Патогенетичні особливості експериментальної черепно-мозкової травми

Размещено на http://www.allbest.ru/

Міністерство охорони здоров'я України

Одеський державний медичний університет

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук

14.03.04- патологічна фізіологія

Патогенетичні особливості експериментальної черепно-мозкової травми

Виконав Петелкакі Олександр Володимирович

Одеса - 2007

АНОТАЦІЯ

нейротоксин черепний мозковий пентоксифілін

Петелкакі О.В. Патогенетичні особливості експериментальної черепно-мозкової травми. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 14.03.04 - патологічна фізіологія. - Одеський державний медичний університет МОЗ України, Одеса, 2007.

В дослідженнях на моделі черепно-мозкової травми (ЧМТ) середнього ступеня тяжкості вивчено динаміку змін рухової активності, параметрів імунологічної реактивності: Т-ланки клітинного імунітету, рівня імуноглобулінів, фактору некрозу пухлин-альфа, реакції бласттрансформації, морфометричних параметрів стрес-компетентних органів: надниркових залоз, селезінки та тимусу, а також стан антиоксидантної системи в посттравматичному періоді. Доведено підвищення чутливості утворень гіпокампу до епілептогенного впливу агоністів рецепторів збуджуючих амінокислот - каїнової кислоти та NMDA протягом посттравматичного періоду. Встановлено посилення поведінкових та імунологічних порушень за умов зниження функціонального стану дофамінергічної системи мозку шляхом пошкодження її середньомозкової ланки. Встановлено протективні ефекти пентоксифіліну у тварин з ЧМТ та потенціювання терапевтичного впливу препарату за умов застосування L-депренілу.

Ключові слова: черепно-мозкова травма, фактор некроза пухлин-альфа, L-депреніл, пентоксифілін, імуноглобулін G.

1. ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. Черепно-мозкова травма (ЧМТ) складає від 20 до 54% загальної кількості травматологічних хворих [Ромоданов А.П., Лисяный Н.И. 1991; Герасимова М.М., Ягудин Г.Т., 2000; Wolach B. et al., 2001; Головко А.И. и соавт., 2002; Green L.B. et al., 2004; Nortje J., Menon D.K., 2004; Alves O.L. et al., 2005]. Враховуючи ріст травматизму, важкі наслідки травми, які нерідко призводять до інвалідності осіб працездатного віку, значну резистентність проявів до лікувальних заходів, проблема дослідження патогенезу ЧМТ, а також патогенетичне узагальнення методів лікування наслідків є вельми актуальним завданням сучасної патофізіології [Волохова Г.О., 1996; Шандра О.А. та співавт., 1993; 1999; Bauer R.,Fritz H., 2004; Bayir H. еt al., 2005; Heida J.G., Quentin., 2005]

Останнім часом встановлена наявність взаємозв'язку між системами контролю функції нейронів і імунологічною системою - як лімфоцитарною ланкою, так і чинниками гуморальної природи [Абрамов В.В.. 1991; Арушанян Э.Б., Бейер Э.В., 2004]. Визначена важлива роль медіаторів запалення в контролі збудливості нейронів, формуванні нейродегенеративних змін, а також в розвитку компенсаторно-пристосовних реакцій [Vezzani A., 2005; Годлевський Л.С., Нєнова О.М., 2006; Вастьянов Р.С. та співавт., 2006; Шандра О.А. та співавт., 2006]. Так, зокрема, встановлена патогенетична роль прозапальних цитокінів - фактору некрозу пухлини-альфа (ФНП-альфа), інтерелейкіну-1-бета (ІЛ-1-бета) в розвитку епілептогенного збудження [Shandra A.A. et al., 2002; Vezzani A., 2005], активуванні гіпоталамо-гіпофізарно-наднирковозалозної осі [Spangello B.L., Gorospe W.C., 1995 Watkins L.R. et al., 1995 Licinio J., 1997 Kronfol Z., Remick D.G., 2000], розвитку важких нейропатологічних синдромів: депресії, хвороби Альцгеймера, хвороби Паркінсона [Szelеny J., 2001; Ray S.K.et al., 2002]. Показано підвищення продукції ФНП-альфа, ІЛ-1-бета при черепно- мозковій травмі як в експериментальних, так і клінічних умовах [Lee L.L. et al., 2004; Marklund N. et al., 2005; Fahrig T. et al., 2005].

Встановлено, що травма головного мозку обов'язково зачіпає дофамінергічні системи мозку [Zafonte R.D.et al., 2000; Wagner A.K. et al., 2005], а висока функціональна активність цієї системи необхідна для реалізації антиген-індукованого антитілогенеза і забезпечення достатнього рівня імунологічної реактивності [Арушанян Э.Б., Бейер Э.В., 2004]. Проте до теперішнього часу не досліджувалися особливості імунної системи тварин з ЧМТ на тлі застосування препаратів, що знижують рівень прозапальних цитокінів, зокрема пентоксифіліну [Noel P.et al., 1990], а також L-депренілу- інгібітору моноамінооксидази типу А [Newburn G., Newburn D., 2005], що володіє антиоксидантними властивостями [Wu R.M.et al., 1996].

Тому виглядає доцільним дослідити стан імунологічної реактивності, особливості динаміки посттравматичного періоду у щурів, які перенесли ЧМТ середнього ступеня тяжкості, за умов комбінованого застосування пентоксифіліну та L-депренілу, що і склало основний напрям нашого дослідження.

Зв'язок роботи з науковими планами, програмами. Дисертаційна робота є фрагментом планової науково-дослідницької роботи кафедри нормальної фізіології Одеського державного медичного університету, затвердженої МОЗ України “Вивчити механізми розвитку резистентних форм епілепсії на прикладі експериментального епілептичного статусу, та посткиндлінгу у щурів різного віку, з метою розробки фармакологічних методів їх корекції” (держреєстрація № 0100U006465). Дисертант був співвиконавцем вказаної теми.

