Стан мікроциркуляторного русла пухлин під впливом фітопрепарату ГА-40

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЇ ПАТОЛОГІЇ, ОНКОЛОГІЇ І РАДІОБІОЛОГІЇ ім. Р.Є. КАВЕЦЬКОГО

УДК: 616.13:616-006:615.015.001.5

СТАН МІКРОЦИРКУЛЯТОРНОГО РУСЛА ПУХЛИН ПІД ВПЛИВОМ ФІТОПРЕПАРАТУ ГА-40 (експериментальне дослідження)

14.01.07 - онкологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

ЛИСЕНКО СЕРГІЙ АНДРІЙОВИЧ

Київ - 2009

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у Вінницькому національному медичному університеті ім. М.І. Пирогова МОЗ України.

Наукові керівники: - доктор медичних наук, професор Болюх Борис Афанасійович, Вінницький національний медичний університет ім. М.І. Пирогова МОЗ України, завідувач кафедри променевої діагностики, променевої терапії та онкології;

- доктор медичних наук, професор Галахін Костянтин Олександрович, Український науково-практичний центр ендокринної хірургії, трансплантації ендокринних органів і тканин МОЗ України, завідувач лабораторії патоморфології.

Офіційні опоненти: - доктор медичних наук Коровін Сергій Ігорович, ДУ ”Національний інститут раку”, завідувач відділення пухлин шкіри та м'яких тканин;

- доктор медичних наук, професор Гичка Сергій Григорович, Медичний інститут Української асоціації народної медицини, завідувач кафедри патологічної анатомії.

Захист відбудеться “8” квітня 2009 р. о 15єє на засіданні спеціалізованої вченої ради Д26.155.01 в Інституті експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України (03022, Київ-22, вул. Васильківська, 45).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України (03022, Київ-22, вул. Васильківська, 45).

Автореферат розісланий “5” березня 2009 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

кандидат біологічних наук Л.М. Шлапацька

АНОТАЦІЯ

Лисенко С.А. Стан мікроциркуляторного русла пухлин під впливом фітопрепарату ГА-40 (експериментальне дослідження). - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 14.01.07 - онкологія. - Інститут експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України, Київ, 2009.

Дисертацію присв'ячено вирішенню наукової задачі щодо встановлення антиваскулярних та антиангіогенних властивостей фітопрепарату ГА-40 на основі вивчення стану мікроциркуляторного русла первинних пухлин та метастатичних вузлів на трьох моделях пухлинного росту: карциномі Герена, карциномі легені Л'юїс та меланомі В16.

Застосування фітопрепарату ГА-40 гальмує розвиток в карциномі Герена мікроциркуляторного русла, про що свідчить зменшення на 28 добу експерименту питомої ваги судинного русла та середньої площі судин у порівнянні з контрольною групою. Ступінь інтратуморальної щільності судин з 12 по 28 добу експерименту під впливом фітопрепарату ГА-40 у порівнянні з аналогічними термінами в контрольній групі тварин також зменшується. карцинома антиваскулярний антиангіогенний метастатичний

Встановлено, що фітопрепарат ГА-40 проявляє інгібуючий вплив на неоваскуляризацію та метастазування у тварин з карциномою легені Л'юїс, меланомою В16 та призводить до одночасного достовірного зниження рівня VEGF в сироватці крові та збільшення кількості аваскулярних метастазів. На підставі отриманих результатів визначено новий вектор фармакологічної дії цього фітопрепарату - пригнічення неоангіогенезу з гальмуванням пухлинного росту.

Ключові слова: фітопрепарат ГА-40, мікроциркуляторне русло, ангіогенез, фактор росту ендотеліальних клітин (VEGF), карцинома Герена, карцинома легені Л'юїс, меланома В16.

АННОТАЦИЯ

Лысенко С.А. Состояние микроциркуляторного русла опухолей под влиянием фитопрепарата ГА-40 (экспериментальное исследование). - Рукопись.

Дисертация на соискание научной степени кандидата медицинских наук по специальности 14.01.07 - онкология. - Институт экспериментальной патологии, онкологии и радиобиологии им. Р.Е. Кавецкого НАН Украины, Киев, 2009.

Целью работы явилось исследование особенностей микроциркуляторного русла злокачественных новообразований и метастазов под влиянием фитопрепарата ГА-40 на моделях экспериментальных опухолей.

Диссертация посвящена решению научной задачи по установлению антиваскулярних и антиангиогенных свойств фитопрепарата ГА-40 на микроциркуляторное русло первичных опухолей и метастатических узлов на трех моделях опухолевого роста: карциноме Герена, карциноме легкого Льюис и меланоме В16.

Фитопрепарат ГА-40 ингибирует в карциноме Герена развитие микроциркуляторного русла, что находит свое отражение в уменьшении (на 28 сутки) удельного веса микрососудов на 26% (р<0,001) и средней площади одного сосуда на 21% (р<0,001) в сравнении с карциномой Герена у животных контрольной группы. Также установлено достоверное снижение интратуморальной плотности при использовании фитопрепарата, по сравнению с животными группы контроля на всех сроках исследования, в среднем с уменьшением в 2,73 раза (р<0,001) с 12 по 28 сутки експеримента.

Установлено, что фитопрепарат ГА-40 проявляет ингибирующее влияние на неоваскуляризацию и метастазирование у животных с карциномой легкого Льюис и меланомой В16. Фитопрепарат ГА-40 достоверно угнетает опухолевой рост и метастазирование у мышей с карциномой легкого Льюис: на 39% уменьшается объем опухоли (р<0,01), на 34% - общее количество метастазов (р<0,05). При этом объем метастатического поражения легких становится меньше в 2,37 раза (р<0,05) при сравнении с животными контрольной группы. Установлено, что у животных с меланомой В16, которые получали фитопрепарат ГА-40, происходит достоверное уменьшение объема опухоли на 38% (р<0,01), объема метастатического поражения легких на 43% (р<0,05) и общего количества метастазов на 25% (р<0,05) в сравнении с животными контрольной группы.

Применение фитопрепарата ГА-40 у животных с карциномой легкого Льюис и меланомой В16 приводит к достоверному снижению уровня VEGF в сыворотке крови в сравнении с животными контрольной группы (р<0,05): на 19,4% - у мышей с карциномой легкого Льюис, и 21,9% - у животных с меланомой В16. Также установлено, что использование ГА-40 ведет к преобладанию аваскулярных метастазов в легочной паренхиме в отличие от животных контрольной группы (р<0,05): на 25% - у мышей с карциномой легкого Льюис, и 47% - у животных с меланомой В16.

