Токсикологічна характеристика дельтаметрину у формі децис форте

Размещено на http://www.allbest.ru

Размещено на http://www.allbest.ru

Вступ

Актуальність теми. В умовах подальшої інтенсифікації сільського господарства невід'ємним складником технології обробки культурних рослин і підвищення продуктивності тваринництва є їх захист від шкідливих членистоногих (Ткачов А.В., 2004). Проте, з позитивною характеристикою використання пестицидів є й певні негативні наслідки їх широкого та науково необґрунтованого застосування. Це, передусім, здатність зберігатися протягом тривалого часу в навколишньому середовищі, накопичуватися в кормах та продуктах харчування. Використання пестицидів у обробках на значних територіях призводить до їх розповсюдження у ґрунті, водоймищах, рослинах, що створює реальні умови для проникнення цих речовин до організму тварин і людини (Мартиненко В.І., Промоненков В.К., Кукаленко С.С. та ін., 1992; Клісенко М.А., Демченко В.Ф., Макарчук Т.Л.,1999; Малинін О.О., Хмельницький Г.О., Куцан О.Т., 2002).

Піретроїдні інсектициди - препарати, які широко застосовуються як у рослинництві, так і у ветеринарній медицині. Відомо, що ці пестициди мають низький рівень кумуляції, незначні тератогенні, мутагенні, ембріотоксичні, бластомогенні та не встановлені канцерогенні властивості (Бредбері С.П., Коупс Дж. Р., 1993; Шепельська Н.Р.,1999).

З одного боку, ці сполуки відносно швидко руйнуються у навколишньому середовищі, особливо під впливом сонячного проміння, що характеризує низьку вірогідність забруднення ними довкілля, а з другого боку - ця властивість обумовлює їх недостатню експозицію під час обробки об'єктів (Андрєєв Л.М., Перлова Т.Г., Промоненков В.К., 1992).

Поява на ринку пестицидів значної кількості різних форм препаратів з діючою речовиною (д.р.) дельтаметрином потребує більш глибокого вивчення їх токсикологічних характеристик щодо біологічних об'єктів.

Децис форте 12,5 % к.е. - синтетичний піретроїд третього покоління, у якому збережена стереохімія ефіру циклопропанкарбонової кислоти початкового піретрину І, а спиртова та кислотна частини сполуки представлені L-ціано-3-феноксибензильною групою та дибромвініловою в боковому ланцюзі цис-положення (Deltamethrin, IARC Summary and Evaluation, 1997).

Для цього препарату характерна висока швидкість біотрансформації з утворенням у рослинах вуглеводнів і амінокислот, а в організмі тварин - сульфатів і глюкуронатів та виведення його з організму (Малинін О.О., Шуляк В.Д., Бабій Л.І. та ін. 1995; Juliet S., Chakraborty A.K., Koley K.M., et all., 2001).

Через відсутність даних щодо параметрів гострої токсичності дельтаметрину у формі децис форте, а також суперечливість результатів щодо цитотоксичних властивостей, особливостей його токсикокінетики та токсикодинаміки в гострому та хронічному експериментах, використання недосконалих методик визначення залишкових кількостей згаданого вище препарату є актуальним і необхідним для проведення додаткових досліджень, в яких би визначили ці характеристики інсектициду. Згідно з даними зарубіжної літератури, це питання маловивчене, а у вітчизняній розробляється вперше.

Мета і завдання досліджень. Метою роботи було наукове обґрунтування параметрів токсикологічної характеристики дельтаметрину у формі децис форте.

У зв'язку з цим було необхідним вирішення наступних завдань:

- удосконалити методику визначення дельтаметрину в молоці способом тонкошарової хроматографії;

- установити валідаційні характеристики методики визначення препарату згідно зі стандартом „ІSO 5725-1:1994” та “Європейською інструкцією щодо застосування аналітичних методів та інтепретації результатів ЄС 657/2002”;

- визначити параметри гострої токсичності децис форте 12,5 % к.е. для білих щурів за перорального введення;

- вивчити цитотоксичні властивості децис форте в перещеплюваній культурі клітин нирки великої рогатої худоби MDBK;

- вивчити токсикокінетику та токсикодинаміку дельтаметрину у формі децис форте 12,5 % к.е. у курей за умов гострого та хронічного експериментів.

1. Матеріали та методи досліджень

Робота виконувалась упродовж 1998 - 2006 років у лабораторії токсикологічного моніторингу Центру токсикологічних досліджень, ветсанекспертизи, сертифікації кормів та продуктів тваринництва ННЦ “Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини”.

Виконання експериментальної частини базувалося на загальновизнаних методах досліджень як вітчизняних, так і зарубіжних учених.

У проведених дослідженнях був використаний децис форте 12,5 % к.е. (реєстраційний номер Б 00189 Управління безпеки хімічних речовин України). Стандартні розчини інсектициду - 1, 10 та 100 мкг/см3 - готували на гексані. Під час визначення ступеня токсичності на біологічних об'єктах (культурі клітин, тваринах) використовували водні розчини децис форте.

Удосконалення методики ґрунтувалося на: „Методических указаниях по определению синтетических пиретроидов (амбуш, децис, рипкорд, сумицидин) в растениях, почве, воде водоемов методами газожидкостной и тонкослойной хроматографии” (Д.Б. Гиренко, М.А. Клисенко и др.), затверджених 22.10.81 № 2473-81, які й до сьогодні використовуються в лабораторіях.

Залишки дельтаметрину визначали способом тонкошарової хроматографії. Дослідження передбачали вилучення інсектициду з матриці, підбору оптимального екстрагенту (органічного розчинника), відпрацювання очищення екстрактів - фільтрації, виморожування, перерозподілу в системах розчинників, що не змішуються, та хроматографії на колонках.

Відповідно до стандарту „ІSO 5725-1:1994” встановили валідаційні характеристики удосконаленого методу, які передбачали визначення: специфічності, точності, лінійності, відтворюваності, меж детектування та визначення методу, стабільності дельтаметрину в розчині та матриці.

