатів. В дисертаційній роботі вперше проведено комплексне дослідження порушень реактивності аорти, коронарних судин, ворітної вени та міокарда за умов експериментального цукрового діабету. Отримані дані щодо порушення ендотелійзалежного механізму регуляції скорочувальних реакцій гладеньких м'язів аорти, коронарних судин та ворітної вени. Виявлено підвищення жорсткості судинних гладеньких м'язів та міокарда. Вперше отримано дані про збільшення кисневої вартості роботи судинних гладеньких м'язів та міокарда. Показано, що можливими патогенетичними механізмами виявлених порушень серцево-судинної реактивності є гіперглікемія, розвиток оксидативного стресу та пригнічення синтезу оксиду азоту.

Вперше показано, що за умов дії антиоксиданту мелатоніну та попередника біосинтезу оксиду азоту L-аргініну спостерігається часткове відновлення всіх порушених реакцій.

Встановлено, що зміни скорочувальної активності міокарда під час ішемії - реперфузії серця є меншими у щурів з експериментальним діабетом порівняно з контрольними щурами та вказано на можливий зв'язок таких змін зі зменшенням чутливості мітохондріальної пори до індукторів її відкриття.

Теоретичне та практичне значення роботи. Отримані результати дозволяють сформулювати сучасні уявлення про механізми розвитку порушень скорочувальних реакцій серця та судин та вказують на роль в виникненні таких порушень гіперглікемії, оксидативного стресу та зменшення активності NO-синтаз. Показано, що за умов цукрового діабету порушується ендотелійзалежний механізм регуляції скорочувальних реакцій серця та судин. Показано ефективність використання попередника біосинтезу оксиду азоту L-аргініну та антиоксиданту мелатоніну з метою корекції порушень скорочувальних реакцій судин за умов експериментального цукрового діабету. Отримані дані належать до фундаментальних наукових розробок. Результати роботи є додатковими передумовами для розробки заходів профілактики та лікування діабетичних ангіопатій.

Особистий внесок здобувача. Дисертаційна робота виконана автором самостійно. Науковий пошук та обґрунтування напрямку досліджень, розробка методичної концепції та схеми експериментів були проведені у співпраці з науковим керівником член-кореспондентом НАН України В.Ф. Сагачем. Автор самостійно моделював цукровий діабет, вивчав всі судинні реакції та реакції серця, кисневу вартість роботи судинних гладеньких м'язів та міокарда, проводив статистичну обробку, аналіз та узагальнення результатів дослідження. Біохімічні дослідження проводились у співробітництві зі старшим науковим співробітником кандидатом біологічних наук А.В. Коцюрубою. Обговорення отриманих результатів та підготовка публікацій здійснювались у співпраці із провідним науковим співробітником, доктором медичних наук

М.М. Ткаченком.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації були представлені та обговорені на конгресах та конференціях: другому міжнародному симпозіумі "Фізіологія та біофізика гладеньких м'язів" (Київ, 2003); III всеросійській з міжнародною участю школі-конференції з фізіології кровообігу (Москва, Росія 2004); IV конгресі патофізіологів України (Чернівці, 2004); міжнародній школі-конференції з фізіології серцево-судинної системи "Проведення сигналів у серцево-судинній системі" (Варшава, Польща 2004); IV всеросійській конференції з міжнародною участю, присвяченій 80-річчю Інституту фізіології ім. І.П. Павлова РАН "Механізми функціонування вісцеральних систем" (Санкт-Петербург, Росія 2005); Європейському фізіологічному конгресі (Мюнхен, Німеччина 2006)

Публікації. Результати дисертації викладено у шістьох наукових статтях та сьоми тезах доповідей.

Обсяг та структура дисертації. Дисертація складається із вступу, огляду сучасної наукової літератури, опису матеріалів і методів дослідження, результатів досліджень, аналізу і узагальнення результатів дослідження, висновків та списку використаних джерел з 282 найменувань (з них 36 вітчизняних та 246 закордонних). Роботу викладено на 174 сторінках, включаючи одну таблицю та 43 рисунка.



ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи досліджень.

Експерименти були проведені на щурах-самцях лінії Вістар вагою 180 - 220 г з дотриманням усіх вимог щодо роботи з лабораторними тваринами (міжнародна конвенція, Страсбург, 1986). Всім тваринам за 5-7 хв до початку досліду вводили уретан (2 г на кг маси тіла). Для моделювання цукрового діабету щурам віком 3 - 4 міс вводили внутрішньоочеревинно стрептозотоцин з розрахунку 50 мг/кг однократно. Для дослідів використовували тварин через 10 - 12 тиж після ін'єкції. Контроль вмісту глюкози в крові здійснювали за допомогою глюкометра "Медісенс" ("Abbott", США).

Дослідження скорочувальних реакцій судин. Скорочувальну активність судинних смужок реєстрували в режимі, наближеному до ізометричного, за допомогою механоелектричного перетворювача 6МХ1С. Ендотелійзалежне та ендотелійнезалежне розслаблення судинних гладеньких м'язів досліджували на кільцевих препаратах грудного відділу аорти. Активації гладеньких м'язів досягали додаванням до буферного розчину норадреналіну (10^-5 моль/л). Для дослідження ендотелійзалежного розслаблення судинного препарату реєстрували зміни тонічної напруги гладеньких м'язів на ацетилхоліну гідрохлорид (10^-6 моль/л), а для дослідження ендотелійнезалежного розслаблення - на нітропрусид натрію (10^-4 моль/л). Амплітуду зміни тонічної напруги судинного препарату при додаванні до розчину ацетилхоліну або нітропрусиду розраховували у відсотках від рівня їхнього стійкого скорочення на адреналін ("плато").