Использование фитопрепарата ГА-40 на моделях экспериментальных опухолей (карцинома Герена, карцинома легкого Льюис, меланома В16) сопровождается как развитием альтеративных изменений в сосудах микроциркуляторного русла, так и торможением процесов ангиогенеза в первичных опухолях и их метастазах. Выявленные свойства дают возможность рекомендовать применение фитопрепарата ГА-40 в комплексном лечении больных со злокачественными опухолями.

Ключевые слова: фитопрепарат ГА-40, микроциркуляторное русло, ангиогенез, фактор роста эндотелиальных клеток (VEGF), карцинома Герена, карцинома легкого Льюис, меланома В16.

SUMMARY

Lysenko S.A. Status of tumor microvascularity under administration of phytopreparation GA-40 (experimental study). - Manuscript.

Thesis for the Degree of Doctor of Philosophy (PhD) in Medicine, speciality 14.01.07 - оncology. - R.E. Kavetsky Institute of Experimental Pathology, Oncology and Radiobiology of National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2009.

The thesis is devoted to the solution of the scientific task to define the antivascular and antiangiogenic properties of the antitumor effect of phytopreparation GA-40 on the basis of the investigation of the status of microvascularity of the primary tumors and metastatic nodes in three models of tumor growth: Guerin carcinoma, Lewis lung carcinoma and melanoma B16.

The application of phytopreparation GA-40 inhibits the development in Guerin carcinoma the microvascularity that is testified by the decrease of specific weight of tumor microvessels and average area of vessels at 28th day of the experiment in comparison with the control group. The degree of the intratumor density of vessels from 12th to 28th day of the experiment under the influence of phytopreparation GA-40 in comparison with the similar terms in the animals of control group also decreases. It has been found out that phytopreparation GA-40 shows inhibitory influence on neovascularization and metastizing in animals with Lewis lung carcinoma and melanoma B16 and leads to the simultaneous reliable decrease of the level VEGF in the blood serum and the increase of the quantity of avascular metastases. On the bases of the obtained results the new direction of the pharmacological effect of this phytopreparation - the suppression of angiogenesis with the inhibition of the tumor growth - has been defined.

Key words: phytopreparation GA-40, microvascularity, angiogenesis, vascular endothelial growth factor (VEGF), Guerin carcinoma, Lewis lung carcinoma, melanoma B16.

ЗАГАЛЬНА ХАРА КТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. В останнє десятиріччя проблема мікроциркуляції пухлини набула особливої актуальності. Відомо, що зміни ступеня васкуляризації органа або тканини є передумовою у виникненні різноманітних захворювань: недостатня васкуляризація сприяє розвитку серцево-судинної патології, безпліддя, виразок, ішемії головного мозку, а надмірна щільність мікросудин - ревматоїдного артриту, сліпоти, псоріазу та злоякісних новоутворень (Фільченков О.О., Стойка Р.С., 2006).

Особлива увага в онкології приділяється проблемі пухлинного ангіогенезу, обов'язкової ланки патогенезу злоякісних пухлин (Галахін К.О. та ін., 2006; Осинский С.П. та ін., 2007). Вивчення ангіогенезу не тільки дає додаткову інформацію для з'ясування механізмів пухлинного росту і метастазування, але і відкриває перспективи в прогнозі та лікуванні хворих на злоякісні новоутворення (Li et al., 2000; Лісняк І.О., 2004). До новітніх напрямків у лікуванні цих хворих відноситься, зокрема, протипухлинна антиангіогенна терапія, а спрямованість такого лікування на пригнічення ангіогенезу в пухлині - це нова стратегія в терапії хворих на рак (Jones A., Harris A.L., 1998; Новак О.Є., Лісняк І.О., Чехун В.Ф., 2002; Соляник Г.І., 2006).

В сучасній онкології особливо актуальним є пошук та дослідження впливу нових лікарських засобів як на пухлинний ангіогенез та його основні показники, так і на стан мікроциркуляторного русла злоякісних новоутворень та метастазів. Одним із таких препаратів є фітопрепарат ГА-40, який відноситься до антинеопластичних та імуномодулюючих засобів. В його склад входить комплекс поліпептидів рослинного походження, виділених із екстракту Купени кільчастої (Polgonatum varticillatum). Доведено, що лікарський засіб ГА-40 по відношенню до злоякісних клітин проявляє цитостатичну активність. Так, поліпептиди фітопрепарату ГА-40 взаємодіють з поверхневими рецепторами пухлинних клітин, зокрема лектиновими рецепторами, Т-клітинним рецептором, та ініціюють апоптоз. На відміну від хіміопрепаратів, ГА-40 не ушкоджує нормальні клітини організму і не має шкідливої дії на органи і тканини, що підтверджено експериментальними дослідженнями (Дікал М.В., Роговий Ю.Є., 2006; Дікал М.В., 2008).

З 2007 р. фітопрепарат ГА-40 дозволений для медичного застосування в нашій країні наказом МОЗ України №263 і Державним фармакологічним центром МОЗ України (реєстраційне посвідчення № UA/6435/01/01 від 25.05.2007 р.). Він використовується в складі комплексної терапії хворих на злоякісні новоутворення, а саме різних видів карцином, гострого мієлобластного і мегакаріобластного лейкозів, меланоми шкіри (Галахін К.О. та ін., 2008). Також ГА-40 призначається хворим при доброякісних новоутвореннях та передпухлинних процесах: фіброми, міоми матки, аденоми передміхурової залози, мастопатії.

Незважаючи на велику кількість робіт, присв'ячених ангіогенезу, існують протилежні думки про його роль в клінічному перебігу, метастазуванні і прогнозі пухлинного процесу, хоча більшість авторів стверджують, що критеріями агресивності злоякісного росту і несприятливого прогнозу захворювання є саме ангіогенез та його показники (висока щільність судин у пухлинах, підвищення у сироватці крові рівня фактора росту судинного ендотелію (VEGF)) (Новак О.Є., Лісняк І.О., Чехун В.Ф., 2002; Folkman J., 2002; Осинский С.П. та ін., 2007). Наявність таких оцінок щодо ролі ангіогенезу у процесі пухлинного росту свідчить про необхідність подальшого вивчення механізмів неоваскуляризації та особливостей мікроциркуляторного русла пухлин, особливо під впливом нових лікарських засобів, зокрема фітопрепарату ГА-40.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дослідження за темою дисертації проведено в рамках планової науково-дослідної роботи кафедри променевої діагностики, променевої терапії та онкології Вінницького національного медичного університету ім. М.І. Пирогова на тему «Клініко-морфологічні аспекти діагностики, лікування та реабілітації хворих на злоякісні новоутворення» (№ держреєстрації 0104U002842, 2004-2010 рр).

