Особливості остеокластичної резорбції кісткової тканини при зниженні опорного навантаження

Размещено на http://allbest.ru

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Особливості остеокластичної резорбції кісткової тканини при зниженні опорного навантаження

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

кістковий резорбтивний остеокласт остеобласт

Актуальність теми. Найтиповішими змінами в кістковому скелеті при зниженні опорного навантаження (в умовах космічних польотів, при тривалій гіпокінезії, імобілізації тощо) є зменшення маси, міцності та мінеральної щільності кісткової тканини. Втрата кісткової тканини кваліфікується як остеопенія, іноді остеопороз. Особливо це стосується кісток, які несуть опорне навантаження (довгі кістки, кістки тазу, хребці): в них збільшується ризик переломів [Григорьев, Ступаков, Воложин, 1994; Оганов, Шнайдер, 1996; Carmeliet et al., 2001; Iwasaki et al., 2002; Дурнова та ін., 2004; Оганов, 2005; Березовский, Литовка, 2006]. За даними ВООЗ остеопороз - одне з захворювань, обумовлених малорухливим способом життя (гіпокінезія) і за розповсюдженістю та смертністю від його наслідків (переломи кісток у людей похилого віку, особливо у жінок) займає третє місце після серцево-судинних та онкологічних захворювань.

Цитологічні механізми втрати кісткової тканини при гіпокінезії та мікрогравітації залишаються багато в чому неясними. В наземних модельних дослідах та у космічних експериментах на щурах і мавпах встановлено зниження інтенсивності остеопластичних процесів у кістках, зменшення кількості остеобластів та їх функціональної активності [Zerath, 1998; Rodionova et al., 2000; Дурнова та ін., 2004 та ін.]. Показано посилення процесів остеоцитарного остеолізу і апоптоза остеоцитів в кісткових структурах [Noble et al., 2000; Rodіonova, Oganov, Zolotova, 2002; Klein-Nulend, 2003 та ін.].

Однак, щодо особливостей остеокластичної резорбції кісткової тканини при зниженні опорного навантаження, питання залишається дискусійним. Деякі дослідники пов`язують остеопоротичні перебудови в кістках при гіпокінезії та мікрогравітації зі збільшенням кількості остеокластів [Mattew et al., 2003 та ін.]. Інші припускають, що активізація остеокластичної резорбції не відбувається, а втрата кісткової маси є наслідком гальмування процесів остеогенеза [Rubin et al., 2000 та ін.]. Так, у дослідженнях на біосупутниках "БІОН-3-4-5" (тривалість польоту 18,5-21,5 діб) показано, що зменшення (на 30-35%) об`єму трабекул у великогомілкових і плечових кістках щурів супроводжується зниженням кількості остеобластів та відсутністю змін у популяції остеокластів [Wronskі et al., 1987 та ін.]. В експериментах на "БІОН-8", SLS-1, SLS-2 (тривалість польотів 2 тижні) гістоморфометричні дослідження довгих кісток щурів показали збільшення кількості остеокластів [Дурнова та ін., 1990, 1994, 1996 та ін.].

Дані про зміни в популяції остеокластів є суперечливими і в експериментах на щурах з модельованої гіпокінезії (зняття опорного навантаження з задніх кінцівок) [Weinreb et al., 1989; Mattew et al., 2003 та ін.]. В гістологічних дослідженнях кісток мавп після 30-денного перебування в умовах АНОГ (кут -5°) та 10-денного експерименту на мавпах за умов "сухої" імерсії показано значне зменшення губчастої кісткової тканини, однак не виявлено змін у кількості й активності остеокластів [Дурнова та ін., 2004]. Також залишаються маловивченими особливості процесів остеокластичної резорбції у різних зонах довгих кісток при зниженні опорного навантаження.

Слід також враховувати, що інтенсивність процесів резорбції у кістковій тканині визначається не тільки кількістю остеокластів, але й функціональною активністю кожної клітини [Gruber, 2001 та ін.]. Тому для оцінки інтенсивності резорбтивних процесів при гіпокінезії та мікрогравітації необхідними є дані про ультраструктурні особливості остеокластів. Наявність в зонах резорбції остеокластів різних функціональних станів показано в електронно-мікроскопічних дослідженнях [Родіонова, 1983, 1989 та ін.]. Однак, у літературі не знайдено відомостей про ультраструктуру остеокластів при гіпокінезії і мікрогравітації.

Маловивченим є також питання про морфологічні особливості взаємодії остеокластів з остеобластами і остеоцитами в зонах резорбції [Notelovitz, 2002; Daci et al., 2002 та ін.]. Недослідженими залишаються також особливості остеокластогенезу при зниженні опорних навантажень, але такі відомості є важливими для оцінки інтенсивності процесів ремоделювання кісткових структур. Необхідність вивчення особливостей функціонування остеокластів в умовах космічного польоту відображена в Інтернет-ресурсі Search Strategy (NASA SPACELINE Office). Все вищевказане обумовлює актуальність наших досліджень.

Зв'язок теми дисертації з науковими програмами, планами, темами.

Дисертаційна робота виконана відповідно до тематичного плану наукових досліджень Інституту зоології ім. І. І. Шмальгаузена НАН України в рамках науково-дослідницької теми відділу цитології та гістогенезу “Цитологічні механізми структурно-функціональних адаптацій в опорних і кровотворних тканинах при дії на організм деяких факторів зовнішнього середовища” (номер держреєстрації 0100U006481).

Мета і задачі дослідження. Мета роботи - з`ясувати особливості остеокластичної резорбції кісткової тканини при зниженні опорного навантаження (модельована гіпокінезія та мікрогравітація).