Мета роботи установити особливості перебігу посттравматичного періоду у тварин з черепно-мозковою травмою на тлі модуляції функціональної активності імунної і дофамінергічної систем.

Завдання дослідження.

1. Дослідити показники клітинного і гуморального імунітету в посттравматичному періоді у щурів з ЧМТ середнього ступеня тяжкості, а також з'ясувати динаміку даних показників на тлі застосування пентоксифіліну та L-депренілу.

2. Виявити особливості розвитку NMDA-викликаних судом у щурів з ЧМТ за умов внутрішньогіпокампального застосування епілептогену, а також в умовах введення імуноглобуліну G, пентоксифіліну та L-депренілу.

3. Вивчити особливості судомної готовності мозку щурів з ЧМТ до нейротоксинів з різним механізмом епілептогенної дії, а також особливості розвитку пікротоксин-індукованого киндлінгу за умов модуляції функціональної активності дофамінергічної системи мозку тварин.

4. Дослідити динаміку ЕЕГ-показників у щурів з ЧМТ середнього ступеня тяжкості, рухову активність в тесті “відкрите поле”, а також особливості вказаних проявів за умов застосування пентоксифіліну та L- депренілу.

5. Вивчити динаміку морфометричних показників стрес компетентних органів: надниркових залоз, селезінки і тимусу у щурів з ЧМТ середньої тяжкості за умов впливу на них пентоксифіліну та L-депренілу.

6. Встановити особливості стану тіол-дисульфідної і аскорбатної окислювально-відновних систем крові у щурів з ЧМТ і ефектами застосування пентоксифіліну та L-депренілу.

Об'єкт дослідження: патогенетичні механізми ЧМТ у щурів.

Предмет дослідження: патогенез посттравматичного періоду у щурів з ЧМТ за умов модуляції активності імунної і дофамінергічної систем.

Методи дослідження: нейропатофізіологічні, імунологічні, біофізичні, імуноферментний метод визначення рівня цитокінів (ФНП-альфа), нейрофармакологічні, морфометричний, статистичні.

Наукова новизна дослідження. Автором вперше проведено комплексні дослідження показників імунологічної реактивності - як клітинних, так і гуморальних в ранньому посттравматичному періоді у щурів з середнім ступенем тяжкості ЧМТ, а також визначено вплив комбінованого застосування пентоксифіліну та L-депренілу. Вперше виявлено ефекти імуноглобулінів у щурів з ЧМТ відносно судомного синдрому, індукованому внутрішньогіпокампальним застосуванням NMDA, і встановлена протисудомна ефективність імуноглобуліну G в цих умовах, а також синергізм у дії імуноглобуліну G з пентоксифіліном і L-депренілом. Встановлена прямопропорційна залежність пригнічення реакції бласттрансформації лімфоцитів щурів, що стимулюється ліпополісахаридом та фітогемаглютиніном, від тяжкості ЧМТ.

Вперше виявлено, що в найближчому (1-3 год з моменту ЧМТ) періоді у щурів в структурах кори головного мозку переважають реакції десинхронізації, які змінювалися в подальшому, через 2-4 год домінуванням синхронізації ЕЕГ. На підставі даних щодо динаміки відновлення дослідницької поведінки щурів в тесті “відкрите поле”, встановлена ефективність пентоксифіліну і L-депренілу. Вперше показана сумація ефектів пентоксифіліну і L-депренілу відносно показників дослідницької активності щурів в тесті “відкрите поле”, а також потенційованої їх взаємодії відносно гальмування судом, індукованих агоністами рецепторів збуджуючих амінокислот. Вперше встановлено, що під впливом пентоксифіліну та L-депренілу збільшується вміст тіолових груп в крові, а також зростає кількість відновленої аскорбінової кислоти у щурів з ЧМТ.

Практичне значення отриманих результатів. Робота належить до фундаментальних досліджень. Отримані результати розширюють науково-теоретичні уявлення про патогенез посттравматичного періоду ЧМТ, який відбувається за участю дофамніергічної системи мозку та системи цитокінів і є підставою для подальшого дослідження ефектів комбінованого застосування препаратів - блокаторів прозапальних цитокінів і дофаміноміметиків в комплексній терапії ЧМТ в клінічних умовах.

Отримані дані щодо ефективного блокування патологічно підвищеної збудливості нейрональних утворень при ЧМТ за допомогою імуноглобуліну G відкривають нові можливості для розширення уявлень про взаємозвязкі між окремими ланками нейроендокринної регуляторної системи, системи імунітету та їх ролі в формуванні компенсуючих змін за умов ЧМТ.

Результати роботи можуть бути використані в навчальному процесі на кафедрах нормальної та патологічної фізіології, невропатології, ендокринології, імунології, у роботі науково-дослідних лабораторії з відповідним науковим спрямуванням.

Особистий внесок дисертанта. Автором був здійснений патентно- інформаційний пошук, підібрана та проаналізована література, відпрацьована модель і проведені експериментальні дослідження. Дисертантом проведена статистична обробка отриманих результатів, написані всі розділи дисертаційної роботи та публікації, спільно з науковим керівником автором сформульовано мету і задачі дослідження, проведено аналіз та узагальнення отриманих результатів, обґрунтування висновків.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційного дослідження викладені на Х конгресі СФУЛТ (Луганськ, 2002); міжнародній науково-практичній конференції молодих вчених “Вчені майбутнього” (Одеса, 2006); IV міжнародному конгресі “Поліпшення якості життя у хворих із захворюваннями нервової системи” (Одеса, 2006); V Всесвітньому конгресі патофізіологів (Пекін, 2006), Х-й конференції Української протиепілептичної ліги (Київ, 2006), III Національному з'їзді фармакологів України (Одеса, 2006).

2. ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи досліджень. Експерименти виконані на 273 щурах-самцях лінії Віcтар маcoю 180-220 г, котрі знаходились в звичайних умовах утримання та годування. Дослідження проведені відповідно до вимог комісії з біоетики ОДМУ (протокол № 7А от 17.11.2006 р.).