Дослідження з установлення параметрів гострої токсичності децис форте після одноразового перорального введення білим щурам здійснювали за методичними рекомендаціями (Косенко М.В., Малик О.Г., Коцюмбас І.Я. та ін., 1997). DL50 підраховували, використовуючи метод найменших квадратів для пробіт-аналізу кривих летальності в модифікації Прозоровського В.Б. (1962), а похибку - за методом Miller та Tainter (Miller C.L., Tainter M.L., 1944).

Патологоанатомічний розтин тварин, що загинули, здійснювали з фіксацією змін у органах і тканинах (Жаров А.В., Іванов І.В., Стрельников А.П., 2003).

Цитотоксичні властивості децис форте, його здатність впливати на виникнення патологій, пов'язаних із зміною структури й функціонування клітин, вивчали на перещеплюваній культурі клітин нирки великої рогатої худоби МDBК. Клітини вирощували в ростовому середовищі Ігла і 199 (1:1) з додаванням 10 % нативної сироватки крові великої рогатої худоби. Інкубували їх за температури 37 °С у культуральних флаконах упродовж 48 годин до утворення моношару клітин. Токсичні концентрації дельтаметрину визначали під час мікроскопічного дослідження після 24-х годинної експозиції моношарової культури. Цитотоксичні властивості оцінювали за цілісністю моношару та ступенем його пошкодження, характером розташування елементів клітин та їх кількістю із зернистою цитоплазмою.

Для вивчення впливу децис форте на мітотичний режим клітини MDBK висівали на накривні скельця розміром 12 х 24 мм і розміщували в культуральних флаконах. Після формування моношару клітин у ростове середовище вносили різні концентрації інсектициду з подальшим визначенням мітотичних параметрів клітин.

Клітини фіксували спиртово-оцтовим розчином (3:1) через 24, 48 і 72 години після внесення дельтаметрину. Препарати фарбували гематоксиліном Карачі згідно методичним рекомендаціям (Голідонова Н.Д., Джарилгасов С.А., Падалкін В.П., 1977; Білокінь В.С., Стегній Б.Т., Берус П.Т та ін., 1993).

Вивчення патологічних форм мітозу здійснювали за класифікацією Алова А.І. (Авцин А.П., Шаламов В.А., 1979; Адамс Р.,1983), визначаючи їх частку від загальної кількості мітозів.

Досліди щодо вивчення токсикокінетики та токсикодинаміки дельтаметрину у формі децис форте 12,5 % к.е. проводили в гострому та хронічному експериментах на курях м'ясо-яєчного напрямку породи білий леггорн, віком 5 і 18 місяців.

Після закінчення адаптаційного періоду курям у гострому досліді одноразово індивідуально вводили водну емульсію децис форте в дозах 50 мг/кг (перша група) та 100 мг/кг маси тіла (друга група). Контрольна група курей одержувала воду, вільну від інсектициду. У хронічному експерименті курям першої групи щоденно згодовували корм із піретроїдом у дозі 5 мг/кг, а другої - у дозі 20 мг/ кг корму протягом шестидесяти діб. Контрольна група птахів одержувала корм, без вмісту препарату.

Під час проведення гострого і хронічного дослідів на курях залишкові кількості дельтаметрину визначали із застосуванням методу газорідинної хроматографії, розробленого співробітниками Центру токсикологічних досліджень ННЦ „ІЕКВМ”. Досліджували кров, головний мозок, серце, легені, селезінку, нирки, внутрішній жир, печінку, білу та червону м'язові тканини, вмістиме м'язового шлунка, дванадцятипалої кишки в гострому досліді - на першу, третю, сьому та чотирнадцяту доби; у хронічному досліді - на шестидесяту добу.

Під час проведення гістоморфологічних досліджень зразки органів фіксували у 10 % розчині нейтрального формаліну та в рідині Карнуа. Гістологічні зрізи готували з парафінових блоків, фарбували за методом Браше (метиловим зеленим та піроніном G), гематоксиліном та еозином. Також визначали загальний стан органів та окремих їх складових структур, оцінювали характер гістологічних змін, поширення патологічних та інволютивних проявів, довжину складових клітин, їх конфігурацію, густину епітеліального та ступінь розвитку поверхневого мозкового шарів (Саркісов Д.С., Петров Ю.Л.,1996).

У крові визначали число еритроцитів і концентрацію гемоглобіну (Заболоцький В.Т., Поляков Б.Ф., 1965); глюкози - за кольоровою реакцією з орто-толуїдином, піровиноградної кислоти - за модифікованим методом Умбретта (Самохін В.Т., Кондрахін І.П. та ін., 1981; Колб В.Г., Камишніков В.С., 1982), молочної кислоти - за Баркером і Саммерсоном (Кондрахін І.П., 1985); у сироватці крові - активність аланінамінотрансферази (АЛТ) та аспартатамінотрансферази (АСТ) - за кінетичним методом Рейтмана та Френкеля в модифікації Ошерович А.М., Мільнер Б.І. (1965), аденозинтрифосфатази (АТФ-азу) (Прохорова М.І., 1982), лужної фосфатази (ЛФ) - за Бессеєм, Лоурі та Броком (Васільєва Е.А., 1982).

Для визначення активності АЛТ, АСТ, ЛФ у печінці та ЛФ у нирках і стінці дванадцятипалої кишки зразки органів після розтину охолоджували, гомогенізували за допомогою скла і відповідних субстратно-буферних розчинів у співвідношенні 1:50. Для АЛТ використовували 50 мМ трис-НСІ буфер, АСТ - 0,25 М сахарозу на 0,05 М трис-НСІ буфері, для ЛФ - 0,05 М гліциновий буфер з 5,5Ч10-3 розчином р -нітрофенілфосфату. Гомогенізат центрифугували, фільтрували та зберігали в умовах побутового холодильника.

У статистичних підрахунках та обробці даних використовували методи варіаційної статистики та комп'ютерну програму Microsoft Office Excel 2003.

2. Результати досліджень

Удосконалення методики визначення залишків дельтаметрину в молоці способом тонкошарової хроматографії. Контроль за залишковими кількостями дельтаметрину в сільськогосподарській продукції є актуальним та потребує розробки нових або вдосконалення існуючих методів визначення.

Для покращання методики визначення залишків пестициду в біологічному матеріалі ми врахували основні вимоги, а саме: підбір екстрагенту, який забезпечує максимальне вилучення препарату із зразка, пробопідготовку (очищення, вивільнення від коекстрактивних речовин, виморожування жирів, тощо) та способи виявлення пестициду на платівці.

