Роль індукції цитохрому Р-450 2Е1 в патогенезі гепатотоксичності ізоніазиду

Key words: cytochrome P-450 2E1, hepatotoxicity, liver, isoniazid, composition “MV”, methionine, vitamins.

Матеріали та методи досліджень. Експерименти проведено на 214 статевозрілих білих щурах-самцях лінії Вістар з масою тіла 160-200 г, вирощених у віварії Інституту фармакології та токсикології АМН України. Тварини утримувались на стандартному раціоні віварію з вільним доступом до їжі та води.

В роботі використано: субстанцію ізоніазиду виробництва ЗАТ Фармацевтична фірма “Дарниця” (Україна), рифампіцин виробництва фармацевтичного заводу “POLFA”А.О. (Польща), дисульфірам фірми Sigma (Німеччина), піридоксину гідрохлорид, метіонін та композицію “МВ” надано АТ “Київський вітамінний завод”.

Експериментальні моделі ураження печінки, використані в дослідженні, представлено в табл. 1. Для моделювання експериментального медикаментозного гепатиту щурам внутрішньоочеревинно вводили ізоніазид у дозі 100 мг/кг маси тіла [С.М. Дроговоз, Ю.І. Губський, 2001] або ізоніазид у дозі 50 мг/кг та рифампіцин у дозі 86 мг/кг маси тіла щурам - внутрішньошлунково, виходячи з дозових рівнів при їх застосуванні в клініці [В.М. Петренко, 2002]. Дисульфірам, інгібітор CYP 2E1, вводили у дозі 30 мг/кг, виходячи з дози його застосування в клініці при алкоголізмі [C. Dollery, 1999]. Композицію “МВ” вводили щурам внутрішньошлунково у дозі 50 мг/кг маси тіла. У якості препаратів порівняння використовували антидот ізоніазиду піридоксин [M. Sievers, L. Chin, 1992] та метіонін, що є одним з основних складників композиції “МВ”. Піридоксину гідрохлорид і метіонін щурам вводили внутрішньошлунково у дозах 5 мг/кг та 60 мг/кг маси тіла, відповідно. Дози препаратів порівняння та компонентів експериментальної композиції “МВ” (метіонін, б-токоферол, піридоксин, нікотинамід, фолієва кислота, тіамін, цианкобаламін, цинку сульфат) розраховували, виходячи з добових доз, що застосовуються в медичній практиці [Ф.П. Тринус, 1994]. Всі вищезазначені дози досліджуваних засобів було обчислено з урахуванням коефіцієнту видової чутливості [Ю.Р. Рыболовлев, Р.С. Рыболовлев, 1979]. Експериментальний алкоголізм моделювали згідно Ю.В. Бурова та Н.Н. Вередникова [1985]. Щурам контрольної групи вводили 0,9 % розчин NaCl, шлях введення - відповідно до експериментальної моделі.

Через 24 год. після останнього введення досліджуваних засобів у тварин під легким наркозом діетиловим ефіром відбирали кров зі стегнової вени та піддавали евтаназії шляхом цервікальної дислокації. Печінку відмивали через воротну вену 0,15 М розчином КСl, виділяли мікросомну фракцію печінки за методом S.A. Kamath та F.A. Kummerow [1971]. Постмітохондріальну фракцію печінки щурів отримували за методом І.І. Карузіної та А.І. Арчакова [1977]. Усі процедури виконували з дотриманням холодового режиму ( +4 ⁰С).

Стан монооксигеназної системи печінки оцінювали за вмістом цитохромів Р-450 та b₅ [T. Omura, R. Sato, 1964], n-нітрофенолгідроксилазною [D.R. Koop, 1990] та анілін-N-гідроксилазною [И.И. Карузина, А.И. Арчаков, 1977] активністю в мікросомній або постмітохондріальній фракціях печінки.

В мікросомній або постмітохондріальній фракціях печінки досліджували швидкість НАДФН- та аскорбат-залежного утворення продуктів реакції з тіобарбітуровою кислотою (ТБК) [И.Д. Стальная, Т.Г. Гаришвили, 1977]. В гомогенаті печінки визначали вміст білкових та небілкових (глутатіон) SH-груп [J. Sedlak, R. Lindsay, 1968].

