Особливості цитогенетичних змін клітин кісткового мозку хворих на мієлодиспластичний синдром та гострі мієлоїдні лейкемії, їх діагностичне і прогностичне значення

Размещено на http://www.allbest.ru

Размещено на http://www.allbest.ru

Вступ

Актуальність теми. Мієлодиспластичний синдром (МДС) та гострі мієлоїдні лейкемії (ГМЛ) характеризуються широким спектром цитогенетичних аномалій, роль яких у становленні патологічного клону та вплив на перебіг захворювання у більшості випадків залишається остаточно нез'ясованою. Відомо, що виникнення гемобластозів пов'язано з перебудовою генетичного апарату. Тип мутації обумовлює морфологічні, цитохімічні та імунофенотипічні властивості пухлинної клітини. Тому ідентифікація аномалій каріотипу необхідна для верифікації захворювання, оцінки рівня злоякісності патологічного клону і визначення прогнозу, відповідно до якого призначають адекватну хіміотерапію [Сергеев А.Г. и др. 2000].

За допомогою цитогенетичного аналізу клональні зміни хромосом виявляються у 30-70% пацієнтів із МДС [Delforge М. 2003; Sole F., 2005.] та 50-80% хворих на ГМЛ [Schoch C., 2001]. При цьому частина встановлених реаранжировок хромосом асоціюється з певним морфологічним варіантом ГМЛ згідно з ФАБ класифікації [Klausa M., 2004].

Потреби гематології зумовили створення MIC-М та ВООЗ класифікацій ГМЛ, які базуються на результатах морфологічних, імунологічних та каріотипічних досліджень. У цих класифікаціях зроблена спроба відобразити біологічну суть захворювання. Використання критеріїв МІС-М класифікації дозволяє верифікувати всі варіанти ГМЛ. Найбільш важливою рисою класифікації ВООЗ є виділення лейкемій, які відповідають специфічним цитогенетичним та молекулярно-генетичним маркерам. Впровадження класифікації ВООЗ передбачає створення та застосування препаратів патогенетичної терапії.

На теперішній час Міжнародна кількісна система прогнозування МДС (IPSS), яка враховує морфологічні та цитогенетичні дані, вважається найбільш прогресивною для визначення терміну виживання та можливості трансформації МДС у ГМЛ [Greenberg P.L., 1997]. Однак не всі аномалії хромосом хворих на МДС знайшли своє відображення в шкалі оцінки цитогенетичних змін прогностичної системи IPSS.

Значна частота захворюваності на ГМЛ та МДС, тяжкий перебіг хвороби, а також несприятливий у більшості випадків прогноз свідчать про високу соціальну значимість вирішення проблем, пов'язаних з цією групою захворювань.

Враховуючи значну роль ідентифікації аномалій каріотипу у вирішенні найбільш важливих практичних та теоретичних проблем сучасної лейкозології, виконання даної дисертаційної роботи є доцільним.

Мета дослідження. Визначити особливості аномалій каріотипу у хворих на МДС і ГМЛ, та на основі клініко-гематологічних і цитогенетичних даних розробити алгоритм прогностичних критеріїв для оцінки перебігу МДС та визначити прогностичне значення ідентифікованих аномалій хромосом у пацієнтів з ГМЛ.

Завдання дослідження:

1. Визначити особливості цитогенетичних змін пухлинного клону та клініко-гематологічної характеристики у хворих на МДС.

2. Встановити діагностичне та прогностичне значення виявлених порушень хромосом у пацієнтів з МДС.

3. Визначити особливості клініко-гематологічної характеристики та аномалій каріотипу патологічного клону у хворих на ГМЛ.

4. Оцінити прогностичне значення виявлених порушень хромосом у пацієнтів з ГМЛ.

5. Розробити алгоритм прогнозу перебігу МДС на основі отриманих клініко-гематологічних та цитогенетичних даних.

1. Матеріали та методи дослідження

Для досягнення вказаної мети та виконання задачі використовувались загальноклінічні, гематологічні, цитохімічні, цитогенетичні та статистичні методи дослідження 48 пацієнтів з МДС та 106 хворих з різними видами ГМЛ. Вік пацієнтів коливався від 18 до 78 років. Матеріалом дослідження були клітини ПК та КМ хворих на ГМЛ та МДС.

