Цитологічні та імуноцитохімічні особливості епітелію шийки матки і цервікального каналу жінок фертильного віку при вірусному та бактеріальному інфікуванні

Размещено на http://www.allbest.ru/

МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ'Я УКРАЇНИ

НАЦІОНАЛЬНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ІМЕНІ О.О.БОГОМОЛЬЦЯ

АВТОРЕФЕРАТ

ЦИТОЛОГІЧНІ ТА ІМУНОЦИТОХІМІЧНІ ОСОБЛИВОСТІ ЕПІТЕЛІЮ ШИЙКИ МАТКИ І ЦЕРВІКАЛЬНОГО КАНАЛУ ЖІНОК ФЕРТИЛЬНОГО ВІКУ ПРИ ВІРУСНОМУ ТА БАКТЕРІАЛЬНОМУ ІНФІКУВАННІ

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті педіатрії, акушерства та гінекології АМН України

Науковий керівник:

доктор медичних наук, професор Задорожна Тамара Данилівна Інститут педіатрії, акушерства та гінекології АМН України, завідувач лабораторії патоморфології

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, професор Стеченко Людмила Олександрівна, Національний медичний університет ім. О.О. Богомольця, професор кафедри гістології та ембріології;

кандидат медичних наук, Шатрова Клавдія Михайлівна, Національна медична академія післядипломної освіти ім. П.Л. Шупика МОЗ України, доцент кафедри патологічної анатомії.

Провідна установа: Тернопільська державна медична академія імені І.Я. Горбачевського, кафедра гістології, цитології та ембріології, МОЗ України, м. Тернопіль.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного медичного університету імені О.О. Богомольця (03057, м. Київ, вул. Зоологічна, 1)

Автореферат розісланий „______”_________________________2007р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради доктор медичних наук, професор Грабовий О.М.

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Запальні захворювання шийки матки займають одне з перших місць у структурі захворюваності жінок, при цьому їх кількість продовжує зростати, особливо в групі пацієнток репродуктивного віку [Анишина М.Б., 2003; Глуховец Б.И., Глуховец Н.Г., 2006]. Інфекційні урогенітальні захворювання, етіологічними агентами яких можуть бути як бактеріальні, так і вірусні фактори, являють собою важливу медико-соціальну проблему у зв'язку з можливістю розвитку важких ускладнень з боку репродуктивної системи жінок [Сидорова И.С., Леваков С.А. 2006]. Серед захворювань, які передаються статевим шляхом, особливе значення мають папіломавірусна (ВПЛ) та герпетична (ВПГ) інфекції геніталій. Це пов'язано, по-перше, з досить високою частотою розповсюдженості інфекції, по-друге, ВПЛ та ВПГ надзвичайно складні для діагностики, особливо їх латентні форми, при яких морфологічні зміни в клітинах не спостерігаються, по-третє - високою онкогенною активністю вірусів [Кулаков В.И., Аполихина И.Ф., 1999; Киселев В.И., 2004].

У зв'язку з широкою розповсюдженістю запальних ушкоджень шийки матки, все більшу актуальність набувають цитологічні дослідження, результати яких є важливими для ранньої діагностики неопластичних змін епітелію шийки матки [Бахутова Г.А., Тамразова Л.И., 2004]. В останні роки цитологічні дослідження поповнилися важливими для діагностики імуноцитохімічними методами, які набувають широкого застосування у світі. Особливе місце серед них займають методи направлені на виявлення рецепторів апоптозу та проліферації, оскільки порушення регуляторних механізмів апоптозу може призводити до проліферації клітин з неопластичними змінами [Райхлин Н.Т., Райхлин А.Н., 2002]. Встановлено, що гормони здатні індукувати ріст епітелію шийки матки, пошкодженого вірусами, з утворенням кондилом, а також підвищують рівень вірус-специфічних ДНК, а деякі епідеміологічні дослідження відводять експозиції естрогену таку ж роль як інфекції папіломавірусу людини в цервікальному канцерогенезі [H.B. Nair, R. Luthra, N. Kirma et. al., 2005].

Аналіз наукових робіт показав, що значна кількість їх присвячена особливостям терапевтичного лікування жінок з вірусним та бактеріальним інфікуванням. Морфологічні аспекти проблеми у вітчизняній та зарубіжній літературі освітлені у меншому ступені, ніж етіологічні, лікувальні та профілактичні. Сучасна морфологічна діагностика хронічних запальних захворювань шийки матки потребує принципово інших підходів. Поява імуноцитохімічних методів дослідження з використанням моноклональних антитіл відкрила нові перспективи в якісній діагностиці патологічних станів шийки матки.

До теперішнього часу в літературі не висвітлені імуноцитохімічні маркери процесу апоптозу, не встановлені важливі для клінічної діагностики показники апоптозного, проліферативного індексів та їх співвідношення в епітелії шийки матки жінок фертильного віку при хронічних запальних захворюваннях репродуктивних органів. Тому дуже важливим є вивчення імуноцитохімічних особливостей факторів, які беруть участь у запуску процесу апоптозу та його регуляції, таких як Fas(APO-1\CD95) та вcl-2, маркерів проліферативних процесів (Кі-67, PCNA), особливостей експресії рецепторів до естрогенів та прогестерону, проведення CIN-тесту на ген р16 (INK4a/CDKN2a), який визначає клітини з онкоцитодеструкцією на ранніх стадіях.

Зв'язок роботи з науковими програмами, темами, планами. Основні положення дисертації були розроблені в рамках Державної науково-технічної програми: "Захист генофонду населення України". Фрагменти роботи виконувались в рамках науково-дослідних робіт ІПАГ АМН України: „Визначення ролі апоптоза і апонекроза в розвитку склеротичних процесів з метою виявлення маркерів хронізації соматичних захворювань у дітей та жінок”, № держреєстрації - 01.03. U 002 250; „Вивчити структурні особливості апоптозу і проліферативних реакцій, як можливих маркерів змін фето-плацентарного комплексу”, № держреєстрації - 01.00U000144; „Клініко-морфологічні особливості та порівняльна цитологічна, гістологічна і імуноцитохімічна характеристика стану ендометрію у жінок фертильного віку в різні фази менструального циклу”, № держреєстрації - 01.04. U009106.