У гомогенаті, постмітохондріальній фракції та фракції мікросом печінки визначали вміст білку [O.H. Lowry, N.J. Rosebrough et al., 1951].

Активність аланін- (АлАТ), аспартатамінотрансферази (АсАТ), лужної фосфатази (ЛФ), вміст загального білірубіну в сироватці крові визначали за допомогою біотестів виробництва НПП “Филисит-Диагностика” (Україна) та фірми PLIVA - Lachema a.s. (Чехія).

Обчислювали відносну масу печінки. Для гістологічного вивчення зрізи печінки забарвлювали гематоксиліном і еозином за методикою М.Г. Шубича [1965]. Аналіз препаратів здійснювали за допомогою мікроскопа Leica, (Німеччина).

Розраховували коефіцієнт кореляції (r). Результати піддавали статистичній обробці та представляли у вигляді середнього арифметичного (М) і стандартної похибки середнього арифметичного (m) для певної вибірки (n). Вірогідність різниці середніх значень досліджуваних показників оцінювали за t- критерієм Ст'юдента. Зміни вважали статистично вірогідними при р<0,05.

В результаті проведених досліджень показано, що внаслідок внутрішньоочеревинного введення щурам ізоніазиду у дозі 50 мг/кг протягом 28 днів активність маркерного ферменту ізоформи CYP 2E1, п-нітрофенолгідроксилази, у постмітохондріальній фракції печінки зростала відносно контролю у три рази.

Це супроводжувалось збільшенням майже у 1,5 рази швидкості аскорбат-індукованого утворення ТБК-реактантів та зменшенням вмісту SH-груп білків у гомогенаті печінки на 13,7 % у порівнянні з контрольною групою, що, на нашу думку, може вказувати на їх окисну модифікацію та/або взаємодію з токсичними інтермедіатами ізоніазиду.

Отримані нами дані цілком узгоджуються з літературними, де показано, що збільшення активності ізоформи CYP 2E1 є одним із потужних промоторів розвитку оксидативного стресу, здатного спричиняти загибель клітин печінки [B.E. Jones, H. Liu et al., 2002].

Значне збільшення рівня індукції CYP 2E1 та посилення прооксидантних процесів в печінці спостерігалось також за умов внутрішньошлункового уведення щурам ізоніазиду у дозі 50 мг/кг протягом 28 днів на тлі індукторів цитохрому Р-450 2Е1 - рифампіцину або етанолу. Так, активність маркера CYP 2E1, n-нітрофенолгідроксилази, та швидкість НАДФН-індукованого утворення ТБК-реактантів в мікросомах печінки зростали, відповідно, в середньому у 2,6 і 1,6 рази в залежності від експериментальної моделі.

Досліджуючи загальний вміст цитохрому Р-450 в мікросомах печінки щурів, яким вводили ізоніазид у дозі 50 мг/кг протягом 28 днів окремо або на тлі етанолу, ми показали, що рівень вищезазначеного показника зменшувався, відповідно, на 34 % та 20 % відносно контролю.

Причиною цього можуть бути деструктивні зміни в мембранах ендоплазматичного ретикулуму, які виникають внаслідок посилення процесів ПОЛ та ковалентна взаємодія активних метаболітів ізоніазиду та етанолу з молекулами цитохрому з наступною їх деградацією [F.P. Guengerich, 2001].

Внутрішньоочеревинне введення щурам ізоніазиду у дозі 50 мг/кг протягом 28 днів призводило до збільшення активності АлАТ сироватки крові майже у 2 рази та відносної маси печінки на 50 % порівняно з контрольними тваринами. Це свідчить про різке зростання некрозодистрофічних порушень в клітинах печінки внаслідок токсичної дії реактивних інтермедіатів ізоніазиду. Під впливом ізоніазиду, внутрішньоочеревинно уведеного щурам у дозі 100 мг/кг маси тіла, також спостерігалось збільшення у 1,5 рази рівня загального білірубіну сироватки крові відносно контролю. Морфологічні дослідження печінки щурів за аналогічних умов експерименту виявили ознаки гіаліновокраплинної та гідропічної дистрофії, а також осередки некрозу печінки.