Для досягнення мети роботи були поставлені наступні задачі:

- дослідити гістоструктурні перебудови в різних зонах стегнових кісток щурів при знятті опорного навантаження на задні кінцівки (модельована гіпокінезія);

- виявити зміни в популяції остеокластів (кількість остеокластів, у тому числі функціонально-активних, кількість ядер в них, питому площу остеокластів) в різних зонах адаптивного ремоделювання кісток за умов модельованої гіпокінезії;

- вивчити динаміку утворення остеокластів у зонах резорбції кісток при знятті опорного навантаження на задні кінцівки;

- проаналізувати зміни в ультраструктурі остеокластів у зонах ремоделювання кісткової тканини при модельованій гіпокінезії та мікрогравітації (космічна станція SLS-2, біосупутник "БІОН-11");

- виявити морфологічні особливості взаємовідносин остеокластів з остеобластами і остеоцитами в зонах резорбції кісткової тканини при гіпокінезії та мікрогравітації.

Об'єкт дослідження: остеокластична резорбція кісткової тканини при зниженні опорного навантаженн на кістковий скелет.

Предмет дослідження: гістоструктурні перебудови в кістковій тканині та морфо-функціональні особливості остеокластів при модельованій гіпокінезії та мікрогравітації.

Матеріал дослідження: стегнові кістки білих щурів, біопсійний матеріал із гребеня клубової кістки нелюдиноподібних мавп (Macaca mulatta).

Методи дослідження: гістологічний - для вивчення змін у кістковій тканині й популяції остеокластів; радіоавтографічний - для дослідження динаміки остеокластогенезу; метод електронної мікроскопії - для вивчення змін в ультраструктурі остеокластів і міжклітинних взаємодій у зонах резорбції; морфометрія - на світлооптичному та електронно-мікроскопічному рівнях - для об`єктивізації результатів досліджень; статистичний метод - для оцінки вірогідності результатів вимірів.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше проведено комплексне дослідження морфо-функціональних особливостей остеокластичної резорбції при зниженні опорного навантаження на кістковий скелет.

Одержані нові дані, що засвідчують значну роль остеокластів у втраті кісткової тканини при тривалій гіпокінезії та мікрогравітації. Показано, що в зонах адаптивного ремоделювання кісткових структур, насамперед у губчастій кістці епіфізів і метафізів, збільшується кількість остеокластів і функціонально-активних форм у популяції. В меншому ступені це характерно для кісткової тканини діафізів.

Вперше з використанням ³Н-тімідіну встановлено, що при тривалій гіпокінезії за локусом зняття опорних навантажень відбувається прискорення процесів остеокластогенезу.

Посилення процесів остеокластичної резорбції при гіпокінезії та мікрогравітації підтверджено оригінальними даними електронно-мікроскопічних досліджень: в популяції виявлено остеокласти з більш інтенсивно розвиненими порівняно з контролем комплексом Гольджі та структурами, що забезпечують специфічні функції резорбції: фібрилярним шаром, фаголізосомами, "щіточною облямівкою".

Вперше показано, що в умовах мікрогравітації у популяції остеокластів з`являються "гігантські" остеокласти, в яких спостерігається вищий порівняно з контролем та типовими функціонально-активними остеокластами ступінь розвитку зони специфічних функцій, описані структурні особливості їх резорбтивної функції при мікрогравітації. Одержані нові дані про морфологічні взаємодії остеокластів з остеобластами й остеоцитами в зонах резорбції.

Результати досліджень є внеском в розуміння клітинних механізмів адаптивного ремоделювання та втрати кісткової тканини при знятті опорних навантажень на кістковий скелет.

Практичне значення одержаних результатів. Виявлені особливості остеокластичної резорбції в довгих кістках при зниження опорного навантаження (тривалій гіпокінезії та мікрогравітації) можуть бути використані в медицині для цілеспрямованої розробки заходів із профілактики й лікування остеопеній та остеопорозу, обумовлених малорухливим способом життя, зокрема при розробці та тестуванні остеопротекторів. Результати досліджень слід також враховувати в космічній біології та медицині при підготовці й проведенні експериментів на тваринах і для запобігання ушкоджень опорно-рухового апарату космонавтів в тривалих космічних польотах. Одержані результати можна рекомендувати для включення в спецкурси із цитології, гістології та патології кісткової тканини в біологічних і медичних вищих навчальних закладах.

Результати дисертаційної роботи впроваджені у навчальний процес і наукові дослідження на кафедрі анатомії та гістології ім. П. О. Ковальського, в лабораторії гістології Білоцерківського державного аграрного університету.

Особистий внесок здобувача. Автором самостійно проаналізовано наукову літературу з проблеми, сформульовано основні положення дисертаційної роботи та висновки, виготовлено фотодокументацію та ілюстрації. Здобувач брав участь зі співавторами публікацій у постановці експериментів на тваринах із гіпокінезії для гістологічних, гісторадіоавтографічних та електронно-мікроскопічних досліджень (проводив забір та обробку біоматеріалу, виготовляв гістопрепарати і гістоавтографи). Самостійно проведені гістологічні й морфометричні дослідження, а також науковий і статистичний аналіз одержаних даних. Для електронно-мікроскопічних досліджень здобувач використовував біозразки та фотоматеріали з фондів відділу цитології і гістогенеза Інституту зоології НАН України. Науковий аналіз гістоавтографів та електронних мікрофотографій проведено за участю наукового керівника, проф. Н. В. Родіонової.

Апробація роботи. Матеріали дисертації були представлені та обговорені на ХІІ конференції з космічної біології та авіакосмічної медицини (Москва, 2002), на ІІІ Національному Конгресі анатомів, гістологів, ембріологів і топографоанатомів України (Київ, 2002), на Другій Українській конференції з перспективних космічних досліджень (Кацивелі, Крим, 2002), на Російській конференції з міжнародною участю “Организм и окружающая среда: адаптация к экстремальным условиям” (Москва, 2003), на 35^th COSPAR Scientific Assembly (Париж, 2004), а також на засіданнях відділу цитології і гістогенезу та на конференції молодих дослідників (Інститут зоології НАНУ, Київ, 2004), на ХІІІ конференції з космічної біології та авіакосмічної медицини (Москва, 2006), на 36^th COSPAR Scientific Assembly (Пекін, 2006).

