Прогнозування ризику виникнення хромосомних аномалій ембріону та наступного невиношування у пацієнток після екстракорпорального запліднення

Размещено на http://www.allbest.ru/

МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ'Я УКРАЇНИ

НАЦІОНАЛЬНА МЕДИЧНА АКАДЕМІЯ ПІСЛЯДИПЛОМНОЇ ОСВІТИ

імені П.Л. ШУПИКА

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

14.01.01 - акушерство та гінекологія

ПРОГНОЗУВАННЯ РИЗИКУ ВИНИКНЕННЯ ХРОМОСОМНИХ АНОМАЛІЙ ЕМБРІОНУ ТА НАСТУПНОГО НЕВИНОШУВАННЯ У ПАЦІЄНТОК ПІСЛЯ ЕКСТРАКОРПОРАЛЬНОГО ЗАПЛІДНЕННЯ

СТОВБУН ГАННА БОРИСІВНА

Київ 2009

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Національній медичній академії післядипломної освіти імені П.Л. Шупика МОЗ України

Науковий керівник

доктор медичних наук, професор

Судома Ірина Олександрівна,

Національна медична академія післядипломної освіти МОЗ України,

професор кафедри акушерства, гінекології та репродуктології

Офіційні опоненти:

доктор медичних наук, професор

Корнацька Алла Григорівна,

Державна Установа «Інститут педіатрії, Акушерства та Гінекології Академії Медичних Наук України», завідуюча відділенням оперативної реабілітації репродуктивної функції жінок

доктор медичних наук, професор

Жук Світлана Іванівна, Українська військово-медична академія МО України, професор кафедри хірургії

Захист відбудеться «09» квітня 2009 р. о 12 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.613.02 при Національній медичній академії післядипломної освіти імені П.Л. Шупика МОЗ України (04112, м. Київ, вул. Дорогожицька, 9)

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національної медичної академії післядипломної освіти імені П.Л. Шупика МОЗ України (04112, м. Київ, вул. Дорогожицька, 9)

Автореферат розісланий «_06_»_березня_2009 р.

Вчений секретар

Спеціалізованої вченої ради

кандидат медичних наук, асистент М.М. Пилипенко

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми.

Самовільне переривання вагітності є однією зі складових репродуктивних втрат. Близько 15-25% клінічно діагностованих вагітностей терміном більше 4-х тижнів завершуються самовільним перериванням. [Запорожан В.М., 2000; Судома І.О., 2002]. За даними ВООЗ, 15% всіх вагітностей в популяції завершуються самовільним перериванням, 40-60% з яких спричинені генетичними аномаліями ембріону. [Стрижаков А.Н., 2000; Lіu H-C. et al., 2000]. Загальний внесок хромосомних аномалій до внутрішньоутробної загибелі (починаючи від моменту імплантації і до пологів) складає близько 45%.[Подзолкова Н.М., 2003, Жук С.І., 2004].

Поряд з цим, широке застосування методів допоміжних репродуктивних технологій для лікування безплідності призвело до того, що кількість індукованих вагітностей останнім часом значно зросла, а проблема збереження цих вагітностей та народження здорових дітей набула особливої актуальності. Багато дослідників аналізуючи особливості перебігу індукованої вагітності, відмічають високу частоту ускладнень та репродуктивних втрат, особливо в першому триместрі. [Корсак В.С., 2003; Медведев М.В., 1999; Benіrschke K., 1998].

На даному етапі розвитку медичної науки існують достатньо суперечливі дані щодо частоти самовільного переривання вагітності при застосуванні ДРТ, зокрема екстракорпорального запліднення (ІVF). За даними різних авторів, вказаний показник складає від 14,7% [Schіeve L. A. та ін., 2003] до 25% [Судома І.О, 2002]. Деякі з авторів [Frates M. C., 1996; Tummers Ph., 2003] вказують на значно більший відсоток раннього переривання вагітності після екстракорпорального запліднення, а саме близько 30%. Частота генетичних аномалій ембріону при застосуванні ДРТ, зокрема екстракорпорального запліднення, становить за даними різних дослідників: 60% [Voullaіre L., 2002]; 65% [Судома І.О., 2002]; 75% [Ludwіg M., 2002]; 61% [Tan Y.-Q., 2004].

Дана обставина може бути пояснена декількома факторами, а саме: по-перше, контроль за розвитком вагітності проводиться з самих ранніх термінів, тому враховуються всі репродуктивні втрати, які не можуть бути прораховані при спонтанних вагітностях; по-друге, пацієнтки, які приймають участь у програмах ДРТ - це певна група пацієнток з багаторічною неплідністю в анамнезі, з обтяженим акушерсько-гінекологічним анамнезом, і, як правило, більш старшого віку (переважно після 35 років). [Wіlton L., ,2002, Корнацька А.Г., 2005].

В сучасній літературі вказується на те, що індукована вагітність, яка припиняє свій розвиток в ранньому терміні, в переважній більшості випадків має безсимптомний перебіг. Також прослідковано, що існує певна залежність між терміном припинення розвитку вагітності та вираженістю хромосомних аномалій: чим грубіші генетичні порушення, тим раніше припиняється розвиток вагітності. [Хачкурузов С.Г., 2003; Mіshell D.R., 1999].

В Україні останніми роками ДРТ з метою лікування безплідності стали застосовуватись дедалі ширше. В зв'язку з цим, проблема вияснення причин розвитку хромосомних аномалій ембріону при застосуванні ДРТ та запобігання цієї патології при наступній індукованій вагітності є надзвичайно актуальною.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами і темами.

Виконана робота є частиною планових науково - дослідних робіт кафедри акушерства, гінекології та репродуктології НМАПО імені П.Л. Шупика за темою «Патологія репродуктивної функції жінок та патологія перименопаузи» (державний реєстраційний номер 0105 UO 03861).

Мета дослідження. Підвищити ефективність екстракорпорального запліднення та забезпечити подальший нормальний перебіг вагітності у пацієнток з неплідністю шляхом прогнозування виникнення хромосомних аномалій ембріону за допомогою розробки сучасних діагностичних критеріїв високого ризику хромосомних аномалій ембріону.

Завдання дослідження.

1. Вивчити характер ультразвукової і допплерографічної картини у пацієнток після екстракорпорального запліднення при ранній безперспективній вагітності та в порівнянні з нормальною прогресуючою вагітністю.

2. Дослідити рівні гормонів (естрадіолу, прогестерону, хоріонічного гонадотропіну) у вагітних досліджуваних груп.

3. Вивчити морфологічні особливості децидуальної оболонки та хоріальної тканини у вагітних досліджуваних груп.

4. Дослідити зв'язок певних хромосомних аномалій у вагітних основної групи, використовуючи розроблений метод визначення каріотипу ворсин хоріону (метод метофазних пластинок, FІSH) та механізм переривання вагітності з нормальним та аномальним каріотипом ембріону.

5. Вивчити характер апоптотичних змін в децидуальній оболонці та хоріальній тканині на основі дослідження маркерів апоптозу Bcl-2, Apo-1 у пацієнток досліджуваних груп.

6. Дослідити характер імунологічних змін в хоріоні та децидуальній оболонці на основі визначення вмісту натуральних кілерів (NK) у жінок досліджуваних груп.

7. На основі вивчення вищеперерахованих діагностичних критеріїв розробити диференційований підхід до тактики ведення даної вагітності та прогнозування наступної вагітності за допомогою передімплантаційної генетичної діагностики (РGD) і медико-генетичного консультування.

Об'єкт дослідження - невиношування вагітності раннього терміну у пацієнток після екстракорпорального запліднення, яке пов'язане з хромосомними аномаліями ембріону.

Предмет дослідження - матеріал ворсин хоріону та децидуальної оболонки, отриманий при проведенні вишкрібання стінок порожнини матки; кров вагітних з ранньою неперспективною вагітністю та з прогресуючою вагітністю.

Методи дослідження - загальноклінічні, ультразвукове дослідження з кольоровою допплерографією, визначення рівня гормонів (естрадіол, прогестерон, хоріонічний гонаждотропін) радіоімунологічним методом, морфологічні методи, цитогенетичні методи (визначення каріотипу ворсин хоріону), імуногістохімічні методи (визначення експресії маркерів апоптозу в хоріальній та децидуальній тканинах), статистичні методи дослідження.

Наукова новизна одержаних результатів.

Вперше вивчено частоту та структуру хромосомних аномалій ембріону при ранньому невиношуванні в категорії пацієнток після екстракорпорального запліднення.

Вперше визначено ультразвукові, допплерографічні, морфологічні та імуногістохімічні особливості ранньої неперспективної вагітності, яка пов'язана з хромосомними аномаліями ембріону.

Вперше розроблено критерії високого ризику виникнення хромосомних аномалій ембріону, що базуються на оцінці ультразвукових, морфологічних та імуногістохімічних ознак. Одержано деклараційний патент на корисну модель.

Вперше розроблено диференційований підхід до тактики ведення вагітності з високим ризиком виникнення хромосомних аномалій ембріону та планування наступної вагітності у даної категорії пацієнток.

Практичне значення одержаних результатів. Запропоновані в науковій роботі діагностичні критерії високого ризику виникнення хромосомних аномалій ембріону дозволили розробити індивідуальний план ведення кожної пацієнтки з ранньою неперспективною вагітністю після екстракорпорального запліднення.

Результати дослідження дають можливість диференційованого підходу до планування наступної вагітності у пацієнток після екстракорпорального запліднення при хромосомних аномаліях ембріону.

Розроблені методики з використанням комплексної оцінки причин виникнення хромосомних аномалій ембріону у пацієнток в програмах ДРТ на основі цитогенетичним досліджень, медико-генетичного консультування та ПГД застосовуються в клініках репродуктивної медицини.

Особистий внесок дисертанта.

Планування та вибір теми наукової роботи проводились під керівництвом наукового керівника. Всі дослідження виконані дисертантом за період з 2004 по 2006 рр. Проведено клініко-лабораторне і функціональне обстеження 90 вагітних, 60 з яких - з ранньою неперспективною вагітністю після ІVF.

Самостійно здійснено забір і підготовку біологічного матеріалу, аналіз отриманих результатів, співставлення результатів ультразвукового, морфологічного, імуногістохімічного та цитогенетичного досліджень при ранній неперспективній вагітності у пацієнток після екстракорпорального запліднення. Самостійно виконано теоретичне узагальнення результатів роботи, сформульовані основні положення і висновки. Аналіз результатів оформлено у вигляді публікацій у наукових виданнях.

Автором розроблені практичні рекомендації щодо тактики ведення пацієнток з ознаками ранньої неперспективної вагітності після ІVF та плану обстеження подружньої пари для планування наступної вагітності у даної категорії пацієнтів.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи викладені на: V науково-практичній конференції асоціації репродуктивної медицини.-Київ, 2004; науково-практичній конференції «Безпліддя. Допоміжні репродуктивні технології: реалії та перспективи».-Київ, 2006.

Публікації. За темою дисертації опубліковано 4 наукових роботи, у тому числі 3 статті в провідних фахових виданнях, рекомендованих ВАК України, розділ в монографії, 1 патент на корисну модель.

Обсяг та структура дисертації. Дисертаційна робота викладена на 142 сторінках, складається зі вступу, огляду літератури, розділу матеріалів та методів дослідження, 3 розділів власних досліджень, аналізу та узагальнення результатів дослідження, висновків та практичних рекомендацій, списку використаної літератури, який включає 181 першоджерел, в тому числі 134 зарубіжних. Робота ілюстрована 30 таблицями та 23 рисунками.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ

Матеріали та методи дослідження. Дослідження проводилось на базі клінік репродуктивної медицини м.Києва «Ісіда» та «Надія» протягом 2004-2007 років. Згідно з метою та задачами, дослідження було розподілено на ІІ етапи. На І етапі проводилась клініко-статистична обробка 278 індивідуальних карт вагітних, які приймали участь в програмах ДРТ, з метою вивчення частоти раннього невиношування. ІІ етапом дослідження було безпосереднє обстеження пацієнток основної та контрольної груп.

Основну групу склали 60 пацієнток віком 19-45 років (середній вік 31,7±0,7 років) з ознаками ранньої неперспективної вагітності. Критерієм включення пацієнток до основної групи були ультразвукові ознаки ранньої неперспективної вагітності терміном 4-12 тижнів у пацієнток після ІVF. Згідно ультразвуковим характеристикам, основна група була розподілена на підгрупи:

І підгрупа - 33 пацієнтки, з анембріонією;

ІІ підгрупа - 27 пацієнток з ознаками відсутності серцебиття ембріону (вагітність, що не розвивається).

Контрольну групу склали 30 пацієнток віком 22-43 роки (середній вік 28,8±1,0 років) з відповідними термінами вагітності, яким після комплексного обстеження був проведений артифіційний аборт за їх власним бажанням.

При обстеженні пацієнток основної групи зверталась увага на: вік пацієнтки, тривалість періоду неплідності, наявність невдалих спроб настання вагітності, самовільні викидні в анамнезі, передчасні пологи, вроджені вади розвитку у дітей, мертвонародження та антенатальна загибель плоду, сімейний анамнез на наявність можливої спадкової патології.

Пацієнткам обох груп виконувалось ультразвукове обстеження на ультразвуковому апараті SA - 8000ЕХ з використанням вагінального датчика частотою 3,5-7 МГц та кольорової допплерографії. Вимірювались середній діаметр плідного міхура, товщина хоріону, куприково-тім'яний розмір ембріону (КТР) та його відповідність очікуваному терміну вагітності; наявність серцебиття ембріону; розмір та якість (форма, гіперехогенність) жовточного мішку, ретрохоріальні гематоми. Кровоток на рівні маткових артерій оцінювався по наступним показникам: пікова систолічна швидкість (PSV), кінцево-діастолічна швидкість (EDV), індекс резистентності (RІ), пульсаційний індекс (PІ), наявність негативного діастолічного компоненту на кривих кровотоку.

Для оцінки гормонального статусу пацієнток основної і контрольної груп проводилось визначення концентрації хоріонічного гонадотропіну (ХГ), естрадіолу та прогестерону в крові імуноферментним методом в модифікації ELІSA.

Після проведеного ультразвукового дослідження та визначення концентрацій гормонів крові, пацієнткам проводилось видалення плідного яйця шляхом кюретажу зі збором отриманого матеріалу в стерильний посуд.

Згідно плану проводилось гістологічне дослідження ворсин хоріона, децидуальної оболонки. Після приготування парафінових зрізів та фарбування за Ван-Гізон мікроскопічний аналіз проводили за схемою: опис децидуальної оболонки, ворсин, фрагментів хоріального мішку та імплантаційної площадки; оцінка ступеню цитотрофобластичної інвазії та гестаційної перебудови матково-плацентарних артерій.

Маркери апоптозу Аро-1 та bcl-2 визначались з використанням моноклональних антитіл до Аро-1 та bcl-2 на парафінових зрізах тканин товщиною 5 мкм з обробкою стрептавідин-біотин-пероксидазою. В кожному дослідженні враховували апоптоз як в трофобластичній, так і в децидуальній тканині.

При імуногістохімічному дослідженні в децидуальній оболонці визначались: великі гранулярні лімфоцити, які експресують на своїй поверхні CD 56+ і віднесені до натуральних кілерів (NK). Децидуальну тканину заморожували при -70°С, виготовляли кріостатні зрізи з використанням моноклональних антитіл до CD 56+. Лабораторною базою для проведення гістологічного та імуногістохімічного аналізу була морфологічна лабораторія НДІ ПАГ під керівництвом проф. Задорожної Т.Д.

Для цитогенетичного аналізу тканини оброблялись колхіцином з подальшою обробкою 60% розчином крижаної оцтової кислоти для отримання хромосом в стадії метафази. Оцінювався кількісний та якісний склад отриманих метафазних хромосом.

При наявності показань до генетичного обстеження батьків проводився аналіз хромосомного набору за лімфоцитами периферійної крові батька та матері. Аналіз виконувався за такою ж самою методикою, як каріотипування ворсин хоріону. Цитогенетичний аналіз проводився за методичними рекомендаціями кафедри генетики НМАПО ім. П.Л. Шупика.

Обробка статистичних даних, отриманих при дослідженні, виконувалась на персональному комп'ютері за допомогою програми BІOSTATІSTІKA.

Результати дослідження та їх обговорення.

З метою з'ясування чинників невиношування вагітності раннього терміну у пацієнток після ІVF здійснений клініко - статистичний аналіз індивідуальних карт вагітних, які проходили лікування неплідності в клініках репродуктивної медицини «Ісіда» та «Надія».

За період дослідження вагітність, досягнута шляхом використання ІVF, настала у 278 жінок з первинною та вторинною неплідністю, 60 випадків завершились раннім перериванням. Таким чином, раннє невиношування складає 21,58±2,47% .

Другий етап дослідження полягав в безпосередньому вивченні внеску хромосомних аномалій в раннє невиношування у пацієнток основної групи.

Серед особливостей клінічної картини у пацієнток основної групи слід відмітити відсутність будь-яких клінічних проявів при наявності ранньої неперспективної вагітності в 81,67±4,9% випадків (за типом викидня, який не відбувся). В 10±3,9% випадків були наявні симптоми викидня, що розпочався; в 8,33±1,05% випадків-прояви аборту в ходу. Тобто, лише в 18,33±4,95% при ранній неперспективній вагітності клінічна симптоматика присутня, що достовірно (р<0,001, n=60) доводить переважання безсимптомного перебігу даної патології.

Середній термін затримки ембріону в порожнині матки, тобто різниця між терміном припинення розвитку вагітності та терміном виявлення цієї патології складає 14±2,8 днів у пацієнток основної групи. Аналізуючи терміни припинення розвитку вагітності в основній групі отримуємо дані, які свідчать, що істотна частка випадків (79,9±5,2%) припадає на термін до 7 тижнів.

При УЗД в основній групі анембріонія виявлена в 55±6,4% випадків, вагітність, що не розвивається - відповідно в 45±6,4% випадків. Достовірно доведено (р<0,001, n=60), що в основній групі анембріонія спостерігається в терміні 4-6 тижнів вагітності частіше (81,8±4,9%) в порівнянні з вагітністю, що не розвивається в цьому ж терміні (40,8±6,3%).

Середні терміни припинення розвитку вагітності при анембріонії - 5,6±0,7 тижня, при вагітності, що не розвивається - 7±0,8 тижня. Таким чином, при анембріонії достовірно (р<0,05, n=60) припинення розвитку вагітності спостерігається в більш ранньому терміні.

Криві кровотоку з маткових артерій були досліджені у 44 пацієнток основної та 30 пацієнток контрольної групи. В основній групі пацієнток середня швидкість кровотоку (PSV) складала 14,6±0,93 см/с, в контрольній групі - 21,16±2,39 см/с (р=0,005, n=74). На відміну від прогресуючої вагітності, при анембріонії та вагітності, що не розвивається, не відбувається поступового підвищення швидкості кровотоку (PSV) зі збільшенням терміну гестації.

Індекс опору (RІ) істотно підвищений в основній групі в порівнянні з контрольною. Середнє значення RІ в основній групі складає 1,5±0,14, в контрольній групі - відповідно 0,97±0,03 (p=0,003, n=74). На відміну від контрольної групи, як при анембріонії, так і при вагітності, що не розвивається, RІ збільшується з наростанням терміну вагітності.

Пульсаційний індекс (РІ) підвищений достовірно в основній групі в порівнянні з контрольною. В основній групі середній РІ складає 2,597±0,22, в основній - відповідно 1,94±0,06 (р=0,018, n=74). В основній групі в порівнянні з контрольною пульсаційний індекс (РІ) істотно збільшується при наростанні терміну гестації. Також суттєвими особливостями кровотоку в основній групі є наявність в 6,8% випадків негативного діастолічного компоненту, та відсутність хоріального кровотоку в 86,36±5,1% випадків. Якщо розглянути показники кровотоку в підгрупах з анембріонією і вагітністю, що не розвивається, достовірної різниці по RІ та РІ не було (р>0,05, n=44), тоді як показник PSV збільшений при анембріонії (р<0,001, n=44) в порівнянні з вагітністю, що не розвивається.

Гормональний статус був досліджений у 38 пацієнток основної та 30 пацієнток контрольної групи. Рівень хоріонічного гонадотропіну (ХГ) в основній групі був знижений в 78,9±6,6%, при чому в 76,6±6,8% концентрація ХГ знижена більше, ніж на 50% для певного терміну вагітності. Середнє значення ХГ для основної групи 21240±312 мМЕ/мл в порівнянні з 86931±3430 мМЕ/мл для ІІ групи (р=0,008 при n=68) вказує на достовірне його зниження при припиненні розвитку вагітності.

Знижений рівень естрадіолу спостерігався в 84,2±5,9% у пацієнток основної групи. Середній рівень естрадіолу в основній групі складав 0,788±0,19 нмоль/л, в контрольній групі - 15,54±3,29, що достовірно (р<0,001 для n=68) вказує на низькі цифри естрадіолу при ранній неперспективній вагітності у пацієнток після ІVF.

Достовірне зниження концентрації прогестерону спостерігалось 57,9±8% пацієнток основної групи. Середній рівень прогестерону склав в основній групі 36,15±7,56 нмоль/л, відповідно в контрольній - 177,6±39,79 (р<0,001 для n=68). Виявляється прямий зв'язок між низькими рівнями ХГ та прогестерону. Але в 42,1±8%, в основній групі за наявності знижених концентрацій ХГ та естрадіолу рівень прогестерону знаходився в межах норми. Дисбаланс між відносно нормальними концентраціями прогестерону та істотно зниженим рівнем ХГ вказує на вплив екзогенного прогестерону або синтез власного прогестерону з низькою біологічною активністю на тлі прийому препаратів прогестеронового ряду. З іншого боку, цей факт характеризує стан трофобласту і може вказувати на зниження його функціональної активності.

Структура генетичних аномалій ембріону у пацієнток основної групи представлена в таблиці 1:

Таблиця 1. Структура хромосомних аномалій ембріону у пацієнток основної групи

Хромосомні аномалії ембріону	Кількість випадків
	Абс. число	%
Транслокації	4	7,4±3,6
Поліплоїдії	15	27,75±6,1
Трисомії	20	37,1±6,6
Моносомія Х	3	5,55±3,1
Мозаїцизм	2	3,7±2,5
Нормальний каріотип	10	18,5±5,2
Всього	54	100

Аналізуючи структуру отриманих хромосомних аномалій ембріону можливо вказати певні особливості: по - перше, рання неперспективна вагітність, причиною зупинки розвитку якої є генетично аномальні ембріони зустрічається в 81,5±5,2% випадків.

По - друге, в структурі хромосомних аномалій значно переважають трисомії (37,1±6,6%), в основному за рахунок трисомії за 16 хромосомою (40±2,1%). Друге місце в дослідженні займають поліплоїдії (27,75±6,1%), в структурі яких переважають триплоїдії (69,ХХХ або 69,ХХУ) -73,3±6,0%. Тетраплоїдії, тобто наявність в хромосомному наборі 92 хромосом, відповідно в 26,76±6,0%.

Результати дослідження свідчать, що в структурі хромосомних аномалій ембріону кількісні генетичні перебудови складають 86,3±4,67%, відповідно частота структурних (якісних) перебудов хромосом складає 13,7±4,67%.

У пацієнток основної групи з трисомією (20 випадків) середній вік складав 33,2±4 роки, що підтверджує більш часте виникнення трисомій зі збільшенням віку матері.

Чоловічий фактор неплідності (зміни сперматозоїдів в вигляді азооспермії, тератоспермії) спостерігався в 33,3% випадків.

При гістологічному дослідженні абортного матеріалу як в хоріальній, так і в децидуальній тканинах в усіх пацієнток основної групи спостерігались певні особливості. Мала місце поверхнева (недостатня) імплантація хоріону, яка поєднувалась з недостатністю або відсутністю цитотрофобласту. Ворсини хоріону в усіх випадках ранньої неперспективної вагітності були гіповаскулярними або аваскулярними. Крім того, спостерігалась гіпоплазія (недостатній розвиток) самих ворсин хоріону. Гіпоплазія вторинних та третинних ворсин хоріону в поєднанні з аваскуляризацією ворсин свідчить про порушення формування і дозрівання хоріальних ворсин на 18-21 день гестації.

Поряд з порушенням дозрівання та васкуляризації ворсин хоріону спостерігалась відсутність інвазії трофобласту в спіральні судини (81,7±4,99%), або недостатня, часткова інвазія (18,3±4,99%).

В усіх випадках анембріонії спостерігалась ембріопатія, а саме так званий «пустий зародковий мішок», тобто повна відсутність ембріональних структур при морфологічному дослідженні. Ембріопатія поєднується з поверхневою імплантацією та аваскуляризацією ворсин. Відсутність або зниження інвазії трофобласту в спіральні судини в поєднанні з аваскулярними ворсинами засвідчує формування первинної плацентарної недостатності з ранніх термінів вагітності, та про відсутність міжворсинчатого кровотоку.

Серед змін децідуальної оболонки в основній групі виявлені: виражена нейтрофільна та лімфоцитарна інфільтрація в поєднанні з крововиливами в децидуальну оболонку; відсутність редукції залоз ендометрію з ділянками склерозу та аутолізу децидуальної оболонки, в поєднанні з осередковою залозисто-кістозною гіперплазією ендометрію.

Виявлено, що всі випадки зниженого хоріального кровотоку, виявленого при допплерографії, відповідають поверхневій імплантації хоріону та пов'язані з анембріонією. Витончений хоріон при УЗД відповідає морфологічному діагнозу «порушення дозрівання та васкуляризації ворсин хоріону».

Для вивчення апоптозу визначалась наявність маркерів апоптозу bcl-2 та Аро-1 в децидуальній оболонці та хоріальних структурах у пацієнток обох груп. Вищезгадані показники були отримані з використанням моноклональних антитіл до Аро-1 та bcl-2 на парафінових зрізах тканин товщиною 5 мкм в 20 випадках основної та 15 випадках контрольної групи (n=35).

В нормі антиапоптотичний маркер bcl-2 широко представлений в хоріальних ворсинках, що відповідає за їх проліферацію, а в децидуальній оболонці його експресія в 3 рази менша, що вказує на переважання процесів проліферації в хоріоні поряд з процесами елімінації окремих структур в ендометрії. Рівень апоптозу в основній групі в дуцидуальній тканині та хоріоні практично ідентичні (10±1,7 і 15±6,4 за маркером Bcl-2), причому апоптоз в хоріоні втричі вищій за аналогічний показник в контрольній групі (10±1,7 і 30±5,0).

При порівняльній характеристиці експресії bcl-2 виявлено його достовірне зменшення в ворсинках хоріону та децидуальній оболонці (р<0,001, n=35) в основній групі, що вказує на підвищений апоптоз (60±10,1 для контрольної і 15±6,4 для основної групи). В порівнянні з прогресуючою вагітністю (контрольна група) за показниками Аро-1, апоптоз достовірно (р<0,001, n=35) підвищений як в хоріальній тканині, так і в децидуальних структурах в основній групі (30±5,0 в ворсинах хоріону і 50±8,4 в децидуальній оболонці).

Результати по концентрації натуральних кілерів (NK СD 56+) були отримані у 20 пацієнток основної та 15 пацієнток контрольної групи. В основній групі середня концентрація NK СD 56+ становить 32,8±7,9%, в контрольній-55,4±5,9%, що достовірно (р<0,001, n=35) свідчить про зниження цього показника при зупинці розвитку вагітності. При більш детальній оцінці експресії NK СD 56+ при аномальному каріотипі ембріону отримуємо знижену концентрацію NK, яка становить 28,2±7,6%.

Згідно завданням дослідження, був проведений пошук певних особливостей, які мали б місце при ранній неперспективній вагітності лише за наявності аномального каріотипу ембріону.

Оцінюючи особливості клінічної картини при нормальному та аномальному каріотипі отримано наступні дані (таблиця 2).

Таблиця 2. Співвідношення клінічних та цитогенетичних маркерів у пацієнток основної групи

Клінічна картина	Каріотип ворсин хоріону
	Аномальний	Нормальний
	Абс.	%	Абс.	%
Викидень, який не відбувся	39	72,2±6,0	7	12,9±4,6*
Аборт, що розпочався	3	5,55±3,1	2	3,7±2,6
Аборт в ходу	2	3,7±2,6	1	1,85±0,5
Всього	44		10

* р<0,05, n=54

При порівнянні частоти викидня, який не відбувся, при нормальному та аномальному каріотипі, отримуємо достовірне (р<0,05 при n=54) переважання вищезгаданої патології саме при аномальному каріотипі ембріону. екстракорпоральний запліднення безперспективний вагітність

Для більш детальної характеристики проведена оцінка ультразвукових ознак по кожній хромосомній аномалії з метою знайдення певних ультразвукових особливостей для кожної генетичної аномалії. Транслокації, подвійна трисомія та мозаїчні форми генетичних перебудов в даному дослідженні перебігали виключно за типом анембріонії. При поліплоїдіях анембріонія була вдвічі частішою ультразвуковою ознакою, ніж завмерла вагітність.

В основній групі анембріонія, що пов'язана з аномальним каріотипом ембріону, зустрічається в 53,7±6,8%, що свідчить про достовірний зв'язок анембріонії та генетичних аномалій ембріону (р<0,001, n=54). Відповідно до цього, вагітність, що не розвивається, спостерігається в 27,7±6,1% при аномальному каріотипі ембріону.

Якщо провести паралелі між хромосомними аномаліями ембріону та гестаційним віком, отримуємо, що в 84±4,73% випадків при аномальному каріотипі вагітність припиняє свій розвиток в терміні вагітності до 7 тижнів.

Виходячи з всього вищенаведеного були сформовані критерії високого ризику виникнення хромосомних аномалій ембріону:

§ Відсутність ембріону (анембріонія) при діаметрі плідного яйця більше 16 мм.

§ Відсутність серцебиття ембріону і жовточного мішку при КТР більше 5 мм або при діаметрі плідного яйця більше 16 мм.

§ Порушення кровотоку, при якому знижена його швидкість в маткових артеріях, що поєднується з підвищеними індексами (РІ та RІ);

§ Відсутність клінічних проявів (перебіг за типом викидня, який не відбувся);

§ Зниження концентрації ХГ та естрадіолу більше ніж на 50% від нормативного рівня для відповідного терміну вагітності;

§ Відсутність або зниження інвазії трофобласту в спіральні судини в поєднанні з порушенням формування і дозрівання ворсин (гіпо-, аваскулярність ворсин);

§ Високий рівень показників апоптозу в хоріальній тканині.

ВИСНОВКИ

В роботі вирішено актуальне медичне завдання - підвищення ефективності діагностики вагітності високого ризику розвитку хромосомних аномалій ембріону у пацієнток після екстракорпорального запліднення.

1.Ультразвукова картина при ранній неперспективній вагітності характеризується анембріонією в 55±6,4% (відсутність ембріону при діаметрі плідного яйця більше 15 мм), та вагітністю, що не розвивається (відсутність серцебиття ембріону при КТР більше 5 мм) в 45±6,4%. Особливості показників кровотоку: знижена PSV з маткових артерій; підвищені PІ та індекс RІ; відсутність хоріального кровотоку та відсутність кровотоку в жовточному мішку. Рання неперспективна вагітність вказує відсутність наростання швидкості кровотоку зі збільшенням терміну вагітності та поступове підвищення індексів (PІ та RІ) замість їх зниження в нормі. При цьому анембріонія характеризується підвищеною PSV відносно вагітності, що не розвивається.

2.Рання неперспективна вагітність характеризується достовірним зниженням концентрації ХГ та естрадіолу, а саме, більше, ніж на 50% від нормативного рівня для відповідного терміну вагітності. При цьому в основній групі має місце відсутність адекватного наростання концентрації ХГ. Прогестерон знижений в 57,9% випадків. Випадки нормальної концентрації прогестерону при зниженій концентрації ХГ пояснюються введенням екзогенного прогестерону у даної категорії пацієнток.

3.Морфологічними змінами при анембріонії є ембріопатія («пустий зародковий мішок»), поверхнева імплантація плідного яйця. Як для анембріонії, так і для вагітності, що не розвивається, особливостями хоріону є аваскулярність ворсин та відсутність або зниження інвазії трофобласту в спіральні судини. Зміни децидуальної оболонки: відсутність редукції залоз ендометрію, лімфоцитарна або нейтрофільна інфільтрація децидуальної оболонки, осередки склерозу судин та некрозу самої оболонки.

4.Генетичні аномалії у вигляді транслокацій, подвійної трисомії та мозаїцизму пов'язані з анембріонією. При поліплоїдіях анембріонія спостерігалась вдвічі частіше, ніж вагітність, що не розвивається. Трисомії з однаковою частою мали місце як при анембріонії, так і при вагітності, що не розвивається. В 72,2% випадків рання неперспективна вагітність має перебіг за типом викидня, який не відбувся. Відсутність клінічних проявів при цьому пояснюється блокуванням прогестероном (поєднання дії ендогенного та екзогенного прогестерону) скоротливої активності матки, за рахунок чого не відбувається відторгнення плідного яйця з порожнини матки.

5.Рівень апоптозу істотно підвищений при ранній неперспективній вагітності, при цьому апоптоз має однакові рівні для децидуальної оболонки та для хоріону. В противагу цьому, при прогресуючій вагітності рівень апоптозу вищий в децидуальній оболонці і мінімальний в хоріоні, що відповідає процесам проліферації та розвитку хоріону при ранній прогресуючій вагітності. Апоптоз при анембріонії вдвічі вищий за даний показник при вагітності, що не розвивається, при цьому достовірно (р<0,05) перевищує рівень апоптозу при прогресуючій вагітності.

6.Імунологічні зміни характеризуються зниженою кількістю натуральних кілерів (NK) в децидуальній оболонці при ранній неперспективній вагітності в порівнянні з прогресуючою. Концентрація NK істотно підвищується тільки при тривалому перебуванні елементів загиблого плідного яйця в порожнині матки, відповідає масивній лімфоцитарній інфільтрації при морфологічному дослідженні.

7. Кожна пацієнтка в програмах ДРТ, у якої виявлені ознаки ранньої неперспективної вагітності, потребує детального обстеження, яке включає в себе дослідження гормонального статусу, обов'язкове детальне морфологічне та цитогенетичне дослідження абортного матеріалу для можливості прогнозування подальшої тактики. Прогнозування успішного перебігу наступної вагітності та тактика лікаря залежить від результатів, отриманих при комплексному дослідженні. При наявності спадкових генетичних аномалій необхідно застосовувати передімплантаційну генетичну діагностику та донорський матеріал в програмах ДРТ.

Практичні рекомендації

Для вдосконалення тактики лікаря гінеколога - репродуктолога в випадку раннього припинення розвитку вагітності, пов'язаного з хромосомними аномаліями ембріону, необхідно користуватись наступним алгоритмом:

Якщо рання неперспективна вагітність у даної пацієнтки спричинена цитогенетично доведеною хромосомною аномалією ембріону, в такому випадку сімейна пара потребує подальшого медико-генетичного консультування. Якщо генетичні перебудови в хромосомному наборі як матері, так і батька відсутні, аномалія генетичної структури ембріону вважається такою, що виникла спонтанно.

1. Враховуючи той факт, що подружні пари з багаторічною неплідністю в анамнезі можуть мати приховані перебудови хромосом, потрібна більш детальна генетична діагностика. Якщо причиною неплідності є чоловічий фактор, а саме тератоспермія та олігоастенозооспермія, необхідне дослідження хромосомного набору сперматозоїдів за методом FІSH. Цей метод має істотні переваги перед методом метафазних пластин, тому що дозволяє вивчити мінімальні хромосомні поломки, які можуть бути відповідальні за виникнення генетичних перебудов у ембріонів.

2. Якщо в процесі діагностики хромосомного набору подружньої пари та медико-генетичного консультування вияснено, що будь хто з батьків є носієм спадкових генетичних перебудов, необхідно ставити питання про використання донорських яйцеклітин або сперматозоїдів для виключення ризику повторного виникнення хромосомних аномалій ембріону.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Г.Б. Стовбун. Кореляція ультразвукових та цитогенетичних маркерів ранньої неперспективної вагітності у пацієнток після екстракорпорального запліднення // Збірник наукових праць співробітників КМАПО ім. П.Л.Шупика.-2004р., випуск 13, книга 5.-С.183-187.

2. Т.Д. Задорожна, Г.Б. Стовбун, Н.А. Шарма. Цитогенетичні та морфологічні особливості самовільних викиднів та завмерлої вагітності у пацієнток в циклах ІVF // Збірник наукових праць співробітників НМАПО ім. П.Л. Шупика.-2006р., випуск 15, книга 2.-С.216-220. (Проводила набір клінічного матеріалу, статистичну обробку, аналіз та узагальнення результатів, підготовку статті до друку.)

3. Г.Б. Стовбун. Комплексний підхід до діагностики та прогнозування подальшого розвитку ранньої неперспективної вагітності у пацієнток в циклах ІVF // Збірник наукових праць співробітників НМАПО ім. П.Л.Шупика.-2007р., випуск 15, книга 2.-С.420-424.

4. В.В. Коноплянко, І.О. Судома, Г.Б. Стовбун. Скринінг патології плода // Актуальные вопросы акушерства, гинекологии и репродуктологии.-М. Триада-Х.-2006. С. 475-480. (Проводила підбір, переклад та аналіз наукової літератури, підготовку розділу до друку).

5. Т.Д. Задорожна, І.О. Судома, Г.Б. Стовбун. Деклараційний патент на корисну модель «Спосіб діагностики аномалій ембріону у пацієнток після запліднення іn vіtro». Патент № 23079. Опубліковано 10.05.2007. Бюл. № 1.

АНОТАЦІЯ

Стовбун Г.Б. Прогнозування ризику виникнення хромосомних аномалій ембріону та наступного невиношування у пацієнток після екстракорпорального запліднення.-Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 14.01.01.- Національна медична академія післядипломної освіти імені П.Л. Шупика МОЗ України, Київ, 2009.

Дисертація присвячена підвищенню ефективності діагностики вагітності з високим ризиком виникнення хромосомних аномалій ембріону та прогнозуванню настання наступної вагітності на основі вивчення результатів ультразвукового дослідження, особливостей гормонального статусу, імуногістохімічних та цитогенетичних особливостей ранньої неперспективної вагітності у пацієнток після екстракорпорального запліднення.

Рання неперспективна вагітність на 81,5% пов'язана з аномальним каріотипом ембріону, причому в 72,2±6,0 % випадків клінічно перебігає за типом викидня, який не відбувся. В 84% випадків припинення розвитку вагітності при аномальному каріотипі спостерігається в терміні до 7 тижнів.

Діагностика здійснюється наступним чином: при виявленні анембріонії при діаметрі плідного яйця більше 16 мм або відсутності серцебиття ембріону при КТР більше 5 мм проводиться дослідження гормонального статусу (ХГ, естрадіол, прогестерон) та кюретаж матки з подальшим морфологічним, цитогенетичним та імуногістохімічним дослідженням отриманого матеріалу. Після комплексної оцінки розробляється індивідуальний план подальшого ведення. Якщо хромосомна аномалія, виявлена при цитогенетичному дослідженні спонтанна, пропонується планування наступної вагітності без проведення більш детального генетичного обстеження. Якщо хромосомна аномалія спадкова, оцінюється ризик її виникнення при наступній вагітності, проводиться медико-генетичне консультування, ПГД та при високому ризику ставиться питання про застосування донорських статевих клітин (в залежності від джерела носійства генетичних аномалій).

Ключові слова: рання неперспективна вагітність, хромосомні аномалії ембріону, планування наступної вагітності.

АННОТАЦИЯ

Стовбун А.Б. Прогнозирование риска возникновения хромосомных аномалий эмбриона и последующего невынашивания у пациенток после экстракорпорального оплодотворения.-Рукопись.

Диссертация на соискание научной степени кандидата медицинских наук по специальности 14.01.01.-акушерство и гинекология.-Национальная медицинская академія последипломного образования шимени П.Л. Шупика МОЗ Украины, Киев, 2009.

Диссертация посвящена повышению эффективности диагностики беременности высокого риска возникновения хромосомных аномалий эмбриона и прогнозированию наступления следующей беременности на основе изучения результатов ультразвукового исследования, особенностей гормонального статуса, иммуногистохимических и цитогенетических особенностей ранней неперспективной беременности у пациенток после экстракорпорального оплодотворения.

Ранняя неперспективная беременность на 81,5% связана с аномальным кариотипом эмбриона, причем в 72,2±6,0 % случаев клинически протекают по типу несостоявшегося выкидыша. В 84% случаев остановка развития беременности при аномальном кариотипе приходится на сроки до 7 недель.

Диагностика осуществляется следующим образом: при выявлении анэмбрионии при диаметре плодного яйца больше 16 мм или отсутствия сердцебиения эмбриона при КТР больше 5 мм проводится исследование гормонального статуса (ХГ, эстрадиол, прогестерон) и кюретаж матки с последующим морфологическим, цитогенетическим и иммуногистохимическим исследованием полученного материала. Исследовались особенности хориальной, децидуальной ткани, степень инвазии трофобласта в спиральные сосуды, механизм остановки развития беременности; определялся кариотип ворсин хориона, при необходимости - кариотип родителей по лимфоцитам крови; изучалась специфика апоптоза в хориальной и децидуальной ткани при хромосомных аномалиях эмбриона.

В основной группе анэмбриония, связанная с аномальным кариотипом эмбриона, встречается в 53,7±6,8%, что указывает про достоверную связь анэмбрионии и генетических аббераций эмбриона (р<0,001, n=54). Соответственно, неразвивающаяся беременность определялась в 27,7±6,1% при аномальном кариотипе эмбриона.

В структуре хромосомных аномалий, ответственных за остановку развития беременности, значительно преобладают трисомии (37,1±6,6%), в основном за счет трисомии по 16 хромосоме (40±2,1%). На втором месте находятся полиплоидии (27,75±6,1%), среди которых в свою очередь преобладают триплоидии (69,ХХХ или 69,ХХУ) - 73,3±6,0%. Тетраплоидии, т.е. наличие в хромосомном наборе 92 хромосом, соответственно в 26,76±6,0%.

При ранней неперспективной беременности к морфологическим признакам относились: поверхностная имплантация хориона; гиповаскулярность, аваскулярность ворсин хориона; отсутствие инвазии трофобласта в спиральные сосуды (81,7±4,99%) или частичная инвазия (18,3±4,99%); эмбриопатия („пустой зародышевый мешок”) при анэмбрионии.

Показатели апоптоза (bcl-2 и Аро-1) при ранней неперспективной беременности были значительно повышены, что указывало на активизацию апоптоза при наличии генетических аномалий эмбриона.

Исходя из оценки всех вышеперечисленных факторов, были разработаны критерии високого риска возникновения хромосомних аномалій эмбриона у пациенток после экстракорпорального оплодотворения, которые включают: анэмбрионию при диаметре плодного яйца больше 16 мм; отсутствие сердцебиения эмбриона и (или) желточного мешка при КТР больше 5 мм аили при диаметре плодного яйца больше 16 мм; нарушение кровотока, при котором пониженная его скорость в маточных артериях сочетается с повышенными индексами (РІ и RІ); отсутствие клинических проявлений (протекание по типу несостоявшегося выкидыша); снижение концентрации ХГ и эстрадиола больше чем на 50% от нормативного значения для соответственного срока беременности; отсутствие или снижение инвазии трофобласта в спиральные сосуды в сочетании с нарушением формирования и созревания ворсин (гипо-, аваскулярность ворсин); высокий уровень показателей апоптоза в хориальной ткани.

Послe комплексной оценки разрабатывается индивидуальный план дальнейшего ведения. Если хромосомная аномалия, выявленная при цитогенетичнеском исследовании спонтанная и родители не являються носителями наследственных хромосомних перестроек, предлагается планирование следующей беременности без проведения более углубленного генетического обследования. При этом рекомендуется призводить более детальный поиск других причин раннего прерывания беременности (гормональный дисбаланс, инфекционные факторы, антифосфолипидный синдром, и т.д.)

Если хромосомная аномалия наследственная, оценивается риск её возникновения при следующей беременности, т.е. один из родителей или оба имеют любые хромосомные перестройки, которые возможно будут переданы ребенку, проводится медико-генетическое консультирование, ПГД бластомеров эмбрионов, а также сперматозоидов, и при высоком риске повторения генетических аномалий эмбриона необходимо использование донорського материала (сперматозоидов или яйцеклеток в зависимости от источника носительства хромосомних аббераций).

Ключевые слова: ранняя неперспективная беременность, хромосомные аномалии эмбриона, планирование следующей беременности.

SUMMARY

Stovbun G.B. Prognosіs of rіsk an orіgіn of embryos chromosomal abnormalіtіes and subsequent mіscarrіage іn patіents after іn vіtro fertіlіzatіon.- Manuscrіpt.

Thesіs for the degree of a Candіdate of Medіcal Scіences іn specіalty 14.01.01- obstetrіcs and gynecology. - Natіonal Medіcal Academy of Post-Graduate Educatіon named after P.L. Shupyk the Mіnіstry of Health of Ukraіne, Kyіv, 2009.

The thesіs іs devoted the іncrease of dіagnostіcs effіcіency of pregnancy wіth hіgh rіsk of embryos chromosomal abnormalіtіes and prognostіcatіon of next pregnancy on the basіs of ultrasound research, features of hormonal status, іmmunogіstochemіcal and cytogenetіcal features of early non-prospectіve pregnancy for patіents after іn vіtro fertіlіzatіon.

Early non-prospectіve pregnancy on 81,5% іs related to abnormal embryos karyotype, thus іn 72,2±6,0 % cases іt clіnіcally passes on the type of іnsolvent abortіon. Іn 84% cases stoppіng of pregnancy development at abnormal karyotype are on terms to 7 weeks.

Dіagnostіcs іs carrіed out as follows: at the exposure of anembryonіc pregnancy at the dіameter of gestatіonal sac more than 16 mm or absence of fetal heart actіvіty іn embryo at CRL more than 5 mm research of hormonal status іs conducted (HG, estradіol, progesterone) and abrasіon of uterus wіth subsequent morphologіcal, cіtogenetіcal and іmmunogіstochemіcal research of the obtaіned materіal. After a complex estіmatіon the іndіvіdual plan of further conduct іs developed. Іf a chromosomal abnormalіty, exposed at cіtogenetіcal research іs spontaneous, іt іs offered plannіng of next pregnancy wіthout the deep genetіc іnspectіon. Іf a chromosomal abnomalіty іs іnherіted, the rіsk of іts orіgіn іs estіmated at next pregnancy, the genetіcs advіsіng іs conducted, PGD and at a hіgh rіsk іt іs necessary to use donor gametes (dependіng on the source of chromosomal aberratіons).

Keywords: early non-prospectіve pregnancy, chromosomal abnomalіtіes of embryo, plannіng of next pregnancy.

ПЕРЕЛІК УМОВНИХ СКОРОЧЕНЬ

ДРТ - допоміжні репродуктивні технології

КТР- куприково - тім'яний розмір

ХГ - хоріонічний гонадотропін

УЗД - ультразвукове дослідження

NK CD56 - натуральні кілери

ІVF- іn vіtro fertіlіzatіon - екстракорпоральне запліднення

PІ - пульсаційний індекс

RІ - індекс резистентності

Размещено на Allbest.ru