Під час підбору умов екстракції зразків молока оптимальними виявилися як екстрагент - ацетон у співвідношенні 1:2, так і використання електромеханічного струшувача протягом 30 хвилин. Виморожування впродовж 3 годин за температури 18 - 20 °С найкраще забезпечувало звільнення зразків від жиру. За цих умов на поверхні охолодженого ексктракту встановлено добре застиглі краплі молочного жиру. У процесі удосконалення системи рухливих розчинників, яка характеризувала положення пестициду на платівці з УФ-індикатором, найкращою виявилася система гексан-ацетон у співвідношенні 5:1, Rf становило 0,67 - 0,69. Після обробки платівки 1,5 %-ним розчином бензидину в ацетоні та опромінення УФ-променями дельтаметрин виявлявся у вигляді темно-синіх плям на жовто-коричневому фоні впродовж 1 - 2 хвилин. У наших дослідженнях найбільш придатними виявилися платівки для тонкошарової хроматографії “Реасорб” (алюмінієва підкладка, сорбент - силікагель КСКГ) марки ТХС-КСКГ-УФ 254.

Отримані результати є основою вдосконаленого методу визначення дельтаметрину в молоці способом тонкошарової хроматографії.

Новизна способу детекції дельтаметрину в молоці захищена деклараційним патентом України № 18281 від 15 листопада 2006 року „Спосіб визначення дельтаметрину в молоці”.

Експериментальне встановлення валідаційних характеристик методу визначення дельтаметрину в молоці способом тонкошарової хроматографії. Для того, щоб аналітичний метод відповідав своєму призначенню та гарантував вірогідні і точні результати відповідно до стандарту „ІSO 5725-1:1994” та „Європейської інструкції щодо застосування аналітичних методів та інтерпретації результатів ЄС 657/2002”, усі методи дослідження, що використовуються в лабораторіях, повинні бути валідовані та затверджені. Під час установлення валідаційних характеристик удосконаленої методики визначення дельтаметрину способом тонокошарової хроматографії використали коров'яче молоко 2,5 % - ої жирності, ДСТУ 2661 -94.

Отже, матеріали досліджень, використані під час розробки “Методичних вказівок із визначення дельтаметрину в молоці способом тонкошарової хроматографії”, будуть подані до Державного департаменту ветеринарної медицини Міністерства аграрної політики України для розгляду та прийняття рішення про затвердження.

Визначення параметрів гострої токсичності децис форте 12,5 % к.е. для щурів за умов одноразового перорального введення. Проведення досліджень щодо встановлення параметрів гострої токсичності децис форте було пов'язане з тим, що дані про DL50 згаданого вище препарату для ссавців у спеціальній літературі відсутні. Для цього ми провели два досліди - попередній і основний. У попередньому досліді щурам вводили інсектицид у широкому інтервалі доз - від 30 до 210 мг/кг маси тіла. Клінічна картина дослідних тварин характеризувалась ознаками гострого отруєння, що виявлялись спочатку загальним пригніченням, ціанозом видимих слизових оболонок, інтенсивною слинотечею, пітливістю, а потім загальним збудженням - тремором, судомами, плаваючими рухами кінцівок, спробами заритися в підстилку. При патологоанатомічному розтині виявлені такі зміни: у головному мозку - геморагічні крововиливи, розширення судин мозку, наявність рідкої темно-вишневої крові, що не згорнулася; у грудній порожнині - збільшення та кровонаповнення серця, у легенях - крапкові крововиливи, розширення судин порожнини, відсутністю згустків крові, темно-вишневого кольору; у черевній порожнині - збільшення та кровонаповнення печінки і селезінки, указані органи були темного-вишневого кольору; значне здуття шлунка і тонкого відділу кишковика; кровонаповнення судин стінок черевної порожнини і брижі, збільшення нирок. Відзначалися кровонаповнення підшкірних кровоносних судин та осередкові крововиливи у слизовий шар. Усі дослідні тварини загинули протягом 16 годин.

В основному експерименті щурам дослідних груп вводили інсектицид у менших дозах - 10, 15, 20, 25 і 30 мг/кг маси тіла, а контрольної групи - воду. Клінічні ознаки через півтори години після введення дослідного препарту характеризувалися пригніченням, відмовою від корму, інтенсивною салівацією, пітливістю, тремором, крутінням голови. Шерстяний покрив був вологим, скуйовдженим, щури заривалися в підстилку. Через дві з половиною години після введення інсектициду в піддослідних тварин спостерігалися: збудження, салівація та пітливість, судоми, плаваючі рухи кінцівками, скуйовдженість брудної, сірого кольору шерсті, синюшність видимих слизових оболонок. Через чотири години в групах, в яких щури одержували піретроїд у дозах 20 та 25 мг/кг маси тіла, загинуло по одній тварині. У живих щурів дослідних груп клінічні ознаки мали характер, який залежав від дози піретроїду, тобто стабілізація стану спостерігалася швидше в групах тих тварин, яким вводили меншу дозу препарату. При патологоанатомічному розтині встановлені такі ж зміни, що й у тварин, яким задавали дослідний препарат у більших дозах.

Установлено, що тварини загинули в основному в перші дві доби, кількість загиблих тварин щурів залежала від введеної дози інсектициду, а саме: у групах з дозами препарату: 10 і 15 мг/кг маси тіла не загинуло жодної тварини; 20 мг/кг - 2 щури; 25 мг/кг - 4, а у групі 30 мг/кг маси тіла загинули всі тварини. За результатами летальності щурів розрахували пряму графіку для пробіт-аналізу, використовуючи метод Міллера і Тейнтера, встановили величину помилки.

Отже, за нашими розрахунками, величина DL50 децис форте за одноразового перорального введення білим щурам становила 22,15 мг/кг маси тіла, а величина помилки - ±2,27 мг/кг, що дозволяє віднести інсектицид до сильнодіючих токсичних сполук.

