Генетичний комбінований скринінг першого триместру вагітності як ранній метод пренатальної діагностики

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАУКОВИЙ ЦЕНТР РАДІАЦІЙНОЇ МЕДИЦИНИ АМН УКРАЇНИ

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

ГЕНЕТИЧНИЙ КОМБІНОВАНИЙ СКРИНІНГ ПЕРШОГО ТРИМЕСТРА ВАГІТНОСТІ ЯК РАННІЙ МЕТОД ПРЕНАТАЛЬНОЇ ДІАГНОСТИКИ

03.00.15-генетика

БУТЕНКО Володимир Людвігович

Київ- 2006

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у відділі медичної генетики Наукового центру радіаційної медицини АМН України та Інституті генетики репродукції (м. Київ).

Науковий керівник: доктор медичних наук, професор

Бариляк Iгор Романович,

Науковий центр радіаційної медицини АМН України, завідувач відділу медичної генетики

Офіційні опоненти:

доктор медичних наук, професор Степанова Євгенія Іванівна,

Інститут клінічної радіології Наукового центру радіаційної медицини АМН України, завідувач відділу радіаційноЇ педіатрії, вродженої та спадкової патології

доктор медичних наук, професор

Юзько Олександр Михайлович,

Національна медична академія післядипломної освіти імені П.Л. Шупика МОЗ Украіни,

завідувач кафедри акушерства та гінекології №1

Провідна установа - Івано-Франківський державний медичний університет

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Складні екологічні, соціально-економічні умови в Україні привели до демографічної кризи, скорочення новонароджень та від'ємного приросту населення. На цьому фоні відбувається зростання частоти вроджених вад розвитку та спадкової патології (Бариляк І.Р. і співавт., 1993; Гречаніна О.Я. і співавт., 1991). Саме тому надзвичайно актуальною є розробка та впровадження методів ранньої (в тому числі, і пренатальної профілактики) вказаної патології (Арбузова С.Б. і співавт., 2002; Гойда Н.Г. і співавт., 2002; Ромадіна О.В., 2000; Bewley H. at al., 1995; Dubbins P.A. at al. 1998; Ghi at al., 2003; Smith-Bindman R.. at al., 2003; Spencer К. at al., 2000).

Світові тенденції в пренатальній діагностиці за останні десять років перемістилися та зосередились в сторону першого триместру вагітності (Devine Р. at al., 1999; Nicolaides K.H at al., 1999).

На те було декілька вагомих причин.

По-перше, маркери, що були розроблені та втілені в пренатальну діагностику першого триместру вдало відрізняються від маркерів пізніх термінів, передусім, більш високою чутливістю та інформативністю (Spencer K. at al., 1999; Grudzinskas J.G. at al., 1997).

По-друге, вдалося поєднати ультразвукові (товщина комірцевого простору, наявність або відсутність носової кісточки та інші) та біохімічні маркери хромосомних вражень плоду (асоційований з вагітністю протеїн-А або РАРР-А, ?-ХГ) та аномалій плоду нехромосомного походження (Haddow J.E. at al., 1998; Cicero S. at al., 2001).

По-третє, маркери першого триместру вагітності можуть виступати і як універсальні, і як специфічні по відношенню до окремих нозологічних форм. При паралельному використанні різних маркерів в різних комбінаціях вони підвищують чутливість тестів (Brambati B. at al., 1991; Snijders R.J. at al., 1998; Spencer K. at al., 1999; P. Taipale P. at al., 1997).

Ця властивість в пренатальній діагностиці передусім важлива для впровадження та реалізації скринінгових методик та програм.

Нарешті, термінація вагітності при необхідності незрівнянно безпечніша наприкінці саме першого триместру вагітності ( Nicolaides K.N. at al., 1999; Steel G. at al., 1999).

Високоінформативний скринінг, головним чином, дає змогу більш диференційовано складати групи ризику по хромосомним аномаліям для використання специфічних досліджень, наприклад, каріотипування плоду. Розмір груп ризику значно менший після використання маркерів та їх сполучень в першому триместрі вагітності. Тоді як каріотипування плода займає в 3-4 рази менше часу по зрівнянню з анологічними програмами в другому триместрі вагітності .

Самостійне використання сонографічних та біохімічних маркерів в медичній практиці існує в багатьох країнах та регіонах, але систематизація останніх та доведення їх до масових скринуючих систем в нашій країні поки відсутні України (Арбузова С.Б. і співавт., 2002; Веропотвелян Н.П. і співавт., 1999; Kazy Z. at al., 1982; Verlinsky Yu 1990).

Зв'язок роботи з науковими програмами планами, темами.

Виконана робота відповідає основному плану науково-дослідних робіт Наукового центру радіаційної медицини АМН України за бюджетною темою “Дослідження особливостей та ефективності комплексного генетичного скринінгу першого триместру вагітності, спрямованого на пренатальну діагностику спадкових і уроджених захворювань” (N державної реєстрації 0105U002650, 2001-2004 роки).

Мета дослідження. Вивчити можливості системного використання сонографічних та біохімічних маркерів у складі пренатального комбінованого генетичного скринінгу першого триместру вагітності та розробка пошукового алгоритму для визначення генетичної (хромосомної) патології плоду та вад розвитку нехромосомної природи.

Задачі дослідження.

1. Дослідити чутливість та специфічність сироваткових та сонографічних маркерів хромосомної патології вражень плоду в першому триместрі вагітності.

2. Проаналізувати та визначити оптимальні статистично-математичні підходи та методики для скринінгових обчислень.

3. Вивчити інформативність сигнальних показників та їх порогові значення для маркерів першого триместру у випадках хромосомно нормальних плодів після цитогенетичних досліджень.

4. Дослідити особливості поведінки маркерів першого триместру гестації для вагітностей після використання допоміжних репродуктивних технологій (ДРТ) та вагітних жінок, що проживають на радіаційно забруднених територіях.

Об'єкт дослідження. Вибірка з 2248 вагітних жінок першого триместру вагітності, які проходили програму генетичного комбінованого скринінгу. У склад дослідженої групи вагітних входили дві підгрупи вагітних: після використання допоміжних репродуктивних технологій та проживаючих на радіаційно забруднених територіях.

Предмет дослідження. Внутрішньоутробний плід в період 10-13 тижнів гестації.

