Механизмы регенерации продолжают оставаться во многом загадочными, несмотря на огромный (и вполне оправданный) интерес ученых к этому явлению. Одной из загадок является роль нервов в процессе восстановления утраченных конечностей. Еще в 1823 году английский врач Твиди Джон Тодд (Tweedy John Todd, 1789-1840) обнаружил, что для восстановления отрезанной лапки у тритона необходимо присутствие живого нерва. Если убить нерв, идущий к конечности от спинного мозга, перерезав его у основания, то регенерация не происходит. В дальнейшем выяснилось, что для нормальной регенерации вовсе не нужно, чтобы нерв функционировал, то есть проводил нервные импульсы или выделял нейромедиаторы. Достаточно, чтобы он "просто был". Как оказалось, присутствие нерва, при выполнении некоторых условий, может стимулировать даже развитие дополнительной конечности ("пятой ноги") на месте обычной ранки. В дальнейшем было показано, что нервы необходимы для многих разновидностей регенерационных процессов как у позвоночных, так и у беспозвоночных.

На месте ампутации у тритона сначала образуется так называемая бластема - "холмик" из стволовых клеток, из которого, если всё пойдет нормально, постепенно вырастет новая нога. Бластема образуется даже в отсутствие нерва, но тогда процесс регенерации на этом и останавливается. Если же в культе есть живой нерв (который тоже начинает регенерировать после ампутации), клетки бластемы активно делятся и постепенно формируют заново утраченные части ноги - начиная от проксимальных (ближайших к основанию) и кончая дистальными, то есть пальцами. Интересно, что нерв является необходимым условием только для ранних этапов регенерации (кроме самого раннего - образования бластемы); если конечность уже начала отрастать, то удаление нерва не останавливает этот процесс.

Процесс регенерации утраченных конечностей во многом сходен с процессом их формирования во время эмбрионального развития. Как выяснилось, это сходство не только внешнее. Оба процесса регулируются одними и теми же генно-регуляторными каскадами - Wnt/beta-catenin и BMP. Включая и выключая отдельные гены - участники этих каскадов, можно не только отключить регенерацию у животных, способных к ней, но и включить ее у тех животных, которые эту способность потеряли. В частности, ученым удалось таким путем включить процесс регенерации утраченного крыла у цыпленка.

Биологи из Испании и США провели серию генно-инженерных экспериментов, в результате которых им удалось показать, что регенерация конечностей у позвоночных регулируется теми же ключевыми регуляторными белками, которые управляют развитием конечностей у эмбриона. Белки, о которых идет речь, образуют два сигнально-регуляторных каскада, или пути (pathways), которые называются Wnt/beta-catenin и BMP (по названию ключевого участника каскада - белка BMP, bone morphogenetic protein).

Для первого эксперимента ученые сконструировали специальный вирус, в геном которого был встроен ген белка Axin1. Этот белок блокирует работу Wnt-каскада. Введение вируса аксолотлю снизило способность к регенерации. У аксолотля в норме отрезанные конечности восстанавливаются полностью, однако у зараженных искусственным вирусом аксолотлей вместо лапы вырастала лишь заостренная культя без пальцев.

Этот эксперимент показал, что нормальная работа Wnt-каскада - необходимое условие регенерации, но является ли она также и достаточным условием? Чтобы проверить это, ученые поставили эксперимент на шпорцевой лягушке, у которой, в отличие от аксолотля, способность к регенерации есть только у головастиков и с возрастом исчезает. Был сконструирован еще один вирус, производящий белок бета-катенин - один из ключевых участников Wnt-каскада. Введение этого вируса улучшало способность шпорцевых лягушек к регенерации конечностей на тех стадиях развития, когда эта способность уже ослаблена. Однако у взрослых лягушек, полностью потерявших способность к регенерации, этого не наблюдалось. Следовательно, для регенерации необходимо что-то еще, кроме Wnt-каскада.

Третьим подопытным объектом стала рыбка данио-рерио (zebrafish). В норме эта рыбка способна заново отращивать утраченные плавники. Ранее было показано, что различные ингибиторы Wnt-каскада снижают эту способность (так же, как и у аксолотля и шпорцевой лягушки). Чтобы проверить, способно ли активирование Wnt-каскада усилить способность к регенерации у данио-рерио, исследователи использовали рыбок, потерявших эту способность в результате мутации. Введение таким рыбкам бета-катенинового вируса привело к частичному "исправлению" данного дефекта. На данио-рерио исследователям удалось также показать, что для успешной регенерации, помимо Wnt-каскада, должен нормально работать также и сигнально-регуляторный каскад BMP.