Публікації. За темою дисертаційної роботи опубліковано 14 наукових праць, які містять основні положення проведеного дослідження: з них 9 статей - 3 у фахових виданнях, затверджених ВАК України, 6 - у наукових журналах, матеріалах конференцій і з'їздів, а також 5 тез доповідей.

Структура та обсяг дисертації.

Дисертаційна робота надрукована на 168 сторінках основного тексту. Складається зі вступу, огляду літератури, матеріалів і методів дослідження, результатів власних досліджень, обговорення результатів, висновків, списку використаної літератури. Ілюстрована 36 мікрофотографіями, 20 електронограма-ми, 24 малюнками (графіками), 3 таблицями. Список використаних літературних джерел включає 210 найменувань (26 - держав СНД, 179 - інших зарубіжних країн).

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи досліджень.

Модельована гіпокінезія. Експерименти проведені на статевозрілих білих щурах лінії Wistar (самці, вага ?220-240 г). Гіпокінезія моделювалася за методом, запропонованим Morey-Holton, Wronski (1981) та модифікованим А. Я. Капланським та Г. І. Дурновою (ДНЦ - Інститут медико-біологічних проблем, РАН, Москва, Росія), шляхом зняття опорного навантаження з задніх кінцівок тварин (метод "вивішування" за хвіст, кут 35°). При цьому тварини вільно пересувалися на передніх кінцівках у межах клітки до води й кормів. Під час усіх експериментів тварини знаходилися на стандартному раціоні. Було проведено два експерименти. В першому експерименті (тривалістю 28 діб) 17 тваринам (9 дос-лідним та 8 контрольним) однократно вводили ³Н-тімідін для радіоавтографічних досліджень. У другому експерименті, якій складався з двох серій дослідів (кожен тривалістю 28 діб) у 18 тварин (9 - контроль і 9 - дослід) було взято стегнові кістки для гістологічних та електронно-мікроскопічних досліджень. Біозразки кісток відбирали після проведення тваринам ефірного наркозу.

Мікрогравітація.

Космічна станція SLS-2. Дослід був поставлений на статевозрілих щурах лінії Sprague-Dawley (самці, середня вага тварин - 250 г) в рамках міжнародного співробітництва спільно з російськими та американськими вченими на борту американської космічної станції SLS-2. Тривалість польоту 2 тижні. Тварини були розділені на дві групи (по 5 особин у кожній). Перша група - польотна, друга група - наземний синхронний контроль. Тварини з групи синхронного контролю знаходилися на Землі в аналогічних контейнерах та умовах, що і щури в космічному апараті.

Біосупутник "БІОН-11". Космічний експеримент (тривалістю 14 діб) був проведений в рамках міжнародного співробітництва спільно з російськими вченими на нелюдиноподібних мавпах (Macaca mulatta). Перша група тварин - польотна (2 особини). До групи наземного синхронного контролю (мавпи сиділи у кріслах) входили 3 особини.

По закінченні експериментів зразки кісткової тканини із метафізів стегнових кісток білих щурів (SLS-2) та з гребеню клубової кістки мавп, взятих методом біопсії ("БІОН-11") були надані відділу цитології і гістогенезу проф. В. С. Огановим (ДНЦ - Інститут медико-біологічних проблем, РАН, Москва). Для дослідження змін в ультраструктурі остеокластів при дії факторів космічного польоту використано матеріали (епоксидні блоки з біозразками кістки, негативи і електронні мікрофотографії) із фондів відділу цитології та гістогенезу.

Методи дослідження. Гістологічні методики. По закінченні експериментів із модельованої гіпокінезії у щурів було вичленовано довгі кістки, які фіксували у 10% нейтральному формаліні 2-3 тижні, декальцинували у трилоні Б (рН - 7,4) 2,5 місяці, зневоднювали у спиртах зростаючої концентрації (70є, 80є, 96є), потім - у суміші абсолютного спирту і ксилолу (1:1). Після цього біозразки просвітлювали у ксилолі та у суміші ксилолу й парафіну і заключали у парафін. З кісток у сагітальній площині на одному рівні виготовляли гістозрізи (8-10 мкм) на мікротомі марки Reichert (Aвстрія) та зафарбовували гематоксилін-тіонін-еозіном і гематоксилін-азур2-еозіном [Мажуга, Вечерская, 1974, в нашій модифікації]. Використовували реактиви фірми "Amersham", Австрія.

Радіоавтографія. Для вивчення динаміки утворення остеокластів при модельованій гіпокінезії нами застосовано метод радіоавтографії з ³Н-тімідіном. Цей метод дає можливість дослідити проліферативну активність клітин і динаміку клітинних популяцій [Епифанова, Терских, Полуновский, 1983, та ін.]. ³Н-тімідін ("Amersham", Австрія) однократно інтраперітонеально вводили білим щурам за 3 дні до закінчення першого експерименту в дозі 0,5 мкKu/г маси тіла. Стегнові кістки вичленовували через 1 год., 48 год., 72 год. після введення ізотопу, фіксували в 10% нейтральному формаліні, обробляли за вищеописаною методикою та заключали в парафін. На гістозрізи наносили дрібнозернисту фотоемульсію типу "М" (Московський завод фотопластин). Гісторадіоавтографи експонували (14 діб) у холодильнику, після експонування проявляли за методикою [Епифанова, Терских, Полуновский, 1983] і зафарбовували гематоксиліном Майера-еозіном. На гістоавтографах підраховували індекс мічених ядер в остеокластах (на 100 ядер) та інтенсивність мічення ядер (кількість зерен срібла) в проксимальних метафізах стегнових кісток в досліді та контролі.

Електронна мікроскопія. Біозразки кісткової тканини (?1 мм³) фіксували у 2,5 % розчині глютаральдегіду на фосфатному буфері (рН 7,2-7,4), дофіксовували у 1 % осмієвій кислоті на фосфатному буфері, зневоднювали у спиртах та заключали у аралдит ("Sigma", Німеччина). Активність кислої фосфатази виявляли за методом Гоморі в модифікації [Бухвалов, 1982]. Ультратонкі зрізи виготовляли скляними ножами на ультрамікротомі "УМТП-5". З епоксидних блоків зі зразками кістки виготовляли напівтонкі зрізи (1-2 мкм), які зафарбовували метиленовим синім з метою виявлення в них остеокластів. Контрастування ультратонких зрізів проводилося цитратом свинцю за методикою [Venable et al., 1965]. Зрізи вивчали та фотографували в електронному мікроскопі "Тесла ВС-500".