Методи дослідження

Ультразвукові, біохімічні, цитогенетичні, статистичні.

Наукова новизна одержаних результатів.

Вперше досліджена та вичислена чутливість, специфічність, частота детекції для комбінованого скринінгу першого триместру вагітності для української популяції.

Досліджені особливості проявів чутливості окремих маркерів:38и граничній межі лені у 41,9 РАРР-А, ?-ХГ, АФП, товщини комірцевого простору (ТКП) та їх узагальненої інформативності протягом скринінгового проміжку часу--десятого-тринадцятого гестаційного тижнів.

Визначені та обчислені критичні значення для маркерів хромосомних вражень плоду, для яких тестова чутливість до хромосомних аномалій є найвищою.

Методологічно обґрунтована та практично доведена 88 %-на величина детекції хромосомних вражень плода для комбінованого скринінгу першого триместру вагітності та 68 %-на величина детекції при аналізі окремо ТКП.

Описані варіації маркерної поведінки для вагітностей після використання допоміжних репродуктивних технологій.

Практична значимість одержаних результатів.

При використанні лише одного сонографічного маркеру хромосомної патології плоду товщини комірцевого простору можна сформувати групу ризику для цитогенетичного дослідження з частотою детекції не менше 68% при 5%-му хибно позитивному рівні, що актуально та прийнятно в умовах жіночих консультацій.

Доведена практична значимість маркерів хромосомних вражень плоду у випадках, коли хромосомна патологія не підтверджена цитогенетичним дослідженням. Оптимізований та полегшений діагностичний пошук вроджених вад розвитку внутрішньоутробного плоду в загальній практиці пренатальної діагностики.

Удосконалений підхід при формуванні груп ризику по хромосомним враженням плоду, базуючись тільки на підставі віку вагітної.

Запропоновані різні склади та можливості комбінацій маркерів хромосомних аномалій плоду та алгоритми їх використання.

Обчислені коригуючі коефіцієнти для інтерпретації скринінгових результатів для вагітностей після використання ДРТ.

Особистий внесок здобувача. Автором проведено патентно-інформаційний пошук, проаналізовано літературу за обраною темою, розроблені основні теоретичні і практичні положення, визначено мету і завдання дослідження. Результати, викладені в дисертації, отримані та проаналізовані особисто автором або за його безпосередньої участі. Здобувачем проведена більшість ультразвукових досліджень (2020) оцінені сонографічні показники при оцінці стану плоду та виконані всі інвазивні втручання (біопсія хоріону та амніоцентез). Здобувачем написані всі розділи дисертації, сформульовані висновки і практичні рекомендації. Здійснена статистична обробка отриманої інформації та аналіз даних.

Цитогенетичні дослідження проведені спільно з кандидатом медичних наук О.В. Шеметун.

Впровадження в практичну діяльність. Результати даного дослідження стали основою для широкого використання скринуючих програм у ряді акушерсько-гінекологічних клінік м. Києва та в обласних медико-генетичних консультаціях. Дисертант власноруч виконав 90% всіх ультразвукових досліджень. Статистичні обчислювання, систематизація анамнестичної інформації та розробка бланків для висновків також виконані дисертантом.

Апробація результатів дисертації.

Головні положення дисертаційної роботи доповідались на 3-му з'їзді медичних генетиків у Львові (2002 рік), Першому (2002 рік) та Другому (2004 рік) Національних Конгресах з біоетики, четвертому конгресі світової федерації лікарських товариств у Полтаві (2006 рік), на науково-практичній конференції з міжнародною участю ,,Асоціації репродукції людини та ембріології'' (Київ, 2003).

За методикою та за пошуковими алгоритмами, які викладені в дисертації, налагоджено генетичний комбінований скринінг вагітних першого триместру вагітності в Інституті генетики репродукції (м. Київ), Рівенському та Хмельницькому медико-генетичних обласних консультаціях.

Публікації. Матеріали дисертації опубліковані в 10 наукових працях в провідних фахових виданнях, в тому числі 6 робіт у журналах та збірниках рекомендованих ВАК України.

Структура та обсяг дисертації. Дисертацію викладено на 137 сторінках машинописного тексту (113 сторінки основного тексту), вона має 26 таблиць, 16 рисунків. Текст дисертації включає вступ, огляд літератури, 8 розділів результатів власних досліджень, заключення та висновки. Список літератури охоплює 195 джерел, з них 31 робота вітчизняних та 164 іноземних авторів.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Об'єкт та методи дослідження.

Матеріалом для дослідження були результати комбінованого генетичного скринінгу першого триместру вагітності, проведеного в Інституті генетики репродукції в період з 2001 до 2003 року. Всього генетичний скринінг було здійснено у 2560 вагітних жінок. Після відбору з метою встановлення необхідної статистичної однорідності вибірки було обрано 2248 жінки з прогресуючою вагітністю.

Вік жінок коливався від 15 до 45 років і в середньому складав 32,2 +4,1 року. Для подальшого дослідження всі вагітні були розподілені на 10 вікових груп з інтервалом у три роки.

Комплексна пренатальна діагностика включала ультразвукові дослідження, скринінг маркерів материнської сироватки та інвазивні маніпуляції з метою отримання матеріалу для проведення цитогенетичних досліджень.

У програмі біохімічного скринінгу I-го триместру вагітності використовували як маркери плацентарний білок РАРР-А та вільну субодиницю хоріонічного гонадотропіну (?-ХГ). Показники біохімічних маркерів конвертовані в МоМ по генерованих медіанах після вивчення цих маркерів у 9200 вагітних при проведенні аналогічної пренатальної діагностичної програми в Reproductive Genetics Institute (Tsukerman G.,L. at al., 1999). У новонароджених основної групи підозр щодо наяності хромосомної патології не було.

Рівні вказаних маркерів у сироватці крові вивчали імунофлюоресцентним методом за допомогою стандартних та програмно адаптованих реагентів (Spencer at al., 2000).

Ризики хромосомних аберацій та дефектів невральної трубки визначали відповідно до показників ризику "Синдрому Дауна для MultiCalc". Програмні алгоритми відтворюються залежно від ступеня ризику за даними Kevin Spencer та Kypros H. Nicolaides (1999).

Розрахунок індивідуального ризику народження дитини з хромосомною патологією проводили з урахуванням віку жінки, рівня маркерів материнської сироватки та даних ультразвукового дослідження за допомогою комерційної комп'ютерної програми “Alpha computer programme, version 5.2”.

