Структурні компоненти вірусу плямистості аїру та його біологічні властивості

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Структурні компоненти вірусу плямистості аїру та його біологічні властивості

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Вперше вивчено новий бациловидний вірус плямистості аїру (ВПА, Sweet spotflag virus - SSV), який за своїми біологічними та фізико-хімічними властивостями належить до родини рабдовірусів. Родина Rhabdoviridae включає в себе представників, які є надзвичайно розповсюдженими у навколишньому світі і вражають рослин, комах, риб та ссавців [Hogenhout S.A., 2003]. Але, незважаючи на такий широкий діапазон різноманітних господарів, рабдовіруси є схожими за своєю структурною організацією та функціональною активністю структурних компонентів. Віріони рабдовірусів мають бациловидну або кулевидну форму. Геном рабдовірусів представлений одноланцюговою РНК негативної полярності. Структурні білки рабдовірусів поділяють на нуклеокапсидні (N, P і L), глікопротеїни (G) та мембранні (М). Окрім білків у своїй структурі вони містять ліпіди та вуглеводи.

Всебічне вивчення окремих компонентів вірусів викликає значний інтерес у різних аспектах. Перед усім це необхідно для розуміння механізму взаємодії вірус-клітина, для з'ясування ролі кожного з компонентів вірусу в процесах інфікування клітини та його реплікації, а також його антигенності та мінливості.

В адгезії віріонів з клітиною приймає участь глікопротеїн G оболонки віріона. Глікопротеїн має вуглеводний компонент, який складає близько 3% від маси вірусної частинки. На поверхні вірусної частинки глікопротеїн формує пепломери і саме вони зв'язуються з рецепторами клітин господарів. Глікопротеїни відповідають за адсорбцію вірусу на поверхні клітини, гемоліз клітинної мембрани, її адгезію з оболонкою вірусу, проникнення усередину клітини і відповідно за інфікування організму. Саме властивості вуглеводів визначають коло господарів рабдовірусів. Виходячи з того, що це коло є дуже різноманітним, вважається, що рецептори для прикріплення рабдовірусів мають подібну структуру, яку важко ідентифікувати [Redinbaugh M.G., 2005]. Вірусний глікопротеїн також приймає участь у транспорті та субклітинній локалізації синтезу вірусних макромолекул. Тому вивчення вуглеводів як складових компонентів глікопротеїну становить значний інтерес. Під глікопротеїновою оболонкою віріонів рабдовірусів розміщена біліпідна оболонка. Ліпіди відіграють важливу роль у морфогенезі вірусів. Вони формують подвійну оболонку вірусу і складають близько 20-25% від маси віріона. Біліпідна оболонка пронизана поліпептидами M, а також взаємодіє з глікопротеїном. Ліпідний склад фіторабдовірусів та зоорабдовірусів має як схожі елементи, так і певні відмінності, що пояснюється різною будовою рослинної та тваринної клітини, де розмножується вірус. Тому порівняльне вивчення ліпідного складу дає можливість детально розглянути особливості структури рабдовірусів.

Усередині віріона знаходиться нуклеокапсид, який формується з геномної РНК та зв'язаними з нею білками N, P та L, забезпечуючи експресію вірусного генома. Оскільки вірусна РНК не може самостійно з нею реплікуватись, то роль РНК-полімерази виконує білок L, який знаходиться у віріоні.

Важливість порівняльного вивчення структурних компонентів вірусів рослин та вірусів хребетних полягає в необхідності встановлення закономірностей, властивих для цих вірусів, що пов'язано з фундаментальними задачами вірусології стосовно дослідження еволюції рабдовірусів, а також у пошуку модельного об'єкта для вирішення практичних завдань.

Для вивчення загальних характеристик рабдовірусів, їх білкового, вуглеводного та ліпідного складу, з'ясування механізмів репродукції рабдовірусів в еукаріотичній клітині, особливостей широкого кола господарів, характерного для більшості рабдовірусів, як модель найчастіше використовують вірус везикулярного стоматиту (ВВС), який вражає людину та тварин.

Тому порівняльне дослідження біологічних, фізико-хімічних та імунологічних особливостей бациловидного вірусу плямистості аїру та зоорабдовірусу везикулярного стоматиту представляє значний науковий інтерес та є актуальним.

Зв'язок роботи з науковими програмами. Дисертаційна робота виконана згідно планів комплексної теми відділу проблем інтерферону та імуномодуляторів Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України «Вивчення геноміки та протеоміки мікроорганізмів для створення штамів-пробіотиків, продуцентів лікарських засобів, агробіопрепаратів; дослідження структурно-функціональної організації вірусних геномів та автономних генетичних елементів» підрозділу «Використання глікопротеїнів зоо - та фіторабдовірусів в якості ініціаторів апоптозу трансформованих клітин тварин», державний реєстраційний номер 0107U011129 (роки 2007-2011).

Мета і завдання дослідження. Метою роботи є встановлення біологічних та фізико-хімічних властивостей структурних компонентів фітопатогеного вірусу, що викликає плямистість аїру (вірус плямистості аїру). Для досягнення поставленої мети виконувалися такі завдання:

1. Визначити морфологічні особливості вірусу плямистості аїру.

2. Вивчити білковий, ліпідний та вуглеводний склад вірусу плямистості аїру.

3. Ідентифікувати глікопротеїн серед білків вірусу плямистості аїру та дослідити його різноманітні властивості.

4. Провести порівняльні імунохімічні дослідження структурних білків і вуглеводів вірусу плямистості аїру та зоорабдовірусу вірусу везикулярного стоматиту.