ЧМТ у щурів відтворювали шляхом дії падаючим вантажем масою 30 г з висоти 50 см на тим'яну частину черепа щура, якого за умов ефірного рауш-наркозу фіксували таким чином, що траєкторія падіння вантажу була перпендикулярною до поверхні черепа тварини [Finnie J. et al., 2001]. У тварини відтворювалися порушення, які класифікували у відповідності з їх тяжкістю на три групи [Шандра А.А. та співавт., 1993]:

1) легкий ступінь тяжкості - у тварин мали місце порушення координації і пози, що зберігалися впродовж перших двох годин з моменту механічної травми, після чого реєструвалося поступове відновлення рухової активності (10-15% всіх щурів);

2) середній ступінь тяжкості - поза-тонічні порушення зберігалися впродовж чотирьох годин спостереження, але протягом цього періоду наголошувалося відновлення короткочасних дізкордінованних локомоторних актів (70-80% всіх тварин);

3) важкий ступінь тяжкості - відзначався відсутністю відновлення вертикальної пози тварин, вираженими вегетативними порушеннями і слабкими рефлексами на защипування хвоста та при доторканні до рогівки ока (10-15% всіх тварин).

В якості груп контролю спостерігали інтактних тварин, яких короткочасно за умов ефірного рауш-наркозу фіксували без здійснення механічного удару.

Оцінку рухової активності здійснювали методом “відкритого поля” [Александрова Н.Г. та співавт., 1984], а також методу прямої актометрії [Бyреш Я. та співав., 1991].

Фармакологічний киндлінг відтворювали за допомогою повторних введень пікротоксину у дозі 1,0-1,2 мг/кг, внутрішньоочеревинно (в/очер), а також підпорогових електростимуляцій вентро-базальних відділів мигдалини [Шандра О.А. та співавт., 1999]. Вогнища епілептогенезу і вторинно-генералізовану форму епілептогенезу моделювали шляхом застосування розчинів натрієвої солі бензилпеніциліну (“КМП” Україна) (10 000 МЕ/мл), NMDA (“Sigma”, США) (10,0 мг/мл), каїнової кислоти (“Sigma”, США) (2,0 мг/мл) і азотнокислого стрихніну (30,0 мг/мл), які вводили внутрішньогіпокампально за координатами стереотаксичного атласу в об'ємі 2,0 мкл. Введення NMDA і каїнової кислоти в бокові шлуночки викликало типові клонічні судоми і тонічну екстензію передніх кінцівок за методом [White H.S. et al., 1992]. Розраховували середньоефективні дози епілептогенів (ED₅₀) [Бyреш Я. та співав., 1991]. Для деструкції компактної частини чорної речовини застосовували білатеральні мікроін'єкції 6-оксидофамину (10,0 мкг) згідно стереотаксичних координат G. Paxinos, C. Watson (1998).

Тваринам імплантували ніхромові електроди в структуру мозку під нембуталовим наркозом (40,0 мг/кг, в/очер) та використовували в дослідженні через 7-14 діб з моменту оперативного втручання.

Для оцінки ЕЕГ використовувалася частота дослідження 256 імп/с за допомогою АЦП (DX-системи, Харків) - дані візуалізували на екрані і записували на жорсткий диск для подальшої off-line обробки. Частотний діапазон сигналів склав 0,5- 40 Hz. На фрагментах ЕЕГ визначали показники потужності ЕЕГ-сигналу (?V2).

Для визначення вмісту в крові сульфгідрильних і дисульфідних груп застосовували амперометричне титрування нітратом срібла [Соколовський В.В., 1996]. Роздільне визначення вмісту аскорбінової кислоти та її окислених форм в сироватці крові здійснювали за методом В.В. Соколовського (1996), заснованого на здатності 2,4-динітрофенілгідразину при взаємодії з окисленими фракціями аскорбінової кислоти - дегідроаскорбинової і дикетогулонової утворювати озазони, які в сірчаній кислоті набувають червоного кольору, що використовується для фотометричного визначення суми окислених форм.

Склад Т-субпопуляцій диференціювали на основі дослідження впливу теофіліну на ступінь спонтанного розеткоутворення (теофілін-резистентні лімфоцити трактувалися як Т-хелпери, теофілін-чутливі - як Т-супресори), а також за допомогою моноклональних антитіл [Исаенко В.И. и соавт., 1999].

Неспецифічну клітинну резистентність оцінювали за показниками фагоцитарного індексу і фагоцитарного числа [Петров Р.В., 1991]. Визначення рівня імуноглобулінів крові здійснювали за методом Паніна Л.Е. і співавт. (2005). Вимірювання вмісту імуноглобулінів проводили імуноферментним методом на багатоканальному фотометрі Reader “Multiscan ASCENT”. Дослідження бластної трансформації лімфоцитів здійснювали за методом [Pross S et al., 1987]. Вміст ФНП-aльфа визначали за допомогою специфічних антитіл (“Biotrak”система, "Amersham Pharmacia Biotech", Великобританія) твердофазним імуноферментним методом. Абсорбцію досліджували при 450 нм. Точність визначення складала 4,0 пг/мл. Здійснювали визначення відносної маси надниркових залоз, селезінки та тимусу.

У роботі використовували препарат імуноглобуліну людини (Ig G) (фірма “Імбіо”, РФ), який являє собою 5% розчин імунологічно активної білкової фракції імуноглобуліну G. У 25 мл міститься 1,25 г білку, 0,25 г глюкози, 0,125 г глікоколу; розчинник 0,9% натрію хлорид.

Вcі отримані результати обробляли за допомогою параметричних та непараметричних методів статистичного аналізу [Я.Бyреш і співавт., 1991].

