Протягом останніх 10-15 років частота захворювань щитовидної залози в Україні зросла більш ніж утроє, помітно зросла частота гіпотиреозу (Тимченко А. М., 2002). Розповсюдженню гіпотиреозу сприяє антропогенне забруднення навколишнього середовища радіонуклідами (Астахова Л.Н. и соавт., 1991; Бебешко В.Г. і співавт., 1999) та хімікатами (Терещенко И.В., 2000), які запобігають адекватній акумуляції йоду щитовидною залозою. Гіпотиреоз часто розвивається на грунті вираженого йодного дефіциту (Aghini-Lombardi F. et al., 1999; Фабрі З.Й. і співавт., 2001; Шідловський В.О. і співавт., 2004). Дуже небезпечний за наслідками гіпотиреоз у дітей, який є найчастішою ендокринною патологією новонароджених (1: 3000-1: 4000) (Radetti G. et al., 2002; Gruters A. et al., 2003; Vliet G. V., 2003). Якщо замісна терапія не була розпочата протягом перших 30 діб після народження, у дітей формуються незворотні порушення фізичного, статевого та інтелектуального розвитку, в результаті чого 30 млн осіб на Землі страждають кретинізмом (Weber G. et al., 2003).

Актуальність теми. При гіпотиреозі зазнають пошкоджень всі органи і системи. Ураження серцево-судинної системи проявляється насамперед у вигляді "мікседематозного серця”, симптомами якого є дистрофічні, дисферментозні та електролітні зміни в кардіоміоцитах, зміни ЕКГ (низький вольтаж зубців, подовження інтервалу Q-T, негативний зубець T), аритмії серця (синусова брадикардія, фібриляція передсердь, блокади) (Nyrop M. et al., 1991; Самойленко Л.Е. и соавт., 1993; Зыкова Т.А. и соавт., 1996; Wikstrom L. et al., 1998; Терещенко И.В. и соавт., 2002). Традиційно вважається, що механізм брадикардії полягає у зниженні тонусу симпатичної нервової системи (Dowell R.T. et al., 1994; Klein M. et al., 1995; Zwaveling J. et al., 1996; Zhang Y. et al., 1997; Vischer C.M. et al., 1999). Стан парасимпатичної іннервації серця при гіпотиреозі вивчений дуже мало. Водночас відомо, що блукаючі нерви відіграють провідну роль у формуванні серцевого ритму у здорових осіб (Алипов Н.Н., 1993), при фізичному, емоційному та гормональному навантаженні. Можна припустити, що механізм синусової брадикардії та інших порушень ритму при гіпотиреозі не зводиться лише до пригнічення симпатичної активності. Цілком вірогідно, що у їх розвитку має значення активація холінергічних регуляторних впливів на серце, про що свідчать окремі повідомлення (Inukai T. et al., 1998; Бонецкий А.А. и соавт., 1999; Foley C. M. et al., 2001; Xing H. et al., 2001). Всебічна оцінка холінергічних процесів у гіпотиреоїдному серці, а також результати фармакологічного аналізу механізмів виникнення синусової брадикардії можуть бути враховані при здійсненні замісної гормональної терапії, зокрема у дітей, наслідки гіпотиреозу для яких особливо небезпечні.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота є фрагментом комплексної міжкафедральної теми "Клініко-патогенетичні та морфофункціональні особливості ішемічної хвороби серця при супутньому хронічному бронхіті, цукровому діабеті, експериментальному гіпертиреозі, гастродуоденальних виразках та їх диференційована терапія" (номер державної реєстрації 0103U001017) Тернопільського державного медичного університету імені І.Я. Горбачевського. Дисертант є співвиконавцем названої комплексної наукової теми. Тема дисертації затверджена Проблемною комісією "Патологічна фізіологія та імунологія” 17 квітня 2003 року (протокол № 26).

Мета дослідження. З'ясувати особливості обміну ацетилхоліну в міокарді, а також зміни чутливості серця до холінергічних впливів у статевонезрілих щурів з експериментальним гіпотиреозом, здійснити фармакологічний аналіз холінергічних порушень при гіпотиреозі і дати їм патофізіологічну оцінку.