Для віднесення до групи ризику відносно хромосомних синдромів була вибрана межа 1:300 , яка є загальноприйнятою для популяції (Nicolaides K.H. at al., 1999; Snijders R.J. at al., 1998). У випадках, коли оцінка ризику перевищувала 1:300, жінкам пропонували провести інвазивне обстеження з метою каріотипування плода.

Цитогенетичні дослідження клітин хоріона та амніоцитів проведені за загальноприйнятими методиками (Лозинська і співавт., 1994; Walen, 2001).

З метою отримання матеріалу для цитогенетичного аналізу проводилися трансабдомінальна аспірація ворсин хоріона та амніоцентез. Трансабдомінальна аспірація ворсин хоріона є основним та найбільш прийнятним методом інвазивного втручання. Середня маса хоріона, що вимагається для проведення цитогенетичного та біохімічного досліджень, має становити 12-15 мг. Технічно процедура виконувалася під контролем конвексного датчика 3,5 МГц за методикою “вільної руки“. Тривалість маніпуляції в середньому становила 2-4 хв.

Амніоцентез в описаному дослідженні використовувався у випадках:

-перенесення часу виконання каріотипування плода з причини наявності акушерських протипоказань (загроза викидня, незадовільний перебіг вагітності у період 10-12 тижнів);

- звертання вагітних вже після 13 тижня вагітності;

-повторної інвазивної процедури при неінформативності каріотипування після біопсії хоріона.

Трансцервікальну аспірацію ворсин хоріона проводили рідко, порівняно з транс абдомінальною, у випадках, коли топографоанатомічні та синтопічні особливості розташування матки та сусідніх органів не сприяють безпечності проведення маніпуляції (розташування основної хоріальної маси по задній стінці матки, значне потовщення та післярубцеві зміни на передній черевній стінці).

Вивчення ультразвукових маркерів плодів 10-13 тижнів вагітності проведено на ультразвуковому сканері SIEMENS Versa Pro, який обладнано конвексним абдомінальним 3,5 МГц, вагінальним механічним 5,0 МГц та 6,0 МГц датчиками. Дослідження проводилося за вимогами The Fetal Medicine Foundation London (FMFL). Дослідженим сономаркером хромосомних аберацій плода була товщина комірцевого простору (ТКП).

Статистичні методи та розрахунки базувалися на використанні критеріїв для нормально розподіленої сукупності та методів аналізу множинної лінійної, поліноміальної та логістичної регресії. Як головні критерії діагностичного пошуку досліджувалися: чутливість, специфічність, прогностична цінність позитивного та негативного результатів тестів.

Математичну формулу, що пов'язує чутливість, специфічність тесту та частоту виявлення хромосомних аномалій плодів чи аномалію розвитку з прогностичною цінністю позитивного результату, виводили з теореми Байєса для умовних ймовірностей.

Кількісні показники були уніфіковані і приведені до статистично адаптованого вигляду як кратність медіані, яка є середньою у ряді упорядкованих за збільшенням показників материнських сироваткових білків, і ТКП при нормальній вагітності та позначається як МоМ (multiples of median). Границями норми умовно вважали діапазон від 0,5 до 2,0 МоМ.

Технічно методику було реалізовано за допомогою програмного пакету для комп`ютерного обчислення STATISTICA 6.

Результати дослідження та їх обговорення.

При обстеженні 2248 вагітних жінок виявлено 185 пацієнток з високим генетичним ризиком, що складає 8,2±0,7%. 171 пацієнтка пройшли інвазивну процедуру - біопсію хоріону з метою каріотипування плода; десяти вагітним проведено амніоцентез. 205 вагітних віком 35-ти і більше років були направлені на біопсію хоріона для наступного цитогенетичного аналізу клітин ворсин, незалежно від результатів комбінованого скринінгу на підставі підвищеного вікового ризику. З них у 67 вагітних (32,6%) підвищений ризик був зумовлений маркерними значеннями плацентарних гормонів та ТКП.

Каріотипування плодів у рамках комплексної програми було виконано майже всім вагітним групи високого комбінованого ризику (181-ій вагітній із 185-ти групи високого комбінованого ризику) та 53-м вагітним старше 35 років.

Досліджуючи біохімічні сироваткові маркери хромосомних розладів плода, було встановлено, що середній РАРР-А у вагітних жінок з високим генетичним ризиком коливається у незначних межах і не перевищує 1,18 МоМ, причому має місце тенденція до зниження рівня РАРР-А у жінок старшого віку: якщо у вагітних віком до 30 років середнє значення РАРР-А становило 1,18 +0,09 МоМ, то у жінок після 30 років воно знижувалось до 0,84±0,02 МоМ (Р<0,05).

Рівень вільного?? -ХГ у всіх жінок, у тому числі й у жінок з високим комбінованим ризиком, був у межах від 0,5 до 2,5 МоМ, причому у 70% пацієнток він не перевищував 2,0 МоМ, при середньому його значенні 1,55±0,14 МоМ.

У жінок з високим комбінованим ризиком існує певна залежність рівня вільного ? -ХГ від віку жінки: до 32 років його рівень залишається майже однаковим (дещо нижчі показники у жінок віком до 20 років можна пояснити невеликою кількістю спостережень), після 32 років намічається поступове його зниження, і найнижчий рівень спостерігався у жінок віком 43-45 років -1,7± 0,11МоМ.

Дослідження ультразвукових маркерів та фетометричних параметрів показало:

КТР плодів коливається в межах від 30 до 78 мм і більше, що в першу чергу пов'язано з терміном вагітності, на якому проводилося дослідження. Переважна більшість плодів мали КТР від 36 до 70 мм. При детальному статистичному аналізі фетометричних показників КТР плодів за межами 95^th не було виявлено за прийнятими в пренатальній діагностиці шкалами.

Плоди вагітних жінок, які ще не стали на облік до жіночої консультації та звернулись для проведення генетичного аналізу, зазвичай були на рівні 12 тижнів 3 дні (ДІ 12 тижн.1 дн. - 13 тижн. 2 дн.).