Вивчення цитотоксичного ефекту дельтаметрину у формі децис форте в перещеплюваній культурі клітин нирки великої рогатої худоби MDBK. Цитотоксичні властивості децис форте, його здатність впливати на виникнення патологій, пов'язаних із зміною структури і функціонування клітин, вивчали в перещеплюваній культурі клітин нирки великої рогатої худоби МDBК.

Установлено, що концентрації, які відповідають DL50 у дослідах in vivo, та десятикратному розведенні - 22,15 мкг/см3 та 22,15х10-1 мкг/см3 відповідно, викликали повну деструкцію моношару культури, склеювання клітин, грануляцію цитоплазми та руйнування їх морфологічної структури. Мітотичну активність та патологічні мітози культури МDBК були вивчені за дії препарату в менших концентраціях.

Установлено, що концентрація 22,15х10-2 мкг/см3 викликала незначну грануляцію цитоплазми та порушення морфоструктури клітин. Розведення 22,15х10-3, 22,15х10-4 та 22,15х10-5 мкг/см3 помітних порушень структури клітин не виявили. Дані таблиці свідчать, що розведення децис форте 22,15·102 мкг/см3 протягом 24 годин підвищувало мітотичну активність у 1,5 раза. Через 48 і 72 годин експозиції піретроїду встановлено зниження мітотичної активності.

Підвищення рівня мітотичної активності супроводжувалося збільшенням кількості патологічних мітозів. На 24 та 48 години у всіх концентраціях піретроїду встановлено вірогідне збільшення кількості патологічних мітозів у 2 - 2,5 раза. Патологічні мітози були пов'язані з пошкодженням мітотичного та хромосомного апаратів клітин. Найбільша кількість патологічних форм ділення клітин під дією децис форте була виявлена на першу добу і характеризувалася:

- колхіциновим (К-) мітозом у концентраціях 22,15х10-5 мкг/см3 - 37 %; 22,15х10-4 - 36 %; 22,15х10-3 - 29 % та у 22,15х10-2 мкг/см3 - 41 %, у порівнянні з контролем - 23 %;

- хромосомами, що злиплися - високий рівень яких, у порівнянні з контролем, виявляли впродовж трьох діб досліджень у всіх концентраціях децис форте: контроль - 10 %; 22,15х10-5 мкг/см3 - 41 %; 22,15х10-4 - 59 %; 22,15х10 -3 - 73 % та у 22,15х10-2 мкг/см3 - 58 %;

- утворенням „мікроядер”: контр. - 7 %; у 22,15х10-5мкг/см3 - 3 %; 22,15х10-4 - 9 %; 22,15х10-3 - 12 % та у 22,15х10-2 мкг/см3 - 23 %.

Отже, підвищення мітотичної активності культури клітин указує на стимулювальні властивості інсектициду, а утворення зазначених патологій ділення (К- мітозу, хромосом, що злиплися та „мікроядер”) свідчать про незначні мутагенні властивості децис форте.

Вивчення токсикокінетики та токсикодинаміки дельтаметрину у формі децис форте 12,5 % к.е. у курей за умов гострого експерименту.

Для визначення впливу та механізму дії децис форте в токсичних дозах на курей за одноразового внутрішнього введення ми провели дослід, який передбачав вивчення специфіки клінічних проявів після застосування піретроїду, особливостей впливу на гематологічні показники та активності ферментів, розподілу в тканинах та швидкості виведення з організму, визначення патологоанатомічних змін тканин та органів.

Клінічні ознаки отруєння децис форте у курей обох дослідних груп характеризувалися симптомами впливу на центральну нервову систему - відзначали збудження, лякливість, реагування на голосні звуки та світло з навколишнього середовища, крутіння головою, збентеження, збільшення спонтанної рухової активності, некоординованість рухів. У деяких курей спостерігалася блювота, тьмяність та вологість пір'я, синюшність гребеня, сережок та видимих слизових оболонок, відмова від корму та спрага. Більш виражені ознаки інтоксикації спостерігалися у групі курей, які отримували препарат у дозі 100 мг/кг маси тіла. На третю добу після введення інсектициду згадані вище клінічні ознаки гострого отруєння не спостерігалися і в загальному стані курей визначилася тенденція до нормалізації.

Для встановлення характеру розподілу дельтаметрину проводили забій курей і відбір крові та внутрішніх органів через одну, три, сім та чотирнадцять діб після введення препарату.

При визначенні коефіцієнта мас внутрішніх органів після одноразового введення децис форте встановлено його зменшення на 10 % для маси серця у групі з дозою 100 мг/кг; у обох дослідних групах зменшення цього показника для нирок на 38,89 %. У показниках коефіцієнтів маси дванадцятипалої кишки спостерігалося зменшення на 22 % у першій групі та збільшення на 12,19 % у другій. Показники коефіцієнта маси печінки та селезінки істотно не відрізнялися від курей контрольної групи.

Особливості токсикокінетики децис форте в організмі курей знаходяться у прямій залежності від дії препарату в дослідних дозах та структури тканин, тобто розподіл та рівень накопичення залишкових кількостей дельтаметрину відбувався переважно в органах травного каналу та жировмісних тканинах.

Найбільша кількість інсектициду в групі з дозою 50 мг/кг через одну добу була встановлена в м'язовому шлунку - 0,25 мг/кг, дванадцятипалій кишці - 0,08 мг/кг та легенях - 0,021 мг/кг. А через три доби - у червоній м'язовій тканині (0,075 мг/кг), дванадцятипалій кишці (0,04 мг/кг), внутрішньому жирі, нирках, м'язовому шлунку (відповідно по 0,03 мг/кг) та в серці (0,011 мг/кг).

На сьому та чотирнадцяту доби досліджень залишкові кількості дельтаметрину в зразках органів і тканин були нижчими від межі величин визначення (0,01 мг/кг). У мозку, печінці та селезінці залишків інсектициду не виявляли впродовж всього терміну досліджень.