Задачі дослідження. Для досягнення поставленої мети було заплановано виконати такі завдання:

гіпотиреоз холінергічний вплив щур

1. Кількісно оцінити співвідношення між активністю симпатичного і парасимпатичного відділів вегетативної нервової системи в процесі розвитку експериментального гіпотиреозу.

2. Дати порівняльну характеристику негативно-хронотропних впливів блукаючого нерва і екзогенного ацетилхоліну на серце контрольних і гіпотиреоїдних щурів.

3. З'ясувати, як змінюється вміст парасимпатичного медіатора ацетилхоліну в міокарді передсердь і шлуночків серця в динаміці розвитку експериментального гіпотиреозу.

4. Визначити інтенсивність процесів синтезу ацетилхоліну (за активністю холінацетилтрансферази), а також ферментативного розщеплення його (за активністю холінестерази) в міокарді передсердь і шлуночків тварин з експериментальним гіпотиреозом.

5. Шляхом застосування фармакологічних середників з'ясувати механізми і патогенетичне значення синусової брадикардії при гіпотиреозі.

Об'єкт дослідженн - експериментальний гіпотиреоз.

Предмет дослідження - обмін ацетилхоліну в міокарді і чутливість серця до холінергічних впливів у статевонезрілих тварин з експериментальним гіпотиреозом.

Методи дослідження. У процесі виконання задач, передбачених планом дослідження, було застосовано наступні методи: біологічні ? для визначення вмісту ацетилхоліну і активності холінацетилтрансферази в міокарді; фотоелектроколориметричні ? для визначення активності холінестерази в міокарді; електрофізіологічні ? для визначення реакцій серця на холінергічні впливи; математичні ? для кількісної оцінки співвідношення між активністю симпатичного і парасимпатичного відділів вегетативної нервової системи, а також для статистичної обробки результатів дослідів.

Наукова новизна одержаних результатів. В результаті проведеного дослідження отримано нові дані про особливості холінергічно-адренергічних взаємовідносин при експериментальному гіпотиреозі, зокрема встановлено, що з наростанням глибини гіпотиреозу все більше проявляється переважання холінергічних регуляторних впливів над адренергічними, яке формується внаслідок різноспрямованих зрушень обидвох відділів вегетативної нервової системи, але головним чином за рахунок посилення холінергічного контролю. Встановлено, що за умов гіпотиреозу посилюється інтенсивність холінергічних впливів на серце через блукаючий нерв при одночасному компенсаторному зниженні чутливості холінорецепторів кардіоміоцитів синоатріального вузла до ацетилхоліну. Вперше доведено, що підсилення ефективності вагусних впливів на серце при гіпотиреозі пов'язане із збільшенням вмісту ацетилхоліну в міокарді і відповідно кількості медіатора, що діє на рівні синапсів між холінергічними терміналями і кардіоміоцитами провідної системи. З'ясовано, що причиною зростання вмісту парасимпатичного медіатора в міокарді є більш висока активність синтезуючого ферменту холінацетилтрансферази, особливо в міокарді передсердь, яка поєднується з підвищенням інтенсивності ферментативного гідролізу ацетилхоліну. За допомогою холінолітичних фармакологічних середників вперше доведено, що підвищення ефективності вагусної регуляції гіпотиреоїдного серця реалізується через модуляцію чутливості М-холінорецепторів кардіоміоцитів провідної системи серця і пропускної здатності іонних каналів.

Практичне значення одержаних результатів. В результаті проведених досліджень з'ясовано, що збільшення вмісту ацетилхоліну в міокарді є однією з патогенетичних ланок формування гіпотиреоїдного серця, зокрема синусової брадикардії та інших аритмій при гіпотиреозі. Експериментально доведено ефективність застосування холіноблокаторів з метою корекції холінергічних розладів у серці гіпотиреоїдних тварин. Найефективнішим виявився універсальний холіноблокатор атропін. Узагальнені результати дисертаційного дослідження можуть бути використані в навчальному процесі на кафедрах патологічної фізіології, педіатрії, внутрішніх хвороб. Результати дослідження впроваджено в навчальний процес в Одеському державному медичному університеті, Буковинському державному медичному університеті, Івано-Франківському державному медичному університеті, Вінницькому національному медичному університеті ім. М.І. Пирогова, Харківському державному медичному університеті, Запорізькому державному медичному університеті, Українській медичній стоматологічній академії, Тернопільському державному медичному університеті імені І.Я. Горбачевського.