Дослідження скорочувальних реакцій та жорсткості судинних гладеньких м'язів під впливом дозованого розтягування проводили на ізольованих смужках ворітної вени, які піддавали початковому розтягуванню силою 2 мН. Смужки дозовано розтягували до 8 - 14 мН та реєстрували зміну амплітуди фазних скорочень для отримання змін залежності довжина-сила скорочень гладеньких мязів судин. За допомогою мікроскопа МБС-10 та окулярного гвинтового мікрометра МОВ-1-15 вимірювали довжину судинного препарату ворітної вени. Розраховували: відносний приріст сили скорочень - L/Lo та жорсткість смужки, що представляє собою відношення приросту сили скорочень до зміни довжини судинного препарату у перерахунку на масу смужки L/m/Х (Х зміна довжини препарату при активній силі скорочення L смужки масою m).

Дослідження функції ізольованого серця за методом Лангендорфа. Досліди проводили на ізольованих серцях щурів за методом Лангендорфа [O.Langendorff, 1895]. Перфузія коронарних судин здійснювалась ретроградно через аорту з постійним тиском 75-80 мм рт ст модифікованим розчином Кребса - Хензеляйта. У порожнину лівого шлуночка вставляли поліетиленовий балончик, з'єднаний з тензодатчиком. Реєстрували систолічний тиск, кінцево - діастолічний тиск (КДТ), швидкість коронарного потоку (ШКП), dР/dt_max, dP/dt_min, частоту серцевих скорочень. Для дослідження стану ендотелію коронарних судин оцінювали зміни опору коронарних судин у відповідь на введення ендотелійзалежного вазодилататора ацетилхоліну гідрохлориду (10^-6 моль/л) [D.C. Lefroy et al., 1993].

Для дослідження діастолічної жорсткості лівого шлуночка та залежності сили скорочень лівого шлуночка від його навантаження дозовано збільшували об'єм балончика. Оцінювали зміни діастолічного тиску та тиску, що розвивається (крива Франка - Старлінга). Діастолічну жорсткість міокарду розраховували як відношення приросту діастолічного тиску (КДТ) до приросту об'єму балончика в лівому шлуночку (v) у перерахунку на масу серця: КДТ/m/v (КДТ - приросту діастолічного тиску в лівому шлуночку у відповідь на збільшення об'єму на v серця масою m).

Для відтворення ішемії - реперфузії повністю припиняли подачу перфузуючого розчину на 30 хв. для розвитку глобальної ішемії. Після 30-хвилинної ішемії подачу розчину відновлювали та кожні 5 - 10 хв. протягом 40-хвилинної реперфузії вимірювали показники скорочувальної активності серця, швидкість коронарного потоку, тощо.

Спектрофотометричне визначення вмісту стабільного мітохондріального фактору у сироватці крові та розчинах. Стабільний мітохондріальний фактор в розчині визначали як показник стану мітохондріальної пори [В.Ф.Сагач та ін., 2002]. Проби відтікаючого від серця розчину, зібрані перед ішемією та на 1 - 3 хвилинах реперфузії, досліджували на спектрофотометрі СФ-46 при довжинах хвиль від 230 нм до 260 нм. За величину мітохондріального фактору (МФ) приймали різницю між оптичною щільністю поглинання проби при довжині хвилі 250 нм та 235 нм. Для дослідження вмісту мітохондріального фактору в крові після декапітації щурів відбирали змішану артеріо - венозну кров. Для попередження згортання крові щурам за 5 хвилин до забою вводили гепарин 5 тис. од. / кг. Отримані проби крові центрифугували при 3000 об./хв протягом 20 хвилин. Сироватку відбирали піпеткою і додавали три хлороцтову кислоту (ТХО) у співвідношенні 1 : 10 для забезпечення повного осадження білків. Після цього проби знов центрифугували при 3000 об./хв протягом 15 хвилин. Надосадовий розчин відбирали піпеткою і фільтрували через тонкий паперовий фільтр. Після цього проводили спектрофотометричні вимірювання надосадового розчину.

Визначення кисневої вартості роботи судинних гладеньких м'язів та міокарда. Для дослідження кисневої вартості роботи судинних гладеньких м'язів смужки ворітної вени поступово розтягували до 5,5 мН. Вимірювали вміст кисню у розчині, в якому знаходився препарат за допомогою полярографа ЛП - 46 (Чехословаччина) полярографічним методом з відкритим платиновим електродом у відповідності до загальноприйнятої методики [В.А. Березовський, 1975]. Споживання кисню розраховували відповідно до методики Neely [J.R. Neely et al., 1967]. Роботу ворітної вени розраховували як добуток сили скорочень на їх частоту. Киснева вартість роботи дорівнює відношенню спожитого кисню до роботи, яку виконали гладенькі м'язи ворітної вени.

