Размещено на http://www.allbest.ru/

МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ'Я УКРАЇНИ

НАЦІОНАЛЬНИЙ ФАРМАЦЕВТИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

15.00.02 - фармацевтична хімія та фармакогнозія

УДК 615.322:582.632.1

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата фармацевтичних наук

ФАРМАКОГНОСТИЧНЕ ВИВЧЕННЯ РОСЛИН РОДУ DUSCHEKIA OPIZ

Кулагіна Марія

Андріївна

Харків - 2006

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана на кафедрі ботаніки Національного фармацевтичного університету (м. Харків), Міністерства охорони здоров'я України.

Науковий керівник:

доктор фармацевтичних наук, професор Сербін Анатолій Гаврилович Національний фармацевтичний університет, завідувач кафедри ботаніки

Офіційні опоненти:

доктор фармацевтичних наук, професор Безуглий Петро Овксентійович Національний фармацевтичний університет, завідувач кафедри фармацевтичної хімії кандидат фармацевтичних наук, старший науковий співробітник Деркач Анатолій Іванович

Державне підприємство “Державний науковий центр лікарських засобів”, завідувач сектором природних гетероциклічних сполук

Провідна установа:

Запорізький державний медичний університет, кафедра фармакогнозії з курсом ботанікиЗахист відбудеться „ 21 ” квітня 2006 р. о 10 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.605.01 при Національному фармацевтичному університеті за адресою: 61002, м. Харків, вул. Пушкінська, 53.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного фармацевтичного університету (61168, м. Харків, вул. Блюхера, 4)

Автореферат розісланий „ 20 ” березня 2006 р

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради доктор біологічних наук, професор Малоштан Л.М.

1. ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми: Концепція оздоровлення, прийнята ВООЗ на XXI сторіччя, актуалізує проблему пошуку та розширення арсеналу ефективних, безпечних лікарських та профілактичних засобів. В даному контексті лікарські препарати на основі рослинної сировини виглядають дуже привабливими завдяки ряду позитивних властивостей: максимальній спорідненості до організму людини, більшою безпечністю відносно побічної дії, незначною алергійністю і токсичністю, можливістю тривалого використання без формування звикання.

Не менш актуальними в сучасній фармації залишаються питання раціонального і комплексного використання відомих лікарських рослин, а також пошук нових джерел природних біологічно активних сполук з метою розширення номенклатури офіцинальних лікарських рослин та сировинної бази.

Дана робота є продовженням досліджень НФаУ та ДНЦЛЗ з фітохімічного, анатомо-гістохімічного та фармакологічного вивчення видів родини Betulaceae, які здавна використовуються народною і науковою медициною.

До перспективних джерел лікарської рослинної сировини для виробництва препаратів антимікробної, протизапальної, імуностимулюючої та діуретичної дії належать види роду Duschekia Opiz, які характеризуються наявністю ряду біологічно активних речовин (БАР), в тому числі поліфенольних сполук.

Душекія зелена - Duschekia viridis (Chaix) Opiz відноситься до секції Alnobetula родини Betulaceae. Розповсюджена в Західній Україні, де займає від 4% до 6% загальної площі високогір'я Українських Карпат. Також до цього роду належать душекія Максимовича - Duschekia maximowiczii (Call.) Pouzar і душекія чагарникова - Duschekia fruticosa (Rupr.) Pouzar, які у дикому стані зрозтають поза межами України.

Фітохімічне, морфолого-анатомічне та гістохімічне вивчення видів роду Duschekia, отримання біологічно активних комплексів і субстанцій та впровадження в практику додаткових джерел офіційної лікарської рослинної сировини є актуальною проблемою.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами: Дисертаційна робота “Фармакогностичне вивчення рослин роду Duschekia Оpiz” виконана відповідно до планів науково-дослідних робіт Національного фармацевтичного університету з проблеми “Створення нових лікарських препаратів на основі рослинної та природної сировини, зокрема продуктів бджільництва для дорослих та дітей” (№ державної реєстрації 0198U007008) проблемної комісії “Фармація” МОЗ України.

Мета і завдання дослідження: Проведення порівняльного вивчення видів роду Duschekia щодо якісного складу та кількісного вмісту деяких груп біологічно активних речовин з метою їх виділення і подальшого використання в медичній практиці; визначення найбільш перспективного виду та сировини для одержання біологічно активних субстанцій, встановлення їх біологічної активності та стандартизація; вивчення морфолого-анатомічних діагностичних ознак сировини видів роду Duschekia та визначення ресурсів D. viridis в Україні.

Для досягнення постановленої мети необхідно було вирішити наступні завдання:

· провести попереднє фармакогностичне дослідження видів роду Duschekia та визначити найбільш перспективний вид і сировину для подальших досліджень;

· виділити в індивідуальному стані домінуючі речовини запропонованої сировини та встановити їх структуру;

· провести кількісне визначення основних БАР в рослинах роду Duschekia;

· розробити технологію одержання комплексів БАР та встановити їх біологічну активність;

· здійснити порівняльний морфологічний та анатомо-гістохімічний аналіз сировини видів роду Duschekia;

· провести ресурсознавчі дослідження та визначити запаси сировини Duschekia viridis на території України;

· розробити аналітичну нормативну документацію на сировину та одержану субстанцію.

Об'єкти дослідження: кора, листя, зелені і стиглі супліддя, однорічні та здерев'янілі пагони видів роду Duschekia: D. viridis, D. maximowizcii, D. fruticosa.

Предмет дослідження: Виявлення, кількісне визначення, виділення та встановлення структури біологічно активних речовин; вивчення біологічної активності сумарного поліфенольного та полісахаридних комплексів; визначення морфолого-анатомічних та гістохімічних ознак сировини D. viridis, D. maximowizcii, D. fruticosa; визначення запасів сировини D. viridis.