5. Вивчити біологічні властивості вірусу плямистості аїру.

Об'єкт дослідження - фітопатогенний вірус плямистості аїру.

Предмет дослідження - структурні компоненти фітопатогенного вірусу плямистості аїру.

Методи дослідження - для виконання поставлених завдань використовували вірусологічні, імунологічні, молекулярно-біологічні та методи статистичної обробки результатів.

Наукова новизна одержаних результатів. Робота присвячена вирішенню важливого наукового завдання - встановленню біологічних, імунологічних та фізико-хімічних властивостей структурних компонентів нового фітопатогеного рабдовірусу - ВПА, вперше знайденого нами на рослинах аїру в Київській області, що розширює знання про загальні властивості цього патогену, структуру і морфологію його віріонів.

Встановлено, що ВПА має бациловидну форму з розмірами віріону 110-130 Ч 45 нм. Вірус містить одноланцюгову РНК негативної полярності з молекулярною вагою 6 тис. нуклеотидів, п'ять структурних білків. Доведено, що серед структурних білків ВПА є лектини. Визначено якісний і кількісний склад ліпідів та вуглеводів ВПА. Показано, що ВПА містить моноцукри - глюкозу, галактозу, арабінозу, рамнозу, манозу та фукозу, а також жирні кислоти - пальмітинову, стеаринову, олеїнову, лінолеву та холестерол. Встановлено, що домінуючими моноцукрами для ВПА виявилися глюкоза та галактоза, а серед ліпідів - пальмітинова кислота.

Доведено, що структурні компоненти ВПА, зокрема білок з молекулярною вагою 43 кДа, є антигеноспорідненим до небезпечних рабдовірусів людини та тварин - ВВС та вірусу сказу (ВС), а імуноглобуліни до рослинного рабдовірусу плямистості аїру in vitro здатні нейтралізувати інфекційну активність вірусу везикулярного стоматиту.

Встановлено антигенну спорідненість поліцукрів - манану і глюкану та структурних вуглеводів фіторабдовіруса плямистості аїра й рабдовірусів людини і тварин вірусу везикулярного стоматиту та вірусу сказу.

Дослідженно, що ВПА вражає велике коло рослин 13 родин, серед яких є найважливіші сільськогосподарські культури в Україні з родини пасльонових, гречаних, бобових та зернових. Встановлено, що вірус передається механічним шляхом і здатний накопичуватися у великій кількості, тому він може розглядатись як модель для вивчення особливостей реалізації генетичної інформації фіторабдовірусів та порівняльного аналізу білків, ліпідів і вуглеводів рослинних і тваринних рабдовірусів.

Практичне значення отриманих результатів. Отримані результати вивчення фізико-хімічних властивостей нового рабдовірусу мають цінність для таксономії представників родини Rhabdoviridae, а також можуть бути використані при подальших дослідженнях властивостей рабдовірусів. Дані про віруснейтралізуючу активність антитіл до вірусу плямистості аїру відносно вірусу везикулярного стоматиту в системі in vitro, відкривають перспективу розробки і створення нових нетрадиційних біотехнологій.

Особистий внесок здобувача. Автором самостійно здійснено аналіз вітчизняної та зарубіжної літератури за обраною темою. Основні експериментальні дані були одержані автором особисто: виділено та напрацьовано препарат вірусу плямистості аїру, одержано препарат вірусної геномної РНК, проведено дослідження молекулярної маси РНК та білків вірусу, отримано антисироватку до ВПА, досліджено біологічні властивості вірусу плямистості аїру.

Вивчення віруснейтралізуючої активності сироватки, специфічної до рослинного рабдовірусу плямистості аїру щодо вірусу везикулярного стоматиту, проведена спільно з співробітникам відділу проблем інтерферону та імуномодуляторів: к.б.н. Н.М. Жолобак та З.М. Олевинською.

Дослідження моноцукридного та ліпідного складу рабдовірусів проведено у співавторстві із співробітниками відділу біохімії мікроорганізмів д.б.н. Л.Д. Варбанець, к.б.н. О.С. Броварською, к.б.н. В.Н. Васильєвим.

Дослідження імунохімічних властивостей вуглеводів проведені спільно з к.б.н. Н.В. Несторовою та к.б.н. С.Д. Загородньою.

Автор висловлює подяку ст. н.с., к.б.н. Л.Ф. Діденко за всебічну допомогу при формулюванні основних положень і висновків, підготовці публікацій за результатами досліджень та представленні їх на наукових конференціях.

Планування напрямку роботи, формулювання основних положень і висновків дисертації проведено під керівництвом наукового керівника, чл.-кор. НАН України, д.б.н. М.Я. Співака.

Апробація результатів дисертації. Основні положення роботи представлені на конференції молодих вчених «Сучасні проблеми фізіології рослин і біотехнології» (Ужгород, 1-3 грудня 2005 р.) та «Медико-біологічні та соціальні проблеми сучасної людини» (Придністров'я, Тирасполь, 15-16 березня 2007 р.), Міжнародній конференції молодих вчених та студентів «Modern problems of microbiology and biotechnology» (Одеса, 28-31 травня 2007 р.), 11-тій Пущинській школі-конференції молодих вчених «Біологія - наука XXI століття» (Росія, Пущино, 29 жовтня-3 листопада 2007 р.), Всеукраїнській науково-практичній конференції «Довкілля і здоров'я» (Тернопіль, 24-25 квітня 2008 р.), XII з'їзді товариства мікробіологів України ім. С.М. Виноградського (Ужгород, 24-30 травня 2009 р.).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 5 статей в наукових журналах, рекомендованих ВАК України та 8 тез доповідей.