Мета дослідження - визначити особливості мікроциркуляторного русла злоякісних новоутворень та їх метастазів при застосуванні фітопрепарату ГА-40 на моделях експериментальних пухлин.

Завдання дослідження:

1. Вивчити структурні зміни мікроциркуляторного русла карциноми Герена при застосуванні фітопрепарату ГА-40.

2. Провести порівняльний аналіз впливу фітопрепарату ГА-40 та циклофосфаміду і опромінення на мікроциркуляторне русло карциноми Герена.

3. Визначити особливості мікроциркуляторного русла карциноми легені Л'юїс при застосуванні фітопрепарату ГА-40 та його вплив на ріст пухлини і метастазування.

4. Визначити стан мікроциркуляторного русла меланоми В16 та особливості її метастазування під впливом фітопрепарату ГА-40.

5. Встановити зміни рівня VEGF в сироватці крові експериментальних тварин з пухлинами при застосуванні фітопрепарату ГА-40.

Об'єкт дослідження: експериментальні моделі пухлин (карцинома Герена, карцинома легені Л'юїс, меланома В16).

Предмет дослідження: інтратуморальне мікроциркуляторне русло первинних пухлин та їх метастазів.

Методи дослідження: методи експериментальної онкології - для оцінки росту злоякісних пухлин та їх метастазів; імуноферментний - для визначення рівня VEGF в сироватці крові експериментальних тварин з пухлинами; морфологічні - з використанням світлової та електронної мікроскопії - для вивчення структурних особливостей мікроциркуляторного русла пухлин та їх метастазів; морфометричні - для визначення кількісних показників пухлинного ангіогенезу; статистичні із застосуванням математичних моделей багатомірного аналізу - для обробки та аналізу отриманих даних.

Наукова новизна одержаних результатів. Встановлені антиваскулярні та антиангіогенні властивості фітопрепарату ГА-40 на основі вивчення стану мікроциркуляторного русла в експериментальних дослідженнях на трьох моделях пухлинного росту: карциномі Герена, карциномі легені Л'юїс та меланомі В16.

Виявлено гістологічні та ультраструктурні зміни судин карциноми Герена, які свідчать про гальмуючий вплив фітопрепарату ГА-40 на її мікроциркуляторне русло, що підтверджується зменшенням на 28 добу експерименту дольового вмісту в пухлині мікросудин та середньої площі судин у порівнянні з контрольною групою.

З'ясовано, що фітопрепарат ГА-40 проявляє інгібуючий вплив на неоваскуляризацію та метастазування у тварин з карциномою легені Л'юїс та меланомою В16. При цьому зменшується і об'єм первинної пухлини, і загальна кількість метастазів, і об'єм метастатичного ураження легень у порівнянні з групою тварин без лікування. Доведено, що застосування ГА-40 у тварин з карциномою легені Л'юїс та меланомою В16 призводить до одночасного зниження рівня VEGF в сироватці крові та збільшення кількості аваскулярних метастазів.

Практичне значення одержаних результатів. Застосування фітопрепарату ГА-40 на моделях експериментальних пухлин (карцинома Герена, карцинома легені Л'юїс, меланома В16) супроводжується як розвитком альтеративних змін в судинах мікроциркуляторного русла, так і гальмуванням процесів ангіогенезу в первинних пухлинах і їх метастазах. Виявлені властивості дозволяють рекомендувати застосування фітопрепарату ГА-40 в комплексному лікуванні хворих на злоякісні пухлини. На підставі результатів власних експериментальних досліджень визначено новий вектор фармакологічної дії цього препарату - пригнічення неоангіогенезу з гальмуванням пухлинного росту. Розпочата клінічна апробація ГА-40 у хворих з первинною меланомою шкіри в Національному інституті раку (м. Київ).

Отримані дані використовуються в навчальних програмах з онкології, гістології, нормальної та патологічної анатомії для студентів та лікарів-інтернів Вінницького національного медичного університету ім. М.І. Пирогова.

Особистий внесок здобувача. Дисертантом визначена мета та завдання даного дослідження, проаналізована наукова література з обраної теми. Здобувачем здійснено планування та виконання експериментів на щурах з пухлиною Герена, мишах з карциномою легені Л'юїс та меланомою В16. Також автором самостійно проведено аналіз первинної документації експериментів, статистична обробка результатів та їх інтерпретація. Дисертантом особисто сформульовані висновки та положення, підготовлений ілюстративний матеріал. У наукових розробках, що висвітлені в статтях, опублікованих сумісно з співавторами, участь здобувача полягала в проведенні експериментальних досліджень, статистичній обробці отриманих даних, формулюванні висновків та підготовці публікацій до друку.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації доповідались та обговорювались на: конференції молодих вчених та фахівців ВНМУ ім. М.І. Пирогова (Вінниця, 2002 р.); VI Міжнародному медичному конгресі студентів та молодих учених (Тернопіль, 2002 р.); III зїзді онкологів СНГ (Мінськ, 2004 р.); засіданні Вінницького обласного наукового товариства онкологів (Вінниця, 2005 р.); VII та IX Міжнародних конференціях молодих онкологів “Сучасні проблеми експериментальної і клінічної онкології” (Київ, 2006 р., 2008 р.); XI з'їзді онкологів України (Судак, АР Крим, 2006 р.); науково-практичній конференції молодих вчених “Медична наука: сучасні досягнення та інновації” (Харків, 2007 р.), VIII Міжнародному конгресі патологів України “Сучасні проблеми патологічної анатомії” (Полтава, 2008 р.).

Публікації. Основний зміст дисертаційної роботи викладений у 10 публікаціях, в тому числі у 5 статтях у фахових журналах, рекомендованих ВАК України, а також 5 тезах вітчизняних та міжнародних конференцій, конгресів та з'їздів.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається із вступу, огляду літератури, опису матеріалів та методів досліджень, розділу власних досліджень, аналізу та обговорення одержаних результатів, висновків, списку використаної літератури та додатків.