Внутрішньошлункове введення щурам інгібітора CYP 2E1, дисульфіраму у дозі 30 мг/кг маси тіла протягом 14 днів на тлі ізоніазиду, уведеного внутрішньоочеревинно у дозі 100 мг/кг маси тіла, призводило до зменшення на 50 % п-нітрофенолгідроксилазної активності та швидкості НАДФН-залежного утворення ТБК-активних продуктів мікросом печінки до рівня контрольних тварин.

Доказом прямого зв'язку між індукцією етанолзалежної ізоформи цитохрому Р-450 ізоніазидом та його токсичною дією на печінку є наявність позитивної кореляційної залежності між зростанням активності маркерного ферменту CYP 2E1, n-нітрофенолгідроксилази, та збільшенням рівня показників гепатотоксичності ізоніазиду - швидкість НАДФН-залежного утворення ТБК-реактантів фракції мікросом печінки, рівень загального білірубіну сироватки крові та відносна маса печінки.

Отримані нами експериментальні дані показали, що за умов введення щурам ізоніазиду окремо, сумісно з рифампіцином або етанолом, ушкодження печінки відбувається за рахунок посилення індукції CYP 2E1, що призводить до активації процесів ПОЛ та утворення токсичних інтермедіатів досліджуваних ксенобіотиків, здатних виступати промоторами ушкодження макромолекул, дестабілізації біомембран клітин печінки тощо. Це визначає необхідність пошуку засобів, здатних попереджати порушення, зумовлені дією індукторів CYP 2E1.

Аналіз даних літератури свідчить про здатність ряду біологічно-активних речовин корегувати патогенетичні ланки ушкоджень печінки ксенобіотиками-індукторами CYP 2E1. Зокрема, відомо, що метіонін, а точніше його активоване похідне, S-аденозил-1-метіонін, взаємодіє безпосередньо з CYP 2E1, інгібуючи його каталітичну активність [А.А. Caro, А.І. Cederbaum, 2005]. За даними M.K. Aleynik та співавторів [1999], здатність знижувати рівень індукції CYP 2E1 має фосфатидилхолін, для синтезу якого необхідний метіонін. Ця амінокислота є основним джерелом метильних груп, SH-груп білків та глутатіону, що відіграє важливу роль в системі антиоксидантного захисту клітин [S.C. Lu, 1998]. б-Токоферол, реагуючи з пероксид-радикалами ліпідів, взаємодіючи безпосередньо з синглетним молекулярним киснем, діє як антиоксидант [Е. Herrera, С. Barbas, 2001] та як мембранопротектор, взаємодіючи з компонентами мембран, що забезпечує їх стабілізацію [П.Дж. Квинн, 2004]. Нікотинамід, безпосередньо взаємодіючи з цитохромом Р-450 та з гідроперекисами ліпідів з утворенням N-оксиду нікотинаміду, знижує, таким чином, рівень процесів ПОЛ в мікросомах [A.B. Weitberg, 1999]. Не менш важливу роль нікотинамід відіграє у складі НАД·Н та НАДФ·Н, що є універсальними донорами електронів в реакціях енергообміну в мітохондріях, окиснення-відновлення в мікросомах тощо. Піридоксин, цианкобаламін, фолієва кислота та нікотинамід - необхідні коферменти в процесі синтезу глутатіону з метіоніну та обміну цієї амінокислоти [H. Refsum еt al., 1998]. Тіамін - за умов його нестачі зростає рівень індукції CYP 2E1 [J.S. Yoo et al., 1990]. За даними Y.J. Kang, Z. Zhou [2005] цинк пригнічує активацію CYP 2E1 в печінці і, як відомо, входить до активного центру ряду важливих ферментів, зокрема, супероксиддисмутази, яка забезпечує утилізацію радикалів кисню [Hassan H.M., 1998].