Для дослідження споживання кисню працюючим серцем вимірювали парціальний тиск кисню у притікаючому та відтікаючому розчині за допомогою газоаналізатора BMS-3 Mk2 ("Radiometer", Данія). Розрахунок поглинання кисню здійснювали за методикою Neely [J.R. Neely et al., 1967]. Роботу серця розраховували як добуток частоти скорочень на силу, що розвивається. Кисневу вартість роботи серця розраховували як відношення поглинання кисню до роботи серця.

Біохімічними методами досліджували: активність NO-синтаз в гомогенатах тканин (спектрофотометрично за зміною вмісту нітрит-аніона); вміст вільного L-аргініну (за допомогою автоматичного амінокислотного аналізатора Т - 339); вміст карбаміду (по реакції с диацетилмонооксимом, використовуючи діагностичний набір "Lahema"), активність аргінази (по утворенню карбаміду); вміст дієнових кон'югатів (спектрофотометричним методом за УФ-поглинанням гептанових екстрактів проб).

Для дослідження впливу індуктора оксидативного стресу терт-бутил гідропероксиду (t(BOOH), 10^-5 моль/л) та інгібітору NO-синтази (L-NАME, 10^-4 моль/л) на скорочувальні реакції серця та судин судинні смужки інкубували у розчині Кребса, що містив відповідну кількість досліджуваної речовини або відповідну кількість речовини додавали до перфузуючого серце розчину. Мелатонін вводили з розрахунку 10 мг/кг внутрішньоочеревинно за одну годину до початку експерименту. L-аргінін додавали до питної води з розрахунку 25 мг/кг щодня протягом 14 днів.

Результати обробляли методом варіаційної статистики, використовуючи програмне забезпечення Origin 7 фірми "Microcal Software, Inc"(США). Різницю між показниками визначали за допомогою тесту ANOVA (різниця вважалась вірогідною при р 0,05, при суттєвому підвищенні вірогідності на це вказували окремо).



РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Зміни скорочувальних реакцій судин та серця за умов експериментального цукрового діабету.

Для судин еластичного типу було показано, що порушення судинних реакцій за умов експериментального цукрового діабету І типу стосуються ендотелійзалежного механізму вазодилатації. Так, ендотелійзалежне розслаблення кільцевих препаратів грудного відділу аорти діабетичних щурів зменшувалося більш ніж вчетверо порівняно з такими препаратами контрольних щурів (рис. 1А). При цьому ендотелійнезалежне розслаблення залишалось неушкодженим.

Підвищений рівень глюкози у розчині також сприяє порушенню ендотелійзалежної вазодилатації. Ендотелійзалежне розслаблення ізольованих препаратів аорти під дією розчину з підвищеним вмістом глюкози зменшувалось в залежності від часу дії гіперглікемії в 1,9 - 5,5 раза (рис. 1А), при цьому ендотелійнезалежне розслаблення залишалось неушкодженим. Це вказує на гіперглікемію як можливий механізм виникнення ендотеліальної дисфункції за умов експериментального цукрового діабету.

У контрольних тварин у відповідь на перфузію ізольованого серця розчином з ацетилхоліну хлоридом спостерігалось зменшення опору коронарних судин, що свідчило про ендотелійзалежну вазодилатацію (рис. 1В). Як за умов експериментального цукрового діабету, так і за умов впливу гіперглікемії спостерігалось збільшення опору коронарних судин, що свідчило про вазоконстрикцію і вказувало на розвиток ендотеліальної дисфункції в таких судинах (рис. 1В).

Рис. 1. Ендотелійзалежне розслаблення аорти (А) та коронарних судин (В) щурів: 1 - контроль; 2 - контроль + гіперглікемія; 3 - контроль + L-NАME; 4 - контроль + t(BOOH); 5 - тварини з цукровим діабетом; 6 - тварини з діабетом, яким вводили мелатонін; 7 - тварини з діабетом, які отримували L-аргінін.

- p<0,05 порівняно з контролем; ⁺ - p<0,05 порівняно з діабетом.

Спонтанна скорочувальна активність, що характерна для ворітної вени [S. Mellander et al., 1968; B. Johansson et al., 1975] дозволила досліджувати такі характеристики, як зміна сили спонтанних фазних скорочень та жорсткість судинних гладеньких м'язів. У тварин зі стрептозотоциніндукованим діабетом було зареєстровано зменшення приросту сили спонтанних фазних скорочень гладеньких м'язів ворітної вени в 2,7 раза порівняно з контрольними щурами (рис. 2).

Рис. 2. Зміни приросту сили фазних скорочень гладеньких м'язів ізольованих препаратів ворітної вени щурів при розтягуванні (у % від вихідної сили скорочень) 1 - контрольні тварини; 2 - тварини з цукровим діабетом; 3 - контрольні тварини, ворітну вену яких інкубували протягом 120 хв у гіперглікемічному розчині.

Також у діабетичних щурів спостерігалось зміщення ліворуч максимуму кривої приріст сили фазних скорочень - сила дозованого розтягування судинних гладеньких мязів, що свідчить про зменшення стійкості судинних гладеньких м'язів до навантаження.