Самое интересное, что оба каскада (Wnt и BMP) руководят и развитием конечностей в ходе нормального эмбрионального развития. На клеточно-тканевом уровне оба процесса - регенерация и развитие конечности в эмбриогенезе - тоже очень сходны. Авторы не исключают, что у регенерации может быть и какая-то своя специфика (то есть могут быть какие-то особые регуляторы, необходимые для регенерации, но не участвующие в эмбриогенезе). Но в целом полученные на сегодняшний день данные указывают на то, что восстановление утраченных конечностей, по сути дела, осуществляется на основе той же самой программы развития, которая руководит формированием конечностей у эмбриона. И эту программу, по-видимому, можно искусственно "включить" даже у тех животных, которые в норме вообще не способны восстанавливать утраченные конечности. Ученым удалось подтвердить это предположение в опытах на курином эмбрионе. Удаление особого многослойного эпителия, расположенного на верхушке зачатка крыла, приводит к недоразвитию крыла (B). Однако если активировать у цыпленка ген бета-катенина, крыло после такой ампутации развивается гораздо лучше (D).

Один из важных регуляторов развития конечности - белок Prod 1, располагающийся на поверхности клеток бластемы. Он задает проксимально-дистальный градиент, от которого зависит, какие части растущего зачатка станут плечом, какие предплечьем, а какие - кистью. Чем ближе к основанию конечности, тем выше концентрация белка Prod 1, чем дальше от основания - тем меньше молекул белка можно найти на поверхности клеток развивающегося зачатка. Экспериментально было показано, что если искусственно активизировать синтез белка Prod 1 в дистальной части зачатка, то там, где следовало бы появиться предплечью или кисти, развивается что-то плечеподобное, то есть клетки начинают вести себя так, как если бы они были расположены гораздо ближе к основанию конечности.

Британские биологи предположили, что белок Prod 1, располагающийся на поверхности клеток, играет роль рецептора, и, следовательно, должен существовать лиганд - вещество, которое связывается с этим рецептором (и таким образом клетки бластемы принимают извне некий руководящий сигнал). Этот гипотетический лиганд, очевидно, должен играть важную роль в регуляции регенерационных процессов. Для его обнаружения ученые исследовали различные вещества, выделяемые клетками регенерирующей конечности, проверяя, не проявляют ли они склонности образовывать прочные комплексы с белком Prod 1. Целенаправленный поиск оказался успешным. Оказалось, что один из секретируемых (выделяемых клетками во внешнюю среду) белков, получивший название nAG, обладает искомым свойством. Этот белок относится к семейству белков AG (anterior gradient), о функциях которого известно довольно мало (в частности, известно, что некоторые AG-белки активно синтезируются в раковых опухолях у человека и грызунов).

Добавив его в культуру стволовых клеток бластемы, ученые обнаружили, что nAG резко ускоряет их деление. Это означало, что ученые на верном пути и что белок nAG может иметь прямое отношение к регенерации.

На следующем этапе исследований обнаружилась связь белка nAG с нервами. Оказалось, что вскоре после ампутации конечности в дистальной части культи начинается активное производства белка nAG клетками, окружающими регенерирующий нерв (шванновскими клетками). Через некоторое время на поверхности бластемы образуется тонкий эпидермис с желёзками, и в этих желёзках тоже вырабатывается белок nAG.

Если же нерв был перерезан у основания (то есть убит), то после ампутации шванновские клетки не производят белка nAG, а бластема вскоре прекращает свое развитие и не образует железок.

Таким образом, стало ясно, что живой восстанавливающийся нерв необходим для того, чтобы шванновские клетки начали вырабатывать белок nAG. Теперь уже у ученых появились все основания предполагать, что белок nAG играет какую-то роль в передаче "руководящего сигнала" от нерва к клеткам бластемы (а принимается этот сигнал белком Prod 1).

Если бы опыты ставились не на тритонах, а на мышах, то в качестве следующего шага было бы естественно "выключить" ген, кодирующий белок nAG (у мышей его нет, но есть его гомологи - белки AG2 и AG3), и посмотреть, будет ли отрастать отрезанная конечность. Но у мышей конечности, как известно, не отрастают, а у тритонов исследователи пока не умеют так ловко отключать гены. Поэтому исследователи поступили иначе. Сначала они перерезали нескольким тритонам нервы, идущие к правой передней лапе. Потом ампутировали конечность. После этого половине тритонов в культю ввели активно работающий ген белка nAG при помощи метода электропорации (создание пор в бислойной липидной мембране под действием электрического поля). Второй половине тритонов, которая служила контролем, тем же способом вели неработающий фрагмент ДНК.

Результат превзошел все ожидания. У контрольных тритонов, естественно, регенерация не состоялась (поскольку нерв был убит). У основной группы животных, несмотря на отсутствие в культе живого нерва, конечность восстановилась полностью, включая даже пальцы. Синтез белка nAG в шванновских клетках так и не начался, но бластема тем не менее стала быстро делиться и образовала эпидермис с желёзками, и эти желёзки, как и положено, начали производить белок nAG. После этого восстановление конечности шло обычным путем.

Таким образом, белок nAG оказался ключевым звеном в передаче сигнала от нерва к клеткам бластемы. Стало ясно, что живой восстанавливающийся нерв нужен для того, чтобы стимулировать производство белка nAG шванновскими клетками. Это стимулирует деление клеток бластемы и образование эпидермиса с желёзками, которые в дальнейшем берут синтез белка nAG на себя.

2. Регенерационная терапия

2.1 Определение