Аналіз хромосом проводився згідно з модифікованим методом дослідження запропонованим Le Beau M [Le Beau M., 1991]. Препарати метафазних хромосом отримували після культивування клітин КМ впродовж 24 годин при температурі 37°С без застосування фітогемаглютиніну. Для цього використовувались живильне середовище RPMI-1640, ембріональна теляча сироватка, антибіотики. Клітинний цикл зупиняли розчином колхіцину в концентрації 0,05 мг/мл. Далі культура оброблялась 0,56% розчином хлориду калію протягом 30 хвилин. Фіксацію проводили розчином метанолу та крижаної оцтової кислоти у співвідношенні 3:1. Диференційне забарвлення хромосом на G-диски проводилось за допомогою 0,25% розчину трипсину та 2% розчину фарби Гімза. Аналіз метафазних пластинок здійснювали згідно із вимогами ISCN. Дослідження каріотипу хворих на МДС та ГМЛ проводилось на етапі первинної діагностики, а також в динаміці перебігу захворювання. Загалом проведено 196 каріотипічних досліджень.

2. Результати власних досліджень

Обстежено 48 пацієнтів з первинним МДС, серед яких було 20 жінок та 28 чоловіків. Середній вік у пацієнтів з ХММЛ становив 66,73,0 роки, у групі РАНБ - 58,24,3 роки, у хворих на РА - 534,2 роки. Кількість хворих на МДС, вік яких перевищував 60 років, становила 70%.

Серед 48 хворих на різні види МДС зміни хромосом спостерігались у 22 (46%) пацієнтів. Для 5 хворих була характерною еволюція змін каріотипу. Таким чином, за період виконання дисертаційної роботи ідентифіковано 27 різних аномалій каріотипу, що становило 56% від кількості хворих на МДС. Отриманий нами показник частоти визначення хромосомних аномалій пацієнтів із МДС узгоджується з даними літератури [Френкель М.Ф., 2001; Sole F., 2005].

Отримані результати свідчать, що частота визначення хромосомних аномалій при різних варіантах МДС узгоджуються з даними літератури [Sole F., 2000; Цветаева Н.В., 2002]. Зміни однієї хромосоми встановлено у 18 випадках, що становило 67%. Аномальні клони, які виникли внаслідок патології двох хромосом зустрічалась двічі, тобто у 7% випадків. Комплексні зміни каріотипу виявлені у 7 випадках, що складало майже 26% від встановлених аномалій каріотипу та 14,5% від загальної кількості пацієнтів. Частота виявлення комплексних цитогенетичних змін суттєво не відрізняється від даних інших дослідників [Sole F., 2005; Pozdnyakova O., 2008; Nimer D.S., 2008].

Проводився аналіз змін хромосом у хворих на МДС з урахуванням втрати або придбання генетичного матеріалу. Втрата частини або цілої хромосоми спостерігалась у 13 хворих, що становило 48% від кількості аномальних клонів, придбання генетичного матеріалу визначалось у 7 пацієнтів, тобто у 26% встановлених аномалій каріотипу. Поєднання втрати та придбання генетичного матеріалу відбувалось теж у 7 пацієнтів, що складало 26% від кількості визначених реаранжировок. Встановлений високий загальний показник втрати генетичного матеріалу у хворих на МДС в основному обумовлений за рахунок пацієнтів із РА, серед яких втрата генетичного матеріалу спостерігалась у 78% випадків.

При аналізі співвідношення кількісних та структурних аномалій хромосом встановлено, що кількісні реаранжировки спостерігались у 9 (34%) хворих, а структурні зміни хромосом у 10 (37%) пацієнтів. Поєднання структурних аномалій та кількісних змін хромосом відмічено у 8 (29%) хворих. Результати наших цитогенетичних досліджень, стосовно наявності структурних та кількісних змін хромосом, узгоджуються із даним літератури.

Утворення аномальних клонів у хворих на МДС відбувалось з неоднаковою частотою залучення окремих хромосом до патологічного процесу. Серед обстежених нами хворих найчастіше до утворення аномалій каріотипу зустрічалась хромосома 5, далі розташовані хромосоми 8, 7 та 20. У проведених нами цитогенетичних дослідженнях частота залучення до патологічних каріотипів окремих хромосом відмінна від результатів, представлених іншими дослідниками [ Sole F., 1992; Абдулкадиров К.М., 2002; Sole F., 2005].