У 95% плодів ТКП знаходилась на рівні 1,5±0,39мм. Лише у 2,4% плодів цей показник був меншим, ніж 1 мм, а у 2,6% - більше 2,1 мм. Розподіл жінок з різними значеннями КТР у групах з високим комбінованим ризиком показані в таблиці 1. вагітність патологія репродуктивний триместр

У день проведення сонографічного дослідження проводився забір крові вагітних для біохімічного дослідження.

Таблиця 1

Середній показник КТР у жінок з високим комбінованим ризиком у різних вікових групах

№ п\п	Вікова група	Кількість обстежених жінок з високим комбінованим ризиком	Середній розмір КТР мм
1	18-20	2	37,3
2	21-23	11	43,04
3	24-26	18	46,17
4	27-29	23	43,76
5	30-32	25	45,87
6	33-35	39	48,65
7	36-39	34	48,42
8	40-42	27	49,0
9	43-45	6	51,8
Середнє значення	46,0
Двійні	11	41,0

При цьому має місце тенденція до збільшення ТКП з віком вагітної жінки: у вагітних до 30 років середній розмір ТКП становив 1,73 мм (ДІ 1,65;1,78 мм), тоді як у вагітних старше 30 років -- 1,88 (ДІ 1,76;1,93 мм). Розмір плода динамічно зростає з його віком, майже не залежить від віку вагітної жінки. А розмір ТКП - достатньо варіабельний показник, який має тенденцію до збільшення у жінок старшого віку.

Динамічний приріст ТКП з 10-го по 13-й тиждень вагітності становив 18% ( ДІ 14,1; 21,9 %) на кожний тиждень гестації для одного і того ж плоду у випадках підтвердженої трисомії та 7,1% (ДІ 5,9; 10,8%) - для випадків відсутності аномалій каріотипу (Р=0,034).

По відношенню до значень РАРР-А показники в-ХГ мають статистично підтвердженні кореляційні зв'язки для вагітних групи ризику, в яких виявлена саме трисомія-21 за методом поліноміальної регресії (скореговане значення R²=0,4676 на досягнутому рівні значимості Р=0,0098).

Простежена особливість поступового включення різних складових комбінованого генетичного скринінгу в такому порядку: раніше від інших чутлівість проявлялась для РАРР-А 58%+2,9% (10 тижн. 2 дні - 12 тижн. 4 дні), потім для ?-ХГ 57%+2,2% (10 тижн. 6 днів - 13 тижн. 4 днів) і на кінець вивчення ТКП 65%+3,2% (11 тижн. 2 дні - 13 тижн. 5 днів). Пікова, тобто максимальна чутливість, також характерна протягом 5 днів для РАРР-А , 11 днів для ?-ХГ і 12 днів для ТКП. Тобто проміжок часу для максимально ефективного скринінгу - 11-13 тижнів вагітності, особливо для його комбінованого використання. Процент хибно позитивних результатів, водночас, не має пікових значень та планомірно знижується з 10 тижн. 2 днів до 13 тижн. 5 днів майже в лінійному вигляді на рівні 5,3% (ДІ 4,7;6,9%) (рис.1).



Рис.1 Розподіл чутливості окремих компонентів комбінованого пренатального генетичного скринінгу

Чутливість окремих компонентів комбінованого генетичного скринінгу протягом 10 - 13 тижнів дещо відрізняється, реагуючи на наявність або відсутність хромосомних відхилень. В окремі проміжки часу проведення програми хромосомна патологія плода виражається в більшій мірі або плацентарним гормоном, або змінами ТКП.

Результати цитогенетичного аналізу в рамках комбінованого пренатального генетичного скринінгу першого триместру вагітності.

При проведенні програми генетичного скринінгу першого триместру у 2248 жінок 4 вагітності завершились самовільними викиднями в терміні до 16 тижнів, причому у двох з них пренатальне каріотипування не виконано через незгоду жінки на інвазивне втручання, у однієї жінки викидень відбувся на 23-му тижні вагітності (пізніше, при цитогенетичному дослідженні плаценти, у плода була встановлена трисомія 21).

Всі вагітні були віднесені до групи ризику за результатами скринінгу (табл. 2).

Таблиця 2

Результати цитогенетичного дослідження групи ризику

Кількість проведених досліджень	Виявлена хромосомна патологія
Нормальний каріотип	2204 (98,1 %)
А н о м а л ь н и й каріотип в тому числі Трисомія 21 Трисомія 18 Трисомія 13 Моносомія ХО Триплоідія	44 (1,9%) 26 (59,0 %) 4 (9,0 %) 3 (6,8 %) 3 (6,8 %) 2 (4,5 %)

Слід зазначити, що у 8 випадках при аналізі клітин хоріону та амніоцитів були виявлені складні мозаїчні форми з структурними перебудовами, які, як правило, несумісні з життям. Так, троє новонароджених з внутрішньоутробними множинними вадами розвитку померли в першу-другу добу після народження, одна вагітність перервалася на 19-му тижні. Новонароджений з одним шлуночком серця помер після народження. У одного 16-тижневого плода зі структурними перебудовами хромосом діагностований мегацистіс, і вагітність в даному випадку перервалася самовільним викиднем на 18-му тижні. У іншого плода з такими ж структурними перебудовами хромосом при патологоанатомічному дослідженні виявлено транспозицію головних артерій. Ця вада була не сумісною з життям, і цей новонароджений помер на п'ятій добі життя. На переривання вагітностей більшість пацієнток не погоджувалась.

Серед вад розвитку нехромосомної природи, в основному, зустрічалися вади серцево-судинної системи, плоди з аненцефалією і спинномозковою килою. Зокрема, у однієї вагітної був встановлений високий рівень АФП в амніотичній рідині (МоМ = 3,73), що й вказувало на наявність такої патології у плода.

Серед вад серцево-судинної системи діагностовані в другому триместрі та підтверджені в постнатальному періоді: стеноз легеневої артерії-1 випадок; коарктація аорти - 1 випадок; тетрада Фалло - 1 випадок; єдиний шлуночок серця - 1 випадок; гіперехогенні включення - 4 випадки.

Нами проведено зіставлення цитогенетичних показників з результатами оцінки ТКП при ультразвуковому обстеженні 124 жінок в групі підвищеного ризику, розрахованого на підставі тільки збільшеної ТКП (табл. 3).