Вірус плямистості аїру задепоновано в Депозитарії Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, реєстраційний номер, наданий штаму мікроорганізму Депозитарієм: Spot Sweetflag Virus (вірус плямистості аїру) ІМВ V-1.

Структура та обсяг роботи: Дисертаційна робота викладена на 121 сторінці машинописного тексту і складається з розділів: вступ, огляд літератури, матеріали і методи досліджень, результати досліджень, який включає 3 розділи власних досліджень, узагальнення результатів, висновки та список використаних джерел. Дисертаційна робота містить 4 таблиці та 27 рисунків. Бібліографічний список складає 181 джерело.

Зміст роботи

Розділ 1. Огляд літератури

Огляд літератури представлений одним підрозділом, який містить сім пунктів. У розділі відображений сучасний аналіз властивостей представників родини Rhabdoviridae, які включають біологічні властивості, геномну організацію, а також структурні компоненти вірусів.

Розділ 2. Матеріали і методи

Об'єктом дослідження був фітопатогенний рабдовірус ВПА. Для накопичення ВПА, використовували рослини махорки (Nicotiana rustica), які в подальшому використовували для виділення вірусу. Для механічного пошкодження листя використовували Celite type 535 фірми Serva. Виділення вірусу виконували наступним чином [6]. Листя махорки, що мали яскраво виражені симптоми захворювання, гомогенізували в рідкому азоті. До цього гомогенату додавали буфер, який містив 0,1 М гліцин; 0,01 М MgCl₂; 0,01 М Na₂SO₃, загальний рН буфера становив 8,0. Інкубували гомогенат протягом 30 хв при кімнатній температурі. Після чого його фільтрували через нейлоновий фільтр. Фільтрат центрифугували при 5000 g протягом 10 хв. Із надосадової рідини вірус осаджували 7% поліетиленгліколем-6000 у присутності 0,15 М NaCl. Преципітованний поліетиленгліколем вірус збирали центрифугуванням при 10000 g протягом 15 хв. Осад ресуспендували в буферному розчині (рН 7,0), який містив 0,1 М гліцин; 0,01 М MgCl_2. Потім звільнялись від поліетиленгліколю центрифугуванням при 10000 g протягом 15 хв [Диденко Л.Ф., 2001]. Вірусну суспензію нашаровували на 1,5 М сахарозну подушку та центрифугували при 27000 об/хв протягом 3 год. Цим методом також виділяли вірус кучерявої карликовості картоплі (ВККК) з листків Nicotiana rustica. Одержані вірусні препарати аналізували на спектрофотометрі «Specord» при довжині хвилі 260 нм.

Вірус везикулярного стоматиту виділяли з інфікованої культури клітин тестикул поросяти (ПТП). В роботі використовували фіксований вірус сказу (вакцину антирабічну «Внуково-32»).

Одержання РНК вірусу плямистості аїру здійснювали методом фенольної депротеінізації з використанням хлороформу на відповідних стадіях виділення РНК та її молекулярну масу визначали методом електрофорезу в ПААГ по F.M. Ausubel та ін. (2003 р.).

Молекулярну масу структурних білків визначали методом електрофорезу в 10% ПААГ за методом Laemmli (1970).Для визначення молекулярних маc досліджуваних білків будували калібровочну пряму залежності між десятковими логарифмами (lg) і відносною електрофоретичною рухомістю білків-маркерів. Для ідентифікації глікопротеїну в складі ВПА після електрофорезу гель витримували протягом 1 год при 20°С у 7,5% розчині оцтової кислоти. Потім гель інкубували протягом 1 год при температурі 4°С в 0,2% водному розчині йодної кислоти. Після чого гелі витримували з реактивом Шиффа при температурі 4°С доти поки смуги глікопротеїнів не стануть червоними. Гелі зберігають в реактиві Шиффа або, якщо термін зберігання більше 1 місяця, гель витримують в розчині, який містить по одному об'єму 1Н соляної кислоти та 10% водного розчину бісульфіта натрію, а також 10 об'ємів дистильованої води. При цьому спочатку суміш потрібно оновлювати по меншій мірі 7 разів через кожні 2 год [Маурер Г., 1971].

Полівалентні сироватки, специфічні до ВПА, ВВС, ВС, одержували шляхом внутрішньом'язевої імунізації кролів сумішшю рівних об'ємів очищеного вірусного препарату та повного ад'юванту Фрейнда («Difco», США) [Шуманашвили В.И., 1979]. Для виявлення антигенноспорідненних білків використовували метод імуноблотингу [Фогт П., 1972, Towbin C.W., 1979]. При дослідженні перехресної віруснейтралізуючої активності зоо - та фітопатогених рабдовірусів використовували гомологічну полівалентну сироватку до ВВС (IgG до ВВС) та гетерологічну специфічну сироватку до ВПА (IgG до ВПА).

Для вивчення антигеної спорідненості структурних вуглеводів рабдовірусів та поліцукрів в якості антигенів використовували глюкан СХМ1-188, отриманий з Sinorhizobium meliloti, та манан, отриманий з Candida maltoza, які надані відповідно Л.Д. Варбанець та А.Г. Коваленко (ІМВ НАНУ).

Крім того антигенами служили ВПА, ВВС, ВС та антисироватки до них, а також нормальна сироватка кроля.