Дисертація викладена на 166 сторінках машинописного тексту, ілюстрована 50 рисунками (мікрофотографії та електронограми), 16 таблицями та 6-ма актами впровадження. Список використаних джерел літератури містить 183 найменування, з них 31 українською та російською мовами та 152 англійською мовою.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи дослідження. Дослідження проведені на 211 щурах (табл.1), яким перещеплювали карциному Герена та 95 мишах з карциномою легені Л'юїс (48 тварин) та меланомою В16 (47 тварин). Для вивчення змін в мікроциркуляторному руслі карциноми Герена без будь-яких впливів, а також при застосуванні фітопрепарату ГА-40 в порівнянні з циклофосфамідом та опроміненням було використано 211 щурів. Для проведення цієї частини роботи штам пухлини був наданий Інститутом експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України. Утримання тварин проводили у відповідності до загальних етичних принципів при проведенні експериментальних досліджень на тваринах (витяг з протоколу комітету з біоетики ВНМУ ім. М.І. Пирогова №21 від 21.11.2007 р.).

Карциному Герена перещеплювали білим нелінійним лабораторним щурам обох статей масою 130-160 г віком 4-5 місяців. Кожній тварині підшкірно в ділянці правої бокової поверхні тіла, ближче до задньої кінцівки та спини, однократно вводили 0,5 мл 20% суспензії пухлинних клітин. Всі тварини були розподілені на чотири групи. 1 групу склали контрольні щурі з карциномою Герена - 68 тварин. 2 групу - 47 щурів з пухлиною Герена, яким вводили фітопрепарат ГА-40 шляхом підшкірних ін'єкцій починаючи з 9 доби, на курс - 10 введень. Доза однієї ін'єкції складала 2 мкг/кг маси тіла один раз на добу у фіксований час (18.00), розчинник - вода для ін'єкцій. До 3 групи увійшли 50 тварин з карциномою Герена, які отримували циклофосфамід. Цитостатик вводили внутрішньоочеревинно в дозі 50 мг/кг - на 9 та 15 добу після перещеплення карциноми. Вибір такої дози пов'язаний з метою реалізації ефективної протипухлинної дії препарату та вивчення динаміки антиваскулярної дії. 4-ту групу склали 46 щурів з карциномою Герена, які були опромінені. Опромінення виконували на апараті „АГАТ-Р” двома фракціями: на 9 та 10 добу після перещеплення пухлини. Разова доза складала 9,5 Гр, сумарна осередкова доза - 44 Гр. Поле опромінення на пухлину становило 5Ч4 см з глибиною 1,5-2 см, середній час опромінення 6 хв 54 сек.

Дослідження впливу фітопрепарату ГА-40 на неоваскуляризацію, метастазування та рівень VEGF у мишей з метастазуючими пухлинами виконані на базі Інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України. Експерименти виконані на мишах лінії С57В?/6 обох статей віком 8-10 тижнів. Всі миші були розподілені на дві групи . В першій - 48 мишей, яким внутрішньом'язово в стегно було перещеплено суспензію 5х10⁵ пухлинних клітин з карциномою легені Л'юїс. Їх розподілили в свою чергу на 25 контрольних тварин та 23 тварини, яким вводили фітопрепарат ГА-40. Другу групу склали 47 мишей, яким було перещеплено 5х10⁵ пухлинних клітин меланоми В16 шляхом внутрішньом'язового введення в стегно. Вони були поділені на дві підгрупи: в першій - 22 контрольні тварини, в другій - 25 тварин, які отримували досліджуваний фітопрепарат. Фітопрепарат ГА-40 починали вводити на 20-22 добу після перещеплення пухлини при досягненні її розміру 8-10 мм. Введення препарату виконували щоденно протягом 10 діб внутрішньом'язово по 0,04 мкг/тварину (при рекомендованій дозі 2 мкг/кг) в об'ємі 0,1 мл.

Забір матеріалу для світлової мікроскопії проводили у щурів з карциномою Герена після виведення з експерименту під ефірним наркозом: тварин групи контролю - на 8, 12, 16, 20, 24 та 28 добу після перещеплення пухлини, тварин інших трьох дослідних груп - на 12, 16, 20 та 28 добу. Забір шматочків тканини проводили з двох ділянок пухлини - центральної та периферичної частини. Досліджуваний матеріал фіксували в 10% нейтральному формаліні з наступною заливкою в парафін. Отримані зрізи забарвлювали гематоксиліном та еозином, пікрофуксином за Ван Гізоном, толуїдиновим синім, проводили трихромну реакцію за Маллорі та досліджували в світлооптичному мікроскопі МБИ-11У42.

Електронномікроскопічні дослідження виконували за загальноприйнятою методикою (Уилки, 1975). Забір матеріалу пухлин щурів проводили на 12 та 28 добу після перещеплення. Всі відібрані фрагменти пухлин подрібнювали на блоки розміром 1 ммі, фіксували в 2,5% глютаровому альдегіді, постфіксували в 1% розчині OsO4, обробляли 1% розчином танінової кислоти з подальшою ступінчатою дегідратацією в етанолі та заключенням в аралдіт. Напівтонкі зрізи готували на ультратомі LKB-III, забарвлювали 1% розчином толуїдинового синього, що давало можливість знаходити в зрізі та диференціювати різні компоненти пухлини, зокрема, судини. Ультратонкі зрізи (50-60 нм) робили на ультратомі LKB-III, які монтували на сітки і забарвлювали цитратом свинцю за Reynolds на 30 хв. при кімнатній температурі та уранілацетатом протягом 15 хв при температурі 56єС. Проводили аналіз і фотографування на електронному мікроскопі ЕМ-125к при прискореній напрузі 75 кВ.

Гістоморфометричне дослідження зрізів карциноми Герена виконували за допомогою аналізатора зображень: мікроскопа Люмам Р8, мікрофотонасадки МФН-10 з цифровою фотокамерою Kokom CCD та персонального комп'ютера. Метричні характеристики мікросудин обраховані на базі програмного забезпечення UTHSCSA Image Tool ® for Windows ® (version 2.00). Визначали середню площу однієї судини - показник Р1, кількість судин на одиницю площі (інтратуморальна щільність мікросудин) - Р2 та питому вагу судинного русла (відношення площі судинного русла до площі пухлини) - показник Р3.

Мишей з карциномою легені Л'юїс та меланомою В16 виводили з експерименту через 5 діб після закінчення введення фітопрепарату. Визначали об'єм пухлин, об'єм метастатичного ураження легень. У видалених легенях визначали загальну кількість метастазів та розміри кожного з них. Потім проводили розподіл їх кількості за розмірами: від 0,5 до 3 мм з інтервалом в 0,5 мм. Облік та вимірювання метастазів проводили за допомогою бінокулярного мікроскопу БМ-51-2. Для гістологічного дослідження проводили забір легень, уражених метастазами, фіксували в 10% розчині нейтрального формаліну з наступною заливкою в парафін. Гістологічні зрізи забарвлювали гематоксиліном та еозином, пікрофуксином за Ван Гізоном, толуїдиновим синім, проводили реакцію Массона та досліджували в світловому мікроскопі “Polіvar-2” (Рейхерт).