Таблиця 3

Порівняння цитогенетичних показників з результатами оцінки товщини комірцевого простору (ТКП) у плодів групи ризику

ТКП мм	Кількість виявлень	К а р і о т и п
		нормальний	аномальний	т р и с о м і я	Моносо мія ХО
				21	18	13
3-4	60	55(91,6%)	5 (8,3%)	4	-	-	1
4-5	24	17(70,0%)	7(29,1%)	5	-	1	1
5-6	18	9(50,0%)	9(50,0%)	7	-	1	1
6-7	11	5(45,4%)	6(54,6%)	4	1	1	-
7-8	8	2(25,0%)	6(75,0%)	4	2	-	-
>8	3	0	3(100,0%)	2	1	-	-
Всього	124	88 (58,1%)	36(41,9%)	26	4	3	3

Як видно з даних таблиці 3, число плодів з аномалією каріотипу (анеуплоїдіями) корелює з величиною ТКП. Так, при розмірі останнього 3-4 мм число геномних порушень складало 8,3 %, при 4-5 мм - відповідно 29,1%, при 5-6 мм - 50,0 %, при 6-7 мм - 54,6 %, при 7-8 мм - 75,0 %. А у випадках, коли ТКП була більше 8 мм, зміни каріотипу були у всіх плодів.

З іншого боку, якщо врахувати, що в групі ризику (за показником ТКП) хромосомні аномалії виявлені у 30% плодів, що значно перевищує їх популяційну частоту, то цілком виправданим є проведення ультразвукового скринінгу плодів наприкінці першого триместру вагітності.

Привертає на себе увагу група обстежених вагітностей групи ризику після проведеного каріотипування, в яких єдиним чинником для включення до показань з метою цитогенетичного дослідження є тільки збільшена ТКП. Після проведеного каріотипування було встановлено нормальний каріотип, але під час ультразвукового дослідження в 22-24 тижні вагітності виявлені вади розвитку, у тому числі несумісні з життям після народження.

Зокрема, при цьому частота трисомії-21 та інших трисомій складає 36 на 124 (29,1 %), або 81,1 % від усіх виявлених хромосомних аномалій. Серед 8 плодів, у яких мала місце аномалія каріотипу, і які не включені в таблицю 3, в 2-х випадках була триплоїдія, у 5-х-транслокації: (46,XY,t(2;5)(q21;q31); 46,XX,der(1),(q21);46,ХХ,der(7)t(7;16)(q21;p11.2)[14]/46,XX[18];46,XY,der(12)t(12;22) (p11.2;p11.2); 46,XY,der (12)t(12;22)(p11.2;p11.2) [8]/46,XY[15])), та одна інверсія 46,ХХ,inv (p13q21).

Результати комбінованого генетичного скринінгу першого триместру вагітності при застосуванні програм допоміжних репродуктивних технологій.

У таблиці 4 наведені дані порівняння результатів генетичного скринінгу плодів у жінок контрольної (в тому числі і за даними популяційного дослідження) і основної (вагітних жінок після застосування різних методик ДРТ) груп.

Таблиця 4

Порівняння результатів генетичного скринінгу контрольної та ДРТ груп

Маркери	Популяційні дані	Р	Група контролю (n=410)	Р	Вагітні після ДРТ (n=133)
ультразвукові і біохімічні	статистичні
КТР мм	µ спс	58,2 ±5,3	0,5	58,0 ±4,8	0,44	57,9 ±5,4
ТКП МоМ	µ спс	1,7 ±0,8	0,3	1,3 ±0,5	0,3	1,2 ±0,4
?-ХГ МоМ	µ спс	1,01 ±0,34	0,5	1,11 ±0,36	0,04	1,41 ±0,24
РАРР-А МоМ	µ спс	1,2 ±0,49	0,5	1,01 ±0,45	0,88	0,88 ±0,28

Примітка: n - кількість жінок; µ- вибіркове середнє ; спс - стандартна похибка середнього; Р - рівень значимості.

Як свідчать наведені дані, фетометричні параметри і рівні біохімічних показників у жінок контрольної групи статистично не відрізняються від аналогічних даних популяційної групи. Зокрема, КТР плодів був відповідно 58,2 і 58,0 мм, а показник ?-ХГ - 1,01 і 1,11 МоМ.

Слід зазначити, що досліджувані показники у плодів основної групи також не відрізнялися від таких у контрольній групі. Проте привертає до себе увагу тенденція до зниження в основній групі рівня РАРР-А (відповідно в контролі 1,01 МоМ, в основній групі - 0,88), однак це зниження статистично недостовірне (Р=0,88).

Щодо рівня ?-ХГ, то у жінок після застосування ДРТ його концентрація становила 1.41 МоМ, що достовірно вище, чим у жінок контрольної групи (1,11 МоМ, Р=0,04).

Фетометричні показники були практично однаковими в обох групах обстежених жінок, проте у жінок, у яких застосовували ICSI, спостерігалася тенденція до зниження концентрації РАРР-А (0,89 і 0,91), проте ця різниця була також статистично недостовірною. Ризик виникнення хромосомного синдрому в жінок контрольної групи становив 4,1%, а в основної (після застосування ДРТ) - 6,1% (Р<0,05).

Каріотипування плодів за клітинами ворсин хоріона було проведено у всіх обстежених жінок (за винятком однієї з контрольної групи через відмову подружньої пари) і лише в двох випадках було діагностовано трисомію по 21-ій парі хромосом.

Результати комбінованого генетичного скринінгу першого триместру вагітності та цитогенетичний аналіз плодів вагітних жінок з радіаційно забруднених територій.

Кількість вагітних з радіаційно забруднених територій у загальній вибірці всіх обстежених вагітних була порівняно невеликою - 76 пацієнток, що в загальній вибірці складало лише 3,4%. Причому, переважну більшість групи складали жінки після 30 років (табл. 5).

Таблиця 5

Розподіл обстежених жінок з радіаційно забруднених територій

Вікові діапазони обстеженої групи (роки)	Кількість вагітних з радіаційно забруднених територій	Кількість вагітних з групи ризику	Кількість вагітних з хромосомними синдромами плода
	n	%	n	%	n	%
20-24	11	14,5	2	20	-	-
25-29	15	19,7	3	30	1	33,3
30-34	34	44,7	3	30	1	33,3
35-39	11	14,5	1	10	-	-
40 і більше	5	6,6	1	10	1	33,3
Всього:	76	100,0	10	13,2	3	3,9

Слід зазначити, що цей рівень статистично не відрізняється від відповідної величини у жінок загальної групи. Крім того, невелика вибірка вагітних жінок з радіаційно забруднених територій, в тому числі і пацієнток з групи ризику, не дозволяє провести аналіз частоти хромосомних порушень у плодів цих жінок.