Для визначення кількісного і якісного складу жирних кислот використовували 10 мг вірусного препарату, який вносили в 3 мл 1,5% хлористого ацетилу на метанолі і проводили гідроліз при температурі 100 єС в запаяних ампулах протягом 4 год. Метилові ефіри жирних кислот екстрагували тричі гексаном (по 3 мл). Гексанову фракцію відбирали і висушували у вакуумному випарнику. Аналіз метилових ефірів жирних кислот проводили на хромато-масспектрометричній системі «Agilent 6890N/5973 inert» США. Використовували колонку HP-5MS довжиною 30 м, внутрішнім діаметром 0,25 мм, товщиною фази 0,25 мкм, при температурному режимі 150-250 єС у градієнті температури 4 єС/хв, газ-носій гелій, швидкість потоку через колонку 1,2 мл/хв. Обробку результатів проводили за допомогою персонального комп'ютера і стандартної суміші метилових ефірів жирних кислот (виробник Supelco, США).

Для ідентифікації нейтральних моноцукрів препарати гідролізували 2Н HCL протягом 5 год при 100 єС, а потім аналізували методом газорідинної хроматографії (ГРХ) у вигляді ацетатів поліолів на хромато-масспектрометричній системі «Agilent 6890N/5973 inert», колонка РВ 225 ms 30 м Ч 0,25 мм Ч 0,25 мкм, газ-носій гелій, потік через колонку 1 мл/хв. Температура випарника 250 єС, інтерфейса 280 єС, термостата 220 єС (режим ізотермічний). Пробу вводили з діленням потоку 1:100. Ідентифікацію моноцукрів проводили шляхом порівняння часу утримування ацетатів поліолів досліджуваних зразків і стандартних, а також з використанням комп'ютерної бази даних Chemstation. Кількісне співвідношення індивідуальних моноцукрів визначали у відсотках до суми площ всіх піків моноцукрів.

Для визначення аміноцукрів 1 мг вірусного препарату гідролізували 6 N HCL протягом 20 год при 100 єС. Гідролізат центрифугували, нейтралізували і випаровували у вакуумі. Визначали аміноцукри на аналізаторі амінокислот KLA («Hitachi», Японія), використовуючи колонку (0,9 Ч 15 см) з катіонітом «Octuon 0803» в натрій-цитратному буфері рН 5,28 при 55 єС.

Екстракцію розчинних лектинів проводили за методом, який був запропонований Трифоновою Е.Д. та ін. (2004 р.). Активність лектинів визначали методом аглютинації трипсинізованих еритроцитів барана [Луцик М.Д., 1981].

Розрахунки проводились за допомогою ІВМ РС з використанням пакету програмних засобів Microsoft Office-2003. Експериментальні дані оброблялись загальноприйнятими методами варіаційної статистики з вирахуванням середніх арифметичних величин (X), їх середньоквадратичного відхилення (S_Х) і середньоквадратичної похибки (m).

Розділ 3. Біологічні властивості вірусу плямистості аїру

Предметом вивчення даної роботи є новий вірус плямистості аїру (ВПА), вперше знайдений нами на рослинах аїру в Київській області (рис. 1). Аїр (Acorus calamus) в українській мові має ще синоніми такі як лепеха та татарське зілля. Відповідно до загальноприйнятої системи номенклатури вірусів рослин, в основу якої покладено симптомологічний прояв захворювання на основній рослині-господарі, виявлене нами захворювання аїру, що викликається вірусом бациловидної форми, названо плямистістю аїру, а вірус - вірусом плямистості аїру (ВПА).

Як рослину, в якій накопичували вірус, застосовували махорку (Nicotiana rustica). Симптоми захворювання на Nicotiana rustica проявлялися первинними некрозами та деформацією верхівкового листя.

Для вивчення кола господарів ВПА використовували 24 види рослин з 15 родин. У інфікованих ВПА рослин проявлялися чітко виражені симптоми захворювання, які проте варіювали за ступенем вираженості мозаїки, деформації і некротичної реакції та часу прояву симптомів від початку інфікування. Це стосується перш за все рослин різних родин і різних видів рослини однієї і тієї ж родини (наприклад, родина Solanaceae, до якої належить також і махорка).

Із родини Solanacea картопля (Solanum tuberosus), томат (Lycopersicum esculentum), перець (Capsicum annuum), дурман (Datura stramonium) виявилися чутливими до ураження ВПА, який передавали соком заражених рослин махорки (Nicotiana rustica). Симптоми захворювання ВПА на представниках родини Solanaceae дещо відрізнялися. ВПА на ураженій картоплі не викликав карликовості, стебла стоншувалися, а листя в нижньому ярусі зросталося, деформуючи листкову пластинку (рис. 3). Бульби картоплі не мали зовнішніх пошкоджень, але відрізнялися малими розмірами.

Найбільш тривалий інкубаційний період ВПА відзначали при ураженні перцю (10-12 тижнів). Хвороба проявилася у вигляді мозаїки і деформації верхівкового листя, іноді проявлялась розеточність верхівкових листків, а також пригнічення цвітіння та зав'язування плодів.

Слід зазначити високу сприйнятливість гречки (Fagopyrum esculentum) до зараження вірусом плямистості аїру. На листках інфікованих рослин з'являлися некрози, а потім мозаїка. На інфікованому вірусом плямистості аїру листі огірків, представника з родини Cucurbitaceae, спочатку проявилися чіткі некрози, потім з'явилася строката мозаїка і згодом хвороба відображалася пожовтінням плодів.

