Нейрохірургічна корекція рухових порушень при паркінсонізмі (експериментальне та клінічне дослідження)

Размещено на http://www.allbest.ru/

АКАДЕМІЯ МЕДИЧНИХ НАУК УКРАЇНИ

ДУ «ІНСТИТУТ НЕЙРОХІРУРГІЇІМ. АКАД. А.П. РОМОДАНОВА АМН УКРАЇНИ»

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора медичних наук

НЕЙРОХІРУРГІЧНА КОРЕКЦІЯ РУХОВИХ ПОРУШЕНЬ ПРИ ПАРКІНСОНІЗМІ (ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНЕ ТА КЛІНІЧНЕ ДОСЛІДЖЕННЯ)

П'ятикоп Володимир Олександрович

Київ - 2009

Анотація

П'ятикоп В.О. Нейрохірургічна корекція рухових порушень при паркінсонізмі (експериментальне та клінічне дослідження). - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора медичних наук зі спеціальності 14.01.05 - нейрохірургія. - ДУ «Інститут нейрохірургії ім. акад. А.П. Ромоданова АМН України», Київ, 2009.

Дисертація присвячена проблемі підвищення ефективності лікування рухових розладів у хворих на паркінсонізм шляхом виконання різного виду стереотаксичних втручань з введенням нейроіндукованих стромальних стовбурових аутоклітин, а також порівняльному аналізу ефективності введених ембріональних нервових клітин (ЕНК) і клітин строми кісткового мозку (КСКМ) на експериментальних моделях паркінсоноподібного синдрому (ПС) і кріогенної травми мозку (КТМ).

На підставі аналізу даних експериментальних досліджень було встановлено наступне: моделювання КТМ у щурів і кролів досягається шляхом дозованого кріовпливу на моторну зону кори тварини, а експериментальна модель ПС з характерними руховими порушеннями, морфологічними змінами та зниженням рівня дофаміну (ДА) розвивається внаслідок двобічного анодного електролізу сірої речовини. Показано, що стереотаксичне введення ЕНК при ПС призводить до нормалізації рівня ДА в структурах мозку експериментальних тварин, чим можна пояснити у них регрес рухових розладів. КСКМ, індуковані за нейрональним шляхом, розподіляються в зоні електролізу і кріодеструкції як при ПС, так і при КТМ, що сприяє відновленню зони ушкодження і регресу рухових порушень.

На основі аналізу результатів лікування 93 хворих на паркінсонізм, у яких було виконано різні види стереотаксичних втручань, розроблено методи диференційованого лікування в залежності від форми захворювання.

Використання інтраопераційної комп'ютерної томографії під час проведення стереотаксичних втручань дозволило покращити результати оперативного лікування на 30%.

Ключові слова: паркінсонізм, аутологічні нейроіндуковані стромальні стовбурові клітини, кріоконсервування, експериментальні моделі паркінсоноподібного синдрому і кріогенної травми мозку.

Аннотация

Пятикоп В.А. Нейрохирургическая коррекция двигательных нарушений при паркинсонизме (экспериментальное и клиническое исследование). - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук по специальности 14.01.05 - нейрохирургия. - ГУ «Институт нейрохирургии им. акад. А.П. Ромоданова АМН Украины», Киев, 2009.

Диссертация посвящена проблеме повышения эффективности лечения двигательных расстройств у больных паркинсонизмом путем выполнения различного вида стереотаксических вмешательств с введением аутологичных нейроиндуцированных стромальных стволовых клеток, а также сравнительному анализу эффективности введенных эмбриональных нервных клеток (ЭНК) и клеток стромы костного мозга (КСКМ) на экспериментальных моделях паркинсоноподобного синдрома (ПС) и криогенной травмы мозга (КТМ).

Проведенные экспериментальные исследования in vitro на изолированных ЭНК с использованием в качестве криопротектора 1,2-пропандиола позволили выработать оптимальную технологию криоконсервирования клеток, благодаря которой сохраняется от 63 до 75% жизнеспособных клеток экспериментальных животных. Применение в качестве криопротектора ДМСО при криоконсервировании КСКМ человека позволило сохранить до 72% клеток.