Результати дослідження та їх обговорення. Вплив модуляції активності дофамінергічної системи мозку на розвиток пікротоксин-викликаного киндлінгу. Розвиток судом у щурів з ЧМТ показав, що після 5-го застосування епілептогена у всіх експериментальних тварин відмічались клонічні судоми окремих м'язів і груп м'язів тіла і кінцівок тварин (1,0+0,3 балів), що не відрізнялося від такої в групі інтактних тварин (0,9+0,2 балів) (P>0,05). У щурів з білатеральною деструкцією компактної частини чорної речовини тяжкість судом склала 1,4+0,3 балів (P>0,05). У групі тварин з ЧМТ, яким вводили L-депреніл (5,0 мг/кг, в/очер) у 8 з 11 тварин під впливом пікротоксину реєструвалися судомні сіпання окремих груп м'язів, а тяжкість судом склала 0,8+0,2 балів, що було достовірно меншим, ніж у щурів з ЧМТ і пошкодженням дофамінергічної системи середнього мозку (P<0,05).

Після 20-и введень пікротоксину в групі щурів з ЧМТ у 9 з 11 щурів відмічались генералізовані тоніко-клонічні судомні напади, а середня тяжкість судом склала 4,1+0,3 балів. У інтактних тварин тяжкість судом була на 8,7% меншою, ніж у щурів з ЧМТ (P>0,05), а у щурів з деструкцією дофамінергічної системи на 9,8% вищою, ніж у щурів з однією тільки ЧМТ (P>0,05). У групі щурів з ЧМТ, яким застосовували L-депреніл, у всіх експериментальних тварин відзначались інтенсивні клонічні судоми м'язів тулуба, - тяжкість судом в групі була на 34,8% меншою, ніж у щурів з однією ЧМТ (P<0,05).

Застосування тестуючої дози пікротоксину (1,0-1,2 мг/кг, в/очер) щурам через три тижні з моменту останнього введення епілептогену супроводжувалося розвитком генералізованих тоніко-клонічних судом у всіх тварин з ЧМТ. При цьому у 3 з 9 щурів судоми носили повторний характер, а їх тяжкість склала 4,3+0,4 балів. У кіндлінгових щурів без ЧМТ повторні судоми відмічались у 2 з 11 щурів і середня тяжкість судом в групі не відрізнялася від такої в групі щурів з ЧМТ. В той же час, у тварин з двосторонньою деструкцією чорної речовини повторні тоніко-клонічні судоми реєструвалися у всіх експериментальних тварин і їх тяжкість перевищувала таку у щурів з однією ЧМТ на 23,5% (P<0,05). У половини щурів з ЧМТ, яким застосовували L-депреніл, відмічались клонічні судоми передніх кінцівок, а середня тяжкість судом склала 2,6+0,3 балів, що було на 28,1% менше, ніж у тварин з однією ЧМТ (P<0,05).

Вплив L-депренілу і пентоксифіліну на рухову активність в тесті “відкрите поле”. У тварин, що перенесли ЧМТ середнього ступеня тяжкості, через 30 хв з моменту її нанесення відмічалось двократне зниження загальної кількості перетнутих квадратів і центральних - в 4,2 рази порівняно з групою контролю (P<0,05). При цьому також реєструвалося зниження числа вертикальних стійок як з опорою (у 6,6 разів), так і без неї (у 4,1 рази) (P<0,05). Вказані порушення рухової активності відзначалось протягом 2- 4 год, після чого впродовж 1- 2 год відбувалося поступове відновлення рухової активності щурів.

За умов застосування пентоксифіліну в дозі 50,0 мг/кг до кінця другої години після ЧМТ 40% щурів демонстрували здатність перетинати центральні квадрати. Перерахунок ED₅₀, що зберігає здатність 50% щурів з ЧМТ перетинати квадрати, показав, що дана доза склала 66,2 мг/кг, а у відношенні попередження зниження кількості вертикальних стійок - 76,1 мг/кг. Відповідні дози ED₅₀ L-депреніла склали 2,44 мг/кг і 4,53 мг/кг. Перерахунок середньо ефективних доз ED₅₀ пентоксифіліну за умов його поєднання з L-депренілом показав їх редукцію в 2,2 і в 3,7 рази відповідно при введенні 60% і 80% дози.

Вплив L-депренілу і пентоксифіліну на стрес-компетентні органи. ЧМТ викликала збільшення маси надниркової залози лівої на 43,0% (P<0,05) і правої - на 38,1% в порівнянні з контролем (P<0,05) (табл.1). Крім того, спостерігалося зниження маси селезінки і тимуса - відповідно на 31,7% і на 30,2% (P<0,05). Комбіноване введення L-депренілу (0,1 мг/кг, в/очер) і пентоксифіліну (25,0 мг/кг, в/очер) супроводжувалось зменшенням маси лівої і правої надниркових залоз у порівнянні з відповідними показниками в групі щурів тільки з однією ЧМТ - відповідно на 28,3% і на 24,1% (P<0,05). Досліджувані показники були меншими, ніж в групах щурів с ЧМТ, для яких застосовували L-депреніл в дозі 0,5 мг/кг (зліва на 19,4%, P<0,05 і справа - на 14,4%, P<0,05) а також пентоксифілін в дозі 100,0 мг/кг (зліва на 15,3%, P<0,05 і справа на 17,4%, P<0,05). Маса селезінки перевищувала таку в групі тварин з однією ЧМТ на 46,7% (P<0,05) і була більшою, ніж в групі щурів з ЧМТ, яким застосовували L-депреніл в дозі 0,5 мг/кг (на 23,6%) і пентоксифілін в дозі 100,0 мг/кг (на 19,1%) (P<0,05). Маса тимуса перевищувала таку в групі щурів з однією тільки ЧМТ на 41,2% (P<0,05) і була вище, ніж в групах щурів, яким застосовували L-депреніл в дозі 0,1 мг/кг (на 30,3%, P<0,05) і пентоксифілін - 25,0 мг/кг (на 36,6%, P<0,05).