Методи дослідження: Якісний склад БАР визначали фармакопейними методами, використовуючи тонкошарову та паперову хроматографії. Для вилучення БАР із сировини застосовували методи вибіркової рідинної екстракції, адсорбційної колонкової хроматографії на силікагелі і поліамідному сорбенті та препаративну хроматографію на папері. Будову виділених сполук встановлювали хімічними та інструментальними методами. Кількісний склад БАР визначали за допомогою спектрофотометрії, газо-рідинної хроматографії, атомно-адсорбційної спектроскопії та ін. Фармакологічні дослідження проводили in vivo та in vitro. Мікроскопічні дослідження здійснювали за допомогою мікроскопів МБР-1 та МБУ-6, фотографування мікропрепаратів проводили фотоапаратом “ФЕД-5В” (плівки “Мікрат-200”, “Мікрат-300”) та цифровою фотокамерою Olympus “Camedia C-4000”. Ресурсознавчі визначення здійснювали загальноприйнятими в геоботаніці методами опису пробних ділянок.Наукова новизна отриманих результатів: Вперше здійснено комплексне фармакогностичне, фармакологічне та ресурсне дослідження видів роду Duschekia Opiz, визначено найперспективніший вид та сировину, встановлено якісний склад та кількісний вміст БАР. Із видів роду Duschekia виділено 19 індивідуальних сполук: флавоноїди (4), кумарини (3), оксикоричні кислоти (5), похідні бензойної кислоти (3) та елаготанини (4), серед яких вперше для роду - кофейна, ферулова, ізохлорогенова кислоти, елаготаніни та скополетин. Відпрацьовані методики виділення із сировини полісахаридів і поліфенолів, та вперше досліджено біологічну дію отриманих субстанцій; розроблений спосіб одержання суми поліфенолів з антимікробною, протизапальною та діуретичною активністю. Вперше визначені морфолого-анатомічні діагностичні ознаки рослинної сировини видів роду Duschekia, проведено ресурсознавче дослідження D. viridis на території Українських Карпат.

Новизна досліджень підтверджена пріоритетним висновком на заявку до патенту № а 200500114 від 04.01.2005 “Спосіб одержання суми поліфенолів з антимікробною, протизапальною та діуретичною активністю”.

Практичне значення одержаних результатів: Отримані дані про склад і вміст біологічно активних речовин сировини видів роду Duschekia Opiz можуть бути використані для розширення номенклатури і сировинної бази офіцинальних лікарських рослин та отримання нових фітокомплексів:

· Розроблено проекти АНД на ЛРС - супліддя D. viridis та на поліфенольну субстанцію під умовною назвою “Душекін”.

· Розроблено та апробовано на ДП “Дослідний завод ДНЦЛЗ”, м. Харків технологію одержання субстанції “Душекін” із стиглих суплідь D. viridis.

· Дані морфолого-анатомічного дослідження рослинних об'єктів використані для розробки АНД на лікарську рослинну сировину, а також уточнення систематичного статусу роду Duschekia Opiz.

· Проведено доклінічні фармакологічні та мікробіологічні дослідження біологічних комплексів, отриманих із вегетативних та генеративних органів D. viridis.

· Фрагменти роботи впроваджені у навчальний процес кафедр фармакогнозії НФаУ, Івано-Франківської державної медичної академії, Львівського національного медичного університету ім. Данила Галицького, Тернопільського державного медичного університету ім. І.Я. Горбачевського та Запорізького державного медичного університету.

Особистий внесок здобувача: Особисто автором проаналізована наукова література з досліджуваної проблеми; визначений якісний склад та кількісний вміст основних груп БАР, зокрема дубильних речовин, флавоноїдів, полісахаридів, амінокислот та жирних кислот в сировині трьох видів роду Duschekia; виділено в індивідуальному стані та ідентифіковано 19 сполук різної хімічної природи; встановлено їх будову; вивчена макро- та мікроскопічні будова трьох видів роду Duschekia, встановлено їх анатомічні та діагностичні ознаки; визначені основні ресурсні характеристики D. viridis в Українських Карпатах; на підставі отриманих експериментальних даних розроблено проект АНД на супліддя D. viridis; розроблено спосіб одержання суми поліфенолів (Душекін) із суплідь D. viridis та напрацьовано 5 серій субстанції в експериментальній фітохімічній лабораторії ДП “Дослідний завод ДНЦЛЗ”, м. Харків; розроблено проект АНД на субстанцію Душекін; узагальнено результати досліджень та сформульовано висновки.

Апробація результатів роботи: Матеріали дисертаційної роботи викладені в доповідях на V Національному з'їзді фармацевтів “Досягнення сучасної фармації та перспективи її розвитку у новому тисячолітті” (м. Харків, 1999 р.), міжвузівській науковій конференції студентів та молодих вчених (м. Харків, 2000 р., 2001 р.), XI з'їзді УБТ (м. Харків, 2001 р.), науково-практичній конференції “Ліки - людині” (м. Харків, 2001 р., 2004 р.), XI Міжнародному конгресі “Человек и лекарство” (г. Москва, 2004 г.), міжнародній науковій конференції “Історія та перспективи розвитку фармацевтичної науки та освіти” (м. Запоріжжя, 2004 р.), VI Національному з'їзді фармацевтів України (м. Харків, 2005 р.).

Публікації: За матеріалами дисертаційної роботи в наукових фахових журналах опубліковано 17 робіт, у тому числі, 5 статей, 1 коротке повідомлення, а також 10 тез доповідей і пріоритетний висновок на заявку до патенту.

Обсяг і структура дисертації: Робота викладена на 152 сторінках, складається із вступу, огляду літератури, експериментальної частини, загальних висновків, додатків та списку використаних літературних джерел, який містить 178 найменувань, у тому числі, 47 іноземних. Робота ілюстрована 28 рисунками, 12 схемами та 30 таблицями.

2. ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У вступі обґрунтована актуальність теми, сформульовані задачі досліджень, наведені відомості про наукову новизну і практичне значення одержаних результатів.

Перший розділ присвячений огляду літератури, який включає відомості щодо систематичного положення і видового складу роду Duschekia, ботанічний опис, хімічний склад і використання в народній медицині трьох представників цього роду: Duschekia viridis, D. maximowiczii, D. fruticosa. Достатньо розповсюджена на території Західної України душекія зелена - Duschekia viridis, відзначена як найбільш перспективне джерело біологічно активних речовин і може бути рекомендована для розширення бази екологічно чистої лікарської рослинної сировини, а також для подальшого поглибленого фармакогностичного і фармакологічного дослідження з метою створення рослинних препаратів антимікробної, протизапальної та іншої дії.