Приріст сили фазних скорочень гладеньких м'язів ворітної вени після її інкубації у гіперглікемічному розчині був вчетверо меншим, ніж у контролі, також було показано зменшення стійкості судинних гладеньких м'язів до розтягнення (рис. 2). Порушення цих показників, а також їх залежність саме від функціонального стану ендотелію були показані при цілому ряді патологічних станів [Сагач В.Ф. та ін., 1993 2000; Ткаченко М.М, 1997; B.P. Brown et al., 1986].

Рис. 3. Залежність тиску що розвивається та кінцево-діастолічного тиску в лівому шлуночку від його навантаження об'ємом. 1 - контрольні тварини; 2 - тварини з цукровим діабетом

Нами було виявлене суттєве збільшення жорсткості гладеньких м'язів ворітної вени як за умов експериментального цукрового діабету, так і під впливом гіперглікемії. Такі дані узгоджується з даними щодо підвищення жорсткості артерій різного калібру за умов цукрового діабету І типу [Christensen T. Et al., 1988; Kobayashi T. et al., 2001; N. Winer et al., 2003].

За умов цукрового діабету порушувалась толерантність міокарда до навантаження - властивість міокарда зберігати постійну силу скорочень при збільшенні навантаження ("плато" кривої Франка - Старлінга).

Тривалість фази "плато" у сердець щурів з експериментальним цукровим діабетом зменшувалась на 60 % порівняно з контрольними (рис. 3).

Скорочувальні властивості міокарда за умов перфузії ізольованого серця гіперглікемічним розчином також зазнавали значних змін - фаза "плато" кривої Франка - Старлінга тривала майже в 2 рази менше, ніж в контролі.

Дослідження діастолічної жорсткості міокарда лівого шлуночку щурів з експериментальним цукровим діабетом вказують на її значне збільшення порівняно з контрольними щурами. Під впливом гіперглікемії також спостерігався ріст цього показника.

Ефективність використання кисню гладенькими м'язами та міокардом є важливим показником, що характеризує здатність дихального ланцюга мітохондрій до синтезу АТФ відповідно до потреб працюючого м'язу.

Як за умов експериментального цукрового діабету, так і під впливом гіперглікемії нами показано зменшення ефективності використання кисню як судинними гладенькими м`язами (рис. 4А), так і міокардом (рис. 4В).

Рис. 4. Киснева вартість роботи судинних гладеньких м'язів (А) та міокарда (В) щурів (позначення див. рис.1).

Збільшення використання кисню може бути наслідком роз'єднання окислення та фосфорилювання зі зменшенням синтезу АТФ та розвитком оксидативного стресу.

Характер реперфузійних порушень у щурів із стрептозотоциніндукованим цукровим діабетом. Під час реперфузії після 30 - хв. ішемії депресія тиску, що розвивається та збільшення діастолічної жорсткості міокарда у діабетичних щурів були достовірно меншими, ніж в контролі. Схожі тенденції мали значення dР/dt_max, dP/dt_min. За умов реперфузії сердець щурів з експериментальним цукровим діабетом не спостерігалось виділення фактору, що свідчить про відкриття мітохондріальної пори, тоді як при реперфузії сердець контрольних щурів його присутність була доведена спектрофотометричним методом в усіх експериментах. Крім того, вміст такого фактору в крові щурів з діабетом виявився достовірно нижчим, ніж у контрольних щурів.

Отже, у щурів зі стрептозотоциніндукованим цукровим діабетом спостерігаються порушення скорочувальних властивостей судин та міокарда. Показано порушення ендотелійзалежної дилатації аорти та коронарних судин. Погіршується скорочувальна активність та збільшується жорсткість судинних гладеньких м'язів та діастолічна жорсткість міокарда. У щурів з експериментальним цукровим діабетом збільшується киснева вартість роботи як гладеньких м'язів, так і міокарда. Аналогічні зміни спостерігаються за умов дії розчину з підвищеним вмістом глюкози, що вказує на можливу роль гіперглікемії у виникненні таких порушень.

Роль оксиду азоту у змінах скорочувальної активності судин та серця за умов експериментального цукрового діабету.

Отримані дані біохімічних досліджень свідчать про порушення системи оксиду азоту, що проявляється в зниженні активності конститутивної NO-синтази (рис. 5) та зменшенні синтезу оксиду азоту, а також підвищенні активності аргінази та зменшенні пулу вільного аргініну в тканинах та плазмі крові тварин з експериментальним цукровим діабетом.

Рис. 5. Активність різних ізоформ NO-синтази в гомогенатах серця (1), аорти (2) та ворітної вени (3). A - контрольні тварини, B - тварини з цукровим діабетом.

Дослідження впливу пригнічення NO-синтази на скорочувальні реакції судин та активність серця показало, що всі порушення, що були виявлені у діабетичних щурів ми в тій чи іншій мірі спостерігали за умов дії цього фактору.

Пригнічення NO-синтази L-NAME призводило до порушення ендотелійзалежного розслаблення кільцевих препаратів аорти та коронарних судин (див.рис. 1). Під впливом інгібування NO-синтази спостерігалось порушення скорочувальних відповідей судинних гладеньких мязів ворітної вени на дозоване розтягування, що підтверджує роль NO в регуляції таких відповідей.