Таким чином, встановлена частота залучення певних хромосом до утворення патологічних каріотипів є однією із особливостей цитогенетичних змін досліджених нами хворих на МДС.

Вплив аномалій хромосом на перебіг МДС було проведено з урахуванням різних цитогенетичних прогностичних підгруп. До підгрупи сприятливого прогнозу включено пацієнтів з нормальним каріотипом, делецією хромосом 5 та 20. Підгрупу несприятливого прогнозу складали пацієнти з комплексними змінами хромосом та патологією хромосоми 7. Хворі з іншими порушеннями каріотипу увійшли до підгрупи проміжного цитогенетичного прогнозу.

В результаті проведеного цитогенетичного дослідження хворих на МДС встановлено, що трансформація у ГЛ відбувалась внаслідок утворення нових патологічних клонів, виникнення додаткових змін хромосом у попередньо виявленому аномальному каріотипі та збільшення проліферативної активності раніше визначеного клону.

Еволюція цитогенетичних змін, при лейкемічній трансформації виявлена у п'яти випадках. Спостерігалась швидка трансформація МДС у ГЛ у всіх випадках еволюції раніше виявленого клону. Виходячи з цього, прогресію цитогенетичних змін можна розглядати, як прогностичний маркер лейкемічної трансформації.

Як відомо, на вплив порушень каріотипу на лейкемічну трансформацію вказує різниця між кількістю пацієнтів з нормальним та зміненим каріотипом, у котрих відбувся перехід МДС у ГМЛ. Достовірної залежності лейкемічної трансформації у порівнянні між хворими з патологією хромосом та нормальним каріотипом не встановлено (р>0,05). В той же час достовірно доведено залежність лейкемічної трансформації від характеру цитогенетичних змін. У пацієнтів, що мали складні аномалії каріотипу, частота лейкемічної трансформації була достовірно вищою у порівнянні з іншими хворими (р<0,05).

Отримані в наших дослідженнях дані стосовно частоти лейкемічної трансформації у хворих на МДС, узгоджуються з даними інших дослідників [Ширин А.Д., 2002; Haase D., 2007].

Прогностичне значення та особливості цитогенетичних змін хворих на ГМЛ. За період виконання дисертаційної роботи цитогенетичний аналіз проведено у 106 хворих на ГМЛ. Метафазні пластинки, які відповідали вимогам ISCN, отримано у 60 пацієнтів. Патологію хромосом виявлено у 35 (58%) випадках, нормальний каріотип встановлено у 25 (42%) пацієнтів.

Хворі на ГМЛ, аномалії каріотипу яких віднесено до особливостей цитогенетичних змін, об'єднувались подібним механізмом утворення різних транслокацій та залученням до процесу утворення аномальних клонів однакових хромосом. У першого хворого виявлено патологічний клон 46,ХY,t(2;15)(q37;p13),+12,add(13)(q14-21),add(13)(14-22). У другої пацієнтки патологічний клон: 44,ХХ,-3,t(7;18)(р22;q23),-15,і(17)(q10),-17,+mar1,+mar2. У третього хворого патологічний клон: 51,XY,t(12;18) (p13;p11),+8,+10,-15,der17,+mar1,+mar2,+mar3х2. В доступній науковій літературі дані стосовно транслокацій t(2;15)(q37;p13), t(7;18)(р22;q23), t(12;18)(p13;p11) відсутні [Heim S., 2008]. Тому представлені транслокації слід вважати вперше визначеними аномаліями хромосом у хворих на ГМЛ. Аномальні каріотипи об'єднуються також іншими спільними патологічними ознаками. По-перше, визначені аномалії хромосом мають складні хромосомні реаранжировки та кілька патологічних клонів, що може вказувати на існування в минулому МДС, якого раніше не було діагностовано. По-друге, ідентифіковані транслокації t(7;18)(р22;q23), t(12;18)(p13;p11), t(2;15)(p13;p11) утворились в результаті кінцевої делеції однієї хромосоми та приєднання її до іншої хромосоми. Механізм виникнення цих транслокацій, який схожий з утворенням дицентриків та кільцевих хромосом, є однією з головних особливостей цитогенетичних змін хворих на ГМЛ. Кільцеві хромосоми, які спостерігались у хворого №99, розглядається як додатковий аргумент, що доводить ушкодження кінцевих ділянок хромосом. Окрім встановлення спільних механізмів транслокацій у всіх хворих до патологічних клонів залучалась хромосома 15. Остаточний вплив розташованих на хромосомі 15 генів на патогенез ГМЛ не встановлено. Але передбачається, що локалізований в сегменті 15q22 ген промієлоцитарної лейкемії може відігравати суттєву роль у становленні як ГПЛ, так і інших лейкемій [Jurcic J.G., 2007]. Одночасно виявлено патологію двох гомологічних хромосом у двох хворих. У першому випадку ідентифіковані додаткові фрагменти на гомологах хромосоми 13, для другого випадку - одночасна патологія хромосоми 17. У двох пацієнтів додатковими змінами каріотипу були маркерні хромосоми. Феномен утворення додаткових маркерних хромосом полягав в тому, що в патологічному каріотипі втрачалась одна нормальна гомологічна хромосома, але натомість з'являлись додаткові маркерні хромосоми.