У другій групі з дозою препарату 100 мг/кг показники залишкових кількостей установлено на першу та третю доби, які утримувалися до сьомої доби. Імовірно, це пов'язано з введеням дози препарату, яка була збільшена вдвічі. Найбільший вміст піретроїду через одну добу після введення був виявлений в м'язовому шлунку - 0,37 мг/кг, печінці - 0,27 мг/кг, дванадцятипалій кишці - 0,16 мг/кг, мозку інирках - по 0,13 мг/кг. Через три доби після введення найвищі залишкові кількості пестициду були встановлені в серці (0,38 мг/кг), легенях (0,16 мг/кг), м'язовому шлунку (0,12 мг/кг), селезінці (0,11 мг/кг) тощо. На сьому добу вміст дельтаметрину в тканинах виявлено на достатньо значущому рівні, особливо в зразках органів, які беруть участь у трансформації іевакуації препарату з організму, а саме в печінці - 0,09 мг/кг, м'язовому шлунку - 0,03 мг/кг, дванадцятипалій кишці - 0,03 мг/кг, нирках - 0,011 мг/кг та селезінці - 0,05 мг/кг.

Децис форте є ліпотропною отрутою, тому залишки інсектициду в жировій тканині були встановлені на всіх етапах дослідження (на третю добу - 0,034 мг/кг; на сьому - 0,031 мг/кг та на чотирнадцяту добу - 0,01 мг/кг). Через чотирнадцять діб після введення в обох дослідних групах дельтаметрин визначався на рівні межі величин визначення (0,01 мг/кг). Під час дослідження крові залишкові кількості дельтаметрину були нижчими від межі визначення методу.

Введення децис форте вплинуло на гематологічні показники. Зокрема, вірогідні зміни вмісту гемоглобіну спостерігали лише в групі з дозою 50 мг/кг маси тіла. Через одну добу після введення інсектициду встановлено зменшення показника на 11,4 %, а через сім діб - незначне збільшення. На чотирнадцяту добу досліджень відзначена нормалізація показників, що вивчалися. Рівень гемоглобіну в групі з дозою 100 мг/ кг маси тіла, порівняно з контролем, на всіх термінах досліджень був без істотних змін. Число еритроцитів у обох експериментальних групах вірогідно зменшилася через одну добу після введення - у першій групі на 9,76 %, у другій - на 8,79 %., на третю добу відповідно - на 3,95 % та 13,31 %.

На третю добу встановили зміну рівня показників обміну вуглеводів. Зокрема, вміст глюкози порівняно з контролем зменшився в першій групі на 21,3 %, а в другій - на 18,52 %. Рівень піровиноградної кислоти був нестабільним. Якщо на третю добу цей показник значно знизився у першій групі - на 44,76 %, у другій - на 30,25 %, то на сьому добу спостерігалося підвищення рівнів, особливо в групі з дією препарату в дозі 100 мг/кг маси тіла. А саме, рівень пірувату у першій групі підвищився на 14,76 %, а в другій - на 63,25 %. На чотирнадцяту добу була виявлена тенденція зниження вмісту піровиноградної кислоти у крові до контролю в групі з дозою 50 мг/кг маси тіла на 16,58 %, а у групі з дозою 100 мг/кг маси тіла - на 9,08 %. Також установили, що вміст молочної кислоти, в порівнянні дослідних і контрольної груп змінювалась тільки в другій групі: на першу добу збільшився на 17,8 %, на чотирнадцяту - зменшився на 13,3 % відповідно. Значення вище вказаного показника не виходила за межі статистично значущих величин.

У процесі встановлення гепатотоксичного впливу децис форте на курей визначали активність індикаторних ферментів - АЛТ, АСТ, ЛФ та АТФ-ази.

Коливання активності ферментів ЛФ і АТФ-ази у сироватці крові курей виявили на першу, третю та сьому доби. Вірогідне зниження активності ЛФ встановлено на сьому добу в першій групі - на 18,16 %, у другій - на 32,3 %. Пригнічення АТФ-ази на першу добу після введення препарату в першій групі зафіксовано на 36,72 %, у другій - на 16,66 %. Зміна показників активності ферментів залежала від доз, що вводилися, та мала тимчасовий характер - тенденція до стабілізації спостерігалася на чотирнадцяту добу після введення інсектициду.

У вивченні активності амінотрансфераз у печінці було встановлено зниження показників упродовж усього експериментального періоду. Активність АЛТ на першу добу зменшилась в групі з дією препарату в дозі 50 мг/кг - на 26,85 %, у групі 100 мг/кг - на 61,97 %, а показник АСТ на третю добу відповідно - на 5,27 %, та на 13,16 %.

Піретроїд виявив деякі особливості впливу на активність ферменту ЛФ у печінці, нирках та дванадцятипалій кишці. У печінці менша доза препарату упродовж усіх термінів визначення викликала підвищення показників у межах від 3,0 до 7,48 %, а більша - пригнічення активності ЛФ від 10,43 до 14,91 %. У нирках найвищий рівень активності встановили через одну добу після введення: в групі з дозою 50 мг/кг маси тіла показник збільшився на 25 %, у групі з дією препарату в дозі 100 мг/кг - на 18,75 %. На третю та сьому доби значення активності ЛФ у обох групах були підвищені, але визначалась тенденція щодо зниження активності. На чотирнадцяту добу активність ферменту у порівнянні з контролем нормалізувалася. У дванадцятипалій кишці активність ЛФ була значно вищою в усі терміни визначення: у першій групі в межах 79,49 - 104,25 %, у другій 30,00 - 42,35 %. Значне підвищення активності ферменту було встановлене на чотирнадцяту добу в обох групах на 144,48 та на 58 % відповідно.

Гістоморфологічні дослідження внутрішніх органів і тканин курей засвідчили, що введення децис форте викликало деяку зміну будови і функціонування клітинних структур, а вплив препарату мав залежний від дози характер. Піретроїд у меншій дозі (50 мг/кг маси тіла) не виявив значної декомпенсаційної дії на стан органів, що досліджували. Виникнення більш глибоких структурних та функціональних патологічних відхилень в органах курей установлено за дози 100 мг/кг. Дельтаметрин викликав морфо-функціональні зміни в печінці, залозистому шлунку, тонкій кишці та виявив супресивну дію на лімфоїдні клітини фолікулів селезінки.

Вивчення токсикокінетики та токсикодинаміки дельтаметрину у формі децис форте 12,5 % к.е. у курей за умов хронічного експерименту. Вивчення особливостей прояву хронічної інтоксикації децис форте на курей при згодовуванні з кормом ґрунтувалося на визначенні характеру змін клінічних, гематологічних, біохімічних показників та встановленні специфіки розподілу препарату в тканинах, швидкості процесів метаболізму та виведення його з організму, патологоанатомічних змін тканин і органів.