Скорочувальні властивості міокарда за умов пригнічення синтезу оксиду азоту також зазнавали значних змін - тривалість фази "плато" була на 40% меншою, ніж в контролі. Дослідження можливої участі оксиду азоту в регуляції жорсткості судинних гладеньких м'язів та міокарда, проведене за допомогою пригнічення NO-синтази L-NAME, показало, що за умов дефіциту оксиду азоту зростає як жорсткість судинних гладеньких м'язів так і діастолічна жорсткість міокарда. Зменшення синтезу оксиду азоту несприятливо впливає на ефективність використання кисню працюючим міокардом та судинними гладенькими м'язами (див. рис.3).

Отже, пригнічення синтезу оксиду азоту призводить до порушення ендотелійзалежних скорочувальних реакцій аорти та коронарних судин, скорочувальної активності та жорсткості судинних гладеньких м'язів та міокарда.

Вплив L-аргініну на скорочувальну активність судин та серця за умов експериментального цукрового діабету. Тривалий прийом попередника біосинтезу оксиду азоту L-аргініну не впливав на рівень глюкози в крові щурів з експериментальним діабетом, тобто ефект L-аргініну не був пов'язаний з впливом на гіперглікемію. Пероральне введення попередника L-аргініну протягом 14 днів призвело до тимчасового відновлення ендотелійзалежного розслаблення судинних гладеньких м'язів кільцевих препаратів грудного відділу аорти, а також до часткового відновлення ендотелійзалежної дилатації коронарних судин (див. рис.1). Під впливом тривалого прийому L-аргініну за умов цукрового діабету спостерігається часткове відновлення скорочувальної активності ізольованих препаратів ворітної вени та міокарда (відновлення тривалості "плато" кривої Франка - Старлінга). Показано зменшення жорсткості судинних гладеньких м'язів та діастолічної жорсткості міокарда щурів з експериментальним цукровим діабетом після двотижневого застосування L-аргініну. За умов введення щурам з експериментальним цукровим діабетом L-аргініну спостерігалось зменшення кисневої вартості роботи міокарда та судинних гладеньких м'язів (див. рис.3).

Таким чином, отримані дані щодо зниження активності та порушення співвідношення ізоформ синтази оксиду азоту, а також підвищення активності аргінази та збільшення вмісту її метаболітів за умов експериментального діабету. Разом з цим показано, що під дією блокатора NO-синтази L-NAME спостерігаються порушення скорочувальної активності серця та судин (аорта, коронарні судини, ворітна вена), а також ефективності використання кисню судинними гладенькими м'язами та міокардом, подібні до таких за умов діабету. Одержані результати свідчать про те, що виявлені при експериментальному діабеті зміни можуть бути обумовлені зниженням синтезу та/або біодоступності оксиду азоту. Введення попередника біосинтезу оксиду азоту L-аргініну призводить до корекції порушень скорочувальних судинних реакцій та активності міокарда за умов експериментального цукрового діабету.

Роль оксидативного стресу у змінах скорочувальних реакцій серця та судин за умов експериментального цукрового діабету.

Оксидативний стрес є одним з основних механізмів гіперглікемічного ураження ендотелію за умов цукрового діабету [D.Giugliano et al., 1996; G. Kojda et al., 1999; B. Tesfamariam et al., 1992].

Отримані нами дані біохімічних досліджень підтвердили що у щурів з експериментальним діабетом розвивається оксидативний стрес. Так, вміст дієнових кон'югатів збільшувався в гомогенаті серця майже в 10 разів, в гомогенатах аорти та ворітної вени втричі (рис. 6).

Рис. 6. Вміст дієнових кон'югатів в гомогенатах серця (1), аорти (2) та ворітної вени (3) щурів з експериментальним цукровим діабетом.

За умов дії індуктора оксидативного стресу терт-бутил гідропероксиду спостерігались порушення скорочувальних реакцій серця та судин подібні до таких за умов стрептозотоциніндукованого цукрового діабету (див. рис. 1, 3). Це може бути обумовлено утилізацією оксиду азоту в реакціях з вільними кисневими радикалами.

Застосування мелатоніну призвело як до часткового відновлення судинних реакцій так і до збільшення ефективності використання кисню, що може свідчити про покращення спряження окислення та фосфорилювання у таких тварин.

Таким чином, розвиток оксидативного стресу внаслідок гіперглікемії є одним з основних механізмів пошкодження ендотелію за умов експериментального цукрового діабету.

Аналіз та узагальнення результатів дослідження.

В представленій роботі на моделі стрептозотоциніндукованого діабету було виявлено комплекс порушень серцево - судинної реактивності, що можуть бути обумовлені хронічною гіперглікемією. У щурів з експериментальним цукровим діабетом показано пригнічення ендотелійзалежного розслаблення гладеньких м'язів аорти та коронарних судин, порушення співвідношення довжина - сила скорочень та збільшення жорсткості судинних гладеньких м'язів та міокарда, збільшення кисневої вартості роботи як гладеньких м'язів, так і міокарда.

Основними механізмами глюкозотоксичності є зменшення синтезу оксиду азоту та розвиток оксидативного стресу.