Методика морфометричного аналізу. На гістопрепаратах стегнових кісток від кожного щура підрахунки здійснювалися на 50 зрізах. На кожному зрізі в зонах, що досліджувались (проксимальні та дистальні епіфізи та метафізи, періост, ендост і судинні канали діафізу) на трьох полях зору методом точкового підрахунку [Автанділов, 1991] на еквівалентних площинах зрізу при збільшенні об.Х25, ок.Х12,5 підраховували наступні показники: відносний питомий об`єм кісткових трабекул в епіфізах і метафізах та в кістковій тканині середньої частини діафізу, питому площу щілин і порожнин, а також судинних каналів у діафізах. Крім того, визначали: кількість остеокластів на кісткових трабекулах епіфізів і метафізів, а також у періості, ендості та судинних каналах діафізу, кількість ядер в остеокластах на гістозрізі, питому та абсолютну площу остеокластів. Використовували комп`ютерну систему аналізу зображень для світлових мікроскопів із цифровою камерою Canon PowerShot і програму "Biowizard".

На гістоавтографах мінімальна кількість зерен срібла, при якій ядра остеокластів вважали міченими, складала 4 зерна, максимальна для підрахунку - 40 зерен. Інтенсивність мічення підраховували в 100 ядрах остеокластів, а також аналізували розподіл ядер за кількістю міток у різні строки досліду.

Електронні мікрофотографії сканувалися на сканері НР ScanJet 3570C. Методом точкового підрахунку [Автандiлов, 1991] визначався відносний питомий об`єм клітинних органел за допомогою програми "Photoshop- 6.0".

Статистичний аналіз одержаних результатів із гістологічних, гісторадіоавтографічних та електроно-мікроскопічних досліджень проведений з використанням програми EXCEL, а також "Statistica 6".

Основні результати досліджень.

Гістоструктурні перебудови в стегнових кістках щурів при модельованій гіпокінезії. Вивчені зміни в гістоструктурі проксимальних і дистальних епіфізів і метафізів, а також у кістковій тканині діафізів. У кісткових трабекулах проксимальних і дистальних епіфізів дослідних тварин виявлені зміни в архітектоніці з ознаками деструктивного характеру. В кістковій тканині трабекул спостерігаються вузькі щілини, овальні або видовжені порожнини, часткове руйнування трабекул. Ці порушення гістоструктури орієнтовані в різних напрямах відносно поздовжньої вісі кістки. Морфометричний аналіз показав, що в проксимальних епіфізах деструктивні зміни кісткової тканини в дослідних тварин виражені сильніше, ніж у дистальних. Так, у проксимальних епіфізах питомий об`єм кісткових трабекул знижується на 22,7% (0,531+0,02 в контролі та 0,410+0,022 в досліді, Р<0,05), в дистальних - на 17,6% (0,51+0,017 в контролі та 0,42+0,021 в досліді, Р<0,05).

Як в проксимальних, так і дистальних метафізах спостерігаються зміни в гістоструктурі кісткової тканини порівняно з контролем. Структура метафізів стає крупно-ячеїстою, порушується типова архітектоніка кісткових трабекул. Деякі трабекули пронизані вузькими щілинами, мають розриви та широкі видовжені порожнини. Питомий об`єм кісткових трабекул у проксимальному метафізі порівняно з контролем зменшується на 24,07% (0,540+0,026 в контролі та 0,41+0,017 в досліді, Р<0,05), в дистальному метафізі - на 18,3% (0,541+0,024 в контролі та 0,44+0,02 у досліді, Р<0,05). Таким чином, при опорному розвантаженні, найістотніші зміни в гістоструктурі реєструються в проксимальних метафізах. В епіфізах подібні зміни менші, ніж у метафізах, але й тут у проксимальних епіфізах ці зміни суттєвіші, ніж у дистальних.

Проведений нами морфометричний аналіз кісткової тканини діафізів показав, що питомий об`єм кісткової тканини в діафізах вірогідно не відрізняється від контролю, але виявляються локальні порушення гістоструктури внаслідок появи щілин і порожнин. Так, питома площа порожнин і щілин у кістковій тканині діафізів в досліді збільшується на 9,3% порівняно з контролем. Виявлені зміни вказують на втрату кісткової тканини в стегнових кістках в умовах модельованої гіпокінезії.

Зміни в популяції остеокластів у зонах резорбції. Підраховували середню кількість остеокластів на умовну одиницю гістозрізу в епіфізах і метафізах у досліді порівняно з контролем.

Показано, що найсуттєвіше цей показник зростає у проксимальних метафізах (на 20,6%) (2,3+0,080 в контролі та 2,9+0,012 в досліді, Р<0,05), в дистальних метафізах - на 15 % (2,1+0,09 в контролі та 2,4+0,11 в досліді, Р<0,05), в проксимальних епіфізах - на 13,7% (2,33+0,11 в контролі та 2,7+0,13 в досліді, P<0,05) і в дистальних епіфізах - на 12% (2,2+0,09 в контролі та 2,5+0,1 в досліді, P<0,05). Підрахунки функціонально-активних остеокластів у популяції в різних ділянках кістки показали, що в проксимальних метафізах частка функціонально-активних остеокластів зростає в досліді порівняно з контролем приблизно на 16%, в дистальних метафізах - на 12%, в проксимальних епіфізах - на 10% і в дистальних епіфізах - на 7%. В діафізах середня кількість остеокластів на умовну одиницю гістозріза в періості зростає порівняно з контролем на 9,7%. Кількість функціонально активних остеокластів в популяції зростає в періості порівняно з контролем на 7%. В ендості та судинних каналах зміни кількості остеокластів не є вірогідними.