Другий розділ присвячений фітохімічному вивченню кори, листя та суплідь D. viridis, D. maximowiczii, D. fruticosa, зразки яких були зібрані у 2001-2004 рр в ботанічних садах України та в Українських Карпатах, виділенню та ідентифікації індивідуальних речовин із видів роду Duschekia.

Встановлена наявність в сировині дубильних речовин, похідних кислоти бензойної, елаготанінів, флавоноїдів, оксикоричних кислот та кумаринів. Проведений гістохімічний експрес-аналіз, адаптований відносно запропонованої сировини та зафіксований розподіл дубильних речовин по зонах листків, асимілюючих і здерев'янілих стебел.

Проведений хід виділення індивідуальних компонентів з використанням різних видів хроматографії, рехроматографії та подрібнювальної кристалізації. В результаті було виділено в індивідуальному стані та доведена структура 19 отриманих речовин. Виділення та встановлення структури деяких речовин проводили на базі ДП ДНЦЛЗ під керівництвом д. хім. н., проф. В.І. Литвиненка.

На підставі фізико-хімічних властивостей, хімічних перетворень, даних елементного та хроматографічного аналізу, УФ- та ІЧ-спектроскопії, молекулярної маси, якісних реакцій та порівнянням з достовірними зразками були ідентифіковані: 3 похідні бензойної кислоти (речовини І-Ш), 4 елаготаніни (речовини IV-VII), 5 похідних кислоти коричної (речовини VIII-XII), 3 похідних бензо-б-пірону (речовини XIII-XV), та 4 флавоноїди (речовини XVI-XIX). Серед них вперше для роду Duschekia виділені: кофейна, ферулова, ізохлорогенова кислоти, скополетин та чотири елаготаніна. Фізико-хімічні властивості виділених речовин наведені у табл. 1.

Таблиця 1 Деякі фізико-хімічні властивості речовин, виділених з видів роду Duschekia

Речовина	Хімічна назва	Загальна формула	Т. пл., °С	Спектральна характеристика	Джерело отримання (вид та орган*)
				УФ-спекр,нм	ІЧ-спектр, см-1
1	2	3	4	5	6	7
Похідні бензойної кислоти
I	3,4,5-тригідроксибензойна (кислота галова)	C7H6O5	251-252	265,269	1550,1640, 2470,3400, 3680,3710	D. viridis,D. fruti-cosa, D. maximo-wiczii (к., л., с.)
IІ	Етиловий ефір кислоти галової (етилгалат)	С9Н10О5	151-152	245,262,	-	D. viridis, D. maxi- mowiczii (к., л., с.) D. fruticosa (л., с.)
III	Ділактон кислоти гексагідроксидіфенової (кислота елагова)	C14H6O8	358 розкл.	260,345	1340,1790, 2500,2870, 3210,3400	D. viridis,D. maxi- mowiczii (л., с.) D. fruticosa (л.)
Елаготаніни
IV	Діефір гексагідроксидіфеноїла-(3-О-L-арабопіранозидо)-3-О-D-ксилопіранозид	С20H26O18	аморф.	220,284	1280,1345, 1650,1800, 2250,3310	D. viridis, D. fruti-cosa (к., л., с.) D. maximowiczii (л., с.)
V	Діефір гексагідроксидіфеноїла-(1-О-б-L-арабопіранозидо)-1-О-в-D-глюкопіранозид	С21H28O19	аморф.	235,290	1250,1400, 1580,1900, 2550,3360	D. viridis, D. maxi-mowiczii (к., л., с.) D. fruticosa (с.)
VI	Діефір гексагідроксидіфеноїла-(1-О-в-D-ксилопіранозидо)-1-О-в-D-глюкопіранозид	С21H28O19	аморф.	230,284	1200,1430, 1580,1840, 2150,2600, 3200	D. maximowiczii (к., л., с.), D. viridis, D. fruti-cosa (л., с.)
VII	Діефір гексагідроксидіфеноїла-(1-О-б-L-арабопіранозидо)-1-О- в-D ксилопіранозид	С20H26O18	аморф.	220,275	1200,1340, 1680,2300, 2760,3340	D. viridis, D. fruti-cosa (л., с.), D. ma-ximowiczii (с.)
Похідні коричної кислоти
VIII	3,4-дігідроксикорична (кислота кофейна)	C9H8O4	193-195	240,310	880,1565, 2975,3235, 3400	D. viridis (к., л.,с.) D. maximowiczii(с.) D. fruticosa (л.)
IX	3-гідрокси-4-метоксикорична (кислота ферулова)	C10H10O4	169-170	290,340	-	D. maximowiczii (к., л., с), D. viridis, D. fruticosa (л., с.)
X	5-О-кофеїл-D-хінна (кислота хлорогенова)	C16H18O9	203-204	230,320	-	D. viridis, D. maxi-mowiczii (л., с.) D. fruticosa (л.)
XI	3-О-кофеїл-D-хінна (кислота неохлорогенова)	C16H18O9	аморф.	245,325	870,920, 1625,3170, 3350	D. maximowiczii (л.), D. viridis, D. fruticosa (л., с.)
XII	3,4-О-кофеїл-D-хінна, 3,5-О-кофеїл-D-хінна та 4,5-О-кофеїл-D-хінна (кислота ізохлорогенова)	C25H24O12	аморф.	-	-	D. fruticosa (к., л., с.), D. maximowi-czii (с.), D. viridis (л., с.)
Похідні бензо-б-пірону (кумарини)
XIII	7-гідроксикумарин (умбеліферон)	C9H6O3	229-231	320,250	905,1000, 1140,1240, 1620,1690	D. maximowiczii (к., л., с.), D. viridis (л., с.)
XIV	6-метокси-7-гідроксикумарин (скополетин)	C10H8O4	202-204	227,250, 290,354	1100,1200, 1300,1390, 1545,1590, 1720,2890	D. maximowiczii (к., л.), D. viridis (л., с.), D. fruti-cosa (с.)
XV	6,7-дігідроксикумарин (ескулетин)	C9H6O4	268-271	235,260, 300,350	1160,1205, 1375,1406, 1475,1585, 1640,1660	D. maximowiczii (к., л.), D. fruti-cosa, D. viridis (л., с.)
Флавоноїди
XVI	3,5,7,4ґ-тетрагідроксифлавон (кемпферол)	C15H10O6	277-289	368,258	850,1510, 1570,1615, 1659,3340	D. maximowiczii (к., л., с.), D. viri-dis, D. fruticosa (л., с.)