Мета дослідження - визначення цитологічних та імуноцитохімічних особливостей епітелію піхвової поверхні і цервікального каналу шийки матки жінок фертильного віку при вірусному та бактеріальному інфікуванні для виявлення ранніх структурних змін.

Задачі дослідження:

На підставі загальноцитологічних та імуноцитохімічних методів дослідження виявити особливості клітин епітелію піхвової поверхні та цервікального каналу шийки матки з визначенням індексів апоптозу, проліферації і експресії рецепторів до естрогенів і прогестерону, проведення CIN- тесту на ген р16 (INK4a/CDKN2a) в мазках жінок фертильного віку при вірусному інфікуванні (герпетична та папіломавірусна інфекції).

На підставі загальноцитологічних та імуноцитохімічних методів дослідження виявити особливості клітин епітелію піхвової поверхні та цервікального каналу шийки матки з визначенням індексів апоптозу, проліферації і експресії рецепторів до естрогенів і прогестерону, проведення CIN-тесту на ген р16 (INK4a/CDKN2a) у мазках жінок фертильного віку при бактеріальному інфікуванні.

Дати порівняльну оцінку цитологічних та імуноцитохімічних проявів процесів апоптозу, проліферації та експресії рецепторів до естрогенів і прогестерону, показників CIN- тесту на ген р16 (INK4a/CDKN2a) в епітелії шийки матки жінок при бактеріальному та вірусному інфікуванні.

На підставі загальноцитологічних методів дослідження провести морфометричний аналіз клітинного складу мазків з шийки матки з урахуванням клітин запальної інфільтрації (нейтрофілів, лімфоцитів) та макрофагальної реакції.

Визначити маркери та критерії діагностики ушкоджень епітелію шийки матки жінок фертильного віку при бактеріальному та вірусному інфікуванні.

Об'єкт дослідження - цитологічні мазки з піхвової поверхні та цервікального каналу шийки матки жінок фертильного віку в фолікуліновій фазі менструального циклу.

Предмет дослідження - цитологічні та імуноцитохімічні особливості епітелію піхвової поверхні і цервікального каналу шийки матки жінок фертильного віку при вірусному та бактеріальному інфікуванні.

Методи дослідження: загальноцитологічний, морфометричний, імуноцитохімічні методи та статистичний аналіз, за допомогою якого оцінювали достовірність одержаних результатів.

Наукова новизна одержаних результатів.

Вперше на підставі імуноцитохімічних досліджень встановлено підвищення індексів апоптозу та проліферації в клітинах плоского епітелію шийки матки жінок з вірусним інфікуванням порівняно з групою контролю. Співставлення показників цих індексів виявило переважання проліферативних процесів при вірусному інфікуванні, що свідчить про порушення регенераторних механізмів і є передумовою розвитку гіперпластичних процесів.

Встановлено, що підвищення рівня експресії рецепторів до естрогенів в ядрах клітин плоского епітелію цервікального каналу на фоні позитивного CIN- тесту на ген р16 (INK4a/CDKN2a) при вірусному інфікуванні жінок є прогностичним маркером розвитку неопластичних процесів в шийці матки.

Вперше на підставі імуноцитохімічних методів дослідження представлені в порівняльному аспекті маркери апоптоза (Fas(APO-1\CD95), вcl-2), проліферативних процесів (Кі-67, PCNA), експресія рецепторів до естрогенів та прогестерону в епітелії шийки матки жінок при вірусному та бактеріальному інфікуванні.

Практичне значення одержаних результатів. Розроблені цитологічні та імуноцитохімічні критерії ушкодження клітин епітелію шийки матки та визначені індекси апоптозу і проліферації доцільні для використання у практиці патоморфологічних і спеціалізованих імуноцитохімічних лабораторій для оптимізації ранньої диференціальної діагностики та розробки обґрунтованої індивідуальної тактики лікування жінок при вірусному та бактеріальному інфікуванні. Теоретичні положення та практичні рекомендації можуть бути використані у навчальному процесі післядипломної підготовки цитологів та патоморфологів.

Особистий внесок здобувача. Розробку завдань, відбір груп дослідження, загальноцитологічні, імуноцитохімічні, морфометричні дослідження, підрахунок та статистичну обробку отриманих результатів, співставлення їх між групами, аналіз та фотодокументування усіх цитологічних препаратів, підготовку наукових даних до публікацій проведено автором самостійно. Узагальнення отриманих результатів, обгрунтування висновків та практичних рекомендацій проведено спільно з науковим керівником.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації доповідалися 19.09.2006 на засіданні лабораторії патоморфології ІПАГ АМН України. Дисертаційна робота апробована 05.12.2006 року на засіданні лабораторно-експериментального відділу ІПАГ АМН України.

Публікації. Матеріали дисертації знайшли своє відображення у 3 статтях, надрукованих у фахових наукових виданнях, рекомендованих ВАК України.

Структура та обсяг дисертації. Результати дисертації викладено на 148 сторінках (обсяг тексту основної частини 122 сторінки). Робота складається із вступу, огляду літератури, розділу “Матеріали та методи дослідження”, розділу власних досліджень, аналізу одержаних результатів, висновків, списку використаних джерел. Роботу проілюстровано 71 рисунком та 22 таблицями. Список літератури містить 192 джерела вітчизняних та зарубіжних авторів.

Основний зміст роботи

Матеріали та методи дослідження. Нами вивчалися цитологічні мазки з піхвової поверхні та цервікального каналу шийки матки 110 жінок фертильного віку, які знаходились на обстеженні у відділенні проблем здоров'я жінок фертильного віку Інституту педіатрії, акушерства та гінекології АМН України, у фолікуліновій фазі менструального циклу. Матеріал забраний при первинному звертанні пацієнток, тобто до проведення будь-якої терапії.