Результати підрахунків середньої кількості ядер в остеокластах на гістозрізі показали: в досліді порівняно з контролем в остеокластах є тенденція до зростання цього показника в усіх ділянках кістки, але найсуттєвіше - в проксимальних метафізах (на 8,2%). Так, в проксимальному метафізі середня кількість ядер в остеокластах на гістозрізі в контролі та досліді становила відповідно 7,36+0,31 і 8,02+0,38 (Р<0,05). В дистальних метафізах середня кількість ядер в остеокластах на гістозрізі в досліді збільшується на 5,6% порівняно з контролем. В проксимальних епіфізах цей показник зростає на 5,2% і в дистальних епіфізах - на 3,7% .

В діафізах середня кількість ядер в остеокластах періосту збільшується, в ендості та судинних каналах зміни не є вірогідними порівняно з контролем.

Морфометричний аналіз показав, що середня питома площа остеокластів збільшується в усіх ділянках кістки порівняно з контролем. Однак, найсуттєвіших змін цей показник зазнає у проксимальних метафізах, де він зростає на 4%, в дистальних метафізах середня питома площа остеокластів збільшується на 3,4%, в проксимальних епіфізах - на 3% і в дистальних епіфізах - на 2,8%. У періості діафізів питома площа остеокластів зростає на 3,2%. В ендості та судинних каналах різниця між контролем та дослідом не є вірогідною. Така ж тенденція спостерігається при підрахунках реальної площі остеокластів.

Одержані нами результати про зниження питомого об'єму кісткової тканини та зростання кількості функціонально-активних остеокластів в метафізах і епіфізах при гіпокінезії корелюють з даними [Дурнова та ін., 1994; Mattew et al., 2003 та ін.].

Динаміка утворення остеокластів у зонах резорбції кісткової тканини при модельованій гіпокінезії (за даними радіоавтографії з ³Н-тімідіном). Для з`ясування питання - чи мають місце особливості в утворенні остеокластів при зниженні опорного навантаження на кісткову тканину, нами проведено дослідження з <sup>3</sup>Н-тимідіном. У метафізах стегнових кісток задніх кінцівок щурів за умов модельованої гіпокінезії мітка <sup>3</sup>Н-тімідіну в ядрах остеокластів через 1 годину після введення радіонукліда як у досліді, так і в контролі не реєструється. Це відбувається тому, що в ядрах остеокластів ДНК не синтезується. Мічені ядра в остеокластах з`являються в результаті приєднання мічених клітин-попередників [Addison, 1980 та ін.]. За даними Родіонової Н. В. (1989), вони включаються в склад остеокластів протягом 14 годин після однократного введення радіонукліду.

До 48 годин в остеокластах спостерігається зростання кількості мічених ядер: індекси мічення ядер у досліді та в контролі дорівнюють 16,8 + 0,8% і 12,3 + 0,6% відповідно, Р<0,05. Результати підрахунків засвідчують, що в остеокластах дослідних тварин зростання кількості мічених ядер відбувається в більшому ступені, ніж в остеокластах у контрольних тварин. Ми припускаємо, що це вказує на прискорення формування остеокластів в умовах модельованої гіпокінезії.

Цей процес продовжується до 72 годин, оскільки індекси мічення ядер в остеокластах зростають і складають: 22,3 + 1,0% у досліді та 17,2 + 0,8% у контролі, Р<0,05.

Для з'ясування змін в інтенсивності проліферації клітин-попередників остеокластів в умовах експериментальної гіпокінезії порівняно з контролем, ми підраховували середню інтенсивність мічення ядер в остеокластах в експозиціях 48 годин і 72 годин. В експозиції 48 годин досліду середня інтенсивність мічення ядер остеокластів у досліді складала 24,8+0,9 зерен срібла, до 72 годин вона знижувалась до 7,1+0,3 зерен, (тобто ? у 3,1 рази). В контролі інтенсивність мічення ядер в остеокластах складала: в експозиції 48 годин - 25,5 + 1,2 зерен. До 72 годин інтенсивність мічення ядер в остеокластах знизилась до 12,1+ 0,6 зерен (тобто у 2,2 рази).

Результати вивчення розподілу ядер в остеокластах за кількістю зерен срібла до 48 і 72 годин засвідчують, що в ці строки популяція мічених клітин-попередників перед тим, як увійти до складу остеокластів, поділилася 1-2 рази (контроль) та 2-3 рази (дослід). В остеокластах до 72 годин реєструються й інтенсивно мічені ядра, що з`явилися після першого поділу.

Наші дані показують, що в умовах гіпокінезії відбувається більш швидке ніж у контролі "розведення мітки” в ядрах остеокластів. Можна вважати, що це відображає активізацію процесів утворення остеокластів, а також посилення функціональної активності вже існуючих остеокластів внаслідок приєднання нових клітин-попередників. Одержані нами дані корелюють з результатами досліджень Grano et al. (2002) на культурах остеокластів, в яких показано, що розвантаження індукує та посилює остеокластогенез і функціональну активність остеокластів.

Ультраструктурна характеристика остеокластів у зонах резорбції кісткової тканини щурів при модельованій гіпокінезії. Електронно-мікроскопічні дослідження остеокластів у проксимальних метафізах стегнових кісток білих щурів, які перебували протягом 28 діб в умовах модельованої гіпокінезії показали, що в досліді, як і в контролі, ядра функціонально-активних остеокластів характеризуються поліморфізмом і відрізняються за ступенем конденсації хроматину, конгломерати якого локалізуються по всьому ядру та його периферії. В клітинах помітно збільшується кількість ядер із низьким ступенем гетерохроматизації ("молоді ядра"). Ядерця великі, рихлі. Мітохондрії мають щільніший матрикс, близько розташовані кристи. Помітної різниці в ультраструктурі ядер і ядерець між контролем і дослідом нами не виявлено. Морфометричний аналіз клітинних органел в остеокластах при гіпокінезії порівняно з контролем показав вірогідну відмінність у ступені розвитку структур комплексу Гольджі: так, питомий об`єм комплексу Гольджі в контролі складає 0,170+0,008, в досліді - 0,212+0,010 (Р<0,05). Основні відмінності стосуються ступеня розвитку структур, які забезпечують специфічні функції остеокластів (зони 2): в остеокластах дослідної групи більш виражений фібрилярний шар, збільшується питомий об`єм фаголізосом (0,234+0,016 в контролі та 0,310+0,015 в досліді, Р<0,05), істотніше розвинена "щіточна облямівка". Фаголізосоми, серед яких зустрічаються великі (1-5 мкм), мають електронно-світлий вміст із конгломератами мінералізованого кісткового матриксу, що резорбується. Електронно-мікроскопічні дані дозволяють припустити, що в умовах гіпокінезії в зонах резорбції функціональна активність остеокластів посилюється.