Можна лише зазначити, що всі три випадки пов'язані з трисомією по 21 хромосомі. У двох з них в анамнезі були випадки народження дітей з вадами розвитку невизначеного походження, які померли в термін до трьох діб з моменту пологів. Отримані результати дозволяють припустити, що у жінок з радіаційно забруднених територій дані фактори могли не вплинули на стан хромосомного апарату їх плодів та методика формування груп високого ризику появи хромосомних уражень плоду у жінок з радіаційно забруднених територій не має особливостей та відмінностей від загальновизнаної тактики формування таких груп. Випадки детекції хромосомних аномалій плоду на скринінговому етапі шляхом вивчення сонографічних та материнських сироваткових маркерів набували подібних з іншими вагітними показників тестової чутливості та детекційної потужності.

Чутливість скринінгових методик до генетичної патології.

Як було зазначено, різні хромосомні аномалії були діагностовані у 44 плодів, в тому числі синдром Дауна - в 26 випадках. Разом з тим, було зафіксовано 124 випадка вимірювання ТКП ?3,0 мм, 112 вимірів за межами 95^th. “Скринуюча межа” (межа ризику або “cut-off risks”) обрана, як 1:300. Після проведених біопсій хоріона виявлено 40 плодів з хромосомними абераціями, після інвазивних методик для другого триместру - тільки 4.

Вплив встановлення межі ризику на чутливість скринінгових методик у різних комбінаціях наведено у таблиці 6. Порівнювали різні комбінації змінних, які визначають ризик народження дітей із синдромом Дауна та іншою хромосомною патологією.

Таблиця 6

Вплив різних встановлених меж ризику на чутливість скринінгових тестів

Склад тесту	Величина детекції при фіксованій 5% хибно позитивному рівні	М е ж і р и з и к у
		1 на 200	1 на 300
		Частота детекції %	Хибно позитивна частота %	Частота детекції %	Хибно позитивна частота %
Т К П	62	41	2,1	44	2,3
РАРР-А+ ?-ХГ	76	39	2,6	46	3,6
ТКП+ РАРР-А+ ?-ХГ	88	45	3,4	82	4,7

Розподіл хромосомної патології залежно від компетентності програми наведено в таблиці 7, з якої чітко прослідковується позитивна кореляція у високих показниках детекції хромосомної патології при використанні головним чином ТКП і РАРР-А.

Таблиця 7

Розподіл чутливості до хромосомної патології залежно від компетентності програм за складом та умовами

Комбінаційні показники	Скринінг вагітних > 35 років	ТКП 3 мм та більша	ТКП >95th	Комбінований тест при межі 1:300	ТКП ?3мм + вік
Кількість вагітних n	205	124	112	185	103
Кількість випадків с.Дауна	11	8	9	15	13
Детекційна потужність	1:250	1:15	1:12	1:5	1:8
Хибно позитивна частота, %	23,3	3,3	3,6	5,01	9,45

При показниках КТР, що знаходиться в проміжку від 47 мм до 60 мм (кінець десятого - початок одинадцятого тижнів), максимальна детекційна потужність комбінованого тесту визначається головним чином специфічними девіаціями РАРР-А. Протягом наступного тижня гестації на узагальнюючу чутливість впливає ТКП одночасно з ?-ХГ. Всі показники ТКП, що перевищують 3,0 мм, знаходяться за межами 95^th, чисельні значення ТКП більші 4,5 мм знаходяться відповідно за 99^th.

Розподіл передтестової (апріорної) чутливості для виявлення окремих трисомій розрахувати неможливо через недостатню кількість виявлень. Достовірні дані можна отримати по трисомії-21 (табл. 8). Взагалі для синдрома Дауна в абсолютному вигляді в даному дослідженні значення маркерів були в середньому: ТКП- 2.91±0.7 MoM , для PAPP-A 0.51 ±0.36 MoM та ?-ХГ-1,91 ±0.74 МоМ.

Прогностична цінність позитивного результату для будь-якого тесту вимагає саме кількісної аргументації. Досліджена вибірка даного дослідження репрезентативна для трисомії-21 і знаходиться на рівні р=0,023.

Таблиця 8

Дані розрахунку чутливості комбінованого скринінгового дослідження (ТКП+ РАРР-А+-?ХГ) по відношенню до трисомії-21

Автори	Термін вагітності, тижн.	Чутливість тесту для трисомії-21(%)	Процент хибно позитивних значень
Orlandi et al.(1997)	9-13	87	5
Wald and Hackshaw et al. (1998)	10-14	80	5
Spencer et al.(1995)	10-14	89	5
de Graaf et al. (1997)	10-14	84	3,3
Krantz et al. (1999)	10-14	87	5,3
Бутенко B. (2002)	10-14	85	5,1

Порівняльний аналіз ефективності генетичного скринінгу першого та другого триместру вагітності.

У другому триместрі розглянуті: потрійний тест -АФП+?-ХГ+Е3, потрійний тест + ІА (quadruple test) або ж четвертинний (немає загальноприйнятої української аналогової назви), та інтегральний тест, що включає показники генетичного комбінованого скринінгу першого триместру (ТКП + РАРР-А), та біохімічні маркери потрійного тесту + ІА тесту (“quadruple test” або “четвертинний”). Частота детекції хромосомних розладів в потрійному або четвертинному тесті при сталій величині хибно позитивних значень 5% становить 68% та 74% проти 88% в описаному дослідженні (за літературними від 83% до 90% при аналізі 56 досліджень, присвячених другому триместру вагітності). Але, водночас, спонтанна елімінація плодів з хромосомними аномаліями між 10 та 16 тижнями становить 18%. Головним недоліком можна вважати значно довший етап культивування амніоцитів порівняно з дослідженням ворсин хоріона та унеможливлення одномоментної медичної термінації вагітності у необхідних випадках, які мають, крім акушерських, зазвичай негативні психологічні наслідки. Вказані обставини спонукали науковців до пошуку та розвитку саме ранніх діагностичних скринінгових технологій.