Таблиця 1. Динаміка змін маси надниркових залоз та імунокомпетентних органів щурів під впливом ЧМТ і за умов використання L-депренілу та пентоксифіліну (M+m), n=10-12

Ізоболграфічний аналіз комбінованого використання різноманітних дозувань препаратів показав сумаційний характер взаємодій препаратів на показники маси надниркових залоз та імунокомпетентних органів щурів під впливом ЧМТ .

Дослідження динаміки показників імунологічної реактивності за умов ЧМТ. Відносний вміст Т-лімфоцитів і їх абсолютне число в загальній популяції лімфоцитів зростали в ранньому посттравматичному періоді - відповідно на 13,2% і на 12,4% (P<0,05). При цьому на тлі недостовірного збільшення абсолютного рівня Т-хелперних лімфоцитів відзначалось відносне зменшення їх вмісту на 9,4% (P<0,05) (рис. 1.). В той же час, в даних умовах мало місце як абсолютне (на 29,2%) (P<0,05), так і відносне зростання рівня супресорних Т-лімфоцитів (P<0,05).

По осі ординат: досліджуванні показники в% по відношенню до тих в групі контролю, які прийняті за 100%.

- P<0,05 в порівнянні з групою контролю (ANOVA+ Newmann- Keuls тест)

Рис. 1. Вплив окремого і комбінованого використання пентоксифіліну та L-депренілу на субпопуляції Т-лімфоцитів у щурів з ЧМТ

Розвиток посттравматичного періоду на тлі поєднаного застосування пентоксифіліну та L-депренілу (у дозах відповідно 25,0 мг/кг і 2,5 мг/кг, які були малоефективні при самостійному застосуванні), достовірно не супроводжувався змінами абсолютних і відносних показників вмісту загальних Т-лімфоцитів крові (див. рис. 1). Були відсутні відмінності по показнику відносного і абсолютного рівня хелперних Т-лімфоцитів порівняно з таким в групі контролю (P>0,05). Абсолютний вміст Т-супресорних лімфоцитів був достовірно вищий ніж в контролі на 7,4%, а В-лімфоцитів - на 5,5%.

Через 8 год з моменту ЧМТ у щурів знижувався рівень імуноглобулінів G і М відповідно на 16,9% і на 15,6%, що було менше порівняно з початковими показниками (P<0,05) (табл. 2.). Крім того, зменшувався вміст циркулюючих імунних комплексів - на 17,1% (P<0,05). У крові також визначалася значна концентрація ФНП-альфа. Схожі показники реєструвалися за умов самостійного застосування пентоксифіліну та L-депренілу, за винятком рівня ФНП-альфа у щурів з ЧМТ, котрим застосовували один пентоксифілін і рівень якого достовірно знижувався у порівнянні до групи щурів з однією ЧМТ (P<0,05). За умов поєднаного застосування пентоксифіліну та L-депренілу рівень імуноглобулінів G і М залишався дещо нижчим порівняно з їх початковим рівнем, проте дані відмінності не були достовірними (P>0,05). Також практично до початкового значення відновлювався вміст імунних комплексів. Вміст ФНП-альфа зменшувався порівняно з однією ЧМТ в 3,8 рази (P<0,05).

Таблиця 2. Вплив L-депренілу та пентоксифіліну та їх комбінації на вміст деяких гуморальних факторів імунологічної реактивності у щурів з ЧМТ

У щурів з ЧМТ середнього ступеня тяжкості відмічалось зниження включення [3H] тимідину - як за умов стимуляції бластогенної активності клітин селезінки за допомогою бактерійного ліпополісахариду (у 3,8 раз порівняно з показником у групі інтактних щурів, P<0,001), так і при стимуляції за допомогою фітогемаглютиніну (у 3,1 раз) (P<0,001). У щурів з важкою ЧМТ відмічалось подальше зниження досліджуваного показника, який в цей період був нижчий за той, який спостерігався у інтактних щурів при стимуляції ліпополісахаридом і фітогемаглютиніном відповідно в 18,6 і 24,6 рази (P<0,001). При цьому достовірне зниження досліджуваних показників відмічалось і порівняно з показниками, які реєструвалися у щурів з легкою і середньою по тяжкості ЧМТ. Поєднане застосування пентоксифіліну та L-депренілу в дозах, які при самостійному застосуванні викликали незначні за своєю вираженностю зміни, супроводжувалося значним зростанням показників стимульованої реакції бласттрансформації лімфоцитів, які достовірно перевищували такі, що визначені при введенні тільки одного з досліджуваних препаратів (P<0,05).

Вплив пентоксифіліну та L-депренілу на динаміку ЕЕГ-змін у щурів з ЧМТ середнього ступеня тяжкості. Через 2-3 години з моменту нанесення ЧМТ середнього ступеня тяжкості у щурів реєструвалася синхронізація ЕЕГ в дельта- і альфа-діапазонах з редукцією швидкої десинхронізованої активності бета-діапазону, а також редукцією тета-активності. Найбільш вираженими і численними вказані зміни відзначалися в структурах вентрального гіпокампу. Відновлення здатності утримувати вертикальне положення тіла, а також здатності здійснювати координовану рухову активність відмічалось впродовж 4-8 год посттравматичного періоду у більшості щурів (8 з 11 тварин).

У ЕЕГ, зареєстрованій через 2,5 год з моменту нанесення ЧМТ і за умов комбінованого застосування препаратів (введення пентоксифіліну в дозі 25,0 мг/кг, в/очер і L-депренілу в дозі 2,0 мг/кг, в/очер), на фоні десинхронізірованої активності реєструвалися окремі хвилі дельта-, тета- і альфа-діапазонів, амплітудою 20-50 мкв. При цьому у вентральних структурах гіпокампу потужність тета-ритму була вищою порівняно з аналогічним показником в лобовій корі (P<0,05). Крім того, як у вентральних відділах, так і в дорзальному відділі гіпокампу потужність бета-активності була нижчою порівняно з відповідним показником в лобовій корі (P<0,05). Причому, у вентральному гіпокампу лівої півкулі нижчим залишався і показник потужності в гама-діапазоні (P<0,05). При цьому всі досліджувані показники спектральних характеристик ЕЕГ не відрізнялися від таких в групі контролю (P>0,05). Поведінковими корелятами подібних змін ЕЕГ у щурів з ЧМТ були збереження тваринами вертикального положення, а також координована дослідницька активність тварин.