Особливості ультраструктури остеокластів в зонах резорбції кісткової тканини щурів в умовах космічного польоту (SLS-2). У біозразках кісткової тканини, що були одержані з проксимальних метафізів стегнових кісток білих щурів польотної групи і синхронного контролю в зонах резорбції зареєстровано функціонально-активні остеокласти. Найістотніші відмінності ультраструктури остеокластів у досліді стосуються ступеня розвитку зони 2. Так, в більшості остеокластів польотної групи ця зона включає інтенсивніше розвинений фібрилярний шар, ширшу ділянку, що містить фаголізосоми і "щіточну облямівку". Питомий об`єм фаголізосом у досліді вірогідно збільшується: у контролі він становить 0,225+0,011, а в досліді - 0,269+0,013, Р<0,05. Однак, в умовах мікрогравітації розміри фаголізосом зменшуються, їх діаметр на зрізах варіює від 0,5 до 1 мкм.

У зонах ремоделювання при мікрогравітації в популяції остеокластів зустрічаються "гігантські" функціонально-активні остеокласти із сильно розвиненою клітинною периферією: фібрилярний шар, фаголізосоми, "щіточна облямівка" охоплюють значну поверхню мінералізованого кісткового матриксу, тобто мають більш об`ємні, ніж у типових остеокластах, зони резорбції. В "гігантських" остеокластах у дослідних тварин зона 2, яка забезпечує специфічні функції резорбції мінералізованого кісткового матриксу за своїми розмірами (на ультратонких зрізах) займає площу в 1-1,5 рази більшу, ніж зона 2 у типових функціонально-активних остеокластах. При цьому в зоні 2 превалюють дрібні вакуолі (0,5-1 мк), великі фаголізосоми не виявляються, "щіточна облямівка" утворена короткими чисельними виростами.

Ультраструктурні особливості остеокластів нелюдиноподібних мавп (Macaca mulatta) за умов мікрогравітації ("БІОН-11"). У кісткових біозразках гребеня клубової кістки від польотної групи тварин (№ 357, № 484) в зонах ремоделювання виявлено типові функціонально-активні остеокласти, а також "гігантські" остеокласти, близькі за ультраструктурою до таких, що були описані вище. Мітохондрії в остеокластах мають щільніший, порівняно з контролем, матрикс, близько розташовані кристи. Гранулярна ендоплазматична сітка набуває виду розрізнених вузьких каналів. У досліді питомий об`єм фаголізосом зростає в обох тварин порівняно з контролем. Якщо в дослідної тварини №357 цей показник складає 0,327+0,016, то у контрольної тварини (№501) - 0,257+0,012, Р<0,05. У тварин №484 (дослід) та №534 (контроль) питомий об`єм фаголізосом становить відповідно 0,340+0,017 і 0,214+0,011, Р<0,05. “Гігантські” остеокласти, на ультратонких зрізах демонструють наявність 5-8 ядер, розвиненіші, ніж у типових функціонально-активних остеокластах фібрилярний шар і “щіточну облямівку”, велику кількість фаголізосом, розмірами 0,5-1 мкм.

Ультраструктурні характеристики та результати морфометричного аналізу "гігантських" остеокластів із космічних дослідів на SLS-2 та "БІОН-11", зокрема, більший ступінь розвитку структур, які забезпечують функції резорбції, засвідчують їх підвищену функціональну активність. Особливості будови зони 2 в остеокластах, зокрема, відсутність великих фаголізосом, відображають структурну специфіку резорбтивного процесу в остеокластах при мікрогравітації: резорбція здійснюється дрібними порціями", але в ширших масштабах.

Морфологічні взаємовідносини остеокластів із клітинами в зонах резорбції при зниженому опорному навантаженні. З використанням електронної мікроскопії у зонах резорбції кісткової тканини виявлено комплементарні цитоплазматичні контакти остеокластів зі стромальними клітинами, преостеобластами та остеобластами. Встановлено, що в процесі ремоделювання остеокласти та остеобласти взаємодіють за допомогою цитокінів, а остеобласти продукують фактори, що стимулюють функціональну активність остеокластів [Matsumada et al., 1999; Daci et al., 2002; Helfrick, 2001]. Аналіз електронних мікрофотографій показав, що при зниженні опорного навантаження, коли, як показано вище, резорбтивні процеси посилюються, контакти остеокластів з остеобластами як і в контролі не призводять до деструкції останніх. Провідна роль в утилізації остеобластів у зонах резорбції належить макрофагам [Rodionova, Polkovenko, Oganov, 2004]. В локусах зняття опорного навантаження остеокласти у процесі резорбції мінералізованого кісткового матриксу проникають в остеоцитарні лакуни та контактують з остеоцитами. Наші електронно-мікроскопічні дослідження не показали участі остеокластів у деструкції остеоцитів; у зонах резорбції остеоцити залишаються інтактними чи піддаються пікнозу.

Розвиток і морфогенез кісткового скелету, підтримання структурно-функціонального гомеостазу, процеси фізіологічного і адаптивного ремоделювання кісткових структур забезпечуються взаємодією системних (гормони) і локальних факторів. До локальних факторів відносять ростові фактори (ТФРв, ФРФ, ТцФР та ін.), простагландіни, неколагенові білки (остеокальцин, остеонектин та ін.), цитокіни тощо.