Особистий внесок здобувача. Дисертант провела літературний і патентний пошуки згідно обраної теми дослідження, за результатами пошуку оформила огляд літератури, опанувала передбачені планом методи дослідження. За безпосередньою участю дисертанта виконано всі біохімічні та електрофізіологічні дослідження, самостійно статистично опрацьовано, проаналізовано і узагальнено отримані результати. За участю наукового керівника дисертант сформулювала найважливіші положення і висновки. У наукових працях, опублікованих у співавторстві, дисертанту належить експериментальне дослідження, статистична обробка та узагальнення отриманих результатів. У тій частині актів впровадження, що стосується науково-практичної новизни, викладено фактичний матеріал дисертації.

Апробація результатів дисертації. Основні матеріали дисертаційного дослідження оприлюднені на VIII і IX Міжнародних медичних конгресах студентів і молодих учених (Тернопіль, 2004, 2005), IV Національному конгресі патофізіологів України з міжнародною участю "Фундаментальні аспекти сучасної медицини” (Чернівці, 2004), III-тіх і IV-тих читаннях ім.В. В. Підвисоцького (Одеса, 2004, 2005), XLVII підсумковій науково-практичній конференції, присвяченій 150-річчю з дня народження академіка І.Я. Горбачевського (Тернопіль, 2004), міжнародній науковій конференції "Молодь - медицині майбутнього" (Одеса, 2005), III Міжнародній науково-практичній конференції студентів і молодих вчених (Ужгород, 2005), науково-практичній конференції з міжнародною участю, присвяченій 200-річчю з дня заснування Харківського державного медичного університету "Від фундаментальних досліджень - до прогресу в медицині” (Харків, 2005), симпозіумі "Проблеми діагностики і лікування ендокринної патології та її ускладнень у осіб, які постраждали внаслідок аварії на Чорнобильській АЕС" (Київ, 2005). Дисертація пройшла апробацію 13 червня 2005 року на спільному засіданні кафедр патологічної фізіології, нормальної фізіології, фармакології, загальної гігієни та екології, фармацевтичних дисциплін з клінічною фармацією, соціальної медицини та ООЗ з медичною статистикою, курсу клінічної фармакології, співробітників центральної науково-дослідної лабораторії.

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 17 наукових праць, в тому числі 8 ? у фахових виданнях, рекомендованих ВАК України, 9 ? у матеріалах конгресів, конференцій і симпозіумів.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методик дослідження, 4 розділів власних досліджень, аналізу та узагальнення результатів досліджень, висновків, списку використаних джерел, додатків. Робота викладена на 179 сторінках комп'ютерного тексту, ілюстрована 23 таблицями, 17 рисунками. Список використаних джерел налічує 281 найменування, з яких 118 надруковані кирилицею і 163 - латиницею. Бібліографічний опис джерел літератури та додатки викладені на 39 сторінках.

Основний зміст роботи

Матеріали і методи дослідження. Експериментальні дослідження проведено на 395 статевонезрілих білих щурах-самцях лінії Вістар масою 0,08-0,12 кг у віці 1,5-2,0 місяці. Усі втручання та забій тварин проводилися з дотриманням принципів "Європейської конвенції про захист хребетних тварин, які використовуються для експериментальних та інших наукових цілей" (Страсбург, 1985) та ухвали Першого національного конгресу з біоетики (Київ, 2001). Комісією з питань біоетики Тернопільського державного медичного університету імені І.Я. Горбачевського (протокол № 7 від 11 травня 2005 року) порушень морально-етичних норм при проведенні науково-дослідної роботи не виявлено. Експериментальний гіпотиреоз відтворювали щодобовим згодовуванням мерказолілу ("Здоров'я”, Україна) в дозі 75 мг/кг маси тіла протягом 14 діб. Показниками глибини гіпотиреоїдного стану були маса тіла тварин, частота серцевих скорочень, ректальна температура, об'єм поглинутого кисню.