Ідентифікація елаготанінів: Речовини IV-VII віднесені до гідролізуємих дубильних речовин елаготанінової групи, оскільки з 1% розчином хлорного заліза утворюють комплекс синьо-сірого кольору, що дозволяє судити про їхню поліфенольну природу. Загальна реакція на дубильні речовини - утворення осаду з розчином желатину позитивна. Ацетонові розчини виділених сполук дають позитивну реакцію на кислоту елагову, що свідчить про можливу її присутність у молекулах. З ваніліном в кислоті хлористоводневій реакція усіх виділених сполук негативна.

В УФ-спектрах виділених речовин спостерігаються максимуми поглинання при 219 та 279, 220 та 283, 220 та 265, 218 та 226 нм (сполуки IV-VII відповідно). В ІЧ-області спектра спостерігаються смуги поглинання при 3345-3350 см-1 (фенольні гідроксили), 1730-1710 см-1 (складноефірні зв`язки), 1620-1615 см-1 (бензольне кільце), 1020-1010 см-1 (цукровий компонент).

Схема хімічного перетворення елаготанінів (рис. 1) показує, що кислотний, лужний та ферментний гідролізи приводять до утворення в усіх сполуках кислоти елагової та L-арабінози і D-ксилози (сполука IV), L-арабінози і D-глюкози (сполука V), D-ксилози та D-глюкози (сполука VI) та L-арабінози і D-ксилози (сполука VII).

Хімічні перетворення, дані елементного аналізу та молекулярної маси свідчать, що речовини IV?VII є біозидами елагової кислоти, а цукри, що входять до молекули елаготанінів мають піранозну форму. Також підтверджено приєднання гексагідроксидіфеноїла у речовині IV до гідроксилу при С-3 вуглеводного залишку, а у сполуках V-VII до напівацетальних гідроксилів цукрів. Речовина IV має структуру діефіру гексагідроксидіфеноїлу-(3-О-L-арабопіранозидо)-3-О-D-ксилопіранозиду.

Третій розділ присвячений результатам визначення кількісного вмісту дубильних речовин, флавоноїдів, вуглеводів, амінокислот, жирних кислот, мікроелементів в корі, листі та супліддях D. viridis, D. maximowiczii, D. fruticosa.

Кількісний вміст флавоноїдів та дубильних речовин визначався, відповідно, спектрофотометричним (в перерахунку на гіперозид) та комплексонометричним (в перерахунку на танін) методами (табл. 2). Дані свідчать, що найбільшу кількість флавоноїдів вміщують листя та супліддя D. fruticosa і кора D. maximowiczii. Щодо дубильних речовин, то їх значною кількістю відрізняються супліддя усіх трьох видів. Суму окислювальних фенолів визначали перманганатометричним методом (ДФ ХІ).

Таблиця 2 Кількісний вміст поліфенольних речовин в корі, листі та супліддях видів роду Duschekia (n = 3, в перерахунку на абсолютно суху сировину)

Вид	Назва органу	Вміст суми флавоноїдів, %	Вміст суми окислювальних фенолів, %	Вміст дубильних речовин, %
D. viridis	Кора	сліди	29,140,16	4,750,14
	Листя	0,960,02	11,810,15	4,500,13
	Супліддя	1,240,02	15,420,18	8,190,02
D. maximo-wiczii	Кора	0,190,05	17,320,25	2,590,13
	Листя	1,550,02	11,500,18	3,860,10
	Супліддя	1,960,03	17,680,18	11,210,03
D. fruticosa	Кора	сліди	11,140,16	3,000,09
	Листя	2,100,03	14,490,20	4,340,10
	Супліддя	2,140,04	13,350,12	8,970,02

Таким чином, за вмістом дубильних речовин кору, листя та супліддя D. viridis, D. maximowiczii і D. fruticosa можна віднести до танідоносної лікарської рослинної сировини.

Амінокислотний аналіз кори, листя та суплідь видів роду Duschekia проводили на амінокислотному аналізаторі. Для визначення якісного складу та кількісного вмісту компонентів використовували автоматичний аналізатор фірми “Хітачі”, модель KLA - 3В. Дані аналізу свідчать про наявність не менше 16 амінокислот, 8 з яких є незамінними. Високим вмістом амінокислот відрізняються листя усіх трьох видів, а переважаючим компонентом як в листках так і в супліддях є глютамінова кислота. У слідових кількостях присутні треонін, гістидин та валін.

Жирнокислотний склад ліпофільних фракцій кори, листя та суплідь видів роду душекія аналізували методом газорідинної хроматографії на хроматографі “Хром-5” після метилування жирних кислот.

Діаграма (рис. 2) демонструє, що із 12 визначених жирних кислот найбільшу кількість складають пальмітинова, лінолева та ліноленова. Відмічено, що вміст жирних кислот в супліддях більше, ніж в корі та листях.

На підставі порівняльної характеристики рівня накопичення важких металів при дослідженні кількості мікроелементів, які містяться в корі, листі та супліддях D. viridis показано, що сировина з Українських Карпат є екологічно чистою та заслуговує на подальше поглиблене вивчення. Дані свідчать (рис. 3), що середній вміст важких металів свинцю та кадмію в пробах Карпатської сировини, значно нижчий, ніж в пробах сировини, зібраної в Харкові, вміст важких металів якої перевищує гранично припустимі концентрації. біологічний сировина активність duschekia

Одержані дані є можливим критерієм оцінки якості сировини та дозволяють рекомендувати збирати кору, листя і супліддя D. viridis в екологічно чистих районах на території Українських Карпат.

Виділені із вегетативних та генеративних органів D. viridis полісахаридні комплекси охарактеризовані за моносахаридним складом, кількісним вмістом кислих та нейтральних цукрів.