Досліджений матеріал було розподілено на наступні групи:

контрольну групу спостережень становили цитологічні мазки від жінок без проявів запальних процесів репродуктивних органів (1 група, вірус-негативна) - 20 досліджень;

до 2 групи увійшли цитологічні мазки від жінок з ВПЛ-інфікуванням (тип 16, 18) - 30 досліджень;

до 3 групи увійшли мазки від жінок з інфікуванням ВПЛ (тип 16, 18), асоційованим з ВПГ 2 - го типу - 30 досліджень;

до 4 групи увійшли цитологічні мазки від жінок зі змішаним бактеріальним інфікуванням (гарднерела, факультативно анаеробні коки), асоційованим з трихомонадною інфекцією -30 досліджень;

Для вирішення поставлених завдань у дослідженні були використані наступні методи:

1) загальноцитологічний - забарвлення за Романовським-Гімзе та Папаніколау;

2) морфометричний:

а) підрахунок клітин з дистрофічними змінами у перерахунку на 500 клітин; б) підрахунок клітин, які характеризують запальну інфільтрацію (нейтрофіли, лімфоцити та макрофаги) у перерахунку на 500 клітин; в) підрахунок клітин, які характеризують морфологічні зміни в епітелії під впливом бактеріальних та вірусних агентів (дискаріоз, паракератоз, койлоцитоз, дво- та багатоядерність, дезагрегація хроматину та інш.) у перерахунку на 500 клітин; г) індекс апоптоза (ІА) визначали за результатами імуноцитохімічного дослідження (кількість позитивно забарвлених клітин поділену на 1000 клітин і помножену на 100%); д) індекс проліферації (ІП) визначали за результатами імуноцитохімічного дослідження (кількість позитивно забарвлених клітин поділену на 1000 клітин і помножену на 100%). імуноцитохімічний піхвовий шийка жінка

3) імуноцитохімічні методи: непрямі стрептавідин - пероксидазні методи виявлення експресії антигену рецепторів Fas(Apo-1/CD95), антиапоптотичного протеїну всl-2, проліферативного антигену Кі-67, ядерного антигену проліферативної активності клітин (PCNA), рецепторів до естрогенів та прогестерону. З метою виявлення неопластичних змін в клітинах епітелію шийки матки використовували CIN-тест для визначення експресії антигену інгібітора кіназ CdK4,6-білка р16NK4a.

Імуноцитохімічні дослідження виконували на цитологічних мазках після заморожування (-20єС), які потім фіксували в ЗФА (забуферений формалін-ацетон), блокували ендогенну пероксидазну активність пероксидазним блоком (DAKO), неспецифічне зв'язування білків - двома краплями 1 - процентного бичачого сивороткового антигену (BSA). Після промивання у фосфатному буфері рН 7,4 (PBS) проводили імуноферментну реакцію. На першому етапі наносили немічені первинні антитіла до відповідного антигену (фірма DAKO, Данія) на одну годину. На другому етапі наносили вторинні антитіла на 30 хв. Потім промивали в PBS - буфері, наносили дві краплі комплексу стрептавідин-пероксидази та інкубували на протязі 30 хв., промивали і наносили АЕС - хромоген-розчин - інкубація від 5 до 20 хв., до появи червоно-коричневого забарвлення, з наступним дофарбовуванням гематоксиліном Майєра.

Інтерпретацію результатів імуноцитохімічного забарвлення проводили залежно від типу реакції. Розповсюдженість та інтенсивність імуноцитохімічної реакції оцінювали напівкількісним методом в балах, від 0 до 3:

1) розповсюдженість (у 8-ми полях зору):

а) 0 - немає забарвлення; б) 1 - менше 10% позитивно забарвлених клітин; в) 2 - більше 10% і менше 50% позитивно забарвлених клітин; г) 3 - гомогенне забарвлення більше 50% клітин.

2) інтенсивність реакції:

а) 0 балів - немає видимого забарвлення; б) 1 бал - слабке забарвлення;

в) 2 бали - помірне забарвлення; г) 3 бали - виражене забарвлення;

Бактеріоскопію здійснювали по мазкам виділень, пофарбованим по Граму, а також за методикою Романовського-Гімзе із трьох досліджуваних ділянок (сечовивідний канал, канал шийки матки та піхва). Визначали наявність патогенної флори: трихомонад, гарднерел, коків.

Бактеріологічні посіви виділень із статевих шляхів проводились на кров'яному агарі, грунті Етта, цукровому бульйоні для виявлення St. aureus, St. Epidermal, Str. Agalact, Klebsiella, E. Colli, Enterococcus та грибів роду Candida.

Для тестування в досліджуваному матеріалі (цервікальному слизу) міко- і уреаплазми, виявлення ДНК онкогенних типів ВПЛ (16, 18), ДНК ВПГ 2-го типу та Trichomonas Vaginalis використовували метод полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР).

Оцінка диспластичних процесів в шийці матки проводилась згідно з класифікацією “Bethesda system” (2001). Визначався легкий, помірний та виразний ступені цервікальної інтраепітеліальної неоплазії (CIN 1; 2; 3).

Отримані данні були статистично оброблені за допомогою програми SPSS for Windows (версія 13.0) та Microsoft Office Excel2003 на персональному комп'ютері Рentium 4 ІВМ. Морфологічні, морфометричні та бактеріскопічні дослідження цитологічних препаратів проведено на базі лабораторій патоморфології і бактеріології Інституту ПАГ АМН України. Дослідження препаратів в прохідному світлі проводили на дослідницькому мікроскопі “Olуmpus ВН-2” (Японія).

Отже, комплекс загальноцитологічних, імуноцитохімічних та морфометричних методів дослідження було здійснено так, щоб отримати дані по невивченим або вивченим недостатньо питанням цитологічних та імуноцитохімічних особливостей епітелію шийки матки жінок фертильного віку при вірусному та бактеріальному інфікуванні.

Результати дослідження та їх обговорення. Для проведення порівняльної цитологічної, морфометричної та імуноцитохімічної характеристики стану епітелію піхвової поверхні та цервікального каналу шийки матки ми відібрали цитологічні мазки від жінок, які проходили профілактичний огляд, без проявів запальних процесів репродуктивних органів (1 група - контрольна, вірус-негативна).

В результаті проведеного комплексного цитологічного, морфометричного та імуноцитохімічного дослідження мазків з піхвової поверхні та цервікального каналу шийки матки жінок 1 групи у фолікуліновій фазі менструального циклу встановлено, що клітинний склад мазків повністю відповідав фазі менструального циклу, дистрофічні зміни клітин епітелію піхвової поверхні шийки матки становили в середньому (1,80+0,05) %, в цервікальному каналі - (0,91+0,03) %. Клітини запальної інфільтрації були представлені, в основному, поодинокими нейтрофілами, які в середньому в мазках з піхвової поверхні шийки матки становили (6,000,18) %, в мазках з цервікального каналу - (3,600,10) %, лімфоцитами - (0,350,01) % та (1,400,04) % відповідно, що свідчить про відсутність запальних процесів репродуктивних органів. У досліджених мазках макрофаги виявлено в незначній кількості, в середньому вони становили (2,950,09) % та (1,950,06) % відповідно. Мікрофлора характеризувалася наявністю в мазках лактобактерій, які забезпечують підтримку нормального біоценозу піхви.