В онкогематології хромосомні аномалії відіграють роль незалежних маркерів прогнозування перебігу ГМЛ. Отримані нами результати лікування тотожні дослідженням інших авторів стосовно сприятливого прогнозу у пацієнтів із ГМЛ М2, які мають t(8;21)(q22;q22) [Hiddemann W., 2001; Schaekel U., 2000; Slovak M., 2000]. В наших дослідженнях t(15;17)(q22;q11) асоціювалась із задовільною відповіддю на лікування. До групи стандартного прогнозу, відповідно до наших досліджень, віднесено пацієнтів з нормальним каріотипом та одиничними аномаліями хромосоми 16. Решту верифікованих хромосомних аномалій віднесено до групи несприятливого прогнозу.

Алгоритм критеріїв прогнозування перебігу МДС. При створенні алгоритму прогнозування перебігу МДС виходили з того, що однією із головних патогенетичних ознак МДС є безперервна прогресія захворювання. Шлях розвитку патологічного процесу починається від становлення РА, а надалі переходить у РАНБ та РАНБ-Т і часто трансформується у ГЛ. Запропонований нами алгоритм прогностичних критеріїв МДС передбачає визначити, на якому із цих патогенетичних етапів, на даний час, знаходиться хворий. В залежності від цього рівня і надається прогностична оцінка стану хворого. Для виконання такого завдання патогенетичний процес становлення та розвитку МДС розподілений нами на шість етапів, кожний з яких має свою бальну оцінку. Послідовні три етапи, які мають певні діагностичні критерії, об'єднуються у групу сприятливого або несприятливого прогнозу.

Група сприятливого прогнозу обумовлює призначення хворим замісної терапії, імуномодуляторів, колонієстимулюючих факторів. Цитостатична терапія може призначатись вибірково за індивідуальними показниками. Група несприятливого прогнозу передбачає перш за все застосування цитостатичної терапії, а також колонієстимулюючих препаратів, імуномодуляторів, препаратів крові. Такий підхід запропонованої прогностичної системи відрізняється від рекомендацій, відповідно до яких хворим із кількістю бластів менше 20%, не передбачається проведення цитостатичної терапії.

Розподіл хворих на дві прогностичні групи сприяє більш чіткому визначенню прогнозу перебігу захворювання, а також нівелює проблеми та неузгодженості, пов'язані із групою проміжного прогнозу. Саме оцінка груп проміжного прогнозу, в зв'язку з тим, що об'єднує різних за клініко-гематологічним станом хворих, має значні розбіжності як в кожній окремій запропонованій раніше прогностичній системі, так і при порівнянні показників різних систем прогнозування. Часто стає незрозумілим, як трактувати проміжну оцінку прогнозу, вважати її доброю або негативною прогностичною ознакою. Для вирішення цієї проблем пацієнтів, які входять до проміжної групи прогнозу, за критеріями прогностичної системи IPSS запропоновано розділяти на дві підгрупи: проміжний ризик-1 та проміжний ризик-2.