В результаті проведених досліджень виявилося, що ВПА може вражати велику кількість різноманітних видів рослин із різних родин. Серед рослин, які є найбільш уразливими виявилися представники найважливіших сільськогосподарських культур в Україні (тобто родин пасльонових, гречаних, бобових, зернових) і не виключається, що ВПА приносить значні збитки врожаю цих культур.

Розділ 4. Структурні та фізико-хімічні особливості вірусних частинок вірусу плямистості аїру

Вірус плямистості аїру представляє інтерес тому, що входить в родину рабдовірусів, яка об'єднує за своїми властивостями віруси людини, тварин, рослин та безхребетних. ВПА містить одноланцюгову РНК негативної полярності, п'ять структурних білків, ліпіди та вуглеводи [Діденко Л.Ф., 2007]. Завдяки тому, що вірус передається механічним шляхом та здатний накопичуватися у великій кількості, він може бути моделлю для вивчення особливостей реалізації генетичної інформації фіторабдовірусів та порівняльного аналізу білків, ліпідів і вуглеводів рослинних і тваринних рабдовірусів.

Результати електронно-мікроскопічного дослідження показали, що ізольовані вірусні частинки ВПА мають характерну для рабдовірусів бациловидну форму, довжина яких складала 110 - 130 нм, а діаметр 45 нм.

Спектр поглинання очищеного препарату ВПА в ультрафіолетовому світлі мав максимум при довжині хвилі 260 нм.

Методом електрофорезу в ПААГ визначено молекулярну масу геномної РНК ВПА. Одержання вірусної РНК здійснювали методом фенольної депротеінізації з використанням хлороформу на відповідних стадіях виділення РНК. Спектрофотометричний аналіз очищеної РНК показав, що спектр поглинання в ультрафіолетовій ділянці має максимум при довжині хвилі 260 нм. Співвідношення показників поглинання при довжині хвилі 260 та 280 нм відповідає двом. Загальний вміст нуклеїнової кислоти у вірусному препараті ВПА дорівнює 1,9%. Для визначення молекулярної маси РНК користувалися методом електрофорезу в ПААГ з подальшим фарбуванням нітратом срібла в кислому середовищі. В якості маркерів використовували РНК, які мали - 6000, 4000, 3000, 2000, 1500, 1000, 500, 200 нуклеотидів (Riboruler High Range RNA Ladder # SM 1821 фірми Fermentas). В результаті проведених досліджень встановлено, що за розмірами РНК ВПА дорівнює близько 6000 нуклеотидів (рис. 7).

Електрофоретичним аналізом в ПААГ встановлено, що 5 структурних білків ВПА мають молекулярну масу, яка дорівнює відповідно 130, 66, 43-39, 32-30, 25 кДа (рис. 8). В порівнянні з іншими представниками родини Rhabdoviridae структурні білки вірусу плямистості аїру мають схожу молекулярну масу, з відповідними білками, як вірусів рослин, так і вірусів тварин. При амінокислотному аналізі сумарного вірусного білку у складі ВПА було виявлено 11 амінокислот. Серед них домінуючою амінокислотою був гліцин (29,9%).

В складі вірусу плямистості аїру виявлено глікопротеїн, з молекулярною масою близько 66 кДа, за допомогою спеціальної обробки, що проводиться після електрофорезу в ПААГ, з використанням препаратів йодної кислоти та реактиву Шиффа. Крім того в складі ВПА виявлені білки, які мають гемаглютинуючу активність. Скоріш за все, такими являються поверхневий глікопротеїн G.

Відомо, що поверхневий білок G рабдовірусів глікозильований та має властивість аглютинувати еритроцити По своїй структурній організації та функціям глікопротеїн відповідає визначенню класу білків - лектинів. Лектини беруть участь в процесах адгезії та виявлені у багатьох патогенних вірусів. Тобто для вірусів лектини їх поверхні слугують для того, щоб вибірково зв'язуватися з клітинами та інфікувати їх. В результаті проведеного дослідження встановлена гемаглютинуюча активність розчинної фракції структурних білків фіторабдовірусу ВПА. Вірусні білки аглютинували трипсинізовані еритроцити барана. Мінімальна кількість білку, яка здатна викликати аглютинацію еритроцитів, складала для ВПА 8,7 мкг/мл [Мандріка Т.Ю., 2006].

Встановлено, що при інфікуванні рослин Nicotiana rustica рабдовірусом ВПА відбувається зміна лектинової активності в динаміці розвитку вірусної інфекції. На першу добу після інфікування у заражених ВПА листках відмічалося збільшення лектинової активності в порівнянні зі здоровими рослинами Nicotiana rustica. На 7, 14, 21 та 28 добу після інфікування відмічався суттєвий спад лектинової активності, з мінімумом на 28 добу, потім - на 35 та 42 добу відмічався її підйом.

Зменшення лектинової активності рослини Nicotiana rustica з наступним її збільшенням можливо визначається конформаційними перебудовами молекул білку в цей період часу, в ході яких змінюється доступність вуглеводзв'язуючих центрів. Можливо при інфікуванні ВПА рослин Nicotiana rustica змінюється поліпептидний склад рослинної клітини, які проявляють лектинову активність.

До складу рабдовірусів входять також і вуглеводи, які складають 3% від вірусної частинки. Аналіз моноцукридного складу показав, що у ВПА як домінуючі присутні глюкоза (25,3%), галактоза (18,3%), арабіноза (16,0%). Значний вміст рибози (31,0%) вірогідно пояснюється наявністю нуклеїнової кислоти. У незначній кількості присутні рамноза, маноза та фукоза, (3,1%, 2,32% та 3,98% відповідно). Порівняльний склад поліцукрів ВПА та ВВС наведений у таблиці.