Для співвідносної оцінки функціонального стану парасимпатичного і симпатичного відділів вегетативної нервової системи використано метод варіаційної кардіоінтервалометрії (Баевский Р.М. и соавт., 1984). Електрокардіограму реєстрували на електрокардіографі ЭК1К-01 при швидкості руху стрічки 50 мм/с до годування мерказолілом, а також на 5-ту, 10-ту і 14-ту доби гіпотиреозу. За допомогою стереоскопічного мікроскопа МБС-9 з окулярною сіткою аналізували 100 послідовно розташованих інтервалів R-R. Визначали наступні параметри: М - середнє значення тривалості інтервалів R-R за досліджуваний період часу (в мілісекундах); ДХ - величину варіаційного розмаху тривалості інтервалів R-R, тобто різницю між їх максимальним і мінімальним значеннями (у мілісекундах); Мо - моду, тобто значення інтервалу R-R, яке найчастіше зустрічається протягом досліджуваного часового періоду (у мілісекундах); АМо - амплітуду моди, тобто відносну кількість інтервалів R-R, які визначають моду (у процентах). Використовуючи значення ДХ, Мо і АМо, обчислювали додаткові показники: показник вегетативного балансу (ПВБ) за формулою АМо/ДХ; вегетативний показник ритму (ВПР) за формулою 1/ (Мо•ДХ); показник адекватності процесів регуляції (ПАПР) за формулою АМо/Мо; індекс напруження регуляторних систем за формулою ІН = АМо/ (2ДХ•Мо).

Негативно-хронотропні ефекти ендогенного ацетилхоліну (АХ) вивчали шляхом подразнення периферичного кінця перерізаного правого блукаючого нерва імпульсами змінного струму напругою 5 і 10 В протягом 1 хв. За допомогою електростимулятора ЭСЛ-2 формували характеристики струму: частота - 50 Гц, тривалість стимулу - 1 мс, затримка - 1 мс. Визначали максимальну інтенсивність негативно-хронотропних реакцій у кожному 10-секундному інтервалі у контрольних і гіпотиреоїдних тварин. Екзогенний АХ ("Мосмедпрепараты”, Росія) вводили в праву зовнішню яремну вену у напрямку до серця в дозі 5 мкг в 0,5 мл 0,9 % розчину натрію хлориду. Величину негативно-хронотропної реакції оцінювали за її інтенсивністю і тривалістю.

Вміст АХ в міокарді передсердь і шлуночків визначали біологічним методом на прямому м'язі живота жаби (Файфура В.В. і співавт., 2004). Активність ключового ферменту синтезу АХ - холінацетилтрансферази (ХАТФ) також визначали біологічним методом в опису Файфури В.В. і співавт. (2005). Активність загальної холінестерази міокарда (ХЕ) визначали фотоелектроколориметричним методом (Пушкина Н.Н. и соавт., 1963).

Усі результати дослідження були піддані математичній обробці з використанням параметричних методів статистичного аналізу (Поляков И.В. и соавт., 1975; Шевченко И.Т. и соавт., 1970). Визначали основні статистичні величини: середнє арифметичне, стандартну помилку середнього арифметичного, критерій Стьюдента, показник достовірності Р.

В умовах експериментального гіпотиреозу відбувається порушення нормального співвідношення між тонусом симпатичного і парасимпатичного відділів вегетативної нервової системи, про що свідчать зміни показників математичного аналізу серцевого ритму (табл.1).

Таблиця 1

Результати математичного аналізу серцевого ритму у щурів з експериментальним мерказоліловим гіпотиреозом (М±m)

У тварин з гіпотиреозом показник варіаційного розмаху ДХ, який характеризує надійність і адаптаційні можливості функціонування системи "синоатріальний вузол - блукаючий нерв”, поступово зростав. На 14-ту добу гіпотиреозу його величина перевищувала вихідну на 45,56 % (Р<0,01). Як показав аналіз показника Мо, гіпотиреоїдне серце поступово звільнюється від адренергічних впливів. На 10-ту добу Мо збільшилася на 13,50 %, порівняно з вихідним показником (Р<0,001). На 14-ту добу відбулося ще помітніше зростання Мо - на 24,45 %, порівняно з вихідною величиною (Р<0,001).