У всіх мишей проводили забір крові з подальшим отриманням сироватки для визначення рівня VEGF на базі Інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України. Визначення рівня VEGF проводили імуноферментним методом за допомогою тест-системи із застосуванням поліклональних антитіл до VEGF165 (Santa Cruz, США). В якості вторинних антитіл використані овечі антитіла до імуноглобуліну G кроля, кон'юговані з пероксидазою хріну (Dako, Данія). Оцінку рівня VEGF здійснювали на фотометрі "Multiscan" при довжині хвилі 492 нм і розраховували за калібровочною кривою, яка будувалась як залежна складова оптичної щільності від концентрації VEGF.

Для аналізу основних кількісних показників ангіогенезу карциноми Герена у щурів використані багатомірні процедури генералізованих лінійних моделей GLM пакету системи статистичного аналізу SAS версія 9.1.3. Для цього був обраний надпараметризований клас моделей, який дозволяє застосувати ІІІ тип розкладу сум квадратів. При дослідженні карциноми легені Л'юїс та меланоми В16 у мишей статистичну обробку отриманих кількісних показників пухлин і їх метастазів та рівня VEGF в сироватці крові проводили за параметричним t-критерієм Ст'юдента. В роботі використані пакети прикладних програм "Sigma Рlоt 5.0", “Excel 7.0” та “Biostat”.

Результати досліджень та їх обговорення. В контрольній групі щурів з карциномою Герена, починаючи з 8-ої доби, відмічено значний ріст пухлини. Паралельно відбувався процес утворення нових судин - ангіогенез. На електронномікроскопічному рівні на 12 добу зафіксовані ознаки формування просвітів нових капілярів, вистланих ендотеліоподібними клітинами. Значна девіталізація паренхіми пухлини реєструвалася на 16 добу. Одночасно навколо тонкостінних судин переважно капілярного типу, формувались розеткоподібні утворення. Починаючи з 20 доби росту пухлини Герена, спостерігались осередкові некрози внаслідок відсутності новоутворених капілярів центральних ділянок. В даний період з'являлись новоутворені судини щілиноподібної форми здебільшого капілярного типу та такі, в яких внаслідок перекалібровки потовщувались стінки. На 28 добу виникали поширені площі некротизації з редукцією судинного русла. Судини були розширені і повнокровні, як це спостерігається при стазі, що подібно явищу сладжування еритроцитів. Часто оточенням для кровотоку були клітини самої пухлини. На електронномікроскопічному рівні візуалізували гемокапілярну сітку з ознаками формування базальної мембрани.

При застосуванні фітопрепарату ГА-40 через 12 діб після перещеплення карциноми Герена відбувалось заміщення ділянок некрозу грануляційною тканиною з великою кількістю новоутворених гіпертрофованих фібробластів, серед яких знаходились сегментоядерні нейтрофіли, окремі судини. Зустрічалися і звичайні капіляри без ознак росту ендотеліальних клітин (хоча і ознак їх інгібіції теж не було) і капіляроподібні кровоносні щілини, які були обмежені пухлинними клітинами. Спостерігались морфологічні ознаки синтетичної активності ендотеліоцитів, що здатні продукувати фактори росту. Зареєстровані ознаки диференціювання із синтетичного в транспортний тип. Паренхіма пухлини всюди характеризувалась клітинним поліморфізмом з дистрофічними та некротичними змінами, фігурами патологічних мітозів. Субмікроскопічно на цей термін в окремих ділянках пухлини спостерігались також збережені пухлинні клітини з ознаками проліферативної активності. В них було збережене ядро, округле ядерце, багато еухроматину.

На 16 добу визначалися різні за площею ділянки некротично зміненої паренхіми, які мали тенденцію до злиття між собою. Слід підкреслити, що в таких зонах паренхіми некротизованими були також і стінки судин. В некрозах тонельного типу спостерігались набряк і крововиливи. У інтактних ділянках паренхіми виявлялись ознаки фібробластичної та ангіобластичної реакції, макрофаги, тонкостінні капіляри радіального напрямку. Процес колагенізації реєструвався переважно в капсулі, від якої в середину пухлини проростала сполучна тканина у вигляді грануляцій, в яких переважали тонкі колагенові фібрили. Фокуси некрозів містили різної щільності еозинофільний детрит, часто з пікнотизованими ядрами. На межі детриту, проникаючи між клітинами паренхіми, визначались паличкоядерні і сегментоядерні нейтрофіли.

В гістологічних зрізах карциноми на 20 добу виявлялися ще більш поширені ділянки некротизованої паренхіми. А в ділянках суміжних з такими осередками була видна дискомплексація клітинних популяцій, міжклітинний набряк з домішками лімфоцитів і нейтрофілів. В локусах дезорганізації пухлинної паренхіми все ще спостерігалась фібробластична і ангіобластична активність. На даний час судини були переважно капілярного типу будови.

Через 28 діб після перещеплення карциноми Герена за умов застосування фітопрепарату ГА-40 домінували процеси незворотньої альтерації пухлинної паренхіми. В центрі - скрізь у полях некрозів знищеними були не тільки пухлинні клітини, але й повністю судини і стромальні смуги. Судини були колаптоїдно розширеними, тонкостінними і містили нитки фібрину. Судинні стінки виявлялись повністю деструктурованими. Забарвлення зрізів пікрофуксином демонструє помірну колагенізацію стінок судин, з більш значним процесом фібротизації капсули, під якою знаходилось чимало нейтрофілів, лімфоцитів, фібробластів і макрофагів. При електронномікроскопічному дослідженн виявлялась вакуолізація або ущільнення цитоплазми з втратою органел без ознак проліферативної активності пухлинних клітин. І як компенсацію з боку судинного забезпечення пухлини, в ендотелії капілярів реєструвались розширені цистерни ендоплазматичної сітки. Також, як підтвердження фіброзного процесу, виявлялися функціонально активні молоді фібробласти.

Враховуючи результати гістоморфометричних досліджень, проведено багатомірний аналіз основних показників ангіогенезу, а саме середньої площі однієї судини (Р1), інтратуморальної щільності мікросудин (Р2) та питомої ваги судинного русла (Р3) в пухлині Герена контрольних тварин та тих, яким вводили фітопрепарат ГА-40. Як свідчать коефіцієнти детермінації, незалежні змінні і їх комбінації пояснюють 78,5%, 42,3%, і 61,3% варіації показників Р1, Р2 і Р3 відповідно. Усі коефіцієнти суттєві (р<0,01) і вказують на інформаційну обумовленість моделі. Через тестування багатомірних гіпотез проаналізовано, які саме незалежні змінні і їх комбінації найбільше визначали рівні показників Р1, Р2, Р3 разом. Всі основні ефекти (тобто вплив змінних “випадок”, “час”, “локалізація”), і два ефекти другого порядку (взаємодії “випадок-час” і “час-локалізація”) є суттєвими з р<0,001. Для оцінки достовірності ефектів за окремими залежними змінними (Р1-Р3), проведено тестування одномірних лінійних гіпотез ефектів.

