АВТОРЕФЕРАТ

Бибик О.Ю. Возрастные особенности морфогенеза органов иммунной системы в нормальних средовых условиях и при воздействии хронической гипертермии. - Рукопись.

Диссертация на соискание научной степени доктора медицинских наук по специальности 14.03.01 - нормальная анатомия. - Крымский государственный медицинский университет им.С.И.Георгиевского МЗ Украины, Симферополь, 2008.

Дисертация посвящена изучению морфофункциональных особенностей первичного лимфоидного органа - тимуса и вторичных лимфоидных органов - брыжеечных (висцеральных) и подмышечных (соматических) лимфатических узлов белых крыс трех возрастных групп, которые пребывали в условиях различных температурно-временных режимов хронической гипертермии и интенсивных физических нагрузок.

Экспериментальное исследование проведено на 535 белых безпородных крысах самцах различных периодов онтогенеза. В работе было изучено влияние 3 различных температурно-временных режима: экстремальная хроническая гипертермия (44,3-45,1єС), хроническая гипертемрия средней степени выраженности (42,0-43,1°С) и умеренная хроническая гипертермия (39,6 - 40,9°С). Кроме того, было изучено влияние сочетанного воздействия екстремального хронического гипертермического режима и интенсивных физических нагрузок в виде плаванья на морфогенез первичных и вторичных лимфоидных органов. С помощью органометрических, морфометрических, ультрамикроскопических, иммунологических методов получены сведения о морфофункциональных изменениях в первичном лимфоидном органе - тимусе и вторичных лимфоидных органах - ЛУ белых крыс, развивающихся в условиях различных термических режимов общей экзогенной ХГ.

Благодаря проведенным комплексным исследованиям, а также методам трехмерной реконструкции органов установлено, что длительное перегревание животных при температуре 44,1-45,3єС сопровождается морфологическими признаками стойкого функционального истощения изучаемых лимфоидных органов. Умеренный термический режим (39,6-40,9єС) обладает иммуностимулирующей активностью. Последствия сочетанного воздействия экстремальной степени выраженности температурного фактора и интенсивной мышечной работы являются наиболее губительными для иммунной системы организма животных. Подобного рода экзогенные воздействия приводят к инициации необратимых дефектов микроорганизации органов иммуногенеза, что требует проведения мероприятий адекватной и рациональной медикаментозной коррекции.

Впервые определена динамика изменений морфогенеза тимуса и брыжеечных и подмышечных лимфатических узлов крыс, находившихся в условиях экстремальной хронической гипертермии при иммунокоррекции экстрактом из листьев Гинкго билоба. Нами также обнаружен стойкий иммунопротекторный эффект нуклеозида пурина - инозина в изучаемых условиях эксперимента.

Выяснены механизмы нарушений функционирования клеточного и гуморального звеньев иммунитета в условиях различных температурных режимов хронической гипертермии при физических нагрузках и рациональной фармакокоррекции экстрактом из листьев Гинкго билоба и инозином.

Результаты исследований структурно-функциональных изменений в тимусе, брыжеечных и подмышечных лимфатических узлов крыс, перенесших влияние различной степени выраженности общей экзогенной хронической гипертермии и физических нагрузок, а также использование медикаментозной коррекции могут быть использованы в онкологической, аллергологической, ревматологической, педиатрической и гериатрической практике для лечения больных с нарушениями иммунологического статуса. Данные проведенного экспериментального исследования являются полезными для изыскания путей иммуностимуляции организма.

Ключевые слова: иммунная система, тимус, лимфатические узлы, возрастные особенности, хроническая гипертермия, физические нагрузки.

Summary

Bibik E.J. Age features of the morphogenesis of the immune system organs under the normal environmental conditions and after influence of the chronic hyperthermia. - The manuscript.

Thesis for Doctor of Medical Science degree on specialty 14.03.01 - normal anatomy. - Crimean State Medical University named after S.I. Georgievsky, Simferopol, 2008.

Dissertaion is devoted to prospective searchings of the a primary morphological units of immune system (IS), such as thymus, and secondary units - visceral mesenteric, axillar somatic lymph nodes of the white lab rats of three different age groups, who have transferred influence of different degrees of constant hyperthermia and physical overload.

Using the complex investigations (organomeasuring, morphometrical, ultramicroscopic, immunologic methods, and 3-D spatial modelling of organs) the age features were analysed in different units of immune system under exposition of extreme, moderate and mild hyperthermia. Also the influence of the combination of the chronic long-term hyperthermia with physical overload was investigated. As a result of current research, the actual medical correction of the secondary immunodefficiency was created, testified and proposed: extraction of the Ginkgo Biloba leaves and Inozine are represent the proper correction.

Key words: immune system, thymus, lymph nodes, age features, chronic hyperthermia, physical overload.

1. Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Протягом останніх десятиріч в умовах погіршення екологічного оточення, підсилення стресорних впливів на організм людини, збільшення розповсюдженості імунодефіцитних станів різноманітного генезу суттєво зросла зацікавленість фахівців багатьох галузей медицини до будови та функцій імунної системи (Н.А. Гуменюк, В.Є. Казмірчук, 2006; В.М. Петренко, 2003; В.А. Черешнєв, 2001; В.І. Кирилов, 1998; Ю.Є. Вирєнков, 1989). Постаючи однією з провідних інтегруючих загальнорегуляторних систем організменного рівня та перебуваючи в тісному взаємозв'язку з нервовою та ендокринною системами, імунна система протягом усього періоду онтогенезу характеризується високим ступенем динамічності (М.Р.Сапін, Д.Б. Нікітюк, 2000; А.А. Ярилін, 2003, В.А. Труфакін, А.В. Шурлигіна, 2002; З.С. Хлистова, 2002).

Морфологічною основою імунної системи є лімфоїдна тканина, згрупована у функціональні утвори (І.С. Фрейндлин, 1998; Gaudecker von B., 1991; J.F. Miller,1994). Імунна система представлена сукупністю клітинних елементів від поліпотентної стовбурової кровоутворювальної до ефекторної клітини, які перебувають у процесах проліферації, диференціювання, міграції, кооперації та загибелі (Ю.І. Бородін, 2004; О.А. Корнєєва, 2003; А.С. Головацький, М.Р. Сапін, 2001).