Вміст поліцукрів у складі вірусу плямистості аїру (ВПА) та вірусу везикулярного стоматиту (ВВС), визначених методом газорідинної хроматографії

плямистий вірус аїр стоматит

Рабдовіруси у своєму складі містять близько 20-35% ліпідів. Ліпіди є невід'ємним структурним компонентом віріонів, який формує бішарову оболонку вірусу. В структурі досліджуваних вірусів ВПА та ВВС були знайдені та ідентифіковані ліпіди, розподіл якісного та кількісного складу яких наведено у таблиці.

Порівняльна характеристика ліпідного складу вірусу плямистості аїру (ВПА) та вірусу везикулярного стоматиту (ВВС), визначеного методом газорідинної хроматографії

Нейтральна ліпідна фракція, що містить холестерол, знайдена в значній кількості у ВВС (28, 32%) та у ВПА (23%). Пальмітинова кислота в значній кількості зустрічається як у фітопатогенного вірусу плямистості аїру (47%), так і зоопатогенного вірусу ВВС (22,9%). Відзначений мінімальний вміст лінолевої кислоти у ВПА (4,2%) і в значній кількості (18,1%) у ВВС. Вміст нормальних насичених кислот - пальмітинової і стеаринової, складав для ВПА та ВВС відповідно 47% і 5,94% та 22,9% і 14,16%. Також ВВС містить пальмітоолеїнову кислоту (2,7%), і відмічено її відсутність у ВПА [Didenko L.F., 2008].

Таким чином ВПА по своїй морфології та структурним компонентам у порівнянні із зоорабдовірусом везикулярного стоматиту (ВВС) відповідає визначенню рабдовірус і належить до родини Rhabdoviridae.

Розділ 5. Імунохімічні дослідження структурних білків та вуглеводів ВПА

Дослідження серологічної спорідненості між фітовірусами - вірусом плямистості аїру та вірусом кучерявої карликовості картоплі (ВККК), а також зоопатогенним вірусом везикулярного стоматиту проведено методом подвійної імунодифузії в гелі. При цьому сироватка до фітовіруса плямистості аїру реагувала як з вірусом кучерявої карликовості картоплі так і з вірусом везикулярного стоматиту.

У складі ВВС та ВПА методом імуноблотингу після фракціонування вірусних білків у ПААГ при використанні сироватки до ВККК виявлені антигенно споріднені білки, молекулярні маси яких дорівнювали 43 кДа [Мандріка Т.Ю., 2007]. Згідно з літературними даними, ці білки скоріш за все є внутрішніми нуклеокапсидними білками.

Відомо, що вуглеводи мають антигенну активність. Як і всі природні антигени вони мультивалентні, тобто комплементарно антитіла наробляються не до послідовності ланцюга в цілому, а до мінімальних структурних ділянок, що здатні викликати продукцію та зв'язування в реакції антиген-антитіло комплементарних антитіл. Ці ділянки періодично повторюються та є епітопами [Jann I., 1984]. Тому особливе значення мають антигенні властивості поліцукрів, які претендують на значиму роль у формуванні імунитету, що показано для мікроорганізмів [Salam S.S., 2004/2005]. Виходячи з цього, не можна виключити вплив вуглеводів на напрацювання антитіл, і це дозволяє припустити наявність структурної аналогії імунодомінантних епітопів вуглеводного компоненту фіто - та зоопатогенних рабдовірусів, що визначає актуальність поставленого завдання.

Зазвичай антивуглеводні антитіла не виявляють афінність до моноцукрів. Їх детермінанти визначаються олігоцукридними структурами, необхідними для специфічного впізнавання, тому імунохімічні дослідження визначення загальних антигених детермінант у складі вірусних вуглеводів, що містять глюкозу та манозу, були проведені з використанням поліцукрів глюкану та манану.

Про можливість наявності у віріонах фіторабдовірусу ВПА і рабдовірусів людини та тварин вірусу везикулярного стоматиту та вірусу сказу загальних детермінант небілкової природи свідчать позитивні результати, отримані методом подвійної імунодифузії в гелі, які показали, що антисироватки до ВПА, ВС та ВВС взаємодіяли з мананом та глюканом. Нормальна сироватка кроля не реагувала з жодним із досліджуваних в експерименті антигенів.

Методом імуноферментного аналізу проведені дослідження по вивченню серологічної спорідненості двох поліцукрів (глюкана та манана) з рядом сироваток до фіто - та зоорабдовірусів. Використано шахову схему титрування, за якої діапазон концентрацій досліджуваних антигенів складав від 0,39 до 50 мг/мл та розведення сироваток від 1:50 до 1:1600. Виявлено, що оптимальні рівні взаємодії антигенів з антитілами детектувались при різних концентраціях антигенів, але розведення сироваток було єдиним - 1:50. Результати експериментів по взаємодії глюкана з сироватками до ВПА, ВВС та ВС, показали, що для всіх сироваток, які досліджувались, оптимальна концентрація антигену складала 3,13 мг/мл. Отримані значення оптичної густини складали для сироватки до вірусу плямистості аїру 0,763 опт. од., до вірусу везикулярного стоматиту та вірусу сказу 0,362 опт. од. та 0,566 опт. од. відповідно. Значення оптичної густини для контрольної сироватки кроля з такою ж концентрацією антигена було негативним (0,015 опт. од.).