ВИСНОВКИ

У дисертаційній роботі здійснено теоретичне узагальнення та нове вирішення наукового завдання -- проведення комплексного генетичного скринінгу патології плода в першому триместрі вагітності. На підставі ультразвукового дослідження плода, а також біохімічної оцінки рівня альфа-фетопротеїну, вільної субодиниці хоріонічного гонадотропіну (?-ХГ) та РАРР-А у сироватці вагітної жінки визначені інформативні маркери хромосомної та не хромосомної патології плода.

1. Головний ультразвуковий маркер комбінованого пренатального скринінгу першого триместру вагітності - комірцевий простір, являє собою найчутливішу ознаку хромосомного розладу плода, та у випадках його ізольованої маніфестації вказує на моно- або поліорганне враження плода нехромосомного походження.

2. У складі з біохімічною панеллю пренатального генетичного скринінгу (РАРР-А та ?-ХГ) збільшений комірцевий простір є найбільш чутливим компонентом комплексного діагностичного підходу з причини втілення патоморфологічних особливостей реалізації хромосомного дисбалансу внутрішньоутробного плода. Використання логістичної регресії дозволяє встановити ймовірність появи хромосомних аномалій у плода.

3. Комбінований пренатальний скринінг першого триместру вагітності щодо хромосомних аномалій має частоту детекції майже 88 % (ДІ 87,2-89,9%) при встановленій 5% хибно позитивній межі.

4. Чутливість до хромосомної патології ультразвукового маркеру ТКП становить 68%, а окремо тільки до трисомії-21 - 65%. Ця обставина є аргументованим підґрунтям для застосування дослідження комірцевого простору у всіх акушерсько-гінекологічних та медико-генетичних закладах, які проводять пренатальну діагностику.

5. Тривалість комбінованого пренатального скринінгу першого триместру вагітності складає 26 днів, чутливість окремих компонентів скринінгу не збігається, а набуває значення сигнальних маркерів РАРР-А або ?-ХГ або ТКП. Про наявність хромосомної патології може свідчити тільки один маркер, набуваючи надкритичних значень.

6. АФП в кінці першого триместру вагітності набуває сигнальних значень тільки при виражених дефектах розвитку центральної нервової системи.

7. Комбінований пренатальний скринінг першого триместру вагітності жінок, які завагітніли після застосування додаткових репродуктивних технологій, має кількісні та якісні особливості й потребує використання коефіцієнтів для урівноваження результатів. При цьому він не фіксує змін у передтестовій чутливості скринінгових маркерів і суттєво не збільшує групу ризику пацієнтів.

8. Порівнюючи детекційні можливості скринінгових діагностичних систем та методик до виявлення хромосомної патології плода у першому та другому триместрах вагітності, треба відзначити вищу чутливість тестів першого триместру - 89% (+1,3%) проти 72 (+2,4%) для тестів другого триместру вагітності (дані метааналізу 56-ти досліджень) .

9. У жінок, які проживають на радіаційно забрудненій території, ризик пошкодження внутрішньоутробного плода не відрізняється від такого у вагітних жінок контрольної групи. Методика формування груп високого ризику появи хромосомних уражень плода у жінок з радіаційно забруднених територій не має особливостей та відмінностей від загальновизнаної тактики формування подібних груп.

ПЕРЕЛІК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Бутенко В.Л., Бариляк И.Р., Стефанович А.В. Особенности комбинированного генетического скрининга первого триместра беременности после программ вспомагательных репродуктивных технологий // Цитология и генетика. -- 2005. -- №1.-- С. 99-103 (особистий внесок здобувача: проведення програм ДРТ, сонографічних досліджень та інвазивних втручань у вагітних в рамках пренатального генетичного скринінгу).

2. Бутенко В.Л., Бариляк И.Р. Результаты комплексно-го пренатального скрининга хромосомной патоло-гии плода в первом триместре беременности // Проблеми екологічної та медичної генетики. - Киів-Луганськ, 2004. -- Вип. 1 (54). -- С. 18-30 (особистий внесок здобувача: проведення сонографічних досліджень та інвазивних втручань у вагітних в рамках пренатального генетичного скринінгу, аналіз даних).

3. Бутенко В.Л., Бариляк И.Р. Увеличенный размер воротникового пространства плода как эхографический маркер хромосомных аномалий. Результаты изучения признака на 1000 беременных в сроке 10-14 недель // Проблеми екології та медицини. - 2002. - Т. 6. - №1-2. -- С. 14-16 (особистий внесок здобувача: проведення сонографічних досліджень та інвазивних втручань у вагітних в рамках пренатального генетичного скринінгу, наукова інтерпретація та виклад тексту).

4. Бутенко В.Л., Бариляк І.Р., Скибан Г.В., Шеметун О.В. Пренатальний скринінг вроджених вад розвитку і хромосомних синдромів в І триместрі вагітності як один з етапів профілактики цієї патології // Проблеми екологічної та медичної генетики і клінічної імунології: Зб. наук. праць.-- 2003.-- Вип. 2 (48). -- С. 163-167 (особистий внесок здобувача: збір матеріалу, попередня наукова інтерпретація та виклад тексту).

5. Стефанович А.В., Червякова Е.В., Шеметун Е.В., Бутенко В.Л., Талан О.А., Бариляк И.Р. Цитогенетическое исследование соматических и морфофункциональные характеристики ооцитов у женщин с нарушениями репродуктивной функции// Цитология и генетика. -- 2004. -- №1, -- С. 3-8 (особистий внесок здобувача: збір матеріалу для проведення цитогенетичних досліджень в рамках програм ДРТ).

6. Бутенко В.Л. Анализ исходов беременностей группы риска по хромосомным аномалиям плода с нормальным кариотипом // Здоровье женщины.-- 2004. -- №2 (18). -- С. 56-59.

7. Бутенко В.Л., Шеметун О.В. Біоетичні проблеми пренатальної діагностики вроджених вад розвитку: Зб. тез доп. Першого Національного Конгресу з біоетики (Київ, 4-5 вересня 2002 р.). --Київ. --2002 (особистий внесок здобувача: збір матеріалу, наукова інтерпретація та виклад тексту, підготовка до друку).