Встановлено, що середня площа судини суттєво обумовлювалась ефектом “час” і взаємодією “випадок-час” (р<0,001). Її значення в пухлинах достовірно змінювалося (р<0,001) з 12 по 28 добу - збільшувалося під впливом фактора “час”. Достовірна відмінність середньої площі судини у пухлинах тварин, які отримували фітопрепарат ГА-40, в порівнянні з пухлинами контрольних тварин також зареєстрована в часі (р<0,001): у тварин, яким вводили ГА-40, вона збільшувалась (398,18 мкмІ і 2485,9 мкмІ - на 12 та 28 добу відповідно; ріст показника у 6,24 рази), і в пухлинах тварин контрольної групи теж (на 12 добу - 463,01 мкмІ та 3151,86 мкмІ на 28 добу; ріст у 6,81 рази). Однак на 28 добу середня площа судини була на 21% меншою в пухлинах тварин, які отримували ГА-40 на відміну від контролю (р<0,001).

Щільність судин суттєво обумовлена всіма головними дослідженими ефектами (р<0,001), проте жоден ефект вищого порядку не виявився суттєвим. Цей показник був відмінним в пухлинах тварин, які отримували ГА-40, від такого в пухлинах контрольних тварин (р<0,001). В пухлинах тварин, які отримували ГА-40, показник Р2 був меншим порівняно з P2 в пухлинах тварин контрольної групи (80 та 95 мікросудин на 1ммІ зрізу пухлини відповідно). Значення інтратуморальної щільності судин достовірно змінювалися (р<0,001) з ростом пухлин - зменшувались з 12 до 28 доби в обох групах. Так, у тварин, яким вводили фітопрепарат ГА-40, показник Р2 зменшувався у 2,73 рази (на 12 добу - 120 мікросудин на 1ммІ зрізу пухлини та 44 - на 28 добу відповідно). Показник Р2 достовірно відрізнявся і за локалізацією (р<0,001): він був меншим в центрі (77 судин на 1ммІ пухлинного зрізу) на відміну від такого в периферії пухлин (98 судин на 1ммІ пухлинного зрізу).

Відношення площі судин до площі пухлини (питома вага судинного русла) суттєво обумовлювалось всіма головними ефектами та двома ефектами другого порядку, а саме взаємодіями “випадок-час”, і “час-локалізація” (р<0,001). Показник P3 був відмінним в пухлинах тварин, які отримували ГА-40, від такого в пухлинах контрольних тварин (р<0,001). В дослідній групі він становив 0,07, в той час як в контрольній був більшим - 0,08. Значення показника Р3 достовірно змінювалося в процесі росту пухлини (р<0,001). Також відмічалась достовірна відмінність у відношенні площі судин до площі пухлини між тваринами, які отримували фітопрепарат ГА-40 та контрольними тваринами в часі (р<0,001). Так, у тварин, яким вводили ГА-40, показник Р3 збільшувався (з 0,048 до 0,105 - на 12 та 28 добу відповідно; ріст показника у 2,19 рази), в той час як в контрольних тварин він спочатку зменшувався (з 12 по 20 добу - з 0,07 до 0,051), а потім збільшувався (на 28 добу - у 2,78 рази, тобто до 0,142). На кінцевий термін досліджень показник Р3 був нижчим на 26% в пухлинах тварин, які отримували фітопрепарат ГА-40, ніж у пухлинах тварин контрольної групи (р<0,001). Відношення площі судин до площі пухлини відрізнялось також і за локалізацією: суттєво нижчі значення (р<0,001) відмічались в центрі (0,068) на відміну від периферії пухлин (0,082). Ця відмінність по локалізації наростала також в часі (р<0,001).

Отже, виявлені при застосуванні фітопрепарату ГА-40 гістологічні та ультраструктурні зміни судин свідчать про пошкоджуючий вплив препарату на мікроциркуляторне русло карциноми Герена, що призводить до прогресивного зменшення кровопостачання паренхіми. При застосуванні ГА-40 в процесі росту пухлини на 28 добу відбувається зменшення питомої ваги судинного русла на 26% та середньої площі однієї судини на 21% в порівнянні з такими ж показниками в пухлинах тварин контрольної групи. Також, на всіх термінах дослідження під впливом фітопрепарату в порівнянні з контрольною групою виявляється менша інтратуморальна щільність мікросудин, в цілому зменшуючись у 2,73 рази з 12 по 28 добу. Все це свідчить про антиваскулярні властивості препарату.

При використанні цитостатика циклофосфаміду, в якості препарату порівняння, в карциномі Герена домінував процес склерозу, що супроводжувався некрозом, а також руйнуванням стінок і відсутністю росту судин. Так, на 28 добу виявлялись ознаки субтотальної втрати пухлинної паренхіми з подальшою інкапсуляцією. Субмікроскопічно переважав процес колагенізації периваскулярних зон та активний фіброгенез з утворенням колагенових волоконець. Кількісно визначалося значне зниження всіх основних показників ангіогенезу на 28 добу. Зокрема, щільність мікросудин була у 4,29 рази менша, ніж в пухлинах контрольних тварин, а середня площа однієї судини з 12 по 28 добу зменшувалась у 5,37 рази. В цілому, встановлені факти підтверджують антиваскулярний вплив цитостатика.

При порівняльному дослідженні впливу опромінення на тварини з карциномою Герена, на гістологічному та ультраструктурному рівні виявлялися ознаки деструктивних змін паренхіми та мікроциркуляторного русла пухлини. А одним із основних механізмів редукції судинного русла пухлини за цих умов був фібриноїдний некроз стінок судин, стаз, сладж еритроцитів. Також відбувалось зменшення питомої ваги судинного русла з 12 по 28 добу - в 1,49 рази. Під впливом опромінення на всіх термінах дослідження відмічено зменшення інтратуморальної щільності мікросудин з загальним зниженням у часі в 3,55 рази у порівнянні з такими в контрольній групі. Крім того, на 28 добу зафіксовано зменшення в 2,32 рази середньої площі судини в порівнянні з такими ж показниками в пухлинах контрольних тварин. Приймаючи до уваги такі зміни морфометричних показників, можна стверджувати, що поряд із основною цитостатичною дією опромінення проявляє певні антиваскулярні властивості.