Загальний клінічний стан курей, яким згодовували корм з препаратом у дозі 5 мг/кг, не виявив ознак інтоксикації - птахи добре споживали корм та воду, були активними. У курей другої групи (доза 20 мг/кг корму) у перші сім діб досліду встановлено пригнічення, невелику спрагу. На восьму добу ці ознаки були відсутніми. Кури обох груп адекватно реагували на подразники з навколишнього середовища (звуки, світло). Гребінь, сережки були еластичними, пір'я гладеньке, щільне, не вологе. Видимі слизові оболонки мали природний рожевий колір. Тремор, судоми, зміна спонтанної рухової активності були відсутніми.

На шестидесяту добу проводили забій курей та визначали коефіцієнти маси внутрішніх органів. Коефіцієнт маси серця збільшився відносно контролю в першій групі на 15,9 %, у другій - на 20,45 %. Коефіцієнт маси печінки в першій групі не відрізнявся від контрольного, у другій - зменшився на 15,4 %. Коефіцієнт маси селезінки збільшився в обох групах на 63,6 % та 18,1 % відповідно.

Розподіл залишкових кількостей дельтаметрину в органах і тканинах відбувався залежно від введених доз та органів можливого накопичення.

Зокрема, у першій групі залишкові кількості дельтаметрину в білих та червоних м'язах, селезінці, мозку були нижчими від межі визначення (0,01 мг/кг), а в другій групі залишкова концентрація препарату в перелічених зразках перевищувала у 2 - 4 рази, у червоних м'язах - навіть у 10 разів.

Найбільша концентрація препарату була виявлена за обох доз у внутрішньому жирі - 0,613±0,02 та 1,25±0,03 мг/кг, нирках - 0,16±0,03 та 0,29 ±0,03 мг/кг, серці - 0,039±0,0013 та 0,27±0,02 мг/кг маси відповідно. Накопичення препарату спостерігали також у м'язовому шлунку та дванадцятипалїй кишці, у першій групі концентрація становила 0,039±0,001 мг/кг. У другій групі концентрація інсектициду також була майже однакова - 0,226 ±0,03 та 0,225± 0,02 мг/кг відповідно. При дослідженні крові залишкові кількості дельтаметрину були нижчими від межі визначення методу.

У наступному етапі визначали зміну гематологічних показників. Вміст гемоглобіну в крові курей першої групи на чотирнадцяту та тридцяту доби був зниженим на 16,3 та 7 % відповідно, а на шестидесяту добу спостерігалося підвищення показника на 13,9 %. У другій групі значення було на рівні контрольного. Встановили незначне підвищення показника на тридцяту та на 18,1 % шестидесяту доби досліджень. Що стосується кількості еритроцитів у обох групах, то вірогідних змін не відбувалося, тільки в першій групі на шестидесяту добу спостерігалося підвищення на 12,5 %.

Введення децис форте з кормом вплинуло на показники обміну вуглеводів. Зокрема, на чотирнадцяту добу у крові курей обох дослідних груп у порівнянні з контролем виявлено гіперглікемію - на 23,53 %. На тридцяту добу показники стабілізувалися до контрольних, а на шестидесяту добу досліджень спостерігалося зниження вмісту глюкози в першій групі на 44,45 %, у другій - на 16,6 %. Зміна рівня піровиноградної кислоти мала нестабільний характер. Якщо на чотирнадцяту та тридцяту доби підвищення вмісту піровиноградної кислоти було відповідно на 14,9 % та 10,6 %, то на кінець досліду він нормалізувався. У другій групі навпаки - після збільшення підвищення вмісту пірувату на чотирнадцяту добу на 15,05 % рівень зростав і залишався достатньо високим до кінця досліду - на 23,07 та 20,15 % відповідно. Рівень молочної кислоти у групі з дією препарату в дозі 5 мг/кг у цілому залишався без істотних змін протягом усього періоду дослідження, лише на шестидесяту добу спостерігали підвищення - на 10,6 % відносно контролю. Однак вплив препарату в більшій дозі на рівень молочної кислоти був іншим. Зокрема, на тридцяту добу встановили підвищення рівня молочної кислоти на 19,04 % та значне підвищення (на 74,35 % ) на шестидесяту добу.

Зміна активності індикаторних ферментів під час досліду мали суперечливий характер. На чотирнадцяту добу досліджень спостерігали пригнічення активності ферментів АЛТ і АСТ порівняно з контролем. Зокрема, у першій групі активність знижувалася - на 10,96 та 20,43 %, у другій - на 2,94 та 5,84 % відповідно. На тридцяту та шестидесяту доби досліджень активність ферментів була на рівні величин контрольних показників. За відносно стабільних показників АЛТ і АСТ активність ЛФ була зниженою під дією препарату в обох дозах упродовж усього дослідного періоду. У групі з дозою 5 мг/кг корму зміна активності ферменту відбувалася за тенденцією збільшення: на чотирнадцяту добу - на 21,24 %, тридцяту - 22,91 %, шістдесяту - на 23,9 %. У групі з дозою 20 мг/кг на початку досліду встановили значне, майже вдвічі, зниження активності ферменту, на тридцяту добу - на 18,35 % та шестидесяту - на 23,73 %.

Зниження активності АТФ-ази в обох групах на чотирнадцяту добу становило 4,62 та 5,72 % відповідно. У подальшому в першій групі було встановлено вірогідне пригнічення активності ферменту на 20,96 та 19,07 %, відповідно. У другій групі на шестидесяту добу спостерігалася тенденція підвищення активності на 11,44 %.

Зміна активності ферментів у печінці, нирках та дванадцятипалій кишці в разі тривалого надходження децис форте через травний канал з кормом підтверджує механізм дії піретроїду.

Довготривале згодовування з кормом децис форте вплинуло на зміну активності амінотрансфераз у печінці птахів обох груп, а саме: зниження активності АЛТ на 11,33 та 8,86 % і незначне підвищення активності АСТ - на 3,70 та 5,86 % відповідно.