У теперішній час на межі фундаментальних медико-біологічних дисциплін - анатомії, фізіології, імунології, екології виник новий напрямок - екологічна імунологія, що вивчає особливості функціонування імунної системи в умовах навколишнього середовища, що змінюється, передусім під впливом антропогенних чинників. Разом з тим, дотепер відсутня у необхідному обсязі інформація про структурно-функціональні зміни в первинних та вторинних лімфоїдних органах під впливом несприятливих факторів навколишнього середовища.

Особлива увага дослідників прикута до вивчення впливу фізичних факторів на організм людини й тварин, серед яких термічні мають істотне значення (Л.Ф. Климчук, 2003; Л.І. Андрєєва, А.В. Банніков, В.В. Горанчук, 1999; A. Мeinande, 2007). Загальновідомо, що висока температура навколишнього середовища є несприятливим чинником, що часто впливає на організм людини в природних умовах, на виробництві й приводить до порушення морфофункціонального стану різних систем і органів. Перегрівання при фізичних навантаженнях спостерігається у працівників глибоких вугільних шахт, робітників гарячих цехів металургійних, машинобудівних, скловиготівних заводів. Впливу температурного фактора піддаються військові в період виконання навчальних і бойових завдань. Важливим є вивчення перегрівання організму також у зв'язку з освоєнням космічного простору, оскільки польоти людини в космос можуть бути пов'язані з ризиком впливу на організм високої зовнішньої температури. Нерідко перегрівання виникає при дії на організм людини високої температури, обумовленої природними кліматичними факторами, особливо враховуючи глобальне потепління на планеті.

Перебування організму в умовах гіпертермічного впливу приводить до суттєвих метаболічних і функціональних змін, що спричиняють високий рівень захворюваності, травматизації та летальності працездатного населення. Оскільки для Донбаського регіону найбільш характерним виробничим фактором є робота в умовах мікроклімату глибоких вугільних шахт, актуальним, на наш погляд, є вивчення морфологічних реакцій органів імуногенезу на підвищення температури навколишнього середовища при посиленій м'язовій роботі. У цьому зв'язку досить актуальними є комплексні дослідження адаптаційних можливостей первинних і вторинних лімфоїдних органів при різних температурних режимах хронічного гіпертермічного впливу та у сполученні з інтенсивними фізичними навантаженнями.

З іншої ж сторони, гіпертермічний вплив на організм розглядається дослідниками як перспективний метод профілактики й терапії ряду захворювань (О.І. Аполіхін, 1996; В.Д. Горічева, 2000; Р.С. Ізмаїл-Заде, 2004; О.К. Курпєшев,1996). За даним інституту раку Онтаріо (Торонто, 1998), загальна екзогенна гіпертермія є однієї з технологій, яка найбільш продуктивно розвивається, при лікуванні злоякісних новоутворень, оскільки доведено низьку толерантність ракових клітин до температурного фактора в інтервалі 42,0-43,5єС, і на цьому тлі в 2-3 рази зростає цитостатична активність хіміопрепаратів, що дозволяє зменшувати їхні дози.

Існує наявність і виражена залежність ступеню структурно-функціональних змін, що формуються в різноманітних системах та органах, від діапазону температури й часу її дії. Однак, дані детальних і цілеспрямованих морфологічних робіт з виявлення закономірностей, що формуються в тимусі та лімфатичних вузлах експериментальних тварин, які перебували під гіпертермічним впливом різного ступеню вираженості, на даний момент відсутні.

Викладене вище вказує на необхідність комплексного експериментального вивчення морфології й цитоархітектоніки первинних та вторинних лімфоїдних органів у звичайних умовах навколишнього середовища та під впливом на організм загальної екзогенної хронічної гіпертермії.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація є фрагментом планової наукової теми кафедри анатомії людини Луганського державного медичного університету «Вплив хронічної гіпертермії й фізичного навантаження на морфогенез органів імунної, ендокринної й кісткової систем» (№ державної реєстрації 0107U004485).

Мета та завдання дослідження. Метою дійсного дослідження було встановлення закономірностей морфогенезу органів імунної системи (тимусу й лімфатичних вузлів) білих щурів у звичайних умовах навколишнього середовища та під впливом різних температурних режимів хронічної гіпертермії за допомогою органометричних, морфометричних, ультрамікроскопічних, імунологічних методів і методу просторового моделювання органів.

Для досягнення зазначеної мети були поставлені наступні завдання:

1. Розробити експериментальну модель різних температурно-часових режимів загальної екзогенної гіпертермії на лабораторних тваринах з морфологічною верифікацією змін, що розвиваються, у первинних та вторинних лімфоїдних органах щурів різних вікових груп.

2. Вивчити особливості росту, макро- і мікроскопічної будови первинного лимфоїдного органа - тимуса білих щурів за нормальних умов життєдіяльності.

3. Дослідити вікові особливості морфогенезу вісцеральних (брижових) і соматичних (пахвових) лімфатичних вузлів білих щурів у звичайних умовах навколишнього середовища.

4. Виявити морфофункціональні зміни в тимусі на органному, тканинному й клітинному рівнях під впливом різних температурних режимів та інтенсивного фізичного навантаження.

5. Вивчити вікові особливості структурних перетворень у брижових і пахвових лімфатичних вузлах на органному, тканинному й клітинному рівнях під впливом різних температурних режимів і фізичного навантаження.

6. Створити модель тривимірної реконструкції пахвових лімфатичних вузлів щурів, що розвиваються в умовах хронічної гіпертермії.

7. Виявити морфофункціональні особливості досліджуваних лімфоїдних органів при хронічній гіпертермії під впливом потенційного імунокорегуючого засобу рослинного походження - екстракту з листя Гінкго білоба.

8. Визначити структурні перетворення досліджуваних лімфоїдних органів при хронічній гіпертермії під впливом потенційного імунокорегуючого засобу синтетичного походження - інозину.

9. Дослідити стан клітинної та гуморальної ланок імунітету у тварин в умовах хронічної гіпертермії під впливом імунокорегуючих засобів.

Об'єкт дослідженн - морфофункціональні зміни органів імуногенезу за звичайних умов навколишнього середовища та при хронічній гіпертермії.