Прогностична оцінка кожного із представлених діагностичних критеріїв запропонованого алгоритму неоднакова. Першим діагностичним критерієм є дані морфологічного дослідження кількості бластів КМ. Пропонуємо встановити їх розподіл в межах: 0-5%, 5-10%, 5-20%. Другим критерієм для шкали прогнозу обрано цитогенетичні зміни. Розподіл порушень каріотипу проведено із врахуванням прогностичного значення кожної хромосомної аномалії окремо. Пропонуємо також розглядати прогресію змін каріотипу, як окрему характеристику цитогенетичних аномалій. Третє місце в нашій системі, як показник рівня диспластичних процесів, займає вміст тромбоцитів в ПК. Введення критерію, який враховує кількість тромбоцитів, вказує, що для характеристики диспластичних змін у хворих на МДС, показник рівня бластів є недостатнім. Слід зважити також на те, що тромбоцитопенія розглядається, як одна із провідних причин смертності хворих на МДС. Клінічно значимою межею розподілу цього критерію пропонуємо вважати кількість тромбоцитів, яка є меншою або більшою 75,0Ч109/л. Зменшення кількості тромбоцитів нижче 75,0Ч109/л вважається негативною ознакою, яка зумовлює збільшення загальної оцінки на один бал. У випадках наявності кількості тромбоцитів понад 75,0Ч109/л., загальна оцінка не змінюється.

Незважаючи на те, що кожен з окремих діагностичних критеріїв, як кількість бластів КМ, так і хромосомні аномалії, мають незалежне прогностичне значення, вважаємо за доцільне їх використання в поєднанні. За умови, коли кількість бластів КМ та каріотипічні зміни не співпадають з наведеною шкалою критеріїв, прогностична оцінка надається з урахуванням показника, який займає вищий ступінь в цій таблиці.

Це пов'язано із тим, що однакові зміни хромосом, в залежності від стадії захворювання, можуть мати різний вплив на його перебіг. Тому допоміжним критерієм у таких випадках слід вважати кількість бластів КМ. В той же час, зважаючи, що хромосомні аномалії передують клінічним проявам хвороби, при наявності більш високої оцінки прогнозу за цитогенетичними параметрами, саме вони є визначальними для оцінки прогнозу.

Висновки

мієлодиспластичний пухлинний каріотип гематологічний

В дисертації представлено теоретичне обґрунтування та вирішення наукового завдання по виявленню особливостей цитогенетичних змін у хворих на МДС і ГМЛ, запропоновано прогностичну систему для визначення терміну прогнозованого виживання та можливості трансформації МДС у ГМЛ, що є важливим внеском в проблему лейкозології.

1. Виявлено, що у обстежених хворих на МДС пошкодження каріотипу найчастіше виникали за рахунок патології хромосоми 5, далі за частотою залучення хромосом до утворення патологічного каріотипу розташовані хромосоми 8, 7, та 20 (5>8>7>20).

2. Встановлено, що до прогностичних факторів ризику трансформації МДС у ГМЛ відносяться виникнення делеції del(2)(q24), трисомії 8 та пентасомії довгого плеча хромосоми 8, ізохромосом 11 та 17, додаткові хромосоми 12 та 13, які були ідентифіковані на етапі еволюційних змін аномального клону, виявленого на початкових стадіях МДС.

3. Доведено статистичну достовірність збільшення частоти виникнення трансформації МДС у ГМЛ у пацієнтів, які мали складні аномалії каріотипу порівняно з хворими, у яких ідентифіковано нормальний каріотип та інші зміни хромосом (р<0,05).

4. Негативною прогностичною ознакою у хворих на МДС є утворення додаткових цитогенетичних змін у раніше виявленому клоні, що потребує призначення більш жорстких схем ПХТ.

5. Встановлено цитогенетичні особливості клітин КМ хворих на ГМЛ, які полягають в тому, що хромосомні аберації виникають внаслідок кінцевої делеції однієї з хромосом та приєднання її до іншої хромосоми, що прогнозує несприятливий перебіг захворювання.