На сьогодні все більше підтвердження знаходить точка зору, що первинна реакція на зміну механічного навантаження опосередкована локальними (тканинними) факторами і прямою участю в цих процесах клітин кісткової тканини [Klein-Nulend, 2003 та ін.]. Експериментальні дані засвідчують, що остеоцити є механосенсорними клітинами, першими сприймають механічні сигнали в кістковій тканині [Нakeda et al., 2001; Klein-Nulend, 2000 та ін.]. Наступним етапом є остеоцитарне ремоделювання - інтенсифікація процесів остеолізу, що призводить до збільшення об`єму остеоцитарних лакун і видаленню "зайвої" кістки [Rodionova, Oganov, Zolotova, 2002]. При тривалому знятті опорного навантаження механічні сигнали через систему канальців і відростків остеоцитарного синцитію потрапляють у певні поверхневі зони кістки і сприймаються остеобластами, вистільними клітинами, а також клітинами кістково-мозкової строми, в першу чергу тими, що знаходяться на кісткових поверхнях [Родіонова, Оганов, 2006]. Неодноразово показана чутливість стромальних клітин кісткового мозку, преостеобластів і остеобластів до змін механічного навантаження, в тому числі в умовах мікрогравітації [Bierkens et al., 1994; Vico et al., 1998]. Як реакція на одержаний механічний стимул (наприклад мікрогравітація) в системі стромальні клітини - преостеобласти - остеобласти уповільнюються проліферація, диференціювання і специфічне функціонування остеогенних клітин, що підтверджується дослідженнями з використанням ³Н-тімідіну [Родіонова, Золотова, Ніцевич, 2004].

Якщо локальне розвантаження перевищує фізіологічні можливості остеоцитів, вони піддаються апоптозу. Встановлено, що в процесах адаптивного ремоделювання остеоцитарний апоптоз діє як "сигнальний механізм" для "направлення" остеокластів у зону резорбції [Mosley et al., 2000; Velborgt et al., 2000; Zhao Zhang et al., 2002].

Проведені нами дослідження засвідчують, що за умов тривалої гіпoкінезії в стегнових кістках щурів в зонах адаптивного ремоделювання кісткової тканини активізується остеокластогенез, збільшується кількість остеокластів, в тому числі функціонально-активних форм. Найістотніше це виражено в губчастій кістці проксимальних і дистальних метафізів. Електронно-мікроскопічні дослідження підтвердили посилення функціональної активності остеокластів, наявність "гігантських" остеокластів в популяції при модельованій гіпокінезії і особливо за умов мікрогравітації.

Враховуючи вищевказані дані літератури, наші результати дають змогу вважати, що збільшення кількості остеокластів і їх функціональна активізація обумовлені розгортанням остеоцитарного апоптоза в локусах зняття механічного навантаження при гіпокінезії і мікрогравітації в ширших масштабах, ніж це має місце за умов фізіологічного ремоделювання. Збільшення кількості апоптозних остеоцитів та наявність порожніх остеоцитарних лакун в кістковій тканині показано в аналогічних експериментах з моделюванням гіпокінезії [Золотова, Полковенко, Кабицкая, 2002] та за умов мікрогравітації ("БІОН-11") в клубовій кістці мавп [Rodionova, Oganov, Zolotova, 2002].

У лакуни резорбції за остеокластами потрапляють макрофаги, які утилізують органічний матрикс та клітинний детрит. Продукти деполімеризації секретуються в зони перебудови і є хемоаттрактантами для "залучення" і подальшого диференціювання тут стромальних клітин і остеогенних клітин [Фрейдлин, 1978; Rodionova, Oganov, Polkovenko, 2004]. Це розглядається як відновлювальна стадія в процесах адаптивного ремоделювання.

Чисельні дослідження [Rubin, 2000; Rodionova, Oganov, Polkovenko, 2002; Teerasak, 2004] показують, що при зменшенні механічних стимулів (гіпокінезія, тривала іммобілізація, мікрогравітація тощо) остеобластогенез не активізується, або відбувається в менших масштабах. Таким чином повноцінного відновлення резорбованої кісткової тканини не відбувається. Така послідовність процесів є одним з механізмів втрати кісткової маси, що призводить до розвитку остеопенії і остеопорозу при дефіциті опорного навантаження.

Висновки

В дисертації представлені дані про особливості остеокластичної резорбції кісткової тканини у ссавців при зниженні опорного навантаження на задні кінцівки (модельована гіпокінезія) і за умов мікрогравітації - американська космічна станція SLS-2, біосупутник "БІОН-11".

1. В умовах зниження опорного навантаження ( модельована гіпокінезія) в стегнових кістках білих щурів відбувається низка адаптивних і деструктивних перебудов. Встановлено зменшення питомого об`єму кісткових трабекул, що найбільше виражено у проксимальних метафізах і епіфізах, причому в метафізах у більшому ступені, ніж в епіфізах. Зменшення питомого об`єму відбувається за рахунок часткової деструкції трабекул, а також через появу в них щілин і порожнин. У діафізі стегнових кісток вірогідного зменшення об`єму кісткової тканини не виявлено, але реєструються локальні ділянки остеокластичної резорбції з боку періосту.

2. В губчастій тканині епіфізів і метафізів відбувається зростання кількості остеокластів, в тому числі функціонально-активних, на умовну одиницю площі кісткової тканини. В остеокластах зростає кількість ядер та збільшується питома площа клітин, що засвідчує посилення їх функціональної активності. Найбільше це виражено у проксимальних метафізах і епіфізах. В діафізах кількість остеокластів вірогідно збільшується тільки на періостальній поверхні кістки.

3. Вивчення з використанням ³Н-тімідіну динаміки мічення ядер в остеокластах проксимальних метафізів показало, що мічені ядра в остеокластах з`являються впродовж 72 годин внаслідок приєднання мічених ДНК-синтезувальних мононуклеарних клітин-попередників. При гіпокінезії має місце тенденція до збільшення кількості мічених ядер в остеокластах та більш швидкого "розведення" в них мітки. Це засвідчує прискорення формування остеокластів шляхом злиття та приєднання мононуклеарних клітин-попередників, які діляться.