На основі вищезазначених сполук було розроблено експериментальну полівітамінну композицію “МВ”, яка, на наш погляд, здатна проявляти гепатопротекторні властивості шляхом корегуючого впливу на відповідні ланки патогенезу ушкодження печінки індукторами CYP 2E1.

Внутрішньошлункове введення щурам композиції “МВ” у дозі 50 мг/кг маси тіла на тлі ксенобіотиків сприяло зниженню активності n-нітрофенолгідроксилази в мікросомах печінки на 30 - 50 %, залежно від експериментальної моделі (рис. 3 А), що свідчить про здатність композиції значною мірою попереджати індукцію етанолзалежної ізоформи CYP 2E1.

Композиція “МВ”, уведена внутрішньошлунково щурам в дозі 50 мг/кг маси тіла за аналогічних експериментальних умов, сприяла нормалізації загального вмісту цитохрому Р-450 та проявила антиоксидантні властивості, знижуючи швидкість індукованого ПОЛ в мікросомах печінки щурів в середньому на 30 %.

Крім того, введення композиції “МВ” на тлі ізоніазиду запобігало зниженню вмісту SH-груп білків в гомогенаті печінки, що може свідчити про здатність компонентів композиції захищати сульфгідрильні групи від окисної модифікації та ушкодження інтермедіатами ізоніазиду.

Про гепатопротекторні властивості композиції за умов її застосування на тлі внутрішньоочеревинного уведення щурам ізоніазиду у дозі 50 мг/кг, свідчить здатність “МВ” знижувати як активність АлАТ сироватки крові, так і відносну масу печінки щурів до рівня цих показників у контрольних тварин, тоді як антидот ізоніазиду, піридоксин, уведений щурам за аналогічних умов у дозі 5 мг/кг, виявився малоефективним.

Одним з інтегральних показників, що характеризують стан печінки, є вміст загального білірубіну сироватки крові. Відомо, що збільшення цього показника може свідчити про порушення метаболічних процесів в гепатоцитах, застій білірубіну в печінці і нездатність переводити зв'язаний пігмент з клітин печінки у жовч [В.С. Камышников, 2004]. Отримані нами дані свідчать, що композиція “МВ”, внутрішньошлунково введена щурам у дозі 50 мг/кг, попереджала розвиток гіпербілірубінемії, яка мала місце за умов застосування ізоніазиду окремо, сумісно з рифампіцином або на тлі експериментального алкоголізму у щурів що є важливим фактором збереження структурно-функціональних властивостей печінки.

Метіонін та піридоксину гідрохлорид, уведені щурам внутрішньошлунково у дозах, відповідно, 60 і 5 мг/кг маси тіла за аналогічних експериментальних умов, проявили низьку ефективність.

Внутрішньошлункове уведення щурам композиції “МВ” у дозі 50 мг/кг на тлі застосування ізоніазиду у дозі 50 мг/кг сумісно з рифампіцином у дозі 86 мг/кг маси тіла або на тлі експериментального алкоголізму, призводило до зниження активності маркерного ферменту холестазу - ЛФ в середньому на 23 % та нормалізації активності амінотрансфераз в сироватці крові, що є підтвердженням гепатопротекторних властивостей композиції.

Отже, в результаті експериментальних досліджень встановлено наявність прямої кореляційної залежності між активацією ізоніазидом CYP 2E1 в печінці та критеріальними показниками її ушкодження. Показано, що застосування інгібітора CYP 2E1 дисульфіраму попереджало розвиток токсичного гепатиту, викликаного ізоніазидом, що підтверджує роль індукції CYP 2E1 в реалізації гепатотоксичних властивостей ізоніазиду. Виявлена гепатопротекторна активність експериментальної полівітамінної композиції метаболічної дії “МВ” обґрунтовує доцільності розробки фармакологічних засобів, здатних попереджати активацію CYP 2E1, для профілактики токсичних ушкоджень печінки ізоніазидом та іншими індукторами вказаної ізоформи цитохрому Р-450.