6. Показано, у хворих на ГМЛ до категорії сприятливого цитогенетичного прогнозу відносяться t(8;21)(q22;q22) та t(15;17)(q22;q21). Несприятливою прогностичною ознакою є наявність трисомії 8, t(9;22), t(11;19)(q14;p13), del(9)(q22), dup(1)(q12-24), трисомії 21, а також поєднання в патологічному каріотипі двох аномалій хромосом і комплексної патології каріотипу. Пацієнти з нормальним каріотипом та inv(16)(р13q22) хромосоми входять до групи стандартного прогнозу.

Практичні рекомендації.

1. З метою прогностичної оцінки перебігу захворювання та комплексного обстеження хворих на МДС необхідно включати проведення цитогенетичного дослідження як у період діагностики захворювання, так і при зміні клініко-гематологічних показників, а також кожні 4 місяців при наявності порушень хромосом. Отримані результати сприятимуть верифікації діагнозу, формуванню груп прогнозу, призначення адекватного лікування.

2. До критеріїв досягнення ремісії у хворих на ГЛ поряд з клініко-гематологічними показниками, з метою верифікації клініко-гематологічної та цитогенетичної ремісії, необхідно включати дані каріотипічного дослідження.

3. Для оцінки ефективності проведеної хіміотерапії хворих з МДС та ГМЛ рекомендовано використовувати результати дослідження величини залишкового патологічного клону, виявленого після проведеного лікування.

4. Для визначення терміну виживання та ризику лейкемічної трансформації хворих на МДС кожна хромосомна аномалія повинна враховуватись індивідуально.

5. Для визначення клініко-гематологічної прогресії МДС пропонується впровадити термін часу спостереження за хворим, який становить не менше чотирьох місяців.

6. Для характеристики патогенетичного етапу розвитку МДС і визначення прогнозу рекомендується використовувати розроблений алгоритм прогнозування перебігу захворювання.

7. На основі принципів розробленого алгоритму прогнозування перебігу МДС рекомендовано призначати цитостатичну терапію хворим, які відносяться до групи несприятливого прогнозу, незалежно від кількості бластів.

Література

1. Immunophenotypic and Cytogenetic Characteristics of Blast Cells Under Some Subvariants of Acute Myeloid Leukemia / L.M. Isakova, N.N. Tretyk, V.N. Khromyak, A.I. Gordienko, A.S. Zverkova, A.M. Vakulchuk // Cytology and Genetics (Tsitologiya I Genetika). - 2000. - Vol. 34. No. 1. - Р. 48-56.

2. Взаимосвязь трансформации хронической миеломоноцитарной лейкемии в острую миеломонобластную лейкемию с цитогенетическими изменениями / Н.Н. Третяк, Н.В. Горяинова, А.М. Вакульчук, А.И. Коваль // Укр. журнал гематології та трансфузіології. - 2003. - №2. - С. 31-34.

3. Третяк Н.Н. Цитогенетические изменения и их значение в прогнозе клинического течения при миелодиспластическом синдроме и остром миелоидном лейкозе / Н.Н. Третяк, Л.М. Исакова, А.М. Вакульчук // Сборник научных трудов к 70-летию НИИ гематологии и трансфузиологии. - Минск: НПООО “Стринко”, 2003. - Т. 1. - С. 265-268.

4. Complex rearrangements involving der(8)t(8;20) and der(14)t(8;14)t(ll;14), CCND1, and duplication of IgH constant region in acute plasmablastic leukemia / Т. Knutsen, A. Vakulchuk, A. Mosijczuk, A. Gabrea, T. Ried, N. Tretyak // Cancer Genetics and Cytogenetics. - Vol. 164 (№2). - 2006. - Р. 137-141.

5. Третяк Н.М. Фактори ризику виникнення нейрорецидиву у хворих на гостру мієлобластну лейкемію / Н.М. Третяк, О.А. Кисельова, О.М. Вакульчук // Український журнал гематології та трансфузіології. - 2007. - №4. - С. 26-31.

6. Оцінка перебігу мієлодиспластичного синдрому (МДС) на основі запропонованої лінійної прогностичної системи / О.М. Вакульчук, Н.М. Третяк, С.Ю. Калініна, А.І. Коваль // Збірник наукових статей співробітників НМАПО імені П.Л. Шупика. - Київ, 2007. - Вип. 16, кн. 4. - С. 679-687.

Размещено на Allbest.ru