При використанні в якості антигену поліцукру манану, встановлено, що при його концентрації 3,13 мк/мл відповідь специфічних сироваток складала для ВПА - 1,158 опт. од., для вірусу везикулярного стоматиту - 0,134 опт. од. та 0,566 опт. од. для вірусу сказу. Значення оптичної густини контрольної сироватки кроля було негативним (0,018 опт. од.) [Диденко Л.Ф., 2008].

Таким чином, встановлено антигенну спорідненість поліцукрів манану та глюкану, а також структурних вуглеводів фіторабдовірусу ВПА й рабдовірусів людини та тварин ВВС та ВС. Свідоцтвом цього є дані імунохімічного аналізу про наявність схожості поліцукрів манана і глюкана з імунодомінантними епітопами вуглеводів фіто - та зоопатогенних рабдовірусів.

Перехресна віруснейтралізуюча активність зоо - та фітопатогенних рабдовірусів При використанні Вестерн імуноблотингу виявлені антигенно споріднені білки в складі ВВС та ВПА. Встановлене нами явище антигенної спорідненості між структурними білками представників однієї родини Rhabdoviridae стало основою для вивчення перехресної віруснейтралізуючої активності in vitro на моделі ВВС та антитіл, специфічних до ВПА.

В реакції нейтралізації використовували препарат вірусу везикулярного стоматиту, раніше стандартизований та кількісно відтитрований, робоча доза складала 100 LD₅₀.

У результаті проведених досліджень in vitro показана здатність імуноглобулінів проти фіторабдовірусу ВПА нейтралізувати інфекційну активність зоорабдовірусу ВВС у перещеплюваній культурі тваринних клітин ПТП. Ефективність інгібування ЦПД ВВС імуноглобулінами до вірусу везикулярного стоматиту та імуноглобулінами до ВПА відрізняється залежно від розведення сироваток та часу контакту вірусу з антитілами до внесення в моношар клітин ПТП.

Посилення нейтралізуючого ефекту в гомологічній системі найімовірніше пов'язано зі збільшенням концентрації антитіл, взятих для нейтралізації. Нейтралізуючий ефект в даному випадку не залежить від часу інкубації антитіл з вірусом. Однак при інкубуванні вірусу протягом 30 хв із сироваткою в розведенні 1:64 спостерігається значне інгібування інфекційної активності вірусу везикулярного стоматиту.

В гетерологічній системі при різному часі інкубації антитіл з вірусом найбільший інгібуючий ефект ЦПД вірусу везикулярного стоматиту виявлено при розведенні сироватки 1:64 та 1:16. Зниження інфекційнності виявлено також при контакті з вірусом гетерологічних антитіл в розведенні 1:64 протягом 15 хв до їх внесення в моношар клітин.

Таким чином, ефективність інгібування ЦПД ВВС антитілами до вірусу везикулярного стоматиту та антитілами до вірусу плямистості аїру відрізняється залежно від часу контакту сироватки з вірусом до їх внесення в моношар клітин ПТП.

Отримані дані, можливо, знайдуть застосування в біотехнології - для отримання імунологічних реагентів, які можуть бути використані в серологічних тестах з метою виявлення вірусів родини Rhabdoviridae в різних еукаріотичних об'єктах, що буде сприяти розвитку нових перспективних нетрадиційних біотехнологій.

Висновки

1. Вивчено структурні компоненти та біологічні властивості нового фіторабдовірусу ВПА, вперше знайденого нами на рослинах аїру в Київській області, які розширюють знання про загальні властивості цього патогену, структуру і морфологію його віріонів, що, у свою чергу, сприяє розумінню процесів розвитку та еволюції рабдовірусів.

2. Показано, що ВПА вражає велике коло рослин із 13 родин, серед яких є найважливіші сільськогосподарські культури в Україні з родин пасльонових, гречаних, бобових та зернових.

3. Встановлено, що ВПА має бациловидну форму з розмірами віріону 110-130 х 45 нм. Вірус містить одноланцюгову РНК негативної полярності та п'ять структурних білків.

4. Визначено якісний і кількісний склад ліпідів та вуглеводів ВПА. Показано, що до складу вірусу входять моноцукри - глюкоза, галактоза, арабіноза, рибоза, рамноза, маноза та фукоза, а також жирні кислоти - пальмітинова, стеаринова, олеїнова, лінолева та холестерол.

5. Встановлено, що в структурі ВПА є білки з пектиновою активністю, що підтверджувалось їх гемаглютинуючою активністю відносно еритроцитів у реакції гемаглютинації. Інфікування ВПА Nicotiana rustica призводило до хвилеподібної зміни активності лектинів цієї рослини залежно від динаміки розвитку вірусної інфекції.

6. Показано, що структурні компоненти ВПА, зокрема білок з молекулярної вагою 43 кДа, є антигенноспорідненими до небезпечних рабдовірусів людини та тварин - ВВС та ВС.

7. Встановлено антигенну спорідненість поліцукрів - манана і глюкана та структурних вуглеводів фіторабдовіруса ВПА й рабдовірусів людини і тварин ВВС та ВС. Свідоцтвом цього служать дані імунохімічного аналізу про антигенну спорідненість поліцукрів - манана і глюкана з імунодомінантними епітопами вуглеводів фіто - та зоопатогенних рабдовірусів.

Список робіт, опублікованих за темою дисертації

1. Мандріка Т.Ю. Лектинова активність в листях Nicotiana rustica, інфікованих рабдовірусами / Т.Ю. Мандріка, О.Б. Серденко, Н.І. Грабченко, С.Г. Козьмін, Л.Ф. Діденко, М.Я. Співак // Вісник Ужгородського Унівірситету. Серія біологія. 2005. Випуск №18. С. 149-152 (Здобувачем виділений вірус ВПА та досліджена лектинова активність у листях Nicotiana rustica, інфікованих ВПА).