Предмет дослідження - вікові особливості тимусу, брижових та пахвових лімфатичних вузлів інтактних білих щурів і тварин, що розвиваються при хронічній гіпертермії різного ступеню вираженості.

Методи дослідження - органометричні, морфометричні, ультрамікроскопічні, імунологічні, метод просторового моделювання органів, а також статистичні методи.

Наукова новизна отриманих результатів. У дослідженні розроблена експериментальна модель, що дозволяє моделювати фактори умов роботи в глибоких вугільних шахтах і гарячих цехах металургійних підприємств Донбасу, шляхом використання «Кліматичної камери з телекеруванням». Уперше за допомогою світломікроскопічних досліджень отримані нові наукові відомості про морфофункціональні зміни в первинному лімфоїдному органі - тимусі та вторинних лімфоїдних органах - лімфатичних вузлах білих щурів, що розвиваються в умовах різних термічних режимів загальної екзогенної хронічної гіпертермії.

Завдяки проведеним органометричним, морфометричним, електрономікроскопічним дослідженням, а також методам тривимірної реконструкції органів встановлено, що тривале перегрівання тварин при температурі 44,1-45,3єС супроводжується морфологічними ознаками стійкого функціонального виснаження досліджуваних лімфоїдних органів. Помірний термічний режим (39,6-40,9єС) володіє імуностимулюючою активністю. Наслідки поєднаного впливу екстремального ступеня температурного фактора та інтенсивних фізичних навантажень є найбільш несприятливими для імунної системи організму тварин. Такого плану екзогенні впливи призводять до ініціації незворотних дефектів мікроорганізації органів імуногенезу, що вимагає проведення заходів адекватної й раціональної медикаментозної корекції.

Уперше визначена динаміка змін морфогенезу тимуса й лімфатичних вузлів щурів, що перебували в умовах хронічної гіпертермії при імунокорекції екстрактом з листя Гінкго білоба. Нами також виявлений стійкий імунопротекторний ефект нуклеозида пурину - інозина на моделі імунодепресивного стану, викликаного тривалим перегріванням.

З'ясовано механізми порушень функціонування клітинної й гуморальної ланок імунітету в умовах різних температурних режимів хронічної гіпертермії при фізичних навантаженнях і раціональній фармакокорекції екстрактом з листя Гінкго білоба та інозином.

Практичне значення отриманих результатів. Результати досліджень структурно-функціональних змін у тимусі, брижових і пахвових лімфатичних вузлах щурів, які перенесли вплив різного ступеню виразності загальної екзогенної хронічної гіпертермії та інтенсивних фізичних навантажень при фармакокорекції можуть бути використані в онкологічній, алергологічній, ревматологічній, педіатричній та геріатричній практиці для лікування хворих з порушеннями імунологічного статусу. Дані проведеного експериментального дослідження є корисними для пошуку шляхів імуностимуляції організму.

Обґрунтовано доцільність використання рослинного препарату з листя Гінкго білоба й лікарського засобу метаболічного типу дії - інозину як коректора виникаючих внаслідок тривалого термічного впливу імунодефіцитних станів. Результати наукових досліджень можуть бути використані при вирішенні прикладних завдань анатомії, гістології, цитології, імунології та фармакології.

Впровадження результатів дослідження. Результати дослідження впроваджені в науково-дослідну роботу й навчальний процес на кафедрах анатомії людини Вінницького, Львівського, Донецького національних медичних університетів, Кримського, Запорізького, Тернопільського, Буковинського, Луганського державних медичних університетів, Дніпропетровської державної медичної академії, Ужгородського національного університету, Сумського державного університету та Вищої державної навчальної установи України «Українська медична стоматологічна академія».

Особистий внесок здобувача. Дисертантом самостійно виконаний патентно-інформаційний пошук, визначені мета й завдання дослідження, самостійно проведений експеримент на лабораторних тваринах. Автором обрані найбільш інформативні органометричні й морфометричні показники для оцінки структурних перетворень в тимусі та лімфатичних вузлах, на комп'ютерному комплексі зроблена зйомка об'єктів дослідження, проведений органометричний і морфометричний аналіз мікрофотографій досліджуваних лімфоїдних органів, самостійно описані електронограми органів імуногенезу. Досліджені й впроваджені нові методичні підходи побудови тривимірних реконструкцій лімфатичних вузлів і їхнього аналізу.

Основним є участь автора в підготовці навчального посібника, наукових статей до друку, а також розробок для оформлення Деклараційних патентів України в співавторстві. В актах впровадження приводяться дані, які особисто отримані автором у процесі виконання роботи.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційного дослідження повідомлені на I регіональній науково-практичній конференції «Перспективи розвитку фармацевтичної науки та практики в Україні» (Луганськ, 2005); Всеукраїнській науковій конференції „Актуальні питання вікової анатомії та ембріотопографії”, присвяченій пам'яті та 70-річчю від дня народження заслуженого діяча науки й техніки України, д.мед.н., проф. Круцяка В.М. (Чернівці, 2005); Міжнародній науково-практичній конференції «Актуальні проблеми морфології», присвяченій 85-річчю Білоруського державного медичного університету (Мінськ, 2006); Х Міжнародному медичному конгресі (Тернопіль, 2006); IX Міжнародній науково-практичній конференції «Сучасні наукові досягнення - 2006» (Дніпропетровськ, 2006); II регіональній науково-практичній конференції «Актуальні питання фармацевтичної науки та практики в Україні» (Луганськ, 2006); ІІІ Міжнародній медико-фармацевтичній конференції (Чернівці, 2006); науково-практичній конференції „Сучасні методи діагностики та лікування алергічних захворювань” (Київ, 2006); Всеукраїнській науково-практичній конференції «Досягнення фундаментальної й прикладної медицини» (англійською мовою) (Луганськ, 2006); IV Національному конгресі АГЕТ України (Сімферополь-Ялта, 2006); Всеукраїнській науково-практичній конференції „Сучасні методичні підходи до аналізу стану здоров'я” (Луганськ, 2007); науково-практичній конференції „Досвід і проблеми застосування сучасних морфологічних методів дослідження органів і тканин у нормі та при діагностиці патологічних процесів” (Тернопіль, 2007); IV Міжнародному конгресі з інтегративної антропології (Вінниця, 2007); III регіональній науково-практичній конференції „Актуальні проблеми сучасної фармації та медицини в теорії та практиці” (Луганськ, 2007); науковій конференції „Европейская наука XXI століття - 2007” (Дніпропетровськ, 2007), VII науково-практичної конференції морфологів України «Актуальні проблеми сучасної морфології» (Житомир, 2007), IV регіональній науково-практичній конференції „Основні напрямки розвитку фармацевтичної та медичної науки на сучасному етапі” (Луганськ, 2008).