Отримані дані свідчать про те, що Duschekia viridis може бути використана як перспективна лікарська рослина.Четвертий розділ присвячений отриманню біологічно активних комплексів та вивченню їх фармакологічної активності. Беручи до уваги, що душекія зелена розповсюджена в Українських Карпатах і має достатні запаси сировини, ми зосередили подальші дослідження саме на її органах, які відрізняються високим вмістом БАР. Для отримання водних, водних-спиртових та етилацетатних екстрактів було використано: кору, листя, зелені та стиглі супліддя. Для виділення і фракціонування полісахаридів використовували відомі методики. Отримані сухі екстракти та 4 фракції полісахаридів: спирторозчинні цукри, водорозчинні полісахариди, пектинові речовини та геміцелюлози. В результаті визначення кількісного вмісту БАР у сировині було встановлено, що найбільша кількість їх міститься в стиглих супліддях. Найбільший вихід цільового продукту (5,6% 0,4) дає екстрагування етилацетатом. Тому подальші дослідження зводилися до їх поглибленого вивчення, а також розробці способу отримання субстанції з максимальним вмістом поліфенольних речовин, під умовною назвою - “Душекін”. Технологія представлена на рис. 4, та апробована в умовах експериментальної фітохімічної лабораторії ДП “Дослідний завод ДНЦЛЗ”, м. Харків.

Новизна досліджень підтверджена пріоритетним висновком на заявку до патенту № а 200500114 від 04.01.2005 “Спосіб одержання суми поліфенолів з антимікробною, протизапальною та діуретичною активністю”.

Дослідження антимікробної активності фітокомплексів проводили на базі інституту мікробіології та імунології ім. І.І. Мечникова АМН України під керівництвом зав. лабораторією біохімії мікроорганізмів та поживних середовищ ст. н. с., к. б. н. Т.П. Осолодченко за методами серійних розведень та дифузії в агар.

Вивчені сухі екстракти, а також різноманітні фракції полісахаридів з кори, листя, зелених та стиглих суплідь д. зеленої на антимікробну дію по відношенню до основних збудників хвороб (Staphylococcus aurеus, Escherichia coli, Proteus vulgaris, Proteus aeruginosa, Bacillus subtilis) та антифунгальну дію по відношенню до Candida albiсans.

Отримані дані свідчать про те, що усі 4 полісахаридних комплекси відрізняються обсягом та рівнем антимікробної активності. Діапазон її дуже широкий та проявляється у вигляді зон затримки росту від 9 до 25 мм. Низький рівень активності встановлений для фракцій пектинових речовин і геміцелюлоз, які інгибують ріст тільки стафілокока, кишкової палички та протея. Найбільш широкий спектр антимікробної та антифунгальної активності мають спиртові та етилацетатні екстракти з листків та стиглих суплідь.

В дослідах in vitro, які проводилися в лабораторії імунореабеталогії під керівництвом ст. н. с., к. б. н. С.Ю. Беляєвської за відомими методиками, фракції полісахаридів і водні екстракти отримані з кори, листя, зелених та стиглих суплідь д. зеленої виявляють імуномодулюючий ефект, але найактивнішіми є субстанції зі стиглих суплідь.

Фармакологічні дослідження Душекіну, а також різних полісахаридних фракцій душекії зеленої проводилися на кафедрі фармакотерапії НФаУ під керівництвом д. фарм. н., професора Б.А. Самури.

Експериментальним методом встановлена доза Душекіну, що проявляє найбільшу протизапальну активність і складає 40 мг на кг маси тварини.

Аналіз вивчення діуретичної активності фракцій полісахаридів і екстрактів з вегетативних та генеративних органів д. зеленої показує, що всі екстракти виявляють діуретичну дію. Найбільшу активність проявляють пектинові речовини з листя та водорозчинні полісахариди з суплідь. Визначено, що максимальна ефективність Душекіну, досягається при введенні дози близько 75 мл на кг маси тварини.

В результаті фармакологічних досліджень встановлено, що Душекін за класифікацією К.К. Сидорова відноситься до малотоксичних речовин (ЛД50 складає 540 ± 10,06 мг/кг) і має антимікробну, протизапальну, діуретичну та імуномодулюючу дії.

В п'ятому розділі обговорюються результати морфолого-анатомічних, гістохімічних та ресурсознавчих досліджень. Встановлені морфолого-анатомічні ознаки кори, листків, зелених та здерев'янілих стебел трьох видів роду душекія - Duschekia: д. зелена - D. viridis, д. Максимовича - D. maximowiczii, д. чагарникова - D. fruticosa.

Визначені видоспецифічні, а також спільні для роду анатомічні ознаки (дорзовентральна амфістоматична будови листкової пластинки; аномоцитний тип продихового апарату; наявність простих і залозистих трихом; двопучкова центральна жилка).

Визначені морфологічні і анатомічні діагностичні ознаки стиглих суплідь душекії зеленої - Duschekia viridis, що пропонуються у якості лікарської рослинної сировини для отримання біологічно активної субстанції “Душекін”. Враховані особливості анатомічної будови головної осі складного суцвіття - тирсу, осі і лусок “шишки”, оплодня крилатого горіха та насінини. На основі отриманих даних складені проекти розділів АНД “Зовнішні ознаки” і “Мікроскопія” для суплідь душекії зеленої - “Fructus Duschekiae”.

Досліджено, що у складі зеленовільхового криволісся Українських Карпат зарості Duschekia viridis займають близько 4-6% загальної площі високогір'я (біля 166,2 га), відповідно, ці райони є перспективними для промислових заготівель екологічно чистих суплідь Dusсhekia viridis (у нормі 8-12 т свіжої сировини на рік). Отримані дані можуть бути враховані у разі складання лімітів збалансованого використання національних фіторесурсів Карпат.

ВИСНОВКИ

1. Вперше проведено комплексне фармакогностичне дослідження кори, стебел, листя та суплідь D. viridis, D. maximowiczii та D. fruticosa з метою використання їх в якості лікарської рослинної сировини. Встановлено наявність дубильних речовин, похідних кислоти бензойної, елаготанінів, флавоноїдів, оксикоричних кислот, кумаринів, вуглеводів, амінокислот, жирних кислот та мікроелементів. Отримані дані свідчать про перспективність подальшого дослідження та використання лікарської рослинної сировини вказаних видів.