На основании анализа результатов экспериментальных исследований на моделях коркового повреждения (КТМ) и подкорковой деструкции (ПС) было установлено следующее: моделирование КТМ у крыс и кроликов, верифицированное с помощью данных СКТ и МРТ и морфологических изменений, достигается путем дозированного криовоздействия на моторную зону коры животного, а экспериментальная модель ПС с характерными двигательными расстройствами, морфологической картиной и снижением уровня дофамина у крыс развивается в результате двусторонней электролитической деструкции черной субстанции. Стереотаксическое введение ЭНК у животных с экспериментальной моделью ПС вызывает нормализацию уровня ДА в структурах головного мозга, чем можно объяснить у них регресс двигательных расстройств. Изучение путей распределения маркированных нейроиндуцированных стромальных клеток в зависимости от способа их введения при ПС показало, что эти клетки обладают «тропностью» к патологическому внутримозговому очагу и накапливаются в зоне очага деструкции. Выявлено также, что сроки максимального накопления нейроиндуцированных клеток в очаге электролитической деструкции совпадают со сроками восстановления движений у экспериментальных животных. Аналогичные результаты получены у животных с экспериментальной моделью КТМ: введенные маркированные стромальные клетки, индуцированные в нейрональном направлении, мигрируют в зону криодеструкции и способствуют морфологическому восстановлению зоны повреждения и возобновлению двигательной активности.

На основании анализа результатов лечения 93 больных с различными формами паркинсонизма, у которых применялись разные виды стереотаксических вмешательств, разработаны методы дифференцированного лечения в зависимости от формы заболевания. Так, криоталамотомия и комбинированное лечение является наиболее эффективными у больных с дрожательно-ригидной и ригидно-дрожательной формами паркинсонизма. У больных паркинсонизмом, которым было проведено комбинированное лечение, наблюдалось прогрессирующее улучшение двигательной активности в отдаленном послеоперационном периоде. Изолированное введение нейроиндуцированных стромальных аутоклеток эффективно у больных с акинетико-ригидной формой паркинсонизма.

Использование компьютерной томографии в качестве средства интраоперационной визуализации при проведении стереотаксических операций позволило улучшить результаты хирургического лечения больных паркинсонизмом на 30%.

Ключевые слова: паркинсонизм, аутологичные нейроиндуцированные стромальные стволовые клетки, криоконсервирование, стереотаксическое введение, экспериментальные модели паркинсоноподобного синдрома и криогенной травмы мозга.

Summary

Pyatikop V.A. The neurosurgical correction of movement disorders at Parkinson disease (experimental and clinical research). - The manuscript.

Dissertation for obtaining scientific degree of doctor of medical sciences on speciality 14.01.05 - neurosurgery. SI «Institute of neurosurgery named after acad. A.P. Romodanov of Academy of Medical Sciences of Ukraine», Kyiv, 2009.

The dissertation is devoted to improving of treatment results at patients with different types of Parkinson disease using different types of stereotaxic operations combined with injections of neuroinduced autological stromal stem cells, and to comparative analysis of the injected embryonic neural cells (ENC) and bone marrow stromal stem cells (BMSSC) effectiveness on experimental models of Parkinson-like syndrome (PS) and cryogenic brain injury (CBI).

On the basis of experimental research analysis the following conclusions were made:

· experimental CBI in rats and rabbits is achieved by dosed cryogenic destruction of motor cortex area;

· experimental PS accompanied by specific motor and morphological disorders and decrease of dopamine (DA) level was obtained as a result of two-sided substantia nigra electrolytic destruction;

· it was proved that stereotaxic injection of ENC in case of PS leads to normalization of DA level in brain structures of experimental animals;

· injected BMSSC induced by neural way were distributed in the area of electrolytic and cryogenic destruction both in cases of PS and CBI and it promoted restoration of the injured area and regress of movement disorders.

On the basis of treatment results analysis at 93 Parkinson patients with different kinds of differential treatment have been worked out.

The use of intraoperational computer tomography during stereotaxic operations made possible to increase effectiveness of surgical treatment up to 30%.

Key words: parkinsonism, neuroinduced autological stromal stem cells, cryopreservation, experimental models of Parkinson-like syndrome and cryogenic brain injury.

1. Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Питання ефективності лікування хворих на паркінсонізм залишаються актуальними на сьогоднішній день.

Морфологічним субстратом паркінсонізму є органічні незворотні зміни в компактній частині чорної субстанції (substantia nigra - SN), які обумовлюють зниження або повне зникнення дофаміну (ДА) в речовині гомолатерального смугастого тіла, що клінічно проявляється ригідністю, тремтінням та акінезією (Левин С.Л., 1972, Кандель Э.И., 1981; Крыжановский Г.Н., Карабань И.Н., Магаева С.В., 2002; Hornykiewicz O., 1982; Koller N.C., 1987).

За відсутності ефекту від консервативної терапії Spigel і Wycis у 50-х рр. минулого століття запропонували нейрохірургічну технологію лікування паркінсонізму, яка полягала у стереотаксичній деструкції базальних ядер - медіальної блідої кулі (globus pallidus) та сочевицеподібної петлі (ansa lenticularis). Обґрунтування стереотаксичних втручань при паркінсонізмі полягає в руйнуванні патологічних руброталамічних і дентатоталамічних зв'язків, внаслідок чого зникає тремор в кінцівках і нормалізується м'язовий тонус. Стереотаксичний метод дозволяє проводити як кріодеструкцію підкіркових вузлів головного мозку, так і їх стимуляцію (Абраков Л.В., 1975; Бехтерева Н.П., 1981; Кандель Э.И., 1981; Лапоногов О.О., 2007).