На роль пригнічення синтезу оксиду азоту у розвитку діабетичних порушень вказують виявлені зміни функціонального стану системи оксиду азоту за умов експериментального діабету. Це підтверджується розвитком порушень скорочувальних реакцій серця та судин, подібних до діабетичних, у контрольних щурів за умов дії блокатору NO-синтази L-NAME та частковим відновленням скорочувальної активності серця та судин у щурів з експериментальним діабетом за умов тривалого введення попередника біосинтезу оксиду азоту L-аргініну.

Про участь розвитку оксидативного стресу у виникненні порушень серцево-судинної реактивності за умов стрептозотоциніндукованого діабету свідчать: підвищення вмісту дієнових кон'югатів в судинах та серці щурів з експериментальним цукровим діабетом; порушення скорочувальних реакцій серця та судин контрольних щурів за умов дії індуктору оксидативного стресу терт-бутил гідропероксиду, що подібні до діабетичних та відновлення таких реакцій у щурів з експериментальним діабетом за умов введення антиоксиданту мелатоніну.

За умов експериментального цукрового діабету І типу спостерігається зменшення реперфузійних порушень після 30-хвилинної ішемії порівняно з контрольними щурами, що супроводжується вірогідним зменшенням чутливості мітохондріальної пори до дії індукторів її відкриття.

Дані, які були отримані в нашій роботі представлені у вигляді схеми, яка дозволяє розширити уявлення про механізми розвитку порушень скорочувальних реакцій серця та судин за умов цукрового діабету І типу (рис. 7).

Першою ланкою пошкодження є гіперглікемія, яка сприяє виникненню оксидативного стресу та зменшенню синтезу та / або збільшенню утилізації оксиду азоту. Це призводить до порушення ендотелійзалежної вазодилатації, співвідношення довжина - сила скорочень та росту жорсткості судинних гладеньких м'язів та міокарда.

Підвищення експресії мітохондріальних білків групи UCP призводить до порушення спряження окиснення та фосфорилювання та зменшення потенціалу внутрішньої мембрани мітохондрій [C. Depre et al., 2000; S.Wang et al., 2002]. Це, в свою чергу призводить до збільшення використання кисню та зменшення синтезу АТФ, а також підвищення рівня вільних кисневих радикалів в мітохондріях [B. Li et al., 2000].

Рис.7. Механізми розвитку порушень скорочувальних реакцій серця та судин за умов цукрового діабету І типу.

Зменшення синтезу АТФ також призводить до росту жорсткості судинних гладеньких м'язів та міокарда, а одним з наслідків росту жорсткості є співвідношення довжина - сила скорочень м'язів.



ВИСНОВКИ

В роботі було проведено дослідження порушення ендотелійзалежного механізму регуляції скорочувальної активності судинних гладеньких м'язів та міокарда за умов експериментального цукрового діабету та здійснено пошук шляхів їх корекції.

Показано, що ендотелійзалежне розслаблення гладеньких м'язів аорти та коронарних судин у щурів з експериментальним цукровим діабетом є меншим, ніж у контрольних тварин. Порушується співвідношення довжина - сила скорочень судинних гладеньких м'язів та вкорочується фаза "плато" кривої Франка - Старлінга. Жорсткість судинних гладеньких м'язів та міокарда у щурів з експериментальним цукровим діабетом є більшою, ніж у контрольних. У щурів з експериментальним цукровим діабетом збільшується киснева вартість роботи як гладеньких м'язів, так і міокарда.

Зміни скорочувальної активності міокарда на ішемію - реперфузію були менш вираженими у щурів із стрептозотоциніндукованим цукровим діабетом І типу порівняно з контрольними щурами. Це супроводжувалось вірогідним зменшенням чутливості мітохондріальної пори до дії індукторів її відкриття.

Першим етапом розвитку порушення скорочувальних реакцій міокарда та судин за умов експериментального цукрового діабету є гіперглікемія. Це підтверджується розвитком під дією гіперглікемічного розчину порушень подібних до тих, що спостерігаються при експериментальному цукровому діабеті.

Порушення скорочувальних реакцій серця та судин за умов експериментального цукрового діабету обумовлені зменшенням синтезу оксиду азоту. Про це свідчать зменшення активності конститутивної NO-синтази, збільшення активності аргінази, зменшення вмісту вільного L-аргініну в гомогенаті аорти та плазмі крові діабетичних щурів; розвиток порушень скорочувальних реакцій серця та судин, подібних до діабетичних, у контрольних щурів за умов дії блокатору NO-синтази L-NAME та відновлення скорочувальної активності серця та судин у щурів з експериментальним діабетом за умов тривалого введення попередника біосинтезу L-аргініну.

Підвищення вмісту дієнових кон'югатів в гомогенатах серця, аорти та ворітної вени щурів з експериментальним цукровим діабетом, порушення скорочувальних реакцій серця та судин контрольних щурів за умов дії індуктору оксидативного стресу терт-бутил гідропероксиду, що подібні до діабетичних та відновлення скорочувальних реакцій судин у щурів з експериментальним діабетом за умов введення антиоксиданту мелатоніну свідчать про участь у виникненні порушень скорочувальних реакцій серця та судин за умов стрептозотоциніндукованого діабету розвитку оксидативного стресу.

Показано ефективність використання попередника біосинтезу оксиду азоту L-аргініну та антиоксиданту мелатоніну з метою корекції порушень скорочувальних реакцій судин за умов експериментального цукрового діабету.