Порівнюючи результати визначення активності АЛТ і АСТ у печінці та сироватці крові, слід зазначити, що на тлі відносно стабільних цих показників у сироватці, активність ферментів у печінці виявились більш показовими щодо ймовірного враження клітин печінки інсектицидом.

У процесі визначення активності лужної фосфатази у внутрішніх органах установили, що ступінь активності ЛФ у печінці курей усіх дослідних груп незначно відрізнявся від величини контролю. Спостерігали зниження активності ферменту в нирках курей першої групи на 11,17 %, другої - на 47,76 %; у дванадцятипалій кишці на 25,92 та 37 % відповідно.

Результати гістоморфологічних досліджень засвідчили, що дія препарату в більшій дозі спричинила зміні структури дослідних органів. Зокрема, у печінці - втраті балкової структури, звуженню цитоплазми та відсутності меж гепатоцитів, розташуванню ядер за межами балок, скупченню еритроцитів у міжбалкових просторах, декомпенсації гепатоцитів і наявності тонкозернистого пігменту жовто-бурого кольору. У залозистому шлунку встановили наявність ознак руйнування епітеліальних клітин слизового шару, дезінтеграцію головних залоз і скупчення залишків залозистих трубочок у порожнині органу, великі кількості старіючих, з дрібним ядром, піронінофільних клітин. У селезінці - велике скупчення піронінофільних клітин, зменшення кількості герментативних і лімфоїдних центрів, розпад клітин з утворенням грудок та розпушування внутрішніх структур. У кишковику курей першої групи відзначали частковий відрив ворсинок слизової оболонки, їх поверхнево розташованих ділянок, відсутність запальної реакції. У другої - десквамацію епітелію, скупчення фрагментів епітелію ворсинок у просвіті кишковика та руйнування залоз.

Отже, ми вдосконалили та валідували методику визначення залишкових кількостей дельтаметрину в молоці. Установили, що децис форте є сильнодіючою сполукою для щурів за умов перорального введення, клінічні симптоми отруєння характеризувалися впливом на ЦНС. Децис форте виявив цитотоксичний та мутагенний ефекти на перещеплюваній культурі клітин нирки ВРХ MDBK. Аналізуючи отримані експериментальні дані, слід зазначити, що одноразове внутрішнє та довготривале з кормом введення курям децис форте викликало прояв клінічних ознак впливу на ЦНС та характеризувалося впливом на вуглеводно-енергетичний та ферментативний статус організму птиці.

Висновки

дельтаметрин пероральний цитотоксичний

1. На основі експериментальних досліджень на курях, щурах та в перещеплюваній культурі клітин нирки великої рогатої худоби МDВК установлені нові токсикологічні характеристики дельтаметрину у формі препарату децис форте; удосконалено та валідовано методику його визначення в молоці способом тонкошарової хроматографії, науково обґрунтовані максимально допустимі рівні дельтаметрину в кормах для сільськогосподарських тварин.

2. Методика визначення децис форте в молоці базується на його вилученні з матриці ацетоном, очищенні екстрактів методом фільтрації; виморожуванні, перерозподілі між розчинниками, додатковому очищенні колонково-розподільчою хроматографією та визначенні способом тонкошарової хроматографії. Визначені валідаційні характеристики методики, яка згідно з вимогами стандарту „ISO 5725-1:1994” та „Європейської інструкції щодо застосування аналітичних методів та інтерпретації результатів ЄС 657/2002” є специфічною (селективною), лінійною, з межею детекції 3 мкг та межею визначення 0,1 мг/л.

3. Визначено параметри гострої токсичності децис форте 12,5 % к.е. за перорального введення білим щурам. Величина DL50 становить 22,15 мг/кг, DL84 -27,7 мг/кг та DL16 - 16,6 мг/кг, що дозволяє віднести вищезгаданий піретроїд до сильнодіючих токсичних сполук. У щурів клінічні симптоми гострого отруєння децис форте характеризуються на початку сильним пригніченням, з переходом у фазу збудження, частим диханням, некоординованими рухами, клоніко-тонічними судомами, салівацією, що свідчить про виражену нейротоксичну дію пестициду.

4. Інтенсивність цитотоксичної дії децис форте залежить від його концентрації в ростовому середовищі і характеризується збільшенням мітотичної активності культури клітин нирки великої рогатої худоби МDВК. Патологія ділення клітин виявляється в пошкодженні мітотичного аппарату К-мітозами та хромосомного апарату клітин - хромосомами, що злиплися, утворенням „мікроядер”, що вказує на прояв мутагенних властивостей препарату.

5. Одноразове пероральне введення курям децис форте в токсичних дозах (50 та 100 мг/кг) викликає прояв симптомів, які вказують на його нейротоксичні властивості. За цих умов спостерігаються гіперактивність у поведінці, мотання головою, неадекватна реакція на зовнішні подразники, судоми, підвищення спонтанної активності, некоординованість рухів. Патологоморфологічні дослідження внутрішніх органів і тканин у курей за одноразового введення піретроїду в дозі 50 мг/кг значних структурних і функціональних відхилень не виявила, а 100 мг/кг - викликала ознаки десквамаційного гастроентериту, рексису клітин ферментативних фолікулів селезінки та декомпенсацію гепатоцитів печінки. Тривале надходження пестициду з кормом упродовж 60 діб у курей істотних клінічних проявів не викликало. Водночас, патоморфологічні дослідження виявили ознаки руйнування епітеліальних клітин слизового шару та дезінтеграцію залоз, у кишковику десквамацію епітелію та руйнування залоз, лізис і підвищену плазматизацію клітин у селезінці, декомпенсацію клітин печінки.

6. За одноразового перорального введення децис форте курям у дозах 50 і 100 мг/кг максимальні залишкові кількості його визначали: на першу добу в м'язовому шлунку (0,25 і 0,37 мг/кг, відповідно до дози) і дванадцятипалій кишці (0,08 і 0,16 мг/кг), а також печінці (0,27 у групі з дозою 100 мг/кг), мозку, нирках (по 0,13 мг/кг) і легенях (0,021 мг/кг у дозі 50 мг/кг). Через три доби - у серці (0,011 і 0,38 мг/кг), легенях (0,16 мг/кг у групі з дозою 100 мг/кг), селезінці (0,11 мг/кг), червоних (0,075 і 0,083 мг/кг) і білих (0,038 мг/кг) м'язах, нирках (0,03 і 0,04 мг/кг), а також внутрішньому жирі (0,03 і 0,034 мг/кг). Через чотирнадцять діб у першій групі залишкові кількості визначали тільки у внутрішньому жирі, а в другій групі в мозку, нирках і внутрішньому жирі. У крові залишкових кількостей дельтаметрину не встановлено.