Щоб дати співвідносну оцінку змінам холінергічно-адренергічних взаємовідношень в динаміці гіпотиреозу, ми співставили ступінь змін показника ДХ, за яким судять про вираженість парасимпатичного тонусу, і показника Мо, який характеризує адренергічні впливи на серцевий ритм. До 10-тої доби гіпотиреозу зміни обидвох показників йшли паралельно. На 14-ту добу цей паралелізм втратився. Ступінь збільшення показника ДХ (на 45,56 %) майже вдвоє перевищував ступінь збільшення показника Мо (на 24,45 %). Отже, наростання холінергічних впливів при гіпотиреозі було вдвоє інтенсивнішим, ніж пригнічення адренергічної регуляції. На відміну від попередніх показників, АМо при гіпотиреозі майже не змінювалася. Оскільки АМо відображає активність центрального контура регуляції, який здійснює свої впливи через симпатичні нерви, то незмінність цього показника можна розцінювати як ще один аргумент на користь твердження, що у розвитку вегетативного дисбалансу вирішальне значення мають холінергічні зрушення.

Аналіз додаткових показників підтвердив встановлені раніше закономірності. Найбільш оперативними критеріями виявилися ВПР та ІН. Вони випереджували два інші показники у часі і характеризувалися значно вищим ступенем змін. Достовірне зменшення ВПР сталося на 10-ту добу гіпотиреозу. Зменшення ІН на 10-ту добу також було досить значним і може розцінюватися як виражена тенденція (Р>0,05). ПВБ і ПАПР досягли істотного зменшення на 14-ту добу. В кінці експерименту величина ВПР складала 52,67 % від вихідної (Р<0,001), що вказує на значну перевагу холінергічного компоненту регуляції над адренергічним. ІН на 14-ту добу становив 47,83 % від початкової величини (Р<0,002), що свідчить про поступову втрату центрального контролю серцевого ритму і підпорядкування його периферичному контуру регуляції на рівні системи "блукаючий нерв - синоатріальний вузол”. ПВБ до 14-тої доби зменшився помірно - на 39,53 %, порівняно з вихідною величиною (Р<0,01). Найбільшу стабільність в динаміці гіпотиреозу проявив ПАПР, який характеризує роль симпатичних впливів у функціонуванні синоатріального вузла, - на 14-ту добу він зменшився на 23,68 % (Р<0,01). Переважання змін ВПР над змінами ПАПР також вказує на те, що ваготонія при гіпотиреозі формується переважно внаслідок підсилення парасимпатичних впливів, а не обмеження симпатичних.

Інтенсивність вагусних впливів залежить, з одного боку, від кількості АХ в синаптосомах пресинаптичних закінчень, а з другого - від специфічної чутливості рецепторів постсинаптичної мембрани. Виходячи з цих міркувань, ми дослідили у контрольних і гіпотиреоїдних тварин негативно-хронотропні ефекти подразнення блукаючого нерва (тобто ендогенного парасимпатичного медіатора), а також негативно-хронотропні ефекти екзогенного АХ.

Негативно-хронотропні реакції серця на подразнення блукаючого нерва у контрольних тварин можна умовно поділити на три стадії, які добре розмежовані при напрузі 5 В. Перша стадія відповідає першому 10-секундному інтервалу часу і характеризується різко вираженою брадикардією. Друга стадія обмежена наступним 10-секундним інтервалом, протягом якого ступінь брадикардії раптово і різко знижується. Для третьої, найтривалішої стадії, яка охоплює 20-60-ті секунди подразнення, характерне плавне, поступове зменшення брадикардії. Поступове ослаблення негативно-хронотропних ефектів під час тривалої вагусної стимуляції ми розглядаємо як прояв "феномену вислизання”. У такий спосіб синоатріальний вузол позбавляється надмірних холінергічних впливів, а частота серцевого ритму не опускається нижче від гранично допустимого рівня.