Традиційні нейрохірургічні методи лікування рухових розладів при паркінсонізмі не завжди дають бажаний результат, до того ж він може бути нестійким (Шток В.Н., Иванова-Смоленская И.А., Левин О.С., 2002; Шабалов В.А., 2004), що зумовлює необхідність пошуку більш ефективних методів лікування.

Кінець ХХ - початок ХХI століття відзначились експериментально-клінічними дослідженнями з трансплантації ембріональної нервової тканини при паркінсонізмі (Полежаев В.А., Александрова М.А., 1985; Отеллин В.А., 2001; Цымбалюк В.И., 2005; Brundin P., 1988; Drucker, 2004).

Проте, використання ембріональних нервових клітин (ЕНК) пов'язане з проблемами морально-етичного характеру (Turner D.A., 1993), а також відсутністю достатньої кількості життєздатних клітин для ефективної трансплантації.

Одним з найбільш перспективних напрямків клітинної терапії вважається використання стовбурових аутоклітин пацієнта, реальним джерелом яких є клітини строми кісткового мозку (КСКМ), вперше описані понад 40 років тому Фріденштейном О.Я. (Friedenstein A.J., 1966). Виявилося, що регіонарні стовбурові клітини багатьох тканин плюрипотентні (Y. Jiang, 2002; Okano H., 2002) і під впливом специфічних індукторів можуть диференціюватися у різноманітні клітинні типи організму, а саме - в остеоцити (Pittenger M.F., 1999), кардіоміоцити (Makino S. et al., 1999; D. Orlic, 2001), гепатоцити (Щегельская Е.А. и соавт., 2002). В останні роки доведено, що КСКМ можуть диференціюватися також і за нейрональним шляхом (Щегельская Е.А., Микулинский Ю.Е., 2002, 2004; Корочкин Л.И., 2006; Prockop D.J., 2000; Sanchez-Ramos J.R., 2000).

Встановлено, що стромальні клітини складають лише 0,001-0,1% всіх клітин кісткового мозку.

Численні широкомасштабні наукові розробки дозволили створити технології кріоконсервування клітин тварин і людини, а також стовбурових клітин дорослих осіб (Грищенко В.І., 2005; Петренко А.Ю. 2002; Гольцев А.Н., 2004; Сукач А.Н., 2005; Das G.D., 1983; Jensen S., 1987; Fang J., 1992).

Останнім часом клінічне застосування стовбурових клітин оцінюється неоднозначно, що пов'язане з відсутністю ефективних технологій їх забору, подальшого культивування та збереження; відсутністю достовірних результатів експериментальних досліджень з вивчення морфологічних особливостей пересаджених суспензій клітин на моделях захворювань і ушкоджень, а також можливих наслідків їх трансплантації в організм хворого (Зозуля Ю.А., Лисяный Н.И., 2005; Цымбалюк В.И., Медведев В.В., 2005; Krebsbach P.H. et al., 1999; Deans R.J. et al., 2000; Kohyama J., 2001; Lindvall O., 2003). Тому очевидно, що вивчення морфології пересаджених суспензій клітин, динаміки рівня ДА і рухових розладів при різних моделях захворювань на теперішній час є актуальним.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційне дослідження виконане в рамках комплексної науково-дослідної роботи Харківського національного медичного університету МОЗ України «Нейротрансплантація в лікуванні екстрапірамідних розладів, спінальних і церебральних травм та інсультів» за № держреєстрації 0105U002758 (2005-2007 рр.).

Мета роботи - підвищення ефективності лікування рухових розладів при паркінсонізмі шляхом виконання диференційованих стереотаксичних втручань з введенням аутологічних нейроіндукованих стромальних стовбурових клітин на основі виявлення морфофункціональних особливостей імплантованих клітин на експериментальних моделях паркінсоноподібного синдрому (ПС) і кріогенної травми мозку (КТМ).

Завдання дослідження:

1. Адаптувати експериментальну модель електролітичної травми SN з ПС, верифіковану за зміною вмісту ДА в структурах головного мозку та їх морфологічними особливостями, до завдання отримання об'єктивної оцінки ефективності різних методів нейротрансплантації.

2. Удосконалити модель КТМ, об'єктивно підтвердженої даними спіральної комп'ютерної томографії (СКТ), магніторезонансної томографії (МРТ) і морфологічних досліджень.

3. Оптимізувати технологію кріоконсервування ЕНК і КСКМ, індукованих за нейрональним шляхом, з метою збереження максимальної життєздатності клітин.

4. Дослідити на експериментальних моделях ПС та КТМ морфологічні особливості