2. Вперше в індивідуальному стані із кори, листя та суплідь видів роду душекія виділено 19 сполук. На підставі хімічних та інструментальних досліджень встановлено структуру цих речовин: похідні кислоти бензойної - 3,4,5-тригідроксибензойна (галова), етиловий ефір кислоти галової (етилгалат), ділактон кислоти гексагідроксидіфенової (елагова); елаготаніни - діефір гексагідрокси діфеноїла-(3-О-L-арабопіранозидо)-3-О-D-ксилопіранозид, діефір гексагідроксидіфеноїла-(1-О-б-L-арабопіранозидо)-1-О-в-D-глюкопіранозид, діефір гексагідроксидіфеноїла-(1-О-в-D-ксилопіранозидо)-1-О-в-D-глюкопіранозид, діефір гексагідроксидіфеноїла-(1-О-б-L-арабопіранозидо)-1-О-в-D-ксилопіранозид; похідні кислоти коричної - 3,4-дігідроксикорична (кофейна), 3-гідрокси-4-метоксикорична (ферулова), 5-О-кофеїл-D-хінна (хлорогенова), 3-О-кофеїл-D-хінна (неохлорогенова), 3,4-О-кофеїл-D-хінна, 3,5-О-кофеїл-D-хінна та 4,5-О-кофеїл-D-хінна ксилоти (ізохлорогенова); похідні бензо-б-пірону (кумарини) - 7-гідроксикумарин (умбеліферон), 6-метокси-7-гідроксикумарин (скополетин); 6,7-дігідроксикумарин (ескулетин); флавоноїди - 3,5,7,4ґ-тетрагідроксифлавон (кемпферол); 3,5,7,3ґ,4ґ-пентагідроксифлавон (кверцетин), 3-О-в-D-галактопіранозил-5,7,3ґ,4ґ-тетрагідроксифлавон (гіперозид) та 3,5,7,3ґ,4ґ,5ґ-гексагідроксифлавон (мірицетин).

3. Визначений якісний склад та кількісний вміст біологічно активних сполук (дубильних речовин, флавоноїдів, вуглеводів, амінокислот, жирних кислот, мікроелементів) в корі, листі та супліддях видів роду Duschekia.

4. Із кори, листя і суплідь D. viridis, D. maximowiczii, D. fruticosa виділено 16 амінокислот та 12 жирних кислот. Вперше методом атомно-абсорбційного спектрального аналізу визначено вміст 11 мікроелементів в корі, листі та супліддях д. зеленої. На підставі порівняльної характерристики вмісту важких металів в д. зеленій показано, що сировина із Українських Карпат є екологічно чистою, і заслуговує на подальше поглиблене вивчення та використання.

5. Із кори, листя і суплідь д. зеленої одержані і охарактеризовані за мономірним складом та біологічними властивостями фракції водорозчинних полісахаридів, пектинових речовин та геміцелюлоз. Визначений кількісний вміст нейтральних та кислих цукрів у полісахаридних фракціях.

6. В результаті фармакологічних досліджень сухих екстрактів і фракцій полісахаридів із кори, листя, зелених та стиглих суплідь D. viridis встановлена антимікробна, антифунгальна, діуретична та імуномодулююча активність. Розроблено спосіб отримання суми поліфенольних сполук зі стиглих суплідь під умовною назвою “Душекін” та встановлено, що субстанція відноситься до малотоксичних речовин (ЛД50 складає 540 ± 10,06 мг/кг) і має додатково протизапальну дію.

7. Вперше встановлені морфолого-анатомічні діагностичні ознаки листків, зелених та здерев'янілих стебел трьох видів роду Duschekia. За допомогою експрес-методу проведено їх гістохімічне дослідження та встановлено місця локалізації гідролізуємих дубильних речовин. Досліджені макро- і мікроскопічні ознаки запропонованої лікарської рослинної сировини - стиглих суплідь душекії зеленої.

8. Розроблено проекти АНД на ЛРС супліддя д. зеленої - “Fructus Duschekiaе” та субстанцію Душекін. Визначені ресурси D. viridis в Українських Карпатах.

9. Результати роботи впроваджені у навчальний процес кафедр фармакогнозії та ботаніки НФаУ, Івано-Франківської державної медичної академії, Львівського національного медичного університету ім. Данила Галицького, Тернопільського державного медичного університету ім. І.Я. Горбачевського та Запорізького державного медичного університету.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ ДИСЕРТАЦІЇ ВИКЛАДЕНИЙ У РОБОТАХ

1. Кулагина М.А., Радько Е.В., Сербин А.Г. Duschekia viridis (Chaix) Opiz - перспективный источник биологически активных веществ //Актуальнi питання фармацевтичної та медичної науки та практики: Зб. наук. ст. - Запорiжжя, 2003.-С. 65-66. Особисто здобувачем проведено визначення поліфенольних сполук із сировини D. viridis, узагальнення результатів та оформлення статті.

2. Кулагина М.А., Сербина Н.А. Изучение элементного состава полисахаридов вегетативных и генеративных органов Duschekia viridis (Chaix) Opiz //Актуальнi питання фармацевтичноi та медичноi науки та практики: Зб. наук. ст. - Запорiжжя, 2004 - вип. ХІІ.-С. 228-230. Особисто здобувачем проведено огляд літератури, сплановано експеримент, отримані полісахаридні комплекси та узагальнені результати.

3. Кулагiна М.А., Сербін А.Г, Радько О.В. Iммуномодулююча дiя полiсахаридiв i водних екстрактiв вегетативних та генеративних органiв Duschekia viridis (Chaix) Opiz //Актуальнi питання фармацевтичноi та медичноi науки та практики: Зб. наук. ст. - Запорiжжя, 2004.-С. 224-227. Особисто здобувачем здійснювалась постановка задач досліджен-ня, приймалась участь в експерименті, обробці і аналізі матеріалів та узагальненні результатів.

4. Кулагіна М.А., Сербін А.Г., Радько О.В. Порівняльне фармакогностичне вивчення пагонів деяких видів роду Alnus Mill.s. і роду Duschekia Opiz //Вісник фармації. - 2004 -№ 3 (39).-С. 17-21. Особисто здобувачем проводилося визначення ряду поліфенольних сполук рослин роду Duschekia Opiz та оформлення статті.