Аналіз даних імуноцитохімічних досліджень виявив помірний рівень експресії (1-2 бали) антигену рецепторів Fas (Apo-1/CD95) на фоні слабко вираженої експресії антигену антиапоптотичного протеїну bcl-2 (0-1 бал) в цитоплазмі клітин епітелію. Індекс апоптозу становив в середньому (1,60+0,05) % в мазках з піхвової поверхні шийки матки та (2,20+0,07)% в плоскому епітелії цервікального каналу. Рівень експресії проліферативного антигену Кі-67 та ядерного антигену проліферативної активності клітин (PCNA) в ядрах епітеліальних клітин був слабким (0-1 бал), індекс проліферації в епітелії піхвової поверхні та цервікального каналу шийки матки в середньому становив (2,10+0,06 та 2,60+0,09) % відповідно, розповсюдженість становила 1-2 бали. Експресія антигену до рецепторів естрогенів в ядрах епітеліальних клітин була слабо виразною (до 1 балу), до рецептору прогестерону та антигену інгібітора кіназ CdK4,6-білка р16NK4a - негативна.

Таким чином, в результаті проведеного комплексного цитологічного, морфометричного та імуноцитохімічного дослідження мазків з піхвової поверхні та цервікального каналу шийки матки жінок 1 групи можна зробити висновок, що клітинний склад мазків повністю відповідає фазі менструального циклу, морфологічні зміни в клітинах епітелію не спостерігаються, гострі та хронічні запальні процеси - відсутні. Проліферативна та апоптотична активність клітин плоского і залозистого епітелію невисока, що вказує на збалансованність цих процесів і узгоджується з даними літератури [J.H. Zhou, H.Z. Chen et al., 2006]. Помірний рівень експресії рецепторів до естрогенів (ЕР) і відсутність експресії рецепторів до прогестерону (ПР) відповідає фазі менструального циклу. CIN-тест показав негативний результат, що свідчить про відсутність неопластичних змін в клітинах епітелію шийки матки жінок контрольної групи.

Проведене комплексне цитологічне, морфометричне та імуноцитохімічне дослідження мазків з піхвової поверхні та цервікального каналу шийки матки жінок з інфікуванням вірусом папіломи людини 16, 18 типів (2 група) виявило наявність виразних дистрофічних змін клітин епітелію піхвової поверхні і цервікального каналу шийки матки, які проявлялись у вигляді каріолізису, каріопікнозу, оголеності ядер, появою шарів клітин залозистого і плоского епітелію з ознаками розпаду, дифузною вакуольною дистрофією цитоплазми, збільшенням розмірів клітин та ядер.

Характерним для вірусного інфікування є формування цитоплазматичних та ядерних включень і вакуолей. Нашими дослідженнями встановлено значне збільшення кількості епітеліальних клітин з вакуолізацією ядра та цитоплазми. Дистрофічні зміни цитоплазми епітеліальних клітин піхвової поверхні шийки матки становили в середньому (76,35+2,33)%, вакуолізація ядер - (26,70+0,85) %, в епітеліальних клітинах цервікального каналу відповідно - (73,90+2,22) %, (31,2+0,96) %.

При цьому, як в мазках з цервікального каналу, так і в мазках з піхвової поверхні шийки матки виявлялись характерні для вірусного інфікування цитологічні ознаки, обумовлені цитопатогенною дією ДНК- вмісних вірусів папіломи людини: койлоцити, двоядерні клітини, кератиноцити, відмічалась амфофілія цитоплазми. Ці морфологічні зміни були достовірно (р<0,05) більш виражені в мазках з цервікального каналу порівняно з аналогічними показниками в мазках з піхвової поверхні шийки матки.

Запальна інфільтрація в мазках з піхвової поверхні та цервікального каналу шийки матки була досить виразною, носила вогнищевий характер і була представлена в основному нейтрофілами, відповідно - (21,05+0,86) %; 15,00+0,50) %, лімфоцитами - (1,90+0,07) %; (2,90+0,09) % та макрофагами - (3,10+0,09) %; (2,95+0,08) %, що свідчить про наявність запального процесу в шийці матки.

Для імуноцитохімічного дослідження були відібрані мазки жінок з діагностованими дисплазіями шийки матки (20 випадків).

Імуноцитохімічне дослідження виявило інтенсифікацію процесів запрограмованої загибелі клітин, морфологічним проявом якої є апоптоз, в клітинах плоского епітелію шийки матки. Встановлено достовірне збільшення порівняно з групою контролю рівня експресії антигену рецепторів Fas(APO-1/CD95) відповідно від слабкого (1 бал у контрольній групі) до помірного і високого (2-3 бали) в 2 групі дослідження на фоні достовірного зниження ступеня експресії антиапоптотичного протеїну вcl-2. В мазках з цервікального каналу жінок 2-ої групи досліджень ці показники були достовірно (р<0,05) вищими порівняно з аналогічними показниками в мазках з піхвової поверхні шийки матки. Середні показники індексу апоптозу в епітелії піхвової поверхні і цервікального каналу шийки матки при цьому були достовірно вищими порівняно з групою контролю і становили в середньому (3,60+0,10) % та (4,40+0,13) % відповідно.

В цій групі дослідження спостерігалось також посилення проліферативної активності клітин епітелію, що підтверджується збільшенням рівня розповсюдженості реакції (більше 50% позитивно забарвлених клітин - 2-3 бали) та ступеню експресії на проліферативний (2 бали) та проліферативно-клітинно-нуклеарний (2 бали) антигени. Індекс проліферації в клітинах епітелію мазків з піхвової поверхні та цервікального каналу шийки матки в середньому становив відповідно - (8,20+0,24) % та (9,30+0,28) % і був достовірно вищим (р<0,05) порівняно з групою контролю. Слід зазначити, що співставлення показників ІА та ІП виявило збільшення у 2,3 рази індексу проліферації порівняно з індексом апоптоза.