При застосуванні фітопрепарату ГА-40 у мишей з карциномою легені Л'юїс об'єм пухлини дорівнював 1104,0±94,4 ммі (табл. 2) та був достовірно меншим на 39% по відношенню до об'єму пухлин контрольних тварин (р<0,01). Об'єм метастатичного ураження легень у тварин, які отримували фітопрепарат, складав 4,69±1,19 ммі і був суттєво нижчим, ніж у тварин контрольної групи - у 2,37 рази (р<0,05). Також у мишей дослідної групи спостерігалась достовірно менша загальна кількість метастазів у легенях: 21,2±2,9 метастазів проти 32,2±4,3 у мишей контрольної групи, що менше на 34% (р<0,05). Такий ефект дії ГА-40 зумовлений розвитком деструктивних змін в судинах мікроциркуляторного русла карциноми легені Л'юїс та одночасним пригніченням пухлинного росту та метастазування у дослідних тварин.

При цьому під впливом фітопрепарату ГА-40 відбувався зсув кількості метастазів в бік переважання дрібних, тобто аваскулярних - 0,5-1 мм в діаметрі. Таких метастазів було 84,3±6,8%, що на 25% більше (р<0,05), ніж у контрольних тварин (67,7±4,3%). Співвідношення метастазів діаметром до 0,5 мм становило 21,4±6,1% в контрольній та 55,5±10,4% (р<0,01) в дослідній групі (більше у 2,59 рази). Кількість ізольованих метастазів до 1 мм складала 28,8±4,5% у тварин, які отримували фітопрепарат, проти 46,3±7,2% без впливу ГА-40, отже вона зменшилась на 38% (р<0,05). Кількість метастатичних вузлів до 1,5 мм також зменшилась на 25% (р<0,05) під впливом ГА-40 і складала 11,0±1,0% на відміну від 14,6±1,4% в контрольних тварин. І значно менша кількість метастазів розміром 2 мм (3,2±0,9%) та 2,5 мм (1,5±0,3%) у мишей з карциномою легені Л'юїс, які отримували ГА-40, що менше від показників у контролі в 4,09 та 2,27 рази (р<0,01) відповідно. Метастази розміром 3 мм у мишей під впливом фітопрепарату ГА-40 зовсім не реєструвались.

Встановлена достовірна відмінність рівня VEGF в сироватці крові у тварин з карциномою легені Л'юїс при застосуванні фітопрепарату ГА-40 в порівнянні з цим показником у тварин контрольної групи (р<0,05). Так, цей показник у мишей, які отримували препарат був меншим (123,2±8,8 пг/мл) ніж у тварин групи порівняння (152,9±10,1 пг/мл) на 19,4%.

При застосуванні фітопрепарату ГА-40 об'єм пухлини у мишей з меланомою В16 достовірно зменшувався на 38% (р<0,01) і дорівнював 1043,4±150,3 ммі. Об'єм метастатичного ураження легень також зменшувався. Так у тварин, які отримували препарат, він складав 5,27±0,92 ммі і був суттєво нижчим, ніж у тварин контрольної групи - на 43% (р<0,05). Також спостерігалась достовірно менша загальна кількість метастазів у легенях мишей, що отримували ГА-40 (23,4±2,3 метастази) на відміну від мишей контрольної групи (31,4±3,3 метастази).

Також у мишей з меланомою В16 під впливом ГА-40 відбувався зсув кількості метастазів в бік переважання гіповаскулярних або дрібних. Серед мишей, які отримували фітопрепарат, такі метастази (0,5-1 мм) зареєстровано в 89,32±9,45% випадків, що на 47% більше (р<0,05), ніж у тварин контрольної групи (60,66±7,84%), а кількість метастазів діаметром до 0,5 мм становила 15,91±6,35% в контрольній та 42,09±10,07% в дослідній групі. Число метастатичних вузлів до 1,5 мм та до 2 мм різко зменшилось під впливом фітопрепарату ГА-40. Так, метастазів до 1,5 мм було 9,83±3,05% проти 30,90±6,83% в контрольній групі, тобто їх кількість зменшилась у 3,14 рази (р<0,01). Саме менше було метастазів розміром 2 мм - 0,85±0,36% у мишей, які отримували ГА-40. Їх було у 7,49 рази (р<0,01) менше ніж у тварин контрольної групи. Метастази розміром понад 2 мм під впливом фітопрепарату ГА-40 не розвивались. Кращі показники в метастатичних осередках легенів за меншою кількістю та меншими розмірами при застосуванні ГА-40 можна пояснити розвитком в них дрібних і поширених зон некрозу та редукцією судинного русла.

Рівень VEGF в сироватці крові тварин з меланомою В16, які отримували фітопрепарат ГА-40, достовірно відрізнявся від рівня VEGF у тварин з меланомою В16 контрольної групи (р<0,05). Як видно із табл. 3, у мишей, які отримували ГА-40, цей показник був меншим на 21,9% (103,2±10,6 пг/мл), ніж у тварин групи порівняння (132,1±8,7 пг/мл).

При узагальненні отриманих кількісних та морфологічних особливостей стану метастазуючих карциноми легені Л'юїс та меланоми В16 у мишей, які піддавались дії фітопрепарату ГА-40, виявлено його суттєвий вплив на неоваскуляризацію, метастазування та рівень VEGF, що підтверджує новий вектор фармакологічної дії цього фітопрепарату - пригнічення неоангіогенезу з гальмуванням росту пухлин. Таким чином, результати дослідження на трьох моделях пухлинного росту свідчать про наявність антиваскулярних і антиангіогенних властивостей фітопрепарату ГА-40.

ВИСНОВКИ

В дисертаційному дослідженні на експериментальних пухлинах (карцинома Герена, карцинома легені Л'юїс, меланома В16) встановлені антиваскулярні та антиангіогенні властивості фітопрепарату ГА-40, який виявляє протипухлинну дію.

1. Застосування фітопрепарату ГА-40 гальмує розвиток в карциномі Герена мікроциркуляторного русла, про що свідчить зменшення на 28 добу експерименту питомої ваги судинного русла у порівнянні з контрольною групою з 0,142 до 0,105 (р<0,001), тобто на 26%, та середньої площі судин з 3151,86 мкмІ до 2485,9 мкмІ (р<0,001), тобто на 21%. Ступінь інтратуморальної щільності судин з 12 по 28 добу експерименту під впливом фітопрепарату ГА-40 у порівнянні з аналогічними термінами в групі контролю зменшується у 2,73 рази.