5. Гістохімічне дослідження стебел і листків представників родів Alnus і Duschekia Opiz /М.А. Кулагіна, А.Г. Сербін, О.В. Радько, Л.М. Сіра //Медична хімія. - 2004. - Т. 6, № 1. - С. 64-67. Особисто здобувачем проводилися гістохімічні дослідженнях рослин роду Duschekia, оброб-ка матеріалу, обговорення результатів та написання статті.

6. Кулагіна М.А., Сербін А.Г., Радько О.В. Вивчення антимікробної активності полісахаридів вегетативних та генеративних органів Duschekia viridis (Chaix) Opiz //Медична хімія. - 2005. - Т. 7, № 4, - С. 16-18. Особисто здобувачем були отримані полісахаридні фракції та здійснена участь в експерименті, обробці і аналізі матеріалів.

7. Рішення про встановлення дати подання заявки на патент України на винахід МПК А 61К35/78 “Спосіб одержання суми поліфенолів з антимікробною, протизапальною та діуретичною активністю” /М.А. Кулагіна, А.Г. Сербін, О.В. Радько, Б.А. Самура, А.В. Таран, Т.П. Осолодченко - Заявка № а 2005 00114 від 04.01.05. Особисто здобувачем здійснено патентно-інформаційний пошук, отримано сумарний поліфенольний комплекс, участь в експериментальних дослідженнях на протизапальну та діуретичну активність, участь у написанні патенту.

8. Радько Е.В., Сербина С.А., Радько М.А. (Кулагина М.А.) Жирнокислотный состав вегетативных и генеративных органов некоторых видов рода Alnus //Досягнення сучасної фармації та перспективи її розвитку у новому тисячолітті: Мат. V нац. з'їзду фармацевтів України. - Х.: Укр. ФА, 1999.-С. 324.

9. Кулагіна М.А., Сербін А.Г. Виділення та аналіз вуглеводів з листків Duschekia viridis (Chaix) Opiz //Тез. доп. наук. конф. молодих вчених та студ. Х.: НФАУ, 2000.-С. 79.

10. Кулагіна М.А., Сербін А.Г. Вивчення елементного складу кори та листків Duschekia viridis (Chaix) Opiz //Тез. доп. наук. конф. молодих вчених та студ. Х.: НФАУ, 2001.-С. 79.

11. Кулагіна М.А., Радько О.В., Бабєєв М.Г. Морфолого-анатомічне дослідження кори Duschekia viridis (Chaix) Opiz //Тез. доп. наук. конф. молодих вчених та студ. - Х.: НФАУ, 2001.-С. 70.

12. Сравнительный морфолого-анатомический анализ коры 9 видов рода Alnus Mill.s.l. /С.А. Радько, А.Г. Сербин, М.А. Кулагина и др. //ХІ з'їзд Укр. ботанічне т-во:. Тез. докл. науч.-практ. конф.-Х.: ХНУ, 2001.-С. 320.

13. Кулагіна М.А., Сербін А.Г., Радько О.В. Вивчення біологічної активності природних комплексів з Duschekia viridis (Chaix) Opiz //Лекарства - человеку: Материалы науч.-практической конф.-Х., 2001.-С. 43.

14. Кулагина М.А., Сербин А.Г., Радько Е.В. Жирнокислотный состав растений рода Duschekia Opiz //Человек и лекарство: Тез. докл. ХІ Рос. нац. конгр. - Москва, 2004.-С. 803.

15. Кулагина М.А., Радько Е.В., Сербин А.Г. Аминокислотный состав растений рода Duschekia Opiz //Ліки людині. Сучасні аспекти фармокотерапии: Наук.- практ. конф., - Х., - 2004.-С. 75.

16. Кулагіна М.А. Розробка технології отримання суми поліфенольних речовин з суплідь Duschekia viridis (Chaix) Opiz //Досягнення та перспективи розвитку фармацевтичної галузі України: Матер. VІ Нац. з'їзду фармац. України. - Х.: Вид-но НФаУ, 2005.-С. 740.

17. Кулагіна М.А., Сербін А.Г., Радько О.В., Отримання біологічно активних комплексів із кори, листків і суплідь Duschekia viridis та вивчення їх мікробіологічної активності //Досягнення та перспективи розвитку фармацевтичної галузі України: Матер. VІ Нац. з'їзду фармацевтів України: Х.: Вид-но НФаУ, 2005.-С. 740-742.

АНОТАЦІЯ

Кулагіна М.А. Фармакогностичне вивчення рослин роду Duschekia Opiz - Рукопис. Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата фармацевтичних наук за спеціальністю 15.00.02 - фармацевтична хімія та фармакогнозія. - Національний фармацевтичний університет, Харків, 2006.

Проведено комплексне фармакогностичне вивчення кори, листя і суплідь D. viridis, D. maximowiczii та D. fruticosa. З досліджених видів виділено і встановлено структуру 19 індивідуальних сполук, з яких: три - похідні бензойної кислоти, п'ять - похідні оксикоричних кислот, три - кумарини, чотири - флавоноїди та чотири - елаготаніни. Визначений амінокислотний, жирнокислотний та мікроелементний склад рослинної сировини.

Проведено порівняльне морфолого-анатомічне вивчення видів роду Duschekia, кількісне визначення біологічно активних речовин та доклінічні фармакологічні дослідження біологічних комплексів, отриманих з вегетативних і генеративних органів D. viridis.

Розроблений спосіб отримання із суплідь D. viridis сумарної поліфенольної субстанції під умовною назвою “Душекін” з антимікробною, протизапальною та діуретичною дією.

Ключові слова: род душекія, душекія зелена, фармакогностичне вивчення, біологічно активні речовини, субстанція Душекін, антимікробна, протизапальна, діуретична активність.

Кулагина М.А. Фармакогностическое изучение растений рода Duschekia Opiz - Рукопись. Диссертация на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук по специальности 15.00.02 - фармацевти-ческая химия и фармакогнозия. - Национальный фармацевтический университет, Харьков, 2006.