2. Діденко Л.Ф. Новий рабдовірус плямистості листя аіру / Л.Ф. Діденко, Л.Д. Варбанец, Т.Ю. Мандріка, О.Б. Серденко, О.С. Броварська, В.М. Васильєв, М.Я. Співак // Доповіді Національної академії наук України. №5, 2007, с. 155-159 (Здобувачем виділений вірус, досліджена його морфологія та проведений аналіз білкового складу).

3. Мандріка Т.Ю. Характеристика бациловидного вірусу плямистості аїру / Т.Ю. Мандріка, О.Б. Серденко, Л.Ф. Діденко, Л.Д. Варбанець, О.С. Броварська, В.М. Васильєв, М.Я. Співак // Мікробіологічний журнал. №5, 2007. - с. 49-58 (Здобувач провів літературний пошук, опрацював та систематизував отримані дані, підготував статтю до друку).

4. Didenko L.F. Monosaccharide composition of rhabdoviruses infecting animals and plants / L.F. Didenko, L.D. Varbanets, T.Y. Sabirova, O.B. Serdenko, O.S. Brovars'ka, N. Ya. Spivak // «Мікробіологія і біотехнологія» №1, 2008, с. 18-22 (Здобувачем виділений препарат вірусу, проведений літературний пошук, опрацьовані отримані дані, підготовлена стаття до друку).

5. Диденко Л.Ф. Антигенное родство полисахаридов и структурных углеводов фиторабдовируса крапчатости аира и рабдовирусов человека и животных/ Л.Ф. Диденко, Н.В. Нестерова, С.Д. Загородняя, Т.Ю. Сабирова, О.Б. Серденко, М.Я. Спивак // «Імунологія та алергологія» 2008, №2, - с. 8-11 (Здобувачем проведено літературний пошук, підготовлений вірусний препарат, отримана антисироватка до ВПА, опрацьовані отримані результати, підготовлена стаття до друку).

6. Мандріка Т.Ю. Лектинова активність листків Nicotiana rustica, інфікованих рабдовірусами / Т.Ю. Мандріка, О.Б. Серденко, Н.І. Грабченко, Л.Ф. Діденко, М.Я. Співак // Тези доповідей наукової конференції молодих учених «Сучасні проблеми фізіології рослин і біотехнології». Ужгород. 1-3 грудня. -2005.-С 81

7. Мандрика Т.Ю. Моносахаридный и жирнокислотный состав фиторабдовирусов - вируса кучерявой карликовости картофеля и вируса крапчатости аира / Т.Ю. Мандрика, О.Б. Серденко, Л.Ф. Диденко, Л.Д. Варбанец, Н.Я. Спивак // Тезисы докладов 11-ой Пущинской школы-конференции молодых ученых «биология - наука XXI века» 29 октября - 2 ноября. -2007. - С 158

8. Sabirova T.Y. Monosaccharides composition of Rhabdoviruses / T.Y. Sabirova, O.B. Serdenko, T. Koretnikova, L.F. Didenko, L.D. Varbanets, N. Ya. Spivak // Book of abstracts the young scientists' and students' international scientific conference «Modern Problems of Microbiology and Biotechnology» 28-31 may 2007, Odessa.-P. 171.

9. Мандрика Т.Ю. Нейтрализация зоопатогенного рабдовируса везикулярного стоматита в системе in vitro антителами к фиторабдовирусу крапчатости аира / Т.Ю. Мандрика, О.Б. Серденко, Н.Я. Спивак, Л.Ф. Диденко, Н.М. Жолобак, 3.М. Олевинская // Материалы докладов конференции молодых ученых «Медико-биологические и социальные проблемы современного человека» 15-16 марта 2007 г. Тирасполь. - C. 72-73

10. Серденко О.Б. Біологічні властивості рабдовірусу, знайденого в лікарській рослині аїрі / О.Б. Серденко, Т.Ю. Сабірова, Л.Ф. Діденко, М.Я. Співак // Матеріали всеукраїнської науково-практичної конференції «Довкілля і здоров'я», Тернопіль 24-25 квітня 2008. - С. 80-82.

11. Серденко О.Б. Ідентифікація глікопротеїна фіторабдовіруса плямистості аїру / О.Б. Серденко, Т.Ю. Сабірова, Л.Ф. Діденко, М.Я. Співак // Матеріали всеукраїнської науково-практичної конференції «Довкілля і здоров'я», Тернопіль 24-25 квітня 2008, - С. 79-80

12. Серденко О.Б. Властивості нового рабдовірусу - вірусу плямистості аїру. / О.Б. Серденко, Т.Ю. Сабірова, Л.Ф. Діденко, Л.Д. Варбанец, М.Я. Співак // Тези доповідей XII з'їзду товариства мікробіологів України ім. С.М. Виноградського, Ужгород, 24-30 травня 2009 р., - С. 466.

13. Серденко О.Б. Аналіз геномної РНК вірусу плямистості аїру / О.Б. Серденко, Б.В. Моргун, Л.В. Юзвенко, Л.Ф. Діденко, М.Я. Співак // Тези доповідей XII з'їзду товариства мікробіологів України ім. С.М. Виноградського, Ужгород, 24-30 травня 2009 р., - С. 465.

14. Свідоцтво про депонування в депозитарії штамів мікроорганізмів Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного від 12.11.07. Вірус плямистості аїру депоновано ІМВ V-1

Размещено на Allbest.ru