Динаміка негативно-хронотропних реакцій серця на подразнення блукаючого нерва у тварин з експериментальним гіпотиреозом в цілому зберігала ті ж закономірності, що й у контрольних щурів, проте відрізнялася кількісними характеристиками. У тварин з 5-добовим гіпотиреозом при напрузі струму 5 В (рис.1) максимально виражена брадикардія також спостерігалася протягом першого 10-секундного інтервалу, але інтенсивність її була на 18,66 % вищою, ніж у контролі. При 10-добовому гіпотиреозі спостерігалася ще помітніша брадикардія у відповідь на подразнення нерва. Інтенсивність її протягом перших 10 с була на 56,34 % вищою, ніж у контролі (Р<0,05). У тварин з 14-добовим гіпотиреозом реакції виявилися ще сильнішими: протягом першого 10-секундного інтервалу інтенивність брадикардії перевищувала показник контролю на 58,78 % (Р<0,05). В межах кожного 10-секундного інтервалу ефективність подразнення також була вищою за аналогічний показник контрольних тварин на усіх етапах експериментального гіпотиреозу.

Отже, за результатами дослідів з подразненням блукаючого нерва напругою 5 В можна стверджувати, що з поглибленням гіпотиреозу зростає ефективність вагусних впливів на серцевий ритм. Найбільш імовірно, що залежність вагусних впливів від глибини гіпотиреозу має в своїй основі нагромадження АХ в нервових терміналях, які підходять до синоатріального вузла. Динаміка реакцій серця гіпотиреоїдних тварин на напругу 10 В характеризувалася тими ж закономірностями.

Внутрішньовенне введення АХ контрольним тваринам закономірно викликало сповільнення ритму, інтенсивність якого коливалася в межах 3,90-11,45, а тривалість - 7,58-18,50 с. У тварин з гіпотиреозом негативно-хронотропні реакції серця на АХ ставали меншими (рис.2). Найбільш помітне ослаблення ацетилхолінових ефектів спостерігалося на 5-ту добу гіпотиреозу: інтенсивність брадикардії зменшилася в середньому на 42,72 % (Р<0,02). На 10-ту добу відбулося деяке зростання реакційної здатності холінорецепторів, та все ж вираженість брадикардії залишалася нижчою, ніж у контролі. Подібно змінювалася її тривалість. Особливо чітко це проявилося на 5-ту добу гіпотиреозу, коли середня тривалість реакцій складала лише 62,67 % від показника контрольних тварин (Р<0,02).

Отже, гіпотиреоз супроводжувався пригніченням реакційної здатності холінорецепторів пейсмекерних клітин. Виявлену нами десенситизацію холінорецепторів щодо медіатора в умовах гіпотиреозу ми розцінюємо як механізм пристосування, спрямований на захист міоцитів провідної системи від дії великої кількості ендогенного АХ. Завдяки цьому механізму пейсмекерні клітини продовжують генерувати імпульси з деякою оптимальною частотою, незважаючи на безперервне бомбардування постсинаптичної мембрани квантами АХ. У такий спосіб вдається запобігти критичному сповільненню серцевого ритму в умовах гіпотиреозу і модулювати частоту в межах функціональних потреб організму.

У дослідах з електричним подразненням блукаючого нерва було отримано дані, що ефективність вагусних впливів на серце при гіпотиреозі значно вища, ніж у здорових тварин. Це пов'язано з функціональними змінами в ділянках синаптичних контактів між закінченнями холінергічних нервів і міоцитами синоатріального вузла. Оскільки у гіпотиреоїдних тварин чутливість холінорецепторів міоцитарних мембран до парасимпатичного медіатора знижується, постсинаптичний механізм не може мати значення у виникненні брадикардії при гіпотиреозі. Більш вірогідно, що в основі її виникнення лежить збільшення робочої кількості АХ, який викидається в синаптичну щілину і досягає постсинаптичної мембрани. Ця кількість залежить від інтенсивності одночасно протікаючих і збалансованих процесів синтезу і гідролізу медіатора. У зв'язку з цим нами було досліджено вміст АХ, активність ХАТФ і ХЕ в міокарді передсердь і шлуночків контрольних і гіпотиреоїдних щурів.

Вміст і розподіл АХ в міокарді передсердь і шлуночків контрольних і гіпотиреоїдних щурів представлено в табл.2.

Таблиця 2