Проведено комплексное фармакогностическое исследование коры, листьев и соплодий D. vіrіdіs, D. maxіmowіczіі и D. frutіcosa. Установлено наличие дубильных веществ, производных бензойной кислоты, элаготанинов, флавоноидов, оксикоричных кислот, кумаринов, углеводов, аминокислот, жирных кислот и микроэлементов. Полученные данные свидетельствуют о перспективности дальнейших исследований и использовании указанных видов в качестве лекарственного растительного сырья. Впервые в индивидуальном состоянии из коры, листьев и соплодий видов душекии выделено 19 веществ из которых: три - производные бензойной кислоты; пять - производные оксикоричной кислоты; три - производные бензо-б-пирона; четыре - флавоноида и четыре - элаготанина. Установлена их химическая структура. В сырье трех видов душекии комплексометрическим методом определены дубильные вещества, перманганатометричеким - окисляемые фенолы и спектрофотометрическим - флаваноиды. Количественное содержание флавоноидов в коре, листьях и соплодиях растений рода Duschekia варьирует от 0,19% до 2,14% в зависимости от сырья и вида, наиболее значительным содержанием дубильных веществ (8,19-11,21%) отличаются соплодия всех видов.

Изучен жирнокислотный состав коры, листьев и соплодий трех видов рода Duschekia. Отмечено, что из 12 определенных жирных кислот преобладают пальмитиновая, линолевая и линоленовая. В исследуемом сырье D. vіrіdіs, D. maxіmowіczіі и D. frutіcosa определен качественный состав и количественное содержание аминокислот. Установлено, что высоким содержанием аминокислот отличаются листья всех видов, а превалирующим компонентом как в листьях, так и в соплодиях является глутаминовая кислота.

На основании сравнительной характеристики уровня накопления тяжелых металлов при исследовании количества микроелементов содержищихся в коре, листьях и соплодиях D. vіrіdіs показано, что сырье из Украинских Карпат экологически чистое и заслуживает дальнейшего углубленного изучения.

Полученные данные свидетельствуют о том, что душекия зеленая может быть использована как перспективное лекарственное растение.

Разработан способ получения суммы полифенольных соединений из зрелых соплодий д. зеленой под условным названием “Душекин”. Технология апробирована в условиях экспериментальной фитохимической лаборатории на ГП “Опытный завод ГНЦЛС”, г. Харьков. Новизна исследований подтверждается приоритетным выводом на заявку к патенту № а 200500114 от 04.01.2005 “Способ получения суммы полифенолов с антимикробным, противовоспалительным и диуретическим действием”.

Из коры, листьев, зеленых и зрелых соплодий д. зеленой получены и охарактеризованы по мономерному составу фракции полисахаридов: спирторастворимых сахаров (СС), водорастворимых полисахаридов (ВРПС), пектиновых веществ (ПВ) и гемицеллюлозы (ГЦ). Определено количественное содержание нейтральных и кислых сахаров в полисахаридных фракциях.

Фармакологические исследования, проведенные на кафедре фармакотерапии НФаУ под руководством д. фарм. н., профессора Б.А. Самуры показали, что фракции ВРПС и ПВ, а также Душекин, который относится к малотоксичным веществам, проявляют диуретическую и противовоспалительную активность.

Исследованиями проведенными на базе института микробиологии и иммунологии им. И.И. Мечникова АМН Украины в лаборатории иммунореабетологии под руководством ст. науч. сотр., к. биол. н. Беляевской С.Ю. установлено, что Душекин и фракции полисахаридов в опытах in vitro оказывают иммуномодулирующий эффект, обладают антимикробным действием по отношению к основным возбудителям инфекций (S. aurеus, E. coli, P. vulgaris, P. aeruginosa, B. subtilis) и антифунгальным действием по отношению к C. albikans.

Определено анатомическое строение и установлены диагностические признаки листьев, зеленых и одревесневших побегов трех видов рода Duschekіa. С помощью экспресс-метода проведено гистохимическое исследование сырья изучаемых видов душекии и установлено место локализации гидролизуемых дубильных веществ в листьях, зеленых и одревесневших побегах. Установлены морфологические и анатомические диагностические признаки соплодий Duschekia viridis, что использовано при разработке соответствующих разделов проэкта АНД. Определены ресурсы D. viridis в Украинских Карпатах. Разработаны проэкты АНД на соплодия D. viridis - “Fructus Duschekiae” и субстанцию - “Душекин”.

Результаты работы внедрены в учебный процесс Национального фармацевтического университета, Ивано-Франковской государственной медицинской академии, Львовского национального медицинского университета им. Данилы Галицкого, Тернопольского государственного медицинского университета им. И Я. Горбачевского и Запорожского государственного медицинского университета.

Ключевые слова: род душекия, душекия зеленая, фармакогностическое изучение, биологически активные вещества, субстанция Душекин, антимикробная, противовоспалительная, диуретическая активность.

Kulagina M.A. Pharmacognosical study of рlants of Duschekia Opiz genus - the Manuscript. Thesis for a candidate of pharmaceutical science degree by speciality 15.00.02 - pharmaceutical chemistry and pharmacognosy. - National University of Pharmacy, Kharkov, 2006.

A comprehensive pharmacognosical study of the bark, leaves and infructescences of D. viridis, D. maximowiczii and D. fruticosa is carried out. 19 individual compounds (3 derivatives of benzoic acids, 5 oxycinnamine acids, 3 coumarins, 4 flavonoids and 4 alagotanids) are isolated and their structure is determined. The aminoacid, fatty acid and microelement compositions of the рlant raw material a determined.

A comparative morphological and anatomical study and the quantitative determination of biologically active substances of the species of Duschekia genus are made. The pre-clinical pharmacological study of biological complexes extracted from the vegetative and generative organs of D. viridis is carried out.

A method for obtaining of the special sum of polyphenol compounds with the antimicrobic, anti-inflammatory and diuretic actions (called by “Duschekin”) from the mature infructescences of D. viridis is invented.

Keywords: Duschekia genus, D. vіrіdіs, pharmacognosical study, biologically active substances, the complex Duschekin, antimicrobic, anti-inflammatory, diuretic action.

Размещено на Allbest.ru