Імуноцитохімічне дослідження експресії рецепторів до естрогенів (ЕР) та прогестерону (ПР) в мазках з піхвової поверхні та цервікального каналу шийки матки жінок з ВПЛ-інфікуванням, показало збільшення ступеня експресії ЕР в ядрах клітин плоского епітелію, порівняно з контрольною групою, від помірного до вираженого (2-3 бали), що свідчить про високий рівень естрогенів в цих клітинах. Експресія (ПР) в ядрах епітеліальних клітин була слабкою (1 бал).

Імуноцитохімічне дослідження CIN-тесту для визначення рівня експресії білка p16 (INK4a /CDK2a) виявило помірну експресію (до 2 балів) в епітелії та ядрах клітин, що свідчить про наявність неопластичних змін в клітинах плоского епітелію шийки матки і підтверджується даними цитологічних досліджень, при яких були виявлені диспластичні зміни клітин плоского епітелію різного ступеня тяжкості: легкі диспластичні зміни (CIN-1) становили 65 %, помірні (CIN-2) - 35 %. Слід відмітити, що ІП та рівень експресії рецепторів до естрогенів мав вищі показники у жінок з помірною дисплазією шийки матки (CIN-2) порівняно з легкою (CIN-1) та більш виражені дистрофічні зміни в ядрах та цитоплазмі клітин. Достовірно (р<0,05) більш виразні морфологічні зміни клітин епітелію, які є характерними для вірусного інфікування (койлоцитарна атипія, паракератоз, наявність двоядерних клітин, амфофілія цитоплазми) відмічались в мазках з цервікального каналу жінок з помірною дисплазією шийки матки (CIN-II) порівняно з легкою дисплазією (CIN-I).

Таким чином, в 2 групі дослідження (папіломавірусне інфікування) виявлено достовірно високі показники (р<0,05) дистрофічних зміни клітин плоского та залозитого епітелію. Причому, більш виражена дистрофія клітин відмічалась в епітелії цервікального каналу, показники якої збільшувались залежно від ступеня дисплазії шийки матки і були більш виражені у жінок з помірною дисплазією, що свідчить про здатність вірусів папіломи людини (тип 16,18) викликати порушення метаболічних процесів та структурні зміни в індукованому епітелії, які призводять до неопластичних змін клітин. Наявність вираженої запальної інфільтрації, представленої нейтрофілами, лімфоцитами та макрофагами, свідчить про хронічний перебіг запального процесу в шийці матки.

Результати імуноцитохімічного дослідження показали виражену експресію рецепторів Fas(APO-1/CD95) на фоні зниження експресії антиапоптотичного протеїні вcl-2 в мембранних структурах клітин порівняно з групою контролю, що вказує на підвищення апоптотичної активності клітин епітелію, ушкодженого ВПЛ. Отримані нами дані, свідчать про високий рівень проліферативної активності на фоні високого рівня рецепторів до естрогенів в клітинах епітелію шийки матки. Проведене комплексне цитологічне, морфометричне та імуноцитохімічне дослідження мазків з піхвової поверхні та цервікального каналу шийки матки жінок з інфікуванням вірусом папіломи людини (тип 16,18,) асоційованим з вірусом простого герпесу 2-го типу (3 група) виявило наявність різко виражених дистрофічних змін клітин плоского та залозистого епітелію.

Характерна для вірусного інфікування дистрофія цитоплазми клітин в мазках з піхвової поверхні та цервікального каналу шийки матки становила в середньому відповідно: (63,50+1,90) % та (50,45+1,51) %, вакуолізація ядер - (36,90+1,10) % та (44,00+1,77) %, тобто дистрофія ядер була більш вираженою, ніж у мазках жінок 2 групи дослідження.

При цьому в клітинах плоского епітелію виявлені характерні для вірусного інфікування цитологічні ознаки, обумовлені цитопатогенною дією ДНК-вмісних вірусів папіломи людини та простого грепесу 2-го типу. Це койлоцити, двоядерні клітини та багатоядерні симпласти з характерним нагромадженням ядер, клітини з проявами паракератозу, а також виражена дезагрегація хроматину в ядрах.

Запальна інфільтрація в мазках з піхвової поверхні та цервікального каналу шийки матки жінок цієї групи була досить виразною, носила вогнищевий характер і була представлена в основному нейтрофілами, які в середньому становили відповідно (16,00+0,50) % та (13,00+0,40) %, лімфоцитами - (2,30+0,07) % та (2,97+0,09) %. Макрофаги в середньому становили (2,70+0,08) % та (2,60+0,79) %, що свідчить про наявність запального процесу в шийці матки.

Для імуноцитохімічного дослідження були відібрані мазки жінок з діагностованими дисплазіями шийки матки (20 випадків).

На підвищення інтенсивності процесів запрограмованої загибелі клітин в епітелії шийки матки вказує збільшення порівняно з групою контролю рівня експресії антигену рецепторів Fas(APO-1/CD95) до помірного (2 бали). В середньому експресії антигену рецепторів Fas(APO-1/CD95) складала в мазках з піхвової поверхні шийки матки (1,700,09) балів, в мазках з цервікального каналу - (1,75+0,10) балів. При цьому (ІА) в епітелії піхвової поверхні шийки матки в середньому становив - (3,20+0,10) %, в мазках з цервікального каналу - (3,80+0,11) %. Експресія антигену антиапоптотичного протеїну вcl-2 в цитоплазмі клітин епітелію піхвової поверхні та цервікального каналу шийки матки була від слабкої до помірної - 1-2 бали. В середньому ступінь експресії вcl-2 становив відповідно - (1,00+0,09) та (1,20+0,10) бали, що свідчить про посилення активності антиапоптотичного фактору порівняно з групою контролю.

В мазках з піхвової поверхні та цервікального каналу шийки матки жінок з ВПЛ та ВПГ-2 інфікуванням так само, як і в 2 групі дослідження, відмічався досить високий рівень проліферативної активності клітин плоского епітелію, що підтверджується збільшенням рівня розповсюдженості реакції (більше 50 % позитивно забарвлених клітин) до 2-3 балів на проліферативний та проліферативно-клітинно-нуклеарний антигени. Ступінь експресії проліферативного антигену Кі-67 становив 2 бали (в середньому в мазках з піхвової поверхні шийки матки - (1,20+0,09), з цервікального каналу - (2,20+0,10) балів, а проліферативно-клітинно-нуклеарного антигену (PCNA) - до 3 балів (в середньому відповідно (2,05+0,08) та (2,30+0,12) балів, що свідчить про високий рівень проліферативної активності клітин епітелію шийки матки жінок 3 групи порівняно з контролем. Індекс проліферації (ІП) в середньому становив відповідно (8,60+0,26) % та (10,60+0,32)%. Співставлення показників ІА та ІП виявило збільшення у 2,8 разів індексу проліферації порівняно з індексом апоптозу в епітелії цервікального каналу.