Вплив пентоксифіліну та L-депренілу на судомну активність. Мікроін'єкція розчину NMDA в гіпокамп викликала у щурів з ЧМТ розвиток спайкових потенціалів, латентний період появи яких був на 62,1% меншим, ніж в контролі (P<0,01). При цьому потужність осередкової активності, яка реєструвалася до початку іктальной активності, перевищувала таку у щурів контрольної групи в 2,03 рази (P<0,001). Тривалість існування вогнищ також була в 1,97 раз більшою, ніж в контролі (P<0,001). Внутрішньогіпокампальна мікроін'єкція розчину каїнової кислоти також супроводжувалася розвитком перших спайкових потенціалів, латентний період появи яких був меншим, ніж в контролі на 33,9% (P<0,05). При цьому у 2 щурів з 8 відповідно на 13-ій і 18-ій хв з моменту введення епілептогену відзначалось формування іктальних розрядів. Тривалість існування епілептичних вогнищ перевищувала таку в контролі на 55,7% (Р< 0,01). Динаміка епілептичної активності, що індукується в гіпокампі пеніциліном і стрихніном, не відрізнялася від такої в контролі (P>0,05).

За умов відтворення ЧМТ у щурів відзначалось істотне зниження дози ED₅₀ NMDA , яка викликала клонічні судоми, - в 2,36 рази порівняно з відповідним показником в групі інтактних щурів (0,66+0,05 мкг) (P<0,05). На тлі застосування пентоксифіліну в дозі 25,0 мг/кг, в/очер за 60 хв. до відтворення ЧМТ у щурів ED₅₀ NMDA не відрізнялася істотно від показників в групі контролю (інтактні щурі) і від щурів з однією тільки ЧМТ (P>0,05). Моделювання ЧМТ на тлі застосування пентоксифіліну в дозі 100,0 мг/кг супроводжувалося підвищенням ED₅₀ NMDA порівняно з такою в групі щурів з однією тільки ЧМТ на 55,6% (P<0,05).

Застосування більш високих доз NMDA (у діапазоні від 0,5 до 6,0 мкг внутрішньогипокампально) супроводжувалося розвитком типової тонічної екстензії передніх кінцівок у частини піддослідних тварин. При цьому ED₅₀ NMDA склала 2,7+0,3 мкг, а у щурів з ЧМТ - на 48,5% менше (P<0,05). За умов застосування пентоксифіліну ED₅₀ NMDA була відповідно в 1,5 (доза пентоксифіліну - 25,0 мг/кг, P>0,05) і в 1,9 разу більш високою (пентоксифілін в дозі 100,0 мг/кг, Р<0,05), ніж у щурів з однією ЧМТ.

Під впливом L-депренілу, вживаного в дозі 1,0 мг/кг, в/очер у щурів з ЧМТ відзначається збільшення ED₅₀ NMDA, яка викликає клонічні судоми в 1,83 рази порівняно з такою у щурів з ЧМТ (P<0,05). Збільшення дози L-депренілу 2,5 рази супроводжувалося зростанням дози ED₅₀ NMDA в 2,13 раз (P<0,05). Під впливом L- депренілу (1,0 мг/кг, в/очер), також зростала доза ED₅₀ NMDA, що викликає тонічну екстензію передніх кінцівок в 1,35 раз порівняно з щурами з ЧМТ без L-депренілу (P>0,05). Застосування більшої дози препарату супроводжувалося зростанням вказаного співвідношення доз в 1,64 рази (P<0,05).

Відповідно середньоефективні дози препаратів - пентоксифіліну та L- депренілу відносно судом, що індукуються у щурів внутрішньогіпокампальним застосуванням NMDA, у щурів з ЧМТ склали для тонічної екстензії передніх кінцівок, - 52,9 і 3,8 мг/кг і для клонічних судом відповідно - 76,1 мг/кг і 4,1 мг/кг.

Перерахунок середньо ефективної дози пентоксифіліну за умов застосування L-депренілу показав її значну редукцію. Так, за умов застосування L-депренілу в дозі, яка складала 80% від його ED₅₀, середньоефективна доза пентоксифіліну складала всього 4,3% від раніше визначеної величини ED₅₀ . Схожа редукція відмічалась і на моделі NMDA- викликаною екстензією передніх кінцівок: за умов застосування L-депренілу в дозі, що становить 80% від раніше визначеної величини ED₅₀ препарату, перерахована доза пентоксифіліну склала 4,7% від раніше визначеної величини ED₅₀ препарату. Ізоболографічний аналіз дії пентоксифіліну та L-депренілу показав наявність потенційованого характеру взаємодії препаратів відносно їх здатності запобігати як клонічним судомам, так і тонічної екстензії передніх кінцівок індукованими внутрішньогіпокампальним застосуванням NMDA у щурів з ЧМТ

Ефекти імуноглобуліну G у поєднанні з комбінацією пентоксифілін + L-депреніл на NMDA-індуковану судомну активність. Визначення величини середньоефективних доз імуноглобуліну G у щурів з NMDA-індукованим судомним синдромом проводили, застосовуючи дози епілептогену, раніше визначені як ED₁₀₀ для індукції клонічних судом і тонічної екстензії передніх кінцівок (відповідно 0,9 і 2,5 мкг). Застосування імуноглобуліну G в дозі 0,5 г/кг, в/очер супроводжувалося протекцією відносно клонічних судом у 10% експериментальних тварин, а збільшення дози імуноглобуліну G в шість разів супроводжувалося захистом відносно NMDA-індукованих клонічних судом у 90% експериментальних тварин.