СПИСОК ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

Статті

1. Сагач В.Ф., Ткаченко М.М., Присяжна О.Д., Коцюруба А.В., Мегедь О.Ф. Зміни вазодилататорних реакцій судинних гладеньких м'язів та системи оксиду азоту за умов експериментального цукрового діабету // Фізіологічний журнал - 2003. - Т. 49, № 4. - С. 24-32.

2. Присяжная А.Д., Сагач В.Ф., Ткаченко М.Н., Коцюруба А.В.. Эндотелиальная дисфункция в условиях экспериментального сахарного диабета: нарушение системы оксида азота // Таврический медико-биологический вестник. - 2004. - Т. 7, № 1. - С. 103-108.

3. Присяжная А.Д., Ткаченко М.Н., Коцюруба А.В., Сагач В.Ф.. Нарушение NO-зависимого механизма сосудистой реактивности при экспериментальном сахарном диабете // Дисфункция эндотелия: экспериментальные и клинические исследования. Труды ІІІ-ей международной научно-практической конференции, 18-20 мая 2004 г. - Витебск, 2004. - С. 113-116.

4. Бондаренко О.І., Присяжна О.Д., Сагач В.Ф.. Електричні реакції інтактного ендотелію аорти щурів при експериментальному діабеті // Фізіологічний журнал - 2004. - Т. 50, № 6. - С. 3-8.

5. Сагач В.Ф., Присяжна О.Д., Ткаченко М.М., Коцюруба А.В.. Вплив L-аргініну на функціональну активність ендотелію за умов експериментального цукрового діабету // Фізіологічний журнал - 2005. - Т. 51, № 2. - С. 3-7.

6. Присяжна О.Д., Коцюруба А.В., Ткаченко М.М., Сагач В.Ф. Механізми зміни скорочувальних реакцій та ефективності використання кисню гладенькими м'язами ворітної вени за умов експериментального цукрового діабету // Фізіологічний журнал - 2006. - Т.52, № 1. - С.8-16.

Тези

7. Prysyazhna O.D., Sagach V.F., Kotsyuruba A.V., Tkachenko M.M.. Endothelium-dependent stretch-induced contractile responses of vascular smooth muscles in experimental diabetes mellitus and the nitric oxide system // Neurophysiology. - 2003. - Т. 35, № 3-4. - С. 367.

8. Присяжная А.Д., Ткаченко М.Н., Сагач В.Ф. Нарушения сосудистой реактивности при экспериментальном сахарном диабете // Третья Всероссийская с международным участием школа-конференция по физиологии кровообращения, посвящённая 250-летию МГУ им. М.В. Ломоносова (27-30 января 2004 г., Москва, Россия). Тезисы докл. - Москва,

9. Присяжна О.Д., Ткаченко М.М., Коцюруба А.В., Сагач В.Ф.. Система оксиду азоту та експериментальний цукровий діабет // Клінічна та експериментальна патологія. - 2004. - Т. 3, № 2, ч.1. - С. 175-176.

10. Присяжная А.Д., Ткаченко М.Н., Сагач В.Ф.. Изменения NO-зависимой регуляции сократительных реакций сосудистых гладких мышц при экспериментальном сахарном диабете // Третий Российский конгресс по патофизиологии с международным участием. Дизрегуляционная патология органов и систем (экспериментальная и клиническая патофизиология). Тезисы докладов. Москва, 9-12 ноября 2004 г. - Москва, 2004. - С. 106.

11. Prysyazhna O.D., Sagach V.F.. Influence of antioxidants introduction on endothelium-dependent reactions at experimental diabetes mellitus // Workshop in cardiovascular physiology "Signal transduction in cardio-vascular system". 13 - 16 May 2004, Warsaw, Poland.Abstracts of poster presentations. - P. 91.

12. Присяжная А.Д., Сагач В.Ф. Изменения сократительных свойств миокарда и коронарных сосудов при экспериментальном сахарном диабете // Механизмы функционирования висцеральных систем. IV Всероссийская конференция с междунар. участием, посвящённая 80-летию Института физиологии им. И.П. Павлова РАН. 4-6 октября 2005 г., С.-Петербург, Россия. Тез. докл. С.-Петербург-2005. - С. 198 - 199.

13. Prysyazhna O.D., Sagach V.F. Changes of ischemic tolerance of myocardium at experimental diabetes mellitus // Acta Physiologica. - 2006. - V. 186, suppl. 1. - P. 208.



АНОТАЦІЇ

Присяжна О.Д. Порушення NO-залежної регуляції скорочувальних реакцій серця та судин за умов експериментального цукрового діабету. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 14.03.04 - патологічна фізіологія. - Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України, Київ, 2006.

Дисертаційна робота присвячена вивченню механізмів порушення серцево-судинної реактивності при експериментальному цукровому діабеті. За умов стрептозотоциніндукованого діабету проведено комплексне дослідження порушень скорочувальних реакцій ізольованих препаратів аорти, ворітної вени, а також коронарних судин та серця. Показано, що порушується ендотелійзалежний механізм регуляції скорочувальних реакцій судинних гладеньких м'язів. Виявлено ріст жорсткості судинних гладеньких м'язів та міокарда, що призводить до порушення розслаблення судин та серця. Збільшення кисневої вартості роботи судинних гладеньких м'язів та міокарда свідчить про порушення функції дихального ланцюгу мітохондрій.