Імуноцитохімічне дослідження рівня експресії рецепторів до естрогенів (ЕР) та прогестерону (ПР) в 3 групі показало, що ступінь експресії ЕР в ядрах клітин епітелію піхвової поверхні та цервікального каналу шийки матки був від помірного до виразного (2-3 бали), в середньому він становив відповідно: (1,70+0,15) та (2,05+0,18) балів. Експресія ПР в ядрах епітеліальних клітин мазків з шийки матки жінок 3 групи дослідження була слабкою (1 бал), в середньому становила відповідно (0,40+0,01) та (0,65+0,02) балів.

Представлені дані вказують на високий рівень естрогенів в клітинах плоского епітелію шийки матки жінок з ВПЛ- та ВПГ-2 інфікуванням порівняно з групою контролю.

CIN-тест (визначення рівня експресії p16INK4a /CDK2a), виявив виразну експресію (до 3 балів), що свідчить про наявність значних неопластичних змін в епітелії шийки матки. При цьому легкі дисплазії епітелію шийки матки (CIN-I) становили 30 % (6 випадків), помірні дисплазії (CIN-II) - 50 % (10 випадків), тяжкі дисплазії (CIN III) - 20 % (4 випадки).

Морфологічні зміни клітин, які є специфічними для вірусного інфікування були більш виражені в мазках при легкій та помірній дисплазіях шийки матки (CIN-І; CIN-ІІ) і мали менші показники при тяжкій дисплазії шийки матки (CIN-ІІІ) на фоні збільшення в них атипових клітин, що може бути наслідком вірусної інтеграції при високих ступенях ушкодження клітин.

В результаті проведеного комплексного цитологічного та імуноцитохімічного дослідження мазків з піхвової поверхні та цервікального каналу шийки матки жінок з інфікуванням ВПЛ (тип 16,18) та асоціацією ВПЛ (тип 16,18) і ВПГ 2-го типу були розроблені імуноцитохімічні та цитоморфологічні критерії ушкодження епітелію шийки матки.

Імуноцитохімічні та цитоморфологічні критерії ушкодження епітелію шийки матки при інфікуванні ВПЛ (тип 16, 18) та при асоціації ВПЛ (тип 16, 18) і ВПГ 2-го типу:

достовірне підвищення рівня експресії антигену індуктора апоптозу Fas(Apo-1/CD95) та апоптозного індексу на фоні зниження експресії антиапоптотичного протеїну bcl-2 в мембранних структурах клітин епітелію при ВПЛ-інфікуванні і підвищення його при асоціації ВПЛ- та ВПГ інфікування та збільшення дистрофічних змін цитоплазми та ядер клітин плоского епітелію;

позитивний CIN-тест експресії антигену інгібітора кіназ CdK4,6 - білка р16NK4a на фоні наявності койлоцитів, клітин плоского епітелію з проявами гіпер- та паракератозу, багатоядерних утворень, атипових ядер, макронуклеозу;

достовірне підвищення проліферативної активності клітин та індексу проліферації, рівня експресії рецепторів до естрогенів та прогестерону на фоні диспластичних зміни клітин плоского епітелію різного ступеня тяжкості.

Комплексне цитологічне, морфометричне та імуноцитохімічне дослідження мазків з піхвової поверхні та цервікального каналу шийки матки жінок зі змішаним бактеріальним інфікуванням (гарднерела, факультативно анаеробна кокова флора), асоційованим з трихомонадною інфекцією (4 група) виявило наявність тяжких дистрофічних та некробіотичних змін клітин епітелію у вигляді цитолізу, каріолізису, каріопікнозу, розрихлювання хроматину, появою оголених ядер. При цьому дистрофія цитоплазми епітеліальних клітин шийки матки становила в середньому (69,55+2,08) %, дистрофія ядер - (18,20+0,54) %, в цервікальному каналі відповідно - (69,00+2,08) %; (22,4+0,92) %. В мазках з цервікального каналу зустрічались поодинокі двоядерні та багатоядерні клітини плоского епітелію з вираженою вакуолізацією цитоплазми, а також клітини метаплазованого епітелію з великими гіперхромними ядрами та інтенсивно зафарбованою цитоплазмою, які розташовувались невеликими групами.

Запальна інфільтрація носила дифузний характер і була представлена в основному нейтрофілами, відповідно - (31,05+0,95) %; (24,90+0,74)%, лімфоцитами - (10,11+0,30) %; (3,90+0,11) % та макрофагами - (3,27+0,10) %; (3,00+0,08) %, що свідчить про наявність гострого запального процесу. Мікрофлора була представлена скупченнями кокової, паличкової флори при наявності великої кількості “ключових” клітин, всіяних короткими паличками. А також наявність трихомонад овоїдної, грушовидної або неправильної форми і різних за розмірами з веретеноподібними ядрами і дрібнозернистою структурою цитоплазми.

Для імуноцитохімічного дослідження були відібрані мазки жінок з діагностованими легкими дисплазіями та фоновими процесами в шийці матки (20 випадків).

Рівень експресії антигену рецепторів Fas(APO-1/CD95) в цитоплазмі епітелію піхвової поверхні та цервікального каналу шийки матки був помірним (1-2 бали) і мав вищі показники порівняно з групою контролю. В середньому вони складали відповідно - (1,600,05); (1,70+0,05) балів. Індекс апоптозу (ІА) в мазках з піхвової поверхні та цервікального каналу шийки матки в середньому становив відповідно - (2,20+0,07) %; (2,80+0,08) %.