2. Основний зміст роботи

Матеріали та методи дослідження. Дослідження проводили на 535 білих безпородних щурах-самцях трьох вікових груп, отриманих з віварію лабораторних тварин ЛугДМУ. Для усунення впливу сезонних і добових коливань на досліджувані показники, основні досліди були проведені в осінньо-зимовий період року. Дослідження здійснювалися відповідно до принципів Гельсінської декларації, прийнятою Генеральною асамблеєю Всесвітньої медичної асоціації (2000р.), Конвенції Ради Європи про права людини й біомедицини (1997), що відповідають положенням ВООЗ, Міжнародної ради медичних наукових суспільств, Міжнародного кодексу медичної етики (1983р.), «Загальними етичними принципами експериментів над тваринами», затвердженими I Національним конгресом з біоетики (Київ, 2001), погодженими з положеннями «Європейської конвенції по захисту хребетних тварин, які використаються в експериментальних та інших наукових цілях» (Страсбург, 18.03.1986). Перед початком експерименту всі тварини були ретельно оглянуті, ураховувалася їхня вага, вік, рухова активність і стан покриву вовни. До та під час експерименту пацюки перебували у віварії при температурі 20-25°С, вологості не більше 50%, обсязі повітрообміну (витяжка-приплив) 8/10, світловому режимі день/ніч у стандартних пластикових клітках не більше 6 тварин у кожній, на стандартному раціоні. Доступ до води був вільним.

Для створення експериментальної моделі екзогенної загальної гіпертермії організму, групу лабораторних тварин поміщали в добре провітрювану термічну камеру, сконструйовану співробітниками кафедри анестезіології й реаніматології Луганського державного медичного університету (авторське посвідчення №1452526 А1 на винахід «Теплова токсикологічна камера». Камера була нами вдосконалена, отриманий патент на винахід «Кліматична камера з телеконтролем і телекеруванням». Вона являє собою шафу у вигляді куба з довжиною ребра 200 мм. Стінки камери виконані із двох шарів листового заліза, простір між якими заповнено термоізолюючим матеріалом. Камера обладнана герметичними дверима, вікном спостереження і вентиляційним пристроєм. Елементи, що нагрівають, одержують струм напругою 220В через комутуючий електронний пристрій на базі семістора високої напруги. Для контролю кліматичних показників камера обладнана модулем дистанційного контролю, схема якого базується на сучасних електронних приладах: мікропроцесорі PIC й електронних датчиках вологості, температури повітря, атмосферного тиску, СО₂, а також комп'ютера з підключеною до нього веб-камерою, як комутуючого модуля.

Датчики у вигляді окремого блоку розташовані усередині камери, після посилення сигнал надходить до мікропроцесорного блоку на базі мікропроцесора PIC 16F625, розташованого зовні. Сигнали з датчиків у реальному часі переводяться в цифрову форму АЦП мікропроцесора й через СОМ порт передаються на персональний комп'ютер. Спеціально розроблене програмне забезпечення «CamerаPower», створене в середовищі розробки «Delphi», аналізує отриману інформацію й через комутуючий пристрій керує елементами, що нагрівають, і вентиляційними пристроями, а також висвітленням у камері залежно від обраного режиму. Оскільки обсяг камери досить значний, температура повітря виміряється на різних вертикальних рівнях і при різниці показників датчиків. Після аналізу інформації через комутуючий пристрій включається вентилятор для перемішування шарів повітря усередині камери. За допомогою програми „CamerаPower” установлюються режими роботи камери, при досягненні заданої температури включається відлік часу експозиції, при закінченні часу проводиться вентиляція для зниження температури в камері до кімнатної.

Також, до комп'ютера, що контролює роботу кліматичної камери, підключена веб-камера, яка транслює зображення тварин, що перебувають в умовах гіпертермії на віддалений комп'ютер для контролю стану, поводження тварин і загального ходу експерименту.

З огляду на наявність виражених добових біоритмів функціональної активності й клітинного складу первинних і вторинних лімфоїдних органів, щури відповідних підгруп піддавалися гіпертермічному впливу в ранкові години з 8-00 до 13-00. Щури експериментальних серій щоденно по 5 годин протягом двох місяців підлягали екзогенному впливові досліджуваних фізичних факторів. Тільки після закінчення цього терміну тривалого гіпертермічного впливу тварин виводили з експерименту шляхом декапітації під ефірним наркозом на 1, 7, 15, 30 та 60 добу, з метою вивчення процесів реадаптації організму після тривалого гіпертермічного впливу.

Для досягнення поставлених у дисертаційній роботі цілей нами був розроблений розподіл тварин по серіях і групам, наведений в таблиці. У якості контролю служила серія № 1, що включає щурів різних періодів онтогенезу, яких витримували також протягом 5 годин у термокамері при температурі 21°С. З метою вивчення гіпертермічного впливу на живий організм використали 3 різних температурних режими. Вплив ХГ на тварин у нашому експерименті вивчалася на щурах 2, 3 й 4 серій. Серія № 2 - складалася з 70 щурів, які щодня протягом 5 годин перебували в термічній камері при температурі 44,1-45,3°С (екстремальний режим). Статевонезрілі тварини внаслідок неспроможності центра терморегуляції в головному мозку не були включені в експериментальну серію. Щодо старих щурів, то у вигляді виключення їхню кількість у групі було збільшено до 8, що було обумовлено 15-20% загибеллю внаслідок екстремального термічного впливу. Тваринні серії № 3 також по 5 годин на добу перебували до камери при температурі 42,0-43,1°С (гіпертермія середнього ступеня - СХГ). Аналогічна кількість тварин серії № 4 утримувалася в умовах вищеописаного часового режиму при температурі 39,6 - 40,9°С (ПХГ).