У дозі 1,0 г/кг, в/очер імуноглобулін G запобігав формуванню екстензії передніх кінцівок у 70% експериментальних тварин, а при зростанні цієї дози в три рази у 100% щурів були відсутні екстензії. На тлі стандартних доз пентоксифіліну і L-депренілу (ED₂₀ кожного препарату) імуноглобулін G в дозах, кратних середньоефективним відносно клонічних судом і тонічної екстензії передніх кінцівок величинам надавало виражений протисудомний ефект, що свідчить про потенційовану протисудомну дію препаратів за умов їх комбінованого застосування.

Тіолдисульфідна і аскорбатна окислювально-відновлювальні системи крові при ЧМТ. Рівень тіолових груп в цілісній крові інтактних тварин склав 22,04+1,6 мкмоль/л, а дисульфідних груп - 7,94+0,87 мкмоль/л. Проведення вимірювання рівня тіолових груп в цілісній крові щурів через 8 годин з моменту відтворення ЧМТ середнього ступеня тяжкості показало, що їх вміст був менший, ніж в групі інтактних щурів, на 44,7% (P<0,05). Рівень дисульфідних груп зростав на 38,4% (P<0,05). У небілковій фракції цілісної крові кількість сульфгідрильних груп знижувалася і складала 63,5% порівняно з такими у інтактних тварин (P<0,05). Вміст дисульфідних груп зростав в 2,1 разу (P<0,05). У білковій фракції цілісної крові відзначалося зниження вмісту сульфгідрильних груп до 53,7% порівняно з таким у інтактних щурів (P<0.05), тоді як кількість дисульфідних груп збільшувалася і складала 132,3% порівняно з контрольними спостереженнями (P<0,05).

Під впливом комбінованої терапії (пентоксифілін - 25,0 мг/кг і L-депреніл - 1,0 мг/кг) відбувалося збільшення вмісту сульфгідрильних груп на 71,4% порівняно з таким у щурів з ЧМТ, яким не застосовували лікування (P<0,05). При цьому вміст дисульфідних груп знижувався і складав 66,5% від такого в контролі (P<0,05). У небілковій фракції крові визначалося збільшення рівня сульфгідрильних груп - на 61,6% порівняно з контролем, а зниження дисульфідних груп - на 52,3% (P<0,05). У білковій фракції збільшення сульфгідрильних груп відбувалося на 68,5%, а зниження вмісту дисульфідних груп на 32,0% (P<0,05) порівняно з показниками у щурів з ЧМТ без лікування.

Загальний вміст аскорбінової кислоти в сироватці крові щурів контрольної групи дорівнював 43,1+4,9 мкмоль/л, а окислених форм - 53,2+6,7 мкмоль/л. Дослідження аналогічних показників через 8 годин з моменту ЧМТ показало, що сума окисленої і відновленої аскорбінової кислоти зростала порівняно з контролем на 58,7% (P<0,05). При цьому, якщо кількість відновлених форм збільшувалася тільки на 55,3% (P<0,05), то вміст окислених форм зростав в 2,2 (P<0,01) рази порівняно з контрольними значеннями.

Комбіноване застосування L-депренілу і пентоксифіліну в неефективних дозах (відповідно 1,0 мг/кг та 25,0 мг/кг) викликало значне зниження загального рівня аскорбінової кислоти - на 34,6% порівняно з таким у щурів з ЧМТ без лікування (P<0,05). При цьому рівень відновленої форми збільшувався на 74,6%, тоді як вміст окисленої форми зростав на 38,5% порівняно з контролем (P<0,05).

ВИСНОВКИ

У дисертації наведено теоретичне узагальнення та нове вирішення наукового завдання, що полягає в обґрунтуванні підходів до розробки методів запобігання тяжких наслідків черепно-мозкової травми. Встановлено ефективність комбінованого застосування пентоксифіліну та L-депренілу, а також імуноглобуліну G на підставі оцінки динаміки посттравматичних поведінкових, метаболічних, електрографічних та імунологічних порушень. Отримані результати дозволяють зробити такі висновки:

1. У ранньому посттравматичному періоді (8 годин з моменту ЧМТ середнього ступеня тяжкості) в крові у щурів спостерігалося збільшення відносного вмісту Т-лімфоцитів і їх абсолютного числа відповідно на 13,2% і 12,4% , менш виражене збільшення В-лімфоцитів, зниження рівня G і М імуноглобулінів відповідно на 16,9% і на 15,6%, циркулюючих імунних комплексів - на 17,1% на тлі збільшення вмісту ФНП-альфа, а також зниження функціональної активності нейтрофілів.

2. У ранньому періоді ЧМТ знижувалася активність лімфоцитів селезінки, що проявлялося гальмуванням реакції бласттрансформації лімфоцитів, яка стимулюється ліпополісахаридом у 3,8 рази і фітогемаглютиніном у 3,1 рази. Вказані порушення були більш виразними при тяжкому ступені травми. Зниження бласттрансформації попереджувалося використанням пентоксифіліну, ефект якого потенціювався L-депренілом.

3. ЧМТ середнього ступеня тяжкості викликала у експериментальних тварин редукцію дослідницької активності в тесті “відкрите поле”, підвищення дофамінергічної активності введенням L-депренілу перешкоджало, а деструкція компактної частини чорної речовини, навпаки, сприяла розвитку відповідних рухових розладів. Пентоксифілін надавав доза-залежні коригуючі ефекти, які адитивно посилювалися L-депренілом.

4. У тварин з ЧМТ відмічалось посилення чутливості структур гіпокампу до дій агоністів збуджувальних амінокислот - каїнової кислоти і NMDA, прискорення формування пікротоксин-індукованих киндлінгових судом, що посилювалося під впливом пошкодження дофамінергічної системи середнього мозку. L-депреніл і пентоксифілін надавали доза-залежні протисудомні ефекти, а також потенційовану протисудомну дію при їх комбінованому застосуванні.