4. Електронно-мікроскопічні дослідження показали, що в умовах гіпокінезії в остеокластах метафізів спостерігаються ультраструктурні зміни, які засвідчують посилення їх функціональної активності порівняно з контролем. Має місце збільшення питомого об`єму комплексу Гольджі і структур, які забезпечують специфічні функції резорбції: фібрилярного шару, фаголізосом, “щіточної облямівки”.

5. В умовах мікрогравітації в популяції остеокластів виявлено “гігантські” остеокласти, що демонструють підвищену функціональну активність. Порівняно з типовими функціонально-активними остеокластами, в “гігантських” остеокластах спостерігається більший ступінь розвитку зони специфічного функціонування: значне збільшення питомого об`єму фібрилярного шару, фаголізосом, “щіточної облямівки”. Превалювання фаголізосом невеликих розмірів (0,5-1 мкм в діаметрі) відображає структурну специфіку резорбтивної функції остеокластів при мікрогравітації.

6. Результати досліджень доводять, що в умовах зниження опорного навантаження (гіпокінезія і мікрогравітація) остеокластам належить значна роль у втраті кісткової тканини у зонах адаптивного ремоделювання кісткових структур. В умовах мікрогравітації - максимального зняття опорного навантаження на кістковий скелет - процеси остеокластичної резорбції виражені значніше, ніж при гіпокінезії.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ РОБІТ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1.N.V. Rodionova, V.S. Oganov, O.V. Polkovenko. Mechanisms of gravity-dependent changes in the bone tissue J. of Gravit. Phys., 2002, 9 (1), P. 169-170. Здобувачем проведений: підбір літератури, участь у аналізі електронограм, підготовка статті до друку.

2.Rodionova N.V., Polkovenko O.V., Oganov V.S. Interactions of cells in zones of bone resorption under microgravity and hypokinesia. J. of Gravit. Physiol., 2004, 11(2), P. 147-151. Автором проведений: підбір літератури, участь у аналізі електронограм, підготовка статті до друку.

3.Полковенко О.В. Динаміка утворення остеокластів при модельованій гіпокінезії за даними радіоавтографії з ³Н-тімідіном. Український морфологічний альманах, 2005, 3(1), С.92-93.

4.Полковенко О.В. Усиление деятельности остеокластов у крыс в условиях дефицита опорной нагрузки. ІІ Українська конференція з перспективних космічних досліджень. Космічна наука і технологія, 2003, 2 (9), С. 463-466.

5.Н.В. Родионова, О.В. Полковенко. Особенности резорбции костной ткани в условиях снижения опорной нагрузки. Український медичний альманах, 2002, т.5,№2,с.179-180. Здобувачем проведений підбір літератури, участь в експерименті та обробці біоматеріалу, аналізі гістопрепаратів.

6.Полковенко О.В. Особенности резорбции костной ткани остеобластами при микрогравитации и гипокинезии. Материалы симпозиума "Биология опорно-двигательного аппарата", 2004, С. 199-202.

7.Н.В. Родионова, В.С. Оганов, Г.Р. Дурнова, О.В. Полковенко. Механизмы резорбции костной ткани в условиях гипокинезии и микрогравитации. Материалы XII конференции по космической биологии и авиакосмической медицине (Россия, Москва), 2002, с.256-257. Здобувачем проведений підбір літератури, участь у науковому аналізі результатів.

8.Н.В. Родіонова, О.В. Полковенко, В.С. Оганов, М.А. Ісламовa. Резорбтивні процеси в кістковій тканині в умовах мікрогравітації. Наукові праці III Національного Конгресу АГЕТ України, 2002. с. 253-254. Здобувач брав участь у науковому аналізі результатів.

9.Родионова Н.В., Оганов В.С., Полковенко О.В., Золотова-Гайдамака Н.В. Взаимодействие клеток в зонах резорбции костной ткани при снижении опорной нагрузки. Материалы конференции "Организм и окружающая среда: адаптация к экстремальным условиям" (Россия, Москва), 2003, с. 299-300. Здобувачем проведений підбір літератури, участь у виготовленні електронограм і науковому аналізі результатів.

10.Полковенко О.В. Усиление остеокластической резорбции костной ткани в условиях сниженной опорной нагрузки. Сборник тезисов II Украинской Конференции по перспективным космическим исследованиям, 2002, с. 174.

11.Золотова-Гайдамака Н.В., Полковенко О.В., Кабицкая О.Е. Состояние остеоцитов костной ткани в условиях сниженной опорной нагрузки. Материалы XII конференции по космической биологии и авиакосмической медицине, 2002, с. 155-156. Здобувачем проведений підбір літератури, участь в обробці біоматеріалу, аналізі електронограм, науковому аналізі результатів.

12.N.V. Rodionova, V.S. Oganov, O.V. Polkovenko. Cellular mechanisms of gravity-dependent changes in the bone tissue. Proceedings of the European Symposium on "Life in Space for Life on Earth", Stockholm, Sweden, 2002, P. 72-73. Здобувачем проведений підбір літератури, участь у аналізі одержаних даних, підготовка до друку.

13.Rodionova N.V., Polkovenko O.V., Oganov V.S. The ways of resorption of mineralized bone matrix under hypokinesia and microgravity. 35th COSPAR scientific assembly, Paris, 2004. Electronic issue of abstracts. Здобувачем проведений підбір літератури, участь у аналізі одержаних даних, підготовка до друку.

14.Полковенко О.В., Нестеренко О.Н., Исламова М.А. Развитие и функциональная активность остеобластов и остеокластoв при моделированной гипокинезии. Космическая биология и авиакосмическая медицина. ХІІІ конференция. Материалы конференции, 2006. с.246-247. Здобувачем проведений підбір літератури, аналіз даних стосовно остеокластів.

Размещено на Allbest.ru