Додатково були проведені дослідження на тваринних серій № 5 й №6, які піддавалися фізичним навантаженням і впливу екстремальної хронічної гіпертермії (ЭХГ) (серія №5) і СХГ (серія №6). Щури цих серій плавали в басейні по 15-20 хвилин, перебуваючи в термічній камері, до появи ознак втомлювання.

Фармакологічну корекцію змін, що виникають внаслідок впливу підвищеної температури навколишнього середовища, здійснювали за допомогою лікарського засобу рослинного походження - таблетованого препарату зі стандартизованого екстракту з листя Гінкго білоба. З профілактичною метою за 1 годину до моделювання загальної екзогенної ХГ тварини серій №7 й №9 через шлунковий зонд отримували екстракт Гінкго білоба в дозі 0,5 мг/кг. Серії №7 й №9 відрізнялися температурними режимами. У якості синтетичного коректора був обраний препарат метаболічного типу дії нуклеозид пурину - інозин.

Тварини серії № 8 одержували інозин також із профілактичною метою через шлунковий зонд у дозі 20 мг/кг за 1 годину до початку екстремального гіпертермічного впливу. Серію №10 склали щури, які аналогічно отримували інозин, але в термічній камері перебували на середньому температурному режимі. Дія препаратів на інтактних щурів у якості контролю оцінювалася на серіях лабораторних тварин №11 (екстракт Гінкго білоба) і №12 (інозин).

Таблиця 1 Розподіл тварин по групах залежно від віку, впливу, термінів виведення з експерименту

Примітка: Н - статевонезрілі пацюки (m=50-55г), С - статевозрілі пацюки (m=120-150г), Ст - старі пацюки (m=290-310г).

Розрахунок доз лікарських препаратів робили з урахуванням рекомендацій Ю.Р. і Р.С. Риболовлєвих (1979).

Після закінчення гіпертермічного впливу з метою вивчення процесів реадаптації на 1, 7,15, 30 й 60 добу тварин виводили з експерименту шляхом декапітації під ефірним наркозом відповідно до «Методичних рекомендацій з виведення тварин з експерименту» (1985). Відразу після забою виділяли лімфоїдні органи - тимус, пахвові й брижові лімфатичні вузли. Тимус ретельно відчищали від жирової тканини, визначали абсолютну масу, загальний об'єм тимусу, довжину правої та лівої долей, та фіксували в 10% розчині нейтрального формаліну. Лімфатичні вузли для збереження капсули й аферентных лімфатичних судин забирали з навколишньою жировою тканиною. Фіксацію матеріалу, виготовлення блоків проводили за загальноприйнятими методиками. Потім за стандартною схемою виготовляли парафінові серійні топографічні зрізи товщиною 3-4 мкм. Використовували забарвлення гематоксилін-еозином, за Ван-Гізоном та за способом Маллорі. Деталі гістологічної будови зрізів лімфоїдних органів вивчали за допомогою мікроскопа Оlympus ВХ 41, використалися об'єктиви Plan 4х ?/-, Plan 10х х/0,25, Plan 40 х х/0,65, ?/0,17.

Мікроморфометричне дослідження об'єктів проводили на комп'ютерному комплексі, до складу якого входять: мікроскоп Оlympus ВХ-41, цифровий фотоапарат Оlympus З 5050Z з п'ятимегапіксельною матрицею, що з'єднаний з мікроскопом системою адаптерів цієї ж фірми. До складу цього комплексу також входить персональний комп'ютер Athlon XP 2200+Mh, DDR RAM 512 m, HDD 128 Gb, video: GeForce FX5200 128Mb, обладнаний платою відеозахоплення, з'єднаний із цифровою камерою за допомогою USB інтерфейсу й відеокабелю. Використано оригінальне програмне забезпечення, розроблене старшим викладачем кафедри анатомії людини ЛугДМУ Овчаренко В.В., що дозволяє переглядати на екрані зображення гістологічного препарату в реальному масштабі часу, вибирати необхідну ділянку для фотографування, за допомогою програмних засобів регулювати режим роботи цифрового апарата (виставляння зумера, корекція колірної гами, зміна фокуса, розмір і компресія зображення), одержувати цифрові зображення гістологічних препаратів і зберігати їх на вінчестері комп'ютера для подальшого аналізу. Використали наближення об'єктива -Zoom 162 й max.

Отримані в такий спосіб цифрові зображення гістологічних зрізів являють собою файли у форматі ВМР або TIF (без компресії) із глибиною кольорів 24 bit. Оскільки координати в цифровому зображенні представлені в пікселях (піксель - це одна крапка зображення з координатами Х,У), а при морфологічних дослідженнях необхідно оперувати величинами в системі СІ, тобто в мкм, для перекладу піксельної системи координат у реальну використовують цифрові зображення каліброваного об'єкта (Держстандарт 07513-55), сфотографованого у двох взаємно перпендикулярних площинах. За допомогою цих зображень каліброваного об'єкта виготовляються калібровані файли, з використанням яких комп'ютерна програма видає розміри в реальних величинах, тобто в мкм.

На зрізах гістопрепаратів тимусу вимірювали відносні площі капсули й трабекул, кіркової речовини, мозкової речовини, корково-медулярний індекс, кількість тілець Гассаля. Клітинний склад і щільність популяції кліток визначали в корковій та у мозковій речовині. На поздовжніх зрізах, що проходять через ворота брижових і пахвових ЛВ, визначали відносні площі капсули й трабекул, коркової речовини, мозкової речовини, кірково-медулярний індекс, відсоток первинних лімфатичних вузликів, відсоток вторинних лімфатичних вузликів, фолікулярний індекс. Клітинний склад визначали в кірковій та мозковій речовині. Для одержання кількісних значень отримані цифрові зображення завантажували в оригінальну комп'ютерну програму «Morpholog», розроблену співробітниками кафедри анатомії людини ЛугДМУ (Посвідчення про реєстрацію авторського права №9604). Дані морфометричного дослідження експортувалися в програму Excel для статистичної обробки. За допомогою розробленого програмного забезпечення проводили тривимірну реконструкцію лімфатичних вузлів по серійних гістологічних зрізах.