2. Структурні зміни судин мікроциркуляторного русла карциноми Герена у тварин при застосуванні фітопрепарату ГА-40 у порівнянні з контрольною групою характеризуються суттєвими морфологічними змінами ендотеліоцитів судин, розвитком в них виражених альтеративних змін, які супроводжуються некрозами паренхіми пухлини та склерозом як в стінках судин, так і в самій пухлині.

3. Порівняльний аналіз впливу фітопрепарату ГА-40 та циклофосфаміду і опромінення на мікроциркуляторне русло карциноми Герена виявив тотальне домінування склеротичних явищ і колагенізацію стінок судин при застосуванні цитостатика та дегенеративні зміни судинного русла під впливом опромінення.

4. Застосування фітопрепарату ГА-40 призводить до розвитку деструктивних змін в судинах мікроциркуляторного русла карциноми легені Л'юїс, пригнічення пухлинного росту та метастазування. При цьому об'єм первинної пухлини зменшується з 1818,1±65,4 ммі у контрольній групі до 1104,0±94,4 ммі (р<0,01), тобто на 39%, а загальна кількість метастазів аналогічно з 32,2±4,3 до 21,2±2,9 (р<0,05), тобто на 34%. Об'єм метастатичного ураження легень під впливом ГА-40 на відміну від тварин контрольної групи зменшується у 2,37 рази.

5. При застосуванні фітопрепарату ГА-40 у тварин з меланомою В16 відбувається редукція мікроциркуляторного русла внаслідок розвитку індукованого тромбозу, що призводить до достовірного зменшення об'єму пухлини з 1671,9±141,8 ммі у контрольній групі до 1043,4±150,3 ммі (р<0,01), тобто на 38%, об'єму метастатичного ураження легень з 9,21±1,61 ммі до 5,27±0,92 ммі (р<0,05), тобто на 43% та загальної кількості метастазів з 31,4±3,3 у контрольній групі до 23,4±2,3 (р<0,05), тобто на 25%.

6. Кількість аваскулярних метастазів в легенях під впливом препарату ГА-40 при карциномі легені Л'юїс в експериментальній групі тварин збільшується у порівнянні з контрольною з 67,7±4,3% до 84,3±6,8% (р<0,05), тобто на 25%, аналогічно при меланомі В16 - з 60,66±7,84% до 89,32±9,45% (р<0,05), тобто на 47%.

7. Рівень VEGF в сироватці крові тварин з карциномою легені Л'юїс при застосуванні фітопрепарату ГА-40 достовірно знижується з 152,9±10,1 пг/мл у контрольній групі до 123,2±8,8 пг/мл (р<0,05), тобто на 19,4%, а при меланомі В16 аналогічно з 132,1±8,7 пг/мл до 103,2±10,6 пг/мл, тобто на 21,9%.

СПИСОК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Лисенко С. А. Якісна та кількісна характеристика ангіогенезу в опромінених пухлинних трансплантатах у щурів / С. А. Лисенко // Морфологія. - 2007. - № 3. - С. 35-41.

2. Лисенко С. А. Мікроскопічні зміни в структурі трансплантованої інтактної пухлини Герена на різних стадіях її розвитку / С. А. Лисенко, М. С. Пушкар, Б. А. Болюх // Вісник морфології. - 2005. - Т. 11, № 2. - С. 259-263. (Дисертант особисто зібрав та проаналізував літературні джерела з даної проблеми, провів статистичну обробку результатів дослідження, підготовив матеріали до друку).

3. Лисенко С. А. Мікроскопічний та гістоморфометричний аналіз судинного русла експериментальної пухлини Герена під впливом цитостатика та імуномодулятора / С. А. Лисенко, М. А. Пушкар // Biomedical and biosocial anthropology. - 2005. - № 5. - С. 93-97. (Дисертант самостійно зібрав матеріал, провів його статистичну обробку та узагальнення отриманих результатів, написав та підготовив статтю до друку).

4. Електронномікроскопічні зміни в судинах експериментальної пухлини Герена під впливом циклофосфаміду, тималіну, опромінення / С. А. Лисенко, Б. А. Болюх, М. С. Пушкар, К. С. Волков // Вісник наукових досліджень. - 2007. - № 1. - С. 117-119. (Дисертант самостійно провів морфологічні експериментальні дослідження та здійснив статистичну обробку отриманих даних, написав та підготовив матеріали до друку).

5. Лисенко С. А. Вплив імунопрепарату ГА-40 на неоваскуляризацію, метастазування та рівень VEGF на моделі експериментальних пухлин / С. А. Лисенко, К. О. Галахін, Т. В. Гордієнко // Вісник медицини та біології. - 2008. - № 2. - С. 41-43. (Дисертант самостійно здійснив експериментальні дослідження, провів підбір методик та статистичну обробку отриманих результатів, підготовив матеріали до друку).

6. Лисенко С. А. Судинне русло експериментальної пухлини Герена під впливом лікарських засобів / С. А. Лисенко // VI міжнар. мед. конгр. студентів та молодих учених, 21-23 трав. 2002 р.: матеріали конгр. - Тернопіль, 2002. - С. 205.

7. Элементы ангиогенеза в растущем опухолевом трансплантате / С. А. Лысенко, Б. А. Болюх, М. С. Пушкар, А. В. Чоботар, А. А. Яцишин // III съезд онкологов и радиологов СНГ, 25-28 мая 2004 г.: материалы съезда. - Минск, 2004. - С. 339-340.

8. Лисенко С. А. Особливості променевого впливу на структуру паренхіми та судинного русла експериментальної пухлини Герена / С. А. Лисенко // Сучасні проблеми експериментальної і клінічної онкології : VII міжнар. конф. молодих онкологів, 2-3 лют. 2006 р.: тези конф. - К., 2006. - С. 51.

9. Лисенко С. А. Особливості судинного русла експериментальної пухлини Герена під впливом циклофосфаміду / С. А. Лисенко, М. С. Пушкар, Б. А. Болюх // XI з'їзд онкологів України, 29 трав.-2 черв. 2006 р.: матеріали з'їзду. - К., 2006. - С. 29.

10. Лисенко С. А. Морфологічні особливості неоваскуляризації пухлини Герена під впливом препарату ГА-40 / С. А. Лисенко // Сучасні проблеми експериментальної і клінічної онкології : IХ міжнар. конф. молодих онкологів, 23-24 квіт. 2008 р.: тези конф. - К., 2008. - С. 77.

Размещено на Allbest.ru