Показано, що можливими механізмами розвитку виявлених порушень скорочувальних реакцій є пригнічення синтезу оксиду азоту, гіперглікемія та розвиток оксидативного стресу.

Проведені дослідження впливу на порушені реакції мелатоніну та попередника біосинтезу оксиду азоту L-аргініну. Показано, що за умов дії таких речовин спостерігається часткове відновлення порушених реакцій.

Приведені дані щодо збільшення ішемічної толерантності міокарда за умов стрептозотоциніндукованого цукрового діабету І типу, що супроводжується вірогідним зменшенням чутливості мітохондріальної пори до дії індукторів її відкриття

Ключові слова: дисфункція ендотелію, пригнічення синтезу оксиду азоту, гіперглікемія, оксидативний стрес.

Присяжная А.Д. Нарушение NO-зависимой регуляции сократительных реакций сердца и сосудов при экспериментальном сахарном диабете. - Рукопись.

Диссертация на соискание научной степени кандидата медицинских наук по специальности 14.03.04 - патологическая физиология. - Институт физиологии им. А.А. Богомольца НАН Украины, Киев, 2006.

Диссертация посвящена изучению механизмов нарушения сердечно-сосудистой реактивности про экспериментальном сахарном диабете. При стрептозотоцининдуцированном диабете проведено комплексное исследование нарушений сократительных реакций изолированных препаратов аорты, воротной вены, а также коронарных сосудов и сердца. Показано, что нарушается эндотелийзависимый механизм регуляции сократительных реакций сосудистых гладких мышц. Выявлен рост жесткости сосудистых гладких мышц и миокарда, ведущий к нарушению расслабления сосудов и сердца. Увеличение кислородной стоимости работы миокарда и сосудистых гладких мышц свидетельствует о нарушении функции дыхательной цепи митохондрий.

Показано, что возможными механизмами развития выявленных нарушений являются угнетение синтеза оксида азота, гипергликемия и развитие оксидативного стресса.

Проведены исследования влияния на нарушенные реакции мелатонина и предшественника биосинтеза оксида азота L-аргинина. Показано, что под действием этих веществ наблюдается частичное восстановление нарушенных реакций. аорта діабет ендотелійзалежний регуляція

Приведены данные о повышении ишемической толерантности миокарда при стрептозотоцининдуцированном сахарном диабете І типа, что сопровождается уменьшением чувствительности митохондриальной поры к индукторам её открытия.

Ключевые слова: дисфункция эндотелия, угнетение синтеза оксида азота, гипергликемия, оксидативный стресс.

O.D. Prysyazhna. Infringement of NO-dependent regulation of contractive reactions of heart and vessels at experimental diabetes mellitus. - Manuscript.

The dissertation on competition of a scientific degree of the candidate of medical sciences on a speciality 14.03.04 - pathological physiology. - Bogomoletz Institute of Physiology National Academy of Sciences of Ukraine, Kiev, 2006.

The mechanisms of derangement of contractive reactions of heart and vessels et experimental diabetes mellitus type I was a subject of this research. The thorough investigation of disturbances of endothelium-dependent reactions of aorta isolated preparations, portal vein strips and also coronary vessels and heart is spent at streptozotocininduced diabetes. We have revealed a complex of disorders of contractive reactions of myocardium and vascular smooth muscles, which can be caused by chronic hyperglycaemia.

At an animal with experimental diabetes mellitus the depression of endothelium-dependent relaxation of aorta and coronary vascular smooth muscles, infringement of the length - force of contractions ratio and growth of vascular smooth muscles stiffness, increase of oxygen cost of the vascular smooth muscles work is revealed. On Langendorff isolated heart the essentially increase of left ventricular diastolic stiffness was shown at experimental diabetes. These phenomena were accompanied with reduction of Franc-Starling curve phase plateau extension (length - force of contractions ratio) and increase of oxygen cost of the myocardium work.

The basic mechanisms of glucose toxicity are reduction of NO synthesis and development of oxidative stress.

A role of depression of NO synthesis in development of such infringements specifies the revealed disturbances of nitric oxide system functioning et experimental diabetes mellitus. It proves to be true by development of disorders of contractive reactions of heart and vessels similar to diabetic at control animals at blocking of NO-synthase by L-NAME and partial restoration of contractive activity of heart and vessels at rats with experimental diabetes after long reception of the predecessor of NO biosynthesis L-arginin.

About participation of oxidative stress in occurrence of alteration of cardio-vascular reactivity at streptozotocininduced diabetes mellitus testify: increase of the contents of dien conjugates in vessels and heart of diabetical rats; development of changes of contractive reactions of heart and vessels similar to diabetic at control animals under action of oxidative stress inductor tert-buthyl hydroperoxide and partial restoration of the choosen reactions after introduction of antioxidative substance melatonin.

Reduction of MPTP sensitivity to inductors of its opening together with data on myocardial contractility testifies to increase of ischemic tolerance of myocardium at experimental diabetes mellitus.

Key words: endothelial dysfunction, depression of nitric oxide synthesis, hyperglycaemia, and development of oxidative stress.

Размещено на Allbest.ru