Для електронно-мікроскопічного дослідження негайно після виділення тимуса й досліджуваних ЛВ шматочки, розміром 1 мм³, занурювали в глутаральдегідний фіксатор за Тарновським на 24 години. Потім матеріал перекладали в 1% тетраксид осмію за Паладе на 1 годину. Після дегідратації в етанолі зростаючої концентрації й абсолютному ацетоні матеріал заливали сумішшю епоксидних смол (епон-аралдит). Полімеризацію проводили протягом 36 годин при 60°С. Ультратонкі зрізи товщиною 0,5-1,5 мкм виготовляли на ультратомі ЛКБ-460. Зрізи фарбували метиленовим синім і піроніном. Після дослідження напівтонких зрізів проводили прицільне заточення пірамід блоків. Ультратонкі зрізи виготовляли на ультрамікротомі УМТП-4 Сумського ВО «Електрон» (Україна), контрастували в розчині уранілацетата й цитраті свинцю за Рейнольдсом й переглядали в електронному мікроскопі ЕМ-125 того ж виробника.

У сироватці крові визначали загальну кількість лімфоцитів, Т-лімфоцитів (СD3+) методом спонтанного розеткоутворення з еритроцитами барана за М.Jondal et al. у модифікації О.Н.Чередєєва з співавт.. Вираховували співвідношення Т-лімфоцитів до В-лімфоцитів. Визначення теофілінчутливих (Т-супресорів/кіллерів) (CD4+) і резистентних до дії теофіліну (Т-хелперів/індукторів) (CD8+) кліток здійснювали за методом Р.Limatibul et al.. Імунорегуляторний індекс розраховували як співвідношення Т-хелперів/індукторів до Т-супрессорів/кіллерів. Також у сироватці крові визначали кількість В-лімфоцитів (СD22+) за N.Mendes. Концентрацію імуноглобулінів G, А, М у сироватці крові визначали за методом радіальної імунодифузії в гелі.

Первинну статистичну обробку отриманих результатів проводили за допомогою пакета прикладних статистичних комп'ютерних програм для Windows та Excel, використовуючи кореляційний і регресивний методи аналізу.

Результати дослідження та їх аналіз. Досліджені морфологічні параметри органів імунної системи лабораторних тварин показали, що вони досить лабільні і залежать від віку щурів. Встановлено, що найбільшу абсолютну масу (274±11,9мг) та загальний об'єм (468±12,5мм³) має тимус щурів статевонезрілої групи. Тварини старечої вікової групи відрізняються суттєвим зменшенням розмірів тимуса, абсолютна маса зменшується майже в 2,1 рази в порівнянні з такою, зареєстрованою у щурів раннього періоду онтогенезу. За нашими даними, у тварин серії №1 найбільшу площу займає кіркова речовина у статевонезрілих щурів - 69,74%, у статевозрілих - 59,67%, у тварин старечої вікової групи цей показник зменшується до 50,84%. Починаючи з ранніх стадій онтогенезу поступово збільшується площа сполучнотканинного остову первинного лімфоїдного органу. Паралельно зі зменшенням площі кіркової речовини тимуса з часом, площа мозкової речовини підлягає значно меншим коливанням. Так, у тварин статевонезрілої групи вона складає 25,5%±1,6%, у статевозрілих - 26,9±1,1%, а у старих тварин - 23,7±1,6%. Кортико-медуллярний індекс в тимусі щурів різних періодів онтогенезу найбільшу величину мав у статевозрілих тварин, складаючи 2,73±0,2%, що на 20,8% більше, ніж у старечій віковій групі.

При всьому різномаїтті вікових змін у тимусі, можна стверджувати, що найбільш глибоким змінам у процесі онтогенезу піддається лімфоїдний компонент органа. Делімфатизація основних структурно-функціональних зон тимуса щурів, що наростає згодом, відбувається на тлі вікових морфофункціональних змін в епітеліоретикулярних клітинах. Це спричиняє зниження гормональної функції тимуса й, безумовно, зміну структури популяції Т-лімфоцитів, порушення їхньої здатності до активації під впливом антигенних та інших стимулів.

Підбиваючи підсумок вищенаведеним результатам светломікроскопічного й ультраструктурного досліджень соматичних і вісцеральних лімфатичних вузлів білих щурів, що розвиваються у звичайних умовах навколишнього середовища, варто погодитися з думкою F.Orsos про те, що в організмі, напевно, немає органа, структура якого була б такою різноманітною, як цей вторинний лімфоїдний орган. Різні структурно-функціональні зони складаються з різних лімфоїдних і нелімфоїдних клітин, кожна з яких виконує певну, властиву їм функцію. У процесі постнатального онтогенезу в лімфатичних вузлах щурів визначаються зміни конструкції у вигляді розростання їх сполучнотканинної строми, при цьому лімфоїдна тканина відтискується до периферії, убік капсули. Так, у статевонезрілих тварин площа капсули та трабекул на зрізах брижових ЛВ складає 6,92±0,051%, у статевозрілих - 10,44±0,119%, у тварин старечої групи - 13,42±0,142%. У пахвових лімфатичних вузлах тварин різних періодів онтогенезу також з віком спостерігається збільшення площі сполучнотканинного остову з 4,81±0,40% у статевонезрілих до 8,94±0,71% у щурів репродуктивного періоду та до 13,21±0,91 у тварин старечої вікової групи.

Значно більш суттєві зміни відбуваються з площею кіркової речовини на зрізах досліджуваних соматичних та вісцеральних лімфатичних вузлів щурів різних вікових груп. На гістологічних зрізах брижових та пахвових лімфатичних вузлів статевонезрілих тварин площа кіркової речовини превалює, складаючи 50,56% та 47,51%, відповідно. До періоду статевої зрілості особливо виражено зменшення в 1,86 рази площі, яку займає кіркова речовина у брижових лімфатичних вузлів до 27,12%. У подальшому відбувається площа кіркової речовини ще більше зменшується, складаючи у старих тварин 14,18%.

Паралельно з цим в процесі постнатального онтогенезу зростає площа мозкової речовини у досліджуваних соматичних лімфатичних вузлів з 29,13% у статевонезрілих щурів до 46,19% у тварин репродуктивного періоду та до 53,74% у щурів старечої вікової групи.