7. Одноразове пероральне введення курям токсичних доз децис форте викликає еритропенію (в середньому на 8 - 13 %), зниження показників обміну вуглеводів (глюкози на 18 - 21 % та піровиноградної кислоти на 30 - 44 %), активності АТФ-ази (на 16 - 36 %), активності ЛФ (на 18 - 32 %) на тлі відносно стабільної активності АЛТ і АСТ. Статистично вірогідні зміни активності ферментів функціонального стану печінки (АЛТ, АСТ, ЛФ) підтверджують ушкодження її клітин унаслідок гепатотоксичних властивостей піретроїду.

8. За тривалого згодовування децис форте в дозах 5 та 20 мг/кг корму найбільша концентрація інсектициду на шестидесяту добу визначається у внутрішньому жирі - 0,613 і 1,25 мг/кг та нирках - 0,165 і 0,29 мг/кг відповідно. В інших зразках тканин і органів у характері розподілу простежується тенденція залежності від дози препарату. Залишкові кількості розподілялися так: м'язовий шлунок (0,029 і 0,226 мг/кг), дванадцятипала кишка (0,029 і 0,225 мг/кг), серце (0,039 і 0,27 мг/кг), печінка (0,02 і 0,214 мг/кг) відповідно. Залишки препарату в червоних м'язах (0,197 мг/кг), мозку й селезінці (по 0,07 мг/кг), білих м'язах (0,034 мг/кг) визначали тільки в групі з дозою 20 мг/кг корму. У крові дельтаметрин не ідентифікувався.

9. Децис форте в дозах 5 і 20 мг/кг з кормом упродовж 60 діб впливав на гематологічні показники крові курей. Зокрема, рівень гемоглобіну в групі, яка отримувала 5 мг/кг, вірогідно знизився (на 16,3 %), а в групі, яка отримувала 20 мг/кг, через 60 діб зростав (на 18,1 %). Кількість еритроцитів у групі, яка отримувала 5 мг/кг, через шістдесят діб знизилася на 12,5 %.. Вірогідно підвищився вміст глюкози (на першу добу досліджень в обох групах на 23 %), а рівні ПВК та молочної кислоти були високими упродовж всього досліду в другій групі.

За відносно стабільних показників активності АЛТ і АСТ у сироватці крові курей активність ЛФ у групі, яка отримувала препарат у дозі 5 мг/кг, знижувалася на 30 добу на 23 %, а в групі, яка отримувала препарат у дозі 20 мг/кг - знижена упродовж усього досліду. Активність АТФ-ази вірогідно пригнічувалася на 30 та 60 доби в групі, яка отримувала 5 мг/кг. При визначенні активності амінотрансфераз у печінці було встановлено зниження показників АЛТ у середньому на 8 - 11 % та підвищення АСТ на 3 - 7 %. Виявлено статистично вірогідне пригнічення активності ЛФ, особливо в нирках та дванадцятипалій кишці.

Пропозиції виробництву.

1. „Максимально допустимі рівні (МДР) синтетичних піретроїдів (перметрин, циперметрин, дельтаметрин, цигалотрин, лямбда-цигалотрин, февалерат, флувалінат) в кормах для сільськогосподарських тварин”. Затверджені Державним департаментом ветеринарної медицини МАП України, наказ № 15-14/ 92 від 18 квітня 2000 року).

2. „Методичні вказівки щодо визначення дельтаметрину в молоці способом тонкошарової хроматографії”. Розглянуті та ухвалені на засіданні методичної комісії ННЦ „Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини”(протокол № 3 від 29.03.2007 року) та направлені до розгляду в Державний департамент ветеринарної медицини Міністерства аграрної політики України.

3. При підтвердженні діагнозу отруєння децис форте необхідно враховувати клінічні симптоми та патолого-анатомічні зміни внутрішніх органів. Для проведення діагностичних хіміко-токсикологічних досліджень рекомендуємо відбирати: м'язовий шлунок, проксимальну ділянку дванадцятипалої кишки, внутрішній жир, мозок, печінку, нирки. Терміни відбору проб повинні не перевищувати 2 - 4 діб з моменту передбачуваного контакту з інсектицидом.

4. Результати досліджень рекомендуємо включати в програму дисципліни „Ветеринарна токсикологія” для викладання студентам факультетів ветеринарної медицини навчальних закладів ІІІ та ІV рівнів акредитації.

Література

1. Ярошенко М.О. Изучение токсикодинамики пороговых доз дельтаметрина в хроническом опыте на курах // Науковий вісник НАУ.- Київ, 2002.- Вип. 55.- С. 177-182.

2. Ярошенко М.О. Изучение острой токсичности “Децис Форте” для кур // Ветеринарна медицина: Міжвід. тематич. наук. зб.- Харків, 2002.- Вип.80.- С. 649-655.

3. Ярошенко М.О. Определение параметров острой токсичности дециса форте для крыс при пероральном введении // Ветеринарна медицина: Міжвід. тематич. наук. зб. - Харків, 2005. - Вип.85.-С. 1182-1187.

4. Патент 18381 Україна, МПК G01N 33/02. Спосіб визначення дельтаметрину в молоці / О.О. Малінін, О.Т. Куцан, М.О. Ярошенко (Україна).- № u 2006 03833; Заявлено 07.04.2006; Опубл. 15.11.2006, Бюл. № 11.- 4 с.

5. „Максимально допустимі рівні (МДР) синтетичних піретроїдів (перметрин, циперметрин, дельтаметрин, цигалотрин, лямбда-цигалотрин, февалерат, флувалінат) в кормах для сільськогосподарських тварин”. Затверджені Державним департаментом ветеринарної медицини МАП України, наказ № 15-14/ 92 від 18 квітня 2000 року).

Размещено на Allbest.ru