8. Бариляк І.Р., Стефанович А.В., Бутенко В.Л. Цитогенетичне дослідження статевих клітин при безплідді: Мат. ІІІ з'їзду медгенетиків. --Львів. --2002. -- С. 36 (особистий внесок здобувача: збір матеріалу для проведення цитогенетичних досліджень в рамках програм ДРТ).

9. Бариляк І.Р., Бутенко В.Л., Скибан Г.В. Сучасні підходи до профілактики вроджених вад розвитку: Тез. доп. ІХ конгр. СФУП. - Луганськ-Київ-Чикаго. --2002. -- С. 76 (особистий внесок здобувача: збір матеріалу, наукова інтерпретація та виклад тексту, підготовка до друку).

10. Бариляк И.Р., Стефанович А.В., Бутенко В.Л. Цитогенетические исследования при IVF технологиях // Актуальні проблеми лікування безплідності (Мат. конф. 30.05-1.06.2003). - Київ. - 2003. - С. 29 (особистий внесок здобувача: збір матеріалу, наукова інтерпретація та виклад тексту).

АНОТАЦІЯ

Бутенко В.Л. Генетичний комбінований скринінг першого триместру вагітності як ранній метод пренатальної діагностики. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 03.00.15-генетика - генетика. - Український науковий центр радіаційної медицини АМН України, Київ, 2006.

Дисертація присвячена вирішенню питань підвищення ефективності та інформативності скринінгових генетичних пренатальних досліджень у першому триместрі вагітності.

Методом проспективного обсерваційного дослідження одержано дані про детекційну потужність маркерів першого триместру вагітності: сонографічного -- товщини комірцевого простору (ТКП) і біохімічних маркерів: асоційованого з вагітністю протеїну (РАРР-А), вільного ланцюжка хоріонічного гонадотропіну людини (?-ХГ) та альфафетопроїну (АФП). Проведено цитогенетичні дослідження плодів групи ризику за ворсинами хоріона та амніоцитами.

Розраховано показники чутливості, специфічності, прогностичної цінності позитивного та негативного результатів діагностичних тестів, які включені в скринінгову методику. Охарактеризовано особливості маркерної поведінки протягом періоду проведення генетичного пренатального скринінгу в першому триместрі вагітності та їх сигнальні значення при виникненні хромосомних розладів у плода.

Досліджено особливості скринінгової інформативності для вагітних після проведення допоміжних репродуктивних технологій (ДРТ) та жінок з радіаційно забруднених територій.

Ключові слова: пренатальний генетичний скринінг, товщина комірцевого простору, РАРР-А, ?-ХГ, біопсія хоріону, амніоцентез, пренатальне каріотипування плода.

БУТЕНКО В.Л. ГЕНЕТИЧЕСКИЙ КОМБИНИРОВАННЫЙ СКРИНИНГ ПЕРВОГО ТРИМЕСТРА БЕРЕМЕННОСТИ КАК РАННИЙ МЕТОД ПРЕНАТАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ. - Рукопись.

Диссертация на соискание научной степени кандидата медицинских наук по специальности 03.00.15- генетика - генетика. - Украинский научный центр радиационной медицины АМН Украины, Киев, 2006.

Диссертация посвящена решению вопросов повышения эффективности и информативности скрининговых генетических пренатальных исследований в первом триместре беременности.

Методом проспективного обсервационного исследования получены данные о мощности детекции маркеров первого триместра беременности: ультразвукового - толщины воротникового пространства (ТВП) и биохимических маркеров: ассоциированного с беременностью протеина (РАРР-А), свободной цепи хорионического гонадотропина человека (?-ХГ) и альфафетопротеина (АФП). Проведены цитогенетические исследования плодов группы риска по ворсинам хориона и амниоцитам.

Рассчитаны показатели чувствительности, специфичности, прогностической ценности положительного и отрицательного результатов диагностических тестов, которые включены в скрининговую методику. Охарактеризованы особенности маркерного поведения на протяжении времени проведения генетического пренатального скрининга в первом триместре беременности и их сигнальные значения при возникновении хромосомных аномалий у плода. Выявлены и описаны наиболее характерные аномалии развития плода у беременных группы риска с нормальным хромосомным набором, но имеющие в первом триместре беременности сигнальные значения ультразвукового маркера ТВП или относящиеся к группе высокого комбинированного риска.

Обосновано использование сокращенных скрининговых методик, включающих исследование отдельно ультразвукового или биохимических маркеров, без потери диагностической ценности скринингового исследования. Описаны особенности дородового ведения беременных группы риска после проведенного кариотипирования плода при нормальном хромосомном наборе.

Исследованы особенности скрининговой информативности для беременных после проведения вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) и женщин с радиационно загрязненных территорий.

Ключевые слова: пренатальний генетический скрининг, толщина воротникового пространства, РАРР-А, ?-ХГ, биопсия хориона , амниоцентез, дородовое кариотипирование плода.

BUTENKO V.L. FIRST TTIMESTER COMBINED TEST AS EARLY METHOD IN PRENATAL DIAGNOSTIC. - Manuscript.

Dissertation for the scientific degree of candidate of medical sciences with specialty 03.00.15-genetics. --Ukrainian scientific center of radiological medicine under Academy of Medical Sciences of Ukraine, Kyiv, 2006.

Dissertation is dedicated to issues of improving effectiveness and information value of screening genetic prenatal studies in the first trimester of pregnancy.

Data on detection potential of the 1st trimester pregnancy markers were obtained through the prospective observation study method: sonographic marker -- (Nuchae translucency or NT) and bio-chemical markers: pregnancy-associated protein (РАРР-А), free-chain human chorionic gonadotropic hormone (free b-hCG) and Alpha-fetoproteina . Cytogenetic studies of fetus in risk groups by Chorionic Villus Sampling and amniotic fluid were conducted.

Screening methodology included calculated indicators of sensitivity, specificity and forecasted value of positive and negative results of conducted diagnostic tests. Specificity of marked behavior and warning indicators of fetal chromosomal disorders within the time of conducted genetic prenatal screening in the first trimester of pregnancy were characterized.

Specific features of screening informational value in pregnancies resulting from artificial reproductive technologies (ART) and in women from radiological polluted areas were analyzed.

Key words: prenatal genetic screening, Nuchal tranclucency or NT, РАРР-А, free b-hCG, chorionic biopsy, amniocentesis, prenatal karyotype fetus analysis.

Размещено на Allbest.ru