Площа коркової речовини з віком зменшується разом зі зниженням розмірів і кількості лімфатичних фолікулів у ньому. Кортико-медуллярний індекс лімфатичних вузлів з віком поступово зменшується за рахунок переваги в старечій віковій групи на зрізах площі, займаної мозковою речовиною. Так, більш суттєві зміни нами були виявлені у досліджуваних вісцеральних лімфатичних вузлів щурів статевонезрілої групи. Кортико-медуллярний індекс у них складає 1,77, тоді як у тварин репродуктивного віку - 0,65, а на гістологічних зрізах брижових лімфатичних вузлів старих щурів цей показник склав 0,28.

Серед лімфатичних фолікулів кіркової речовини як брижових, так і пахвових лімфатичних вузлів статевонезрілих тварин превалюють первинні, які не містять гермінативних центрів. У статевозрілих та старих тварин виявлено збільшення числа вторинних лімфатичних фолікулів. Фолікулярний індекс при цьому був меншим за одиницю. На зрізах досліджуваних нами лімфатичних вузлів молодих тварин добре розвинений крайовий синус, тоді як у старих щурів виявлене розширення проміжних і воротних синусів. На більше пізніх стадіях онтогенезу ретикулярні клітки досліджуваних ЛУ заміщаються жировими, що веде до поступового заміщення паренхіми вузла жировою тканиною. Для ультрамікроскопічної картини як пахвових, так і брижових лімфатичних вузлів щурів серії №1 характерна незначна кількість апоптотично змінених лімфоцитів. Стінки посткапілярних венул недеформовані, що сприяє ефективній міграції імунокомпетентних клітин у системний лімфо- і кровоплин.

Наше дослідження показало, що при тривалому впливі термічного фактора екстремального ступеня вираженості на організм лабораторних тварин у тимусі відбуваються значні зміни на органному, тканинному, клітинному та субклітинному рівнях організації. Виявлені зміни мікроанатомічної організації полягали в зменшенні маси й загального обсягу органа та його лінійних розмірів. Динаміка зміни площі кіркової речовини тимусу статевозрілих щурів після двохмісячного перебування їх в умовах екстремального хронічного гіпертермічного режиму свідчить про вірогідне (Р<0,05) зменшення цього показника на ранніх термінах, в процесі ж реадаптації спостерігається тенденція до незначного збільшення цього показника на 60 добу після завершення термічного впливу. Зміни площі мозкової речовини та сполучнотканинного остову були не так різко вираженими. При цьому кортико-медуллярний індекс тимусу щурів серії №2 змінювався, як це показано на рис.1.

Виявлений нами процес «інверсії кіркової та мозкової речовини» в тимусних дольках щурів характеризує протікання третьої стадії акцидентальної інволюції первинного лімфоїдного органа.

Зміни клітинного складу свідчать про те, що регрес площі кіркової речовини тимусу щурів сериї №2 може бути обумовлене зменшенням чисельності лімфоїдних клітин. Зменшення кількості молодих форм лімфоїдних клітин (лімфобластів і великих лімфоцитів), виявлене в нашому дослідженні, може бути пов'язане з пригніченням проліферації в субкапсулярній зоні тимуса й свідчить про зниження лімфоцитопоетичної функції тимусу після екстремальної хронічної гіпертермії.

Рис. 1. Динаміка змін кортико-медуллярного індексу тимуса щурів після двохмісячного впливу екстремальної хронічной гіпертермії

Зменшення чисельності лімфоїдних клітин у кірковій речовині тимуса щурів після екстремальної хронічної гіпертермії може бути пов'язане ще з двома причинами: підсиленням міграції лімфоцитів з тимуса та стимуляцією загибелі клітин. Відомо, що зрілі тимоцити залишають тимус крізь внутрішньодолькові периваскулярні простори, розташовані в зоні кортико-медуллярного з'єднання. Далі можливі два шляхи виходу лімфоїдних клітин з тимуса - крізь посткапілярні венули або лімфатичні судини, що починаються в периваскулярних просторах. Нами не були виявлені морфологічні ознаки посиленого виходу лімфоцитів з тимуса.

Після екстремальної хронічної гіпертермії в тимусі щурів було виявлене підсилення процесу загибелі клітин, що морфологічно проявлялося збільшенням кількості лімфоїдних клітин з ознаками апоптозу та числа макрофагів, що містять фагоцитовані залишки їхніх ядер.

Зміни, виявлені при хронічній гіпертермії середнього ступеню, були менш різко вираженими, спостерігалася тенденція до виникнення ознак акцидентальної інволюції досліджуваного нами первинного лімфоїдного органа. Співвідношення площ кіркової та мозкової речовин в дольках тимусу після завершення тривалого гіпертермічного впливу середнього ступеню, яке відображується кортико-медулярним індексом, характеризується менш вираженою депресією у порівнянні з такою, зареєстрованою у щурів серії №2 (рис.2).

Помірний режим хронічного гіпертермічного впливу не приводив до появи морфологічних ознак пригнічення функціонального стану тимусу щурів. Більш того, кортико-медуллярний індекс досліджуваного первинного лімфоїдного органу щурів експериментальної серії №4 на всіх термінах спостереження перевищував такий, зареєстрований у контролі (рис.3).

Рис. 2. Динаміка змін кортико-медуллярного індекса тимусу щурів після двохмісячного впливу хронічної гіпертермії середнього ступеню

Рис. 3. Динаміка змін кортико-медуллярного індекса тимуса щурів після двохмісячного впливу помірної хронічної гіпертермії

В основних структурно-функціональних зонах тимусу тварин серії №4 виявлена щільна упаковка клітин лімфоїдного ряду у мережі епітеліоретикулоцитів. Нами знайдені ультрамікроскопічні ознаки стимуляції мітотичной активності лімфоцитів внутрішньої зони коркової речовини тимуса щурів, підсилення білоксинтезуючої функції тимусних епітеліоретикулоцитів і плазмоцитарної реакції. Це може бути морфологічним підтвердженням імуностимулюючої активності помірних гіпертермічних впливів.