5. Застосування препарату імуноглобуліну G супроводжувалося зниженням нейротоксичної дії агоніста рецепторів збуджувальних амінокислот - NMDA. На тлі застосування імуноглобуліну G комплекс L-депреніл і пентоксифілін надавав потенційовану протисудомну дію як відносно клонічних, так і тонічних судом, викликаних внутрішньогіпокампальною мікроін'єкцією NMDA щурам з ЧМТ.

6. Відтворення ЧМТ середнього ступеня тяжкості супроводжувалося змінами спектральних характеристик ЕЕГ. Протягом найближчого посттравматичного періоду (1- 2 год) у тварин реєструвалось зростання десинхронізованої активності бета- і гамма-діапазонів на тлі редукції потужності альфа-ритму, помірного зниження активності дельта-діапазону, а також зниження тета-активності переважно в структурах фронтальної кори і вентрального гіпокампу. Протягом подальших 1-3 годин у тварин розвивалася виражена синхронізація ритмів ЕЕГ, що виявлялося в переважанні активності дельта-діапазону, помірному посиленні потужності альфа-ритму, редукції тета-, бета- і гамма-активності. Вказані зміни ЕЕГ доза-залежно усувалися пентоксифіліном і даний ефект препарату посилювався за умов застосування L-депренілу.

7. У посттравматичному періоді патогенетичні зміни при ЧМТ обумовлені залученням стрес-компетентних органів, що проявляється в збільшенні маси надниркових залоз: лівої на 43,0% і правої - на 38,1%, а також зниження маси селезінки і тимусу: відповідно на 31,7% і на 30,2%. Застосування L-депренілу і пентоксифіліну викликало потенційовані коригуючі ефекти на морфометричні показники стану стрес-компетентних органів.

8. У посттравматичному періоді відзначалось зрушення функціонального стану тіолдисульфідної і аскорбатної окислювально- відновлювальних систем крові у бік переважання дисульфідних груп на 38,4% і окислених форм аскорбінової кислоти в 2,2 рази . Пентоксифілін і L-депреніл викликають підвищення вмісту тіолових груп і відновлених форм аскорбінової кислоти. Дані ефекти посилювалися при поєднаному застосуванні препаратів.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Результати хірургічного лікування в гострому періоді розривів артеріальних аневризм передніх відділів артеріального кола великого мозку у хворих з артеріальною гіпертензією/ Сон А.С., Хрущ О.В., Петелкакі О.В., Гуменюк В.Я. // Український нейрохірургічний журнал.- 2001.- Т. 1, № 13.- С.123-125. (внесок дисертанта: аналіз клінічного матеріалу та підготовка статті до друку).

2. Шандра О.А., Годлевський Л.С., Петелкакі О.В. Патогенетичне обґрунтування терапії експериментальної черепно-мозкової травми// Інтегративна антропологія.- 2005.- № 1-2.- С.18-24. (внесок дисертанта: аналіз клінічного матеріалу, виконання морфологичних досліджень).

3. Петелкакі О.В., Шандра О.А. Зміни чутливості вентрального гіпокампу щурів, які перенесли черепно-мозкову травму (ЧМТ) по відношенню до впливу епілептогенів// Одеський медичний журнал.- 2006.- № 2.- С.22-24. (внесок дисертанта: аналіз експериментального матеріалу, підготовка статті до друку).

4. Петелкакі О.В. Морфометричні порушення імунокомпетентних органів та надниркових залоз, викликаних черепно-мозковою травмою, та ефекти пентоксифіліну і L- депренілу// Одеський медичний журнал.- 2006.- № 3.- С.25-29.

5. Петелкакі О.В. Зміни бластної трансформації лімфоцитів у щурів, які перенесли черепно-мозкову травму, та ефекти пентоксифіліну// Запорізький медичний журнал.- 2006.- №2.- С.114-116.

6. Особливості перебігу гострого періоду розриву артеріальних аневризм каротидного басейну у хворих з артеріальною гіпертензією / Сон А.С., Хрущ О.В., Петелкакі О.В., Гуменюк В.Я. // мат. Х конгресу СФУЛТ.- Луганськ-Київ-Чікаго, 2002.- С. 328. (внесок дисертанта: аналіз клінічного матеріалу та підготовка тез)

7. Petelkaki A.V., Shandra A.A. Usage of immunoglobulines combined with suppression of proinflammatory cytokines in brain trauma treatment // Chinese Journal of Pathophysiology. - 2006, P.333 (Abstracts of V-th World Pathophysiology Congress) Pekin, 2006. (внесок дисертанта: аналіз експериментального матеріалу, написання тез)

8. Petelkaki A. V., Shandra A.A. Immunological basic of the brain trauma treatment // In: 4^th Internat. Congress on the improvement of quality of life on Dementia, Epilepsy, MS and Perihperal Neuropathies . - Odessa, 2006 - P. 48. (внесок дисертанта: аналіз експериментального матеріалу, написання тез).

9. Петелкаки А.В. Изменения перекисного окисления липидов (ПОЛ) и уровня цитокинов в условиях экспериментальной черепно-мозговой травмы и резистентности к противосудорожному действию бензодиазепинов у крыс // Вісник епілептології. - 2006. - № 1 (15-16). - С.78.

10. Петелкакі О. В. Особливості судом, що викликані агоністами рецепторів збуджуючих амінокислот у щурів з черепно-мозковою травмою (ЧМТ) // Тези доповідей науково-практичної конференції молодих вчених з міжнародною участю „Вчені майбутнього”.- Одеса, 2006 - C. 34-35.

11. Петелкакі О.В. Ефективність використання фармакологічної блокади системи прозапальних цитокінів за умов експериментальної черепно-мозкової травми // Тези доповідей ІІІ національного з'їзду фармакологів України „Фармакологія 2006 - крок у майбутнє”. - Одеса, 2006. - С. 134.

Размещено на Allbest.ru