Експресія антигену антиапоптотичного протеїну bcl-2 в мембранних структурах цитоплазми епітелію піхвової поверхні та цервікального каналу шийки матки була слабкою (до 1 балу). Виявляючий її хромаген розміщувався в цитоплазмі у вигляді зерен. В середньому ступінь експресії bcl-2 становив відповідно (0,65+0,09) балів та (0,70+0,09) балів, що свідчить про пригнічення антиапоптотичного фактору порівняно з групою контролю

В мазках з піхвової поверхні та цервікального каналу шийки матки жінок зі змішаним бактеріальним інфікуванням в асоціації з трихомонадною інфекцією відмічалося посилення проліферативної активності клітин плоского епітелію порівняно з групою контролю, що підтверджується збільшенням рівня розповсюдженості реакції (до 2 балів) на проліферативний та проліферативно-клітинно-нуклеарний антигени. Ступінь експресії проліферативного антигену Кі-67 в епітелії піхвової поверхні шийки матки становив 1-2 бали (в середньому 1,50+0,10 балів), в цервікальному каналі відмічено помірний ступінь експресії (в середньому 1,55+0,11 балів). Експресія проліферативно-клітинно-нуклеарного антигену (PCNA), як в епітелії піхвової поверхні шийки матки, так і в епітелії цервікального каналу, була помірною - 2 бали (в середньому відповідно становила: 1,60+0,11; 1,70+0,11 балів). Індекс проліферації в цій групі досліджень в середньому становив відповідно - (6,00 +0,18)% та (7,30+0,21) %.

Експресія (ЕР) в ядрах клітин плоского епітелію мазків з піхвової поверхні шийки матки та цервікального каналу була слабкою (1 бал), в середньому вона становила відповідно (0,90+0,03) бали та (1,00+0,04) бали. Експресія ПР в ядрах епітеліальних клітин піхвової поверхні шийки матки і цервікального каналу була слабко вираженою (0-1 бал), в середньому становила відповідно - (0,35+0,01); (0,40+0,01) балів.

Для виявлення неопластичних змін епітелію в мазках з шийки матки жінок зі змішаним бактеріальним інфікуванням, асоційованим з трихомонадною інфекцією було проведено імуноцитохімічне дослідження CIN-тесту для визначення рівня експресії білка p16 (INK4a /CDK2a), який показав слабку експресію (0-1 бал), розповсюдженість імуноцитохімічної реакції - менше 10% позитивно зафарбованих клітин, що свідчить про наявність незначних неопластичних змін клітин плоского епітелію шийки матки.

Слід відмітити, що ерозії шийки матки виявлені у 13-ти жінок (65 %), ендоцервіцити - у 4-х жінок (20 %), легка дисплазія шийки матки (CIN-I) - у 3-х жінок (15 %).

В результаті проведеного комплексного цитологічного та імуноцитохімічного дослідження мазків з піхвової поверхні та цервікального каналу шийки матки жінок зі змішаним бактеріальним інфікуванні, асоційованим з трихомонадною інфекцією були розроблені цитоморфологічні критерії ушкодження епітелію шийки матки.

Імуноцитохімічні та цитоморфологічні критерії ушкодження епітелію шийки матки жінок при змішаному бактеріальному інфікуванні, асоційованого з трихомонадною інфекцією:

достовірне збільшення дистрофічних змін цитоплазми клітин плоского епітелію;

достовірне підвищення проліферативної активності клітин на фоні наявності клітин плоского епітелію з проявами паракератозу та плоскоклітинної метаплазії;

низькі показники CIN-тесту експресії антигену інгібитору кіназ CdK4,6 - білка р16NK4a при наявності фонових процесів в шийці матки (ерозії шийки матки, ендоцервіцити) та диспластичних зміни в клітинах плоского епітелію легкого ступеню.

Висновки

1. У дисертації наведено теоретичне обґрунтування та нове наукове рішення актуальної задачі по визначенню цитологічних та імуноцитохімічних особливостей клітин епітелію піхвової поверхні і цервікального каналу шийки матки жінок фертильного віку при вірусному та бактеріальному інфікуванні для виявлення ранніх структурних змін.

2. Встановлено, що достовірними та інформативними проявами вірусного інфікування є підвищення маркерів (Fas(Apo-1/CD95), індексів апоптоза та маркерів (Кі-67, PCNA), індексів проліферації в клітинах плоского епітелію шийки матки порівняно з групою контролю. Співставлення показників індексів апоптозу та проліферації виявило переважання проліферативних процесів при вірусному інфікуванні, що свідчить про порушення регенераторних механізмів і є передумовою розвитку гіперпластичних процесів.

3. Виявлено достовірне збільшення рівня експресії рецепторів до естрогенів в ядрах клітин плоского епітелію цервікального каналу при вірусному інфікуванні порівняно з групою контролю, що є прогностичним маркером розвитку неопластичних процесів в шийці матки.

4. Імуноцитихімічно виявлено, що експресія білка р16 (INK4a /CDK2a) в клітинах плоского епітелію шийки матки жінок з вірусним інфікуванням була вищою в 3 групі (1,80+0,05 балів) порівняно з 2 групою (1,50+0,04 балів) дослідження, що свідчить про зростаючий ризик пухлинної трансформації клітин при асоціації вірусу папіломи людини (16, 18 типів) з вірусом простого герпесу 2-го типу.

5. При бактеріальному інфікуванні виявлено достовірне підвищення експресії проліферативного (Кі-67), проліферативно-клітинно-нуклеарного (PCNA) антигенів в ядрах клітин плоского епітелію цервікального каналу на фоні плоскоклітинної метаплазії та помірної макрофагальної реакції, що є прогностичними чинниками прогресування фонових процесів в шийці матки.

6. За результатами комплексного цитологічного, імуноцитохімічного та морфометричного аналізу встановлено, що мазки із цервікального каналу є більш інформативними для ранньої диференціальної діагностики, ніж мазки з піхвової поверхні шийки матки.

7. Розроблені імуноцитохімічні, цитоморфологічні критерії ушкодження клітин епітелію шийки матки та визначені індекси апоптозу і проліферації можуть бути використані у практиці патоморфологічних лабораторій для оптимізації ранньої диференціальної діагностики і розробки обґрунтованої індивідуальної тактики лікування жінок при вірусному та бактеріальному інфікуванні.

Список опублікованих праць за темою дисертації

1. Iliin I., Zadorozhnaya T., Pustovalova O. Endometrial morphology and scaning electron microscopes after steroid replacyment therapy in ovum recipients // Placenta. .-2000. - Vol.21, №7.- P.36-38. Дисертантом самостійно проведено підготовку матеріалу для скануючої мікроскопії та імуногістохімічне, морфометричне дослідження і частковий аналіз отриманих результатів.

2. Подольский В.В., Задорожна Т.Д., Пустовалова О.І., Дронова В.Л. Цитологічні та імуноцитохімічні особливості мазків вульви, піхви та цервікального каналу у жінок фертильного віку при хронічних запальних процесах статевих органів //Здоровье женщины.-2004. - №4.- С.20-24. Дисертантом самостійно проведені цитологічні та імуноцитохімічні дослідження, визначена прогностична значущість досліджуваних показників, підготовка матеріалу до друку.

3. Вовк І.Б., Задорожна Т.Д., Пустовалова О.І. Цитологічні, імуноцитохімічні та морфометрічні особливості піхвового епітелію при вульвовагінітах у дівчат препубертатного віку //Буковинський медичний вісник. -2005. - №1.- C.28-32. Дисертантом самостійно проведено цитологічні, імуноцитохімічні та морфометричні дослідження, статистичну обробку даних та частковий аналіз результатів, підготовка до друку.

Анотація

Пустовалова О.І. “Цитологічні та імуноцитохімічні особливості епітелію шийки матки і цервікального каналу жінок фертильного віку при вірусному та бактеріальному інфікуванні”.- Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 14.03.09 - гістологія, цитологія та ембріологія.- Національний медичний університет імені О.О.Богомольця.- Київ, 2007.

У дисертації наведено теоретичне обґрунтування та нове наукове вирішення актуальної задачі по визначенню цитологічних та імуноцитохімічних особливостей епітелію піхвової поверхні і цервікального каналу шийки матки жінок фертильного віку при вірусному та бактеріальному інфікуванні для виявлення ранніх структурних змін.

В результаті проведеного комплексного цитологічного та імуноцитохімічного дослідження мазків з піхвової поверхні та цервікального каналу шийки матки жінок були розроблені імуноцитохімічні та цитоморфологічні критерії ушкодження епітелію та визначені індекси апоптозу і проліферації для кожної з груп досліджень, що може бути використаним у практиці патоморфологічних лабораторій для оптимізації ранньої диференціальної діагностики і розробки обґрунтованої індивідуальної тактики лікування жінок при вірусному та бактеріальному інфікуванні.

Аннотация

Пустовалова О.И. “Цитологические и иммуноцитохимические особенности эпителия шейки матки и цервикального канала женщин фертильного возраста при вирусном и бактериальном инфицировании”.- Рукопись .

Диссертация на соискание научной степени кандидата медицинских наук по специальности 14.03.09- гистология, цитология и эмбриология.- Национальный медицинский университет имени А.А.Богомольца.- Киев, 2007.

В диссертации дано теоритическое обоснование и новое научное решение актуальной задачи по определению цитологических и иммуноцитихимических особенностей эпителия влагалищной части и цервикального канала шейки матки женщин фертильного возраста при вирусном и бактериальном инфицировании для выявления ранних структурных изменений.

В результате исследования установлены иммуноцитохимические, цитоморфологические критерии повреждения эпителия шейки матки и определены индексы апоптоза и пролиферации для каждой из груп исследований, что может быть использовано в деятельности патоморфологических лабораторий для оптимизации ранней дифференциальной диагностики и разработки обоснованой индивидуальной тактики лечения женщтн при вирусном и бактериальном инфицировании.

Summary

Pustovalova O.I. “Cytological and immunocytochemical peculiarities of uteruses cervix epithelium and cervical canal of fertile women in case of viral and bacterial contamination” - Manuscript.

Thesis for candidate degree in medicine, speciality 14.03.09- The dissertation of a candidate for a degree of medical sciences on a speciality 14.03.09 - histology, cytology and embryology. -National O.Bogomolets maedical university.- Kiev, 2007.

The dissertation provides theoretical justification and new scientific solution of important task - identification of the cytologic and immunocytochemical particularities of Uteruses Cervix Epithelium and Cervical Channel of fertile women age in case of virus and bacterial contamination for optimization of differential diagnostics and prognosis.

We have applied the main qualitative and quantitative indicators in the cytologic smears from cervix uteri and cervical channels of 110 fertile women in follicular phase of menstrual cycle.

As a result of investigation it was established that immunocytochemical and cytomorphological criteria of cervix uteri damage at contamination by papilloma virus (type16, 18) and virus of herpes simplex-2 serotype are as follows:

reliable increase of apoptosis inductor antigen expression level Fas (Apo-1/CD95) and apoptosis index against expression reduction of antiapoptotic protein bcl-2 human papilloma virus contamination and its increase during manifestation of human papilloma virus and herpes simplex virus against increase of cytoplasma dystrophic changes and epithelium cell nucleus vacuolation;

positive CIN-test of kinase inhibitor antigen expression CdK4,6 - albumin р16NK4a against evidence of koilocytes, cells of squamous epithelium with symptoms of hyper-and parakeratosis, plurinuclear masses, atypical nuclei, macronucleus;

reliable increase of cell proliferative activity and proliferation index, receptor expression level to estrogens and рrogesteronum against dysplastic changes of squamous epithelium cells of different severity degree.

Immunocytochemical and cytomorphological criteria of cervix uteri damage at the mixed bacterial contamination together with trychomonades contamination are as follows: reliable increase of squamous epithelium cell cytoplasma dystrophic changes; reliable increase of cell proliferative activity against evidence of squamous epithelium cells epithelium with symptoms of parakeratosis and epithelium planocellular metaplasia;

low indexes CIN-test of kinase inhibitor antigen expression CdK4,6 - albumin р16NK4a with evidence of background processes in cervix uteri (erosion of cervix uteri, endocervicitises, medium dysplastic changes of squamous epithelium cells).

Перелік умовних скорочень

ВПГ-2 - вірус простого герпеса другого серотипу

ВПЛ - вірус папіломи людини.

ГГІ - генітальна герпесна інфекція

ДНК - дезоксирибонуклеїнова кислота

ЕР - рецептор до естрогенів

ЗФА - забуферений формалін-ацетон

ІА - індекс апоптозу

ІП - індекс проліферації

ПЛР - полімеразна ланцюгова реакція

ПР - рецептор до прогестерону

РНК - рибонуклеїнова кислота

РШМ - рак шийки матки

Размещено на Allbest.ru