Найбільш руйнівними для імунної системи виявилися наслідки поєднаного впливу тривалого перегрівання екстремального ступеню вираженості та фізичних навантажень. Дефіцит абсолютної маси тимусу щурів серії №5 у порівнянні з контролем склав майже 44%. Стійке зменшення площі кіркової речовини на гістологічних зрізах тимусних дольок тварин цієї експериментальної серії сприяє суттєвій (у 3 рази) депресії кортико-медуллярного індексу (рис.4).

Нами виявлені стійкі й необоротні дефекти мікроорганізації тимуса пацюків цієї серії, характеризуються глибоким пригнічення лімфоцитопоетичної функції тимусу. Ця обставина вимагає адекватної та раціональної медикаментозної корекції.

Рис. 4. Динаміка змін кортико-медуллярного індексу тимуса щурів після закінчення поєднаного впливу екстремальної хронічної гіпертермії та інтенсивних фізичних навантажень

ЛВ приймають активну участь в компенсації структурно-функціональних порушень, які виникають в організмі під впливом температурного фактора.

Наше дослідження показало, що за умов тривалого впливу екстремального гіпертермічного режиму на організм лабораторних тварин у вісцеральних та соматичних лімфатичних вузлах відбуваються суттєві зміни на органному, тканиному, клітинному та субклітинному рівнях організації. Зміни мікроанатомічної будови характеризувалися зменшенням більш ніж на 40% площі кіркової речовини, суттєвим регресом (більш ніж у 2 рази) кортико-медуллярного індексу брижових лімфатичних вузлів статевозрілих щурів серії №2.

Зміни клітинного складу свідчать про те, що зменшення площі кіркової речовини може бути обумовлено зменшенням чисельності лімфоїдних клітин. Зменшення кількості молодих форм лімфоїдних клітин (лімфобластів і середніх лімфоцитів), виявлене в нашому дослідженні, може бути пов'язане із гнобленням проліферації в кірковій речовині лімфатичних вузлів та свідчить про зниження їх лімфоцитопоетичної функції при екстремальній хронічній гіпертермії. Як у пахвових, так і у брижових лімфатичних вузлах щурів після тривалої дії екстремального температурного режиму було виявлене підсилення загибелі клітин, збільшенням кількості лімфоцитів з ознаками апоптозу та макрофагів, що містять фагоцитовані залишки їхніх ядер.

Зміни, виявлені при хронічній гіпертермії середнього ступеню у досліджуваних групах лімфатичних вузлів щурів, були не настільки різко вираженими, спостерігалася тенденція до виникнення ознак функціонального виснаження цих вторинних лімфоїдних органів.

Помірний режим хронічного гіпертермічного впливу сприяв збільшенню площі кіркової речовини на гістологічних зрізах брижових ЛВ щурів, призводячи до зростання кортико-медуллярного індексу (рис.5). Цей термічний режим характеризується стимуляцією мітотичної і функціональної активності лімфоцитів різних зон та підсиленням білоксинтезуючої функції клітин нелімфоїдного мікрооточення.

Рис. 5. Динаміка змін кортико-медуллярного індексу брижових лімфатичних вузлів щурів після помірної хронічної гіпертермії

Ультраструктурна картина характеризується активацією клітинної й гуморальної ланок імунітету. Отримані дані свідчать про наявність імуностимулюючої активності помірних гіпертермічних впливів, що корелює з даними морфометрических досліджень первинного лімфоїдного органа.

Наслідки поєднаного впливу тривалого перегрівання екстремального ступеню та інтенсивних фізичних навантажень виявилися найбільш згубними для імунної системи. Нами виявлені стійкі й незворотні дефекти мікроорганізації лімфатичних вузлів щурів серії №5. Різко був пригнічений кортико-медуллярний індекс брижових лімфатичних вузлів, як видно на рис.6.

Рис. 6. Динаміка змін кортико-медуллярного індекса брижових лімфатичних вузлів щурів в процесі реадаптації після закінчення двохмісячного поєднаного впливу екстремальної хронічної гіпертермії та інтенсивних фізичних навантажень

Поряд із процесами руйнування та утилізації деструктивно змінених клітин макрофагами, у всіх структурно-функціональних зонах як брижових, так і пахвових лімфатичних вузлів щурів серії №5 різко пригнічується проліферативна активність клітин лімфоїдного ряду, що вимагає адекватної й раціональної медикаментозної корекції.

Структурні перетворення в лімфатичних вузлах свідчать про активації В-клітинних імунологічних реакцій в умовах досліджуваних температурних впливів, а ідентичність морфофункціональних зрушень у соматичних та вісцеральних лімфатичних вузлах вказує на системний характер змін.

Виявлені нами морфологічні зміни на різних рівнях організації у тварин, які перенесли екстремальну хронічну гіпертермію та щоденні інтенсивні фізичні навантаження у вигляді плавання, свідчать про формування істинного вторинного імунодефіцитного стану. Причому поєднаний екзогенний вплив такого плану має не транзиторний, а стійкий характер змін, що розвиваються. Для запобігання формування імунодефіцитних станів раціональними варто вважати заходи імунопротекторного напрямку з використанням спектру ефективних та безпечних імуномодуляторів синтетичного або рослинного походження.

Крім того, нами виявлений дозозалежний ефект впливу хронічної гіпертермії на показники клітинної ланки імунітету, що корелює з даними морфометричних та ультрамікроскопічних досліджень. Екстремальна хронічна гіпертермія призводить до стійкої та вираженої імунодепресії. Т-лімфопенія у щурів серії № 2 супроводжується дефіцитом субпопуляцій Т хелперів/індукторів, найбільш суттєвим (на 34%) в більш віддалених термінах спостереження.

Хронічна гіпертермія середнього ступеню не так інтенсивно, та, можливо, зворотно пригнічує клітинний імунітет. Нами виявлено найбільш суттєве зменшення числа Т-лімфоцитів у крові тварин цієї експериментальної серії на 1 добу після закінчення тривалої температурної дії на 13,8% в порівнянні з контролем. Вплив помірного температурного режиму сприяє стабільній повноцінній імуностимуляції на рівні Т-клітинної ланки. Тривала екстремальна гіпертермія у поєднанні з інтенсивними фізичними навантаженнями характеризується максимально вираженою Т-лімфопенією (на 39,1%) та різким дисбалансом субпопуляційного складу Т-лімфоцитів, що зумовлює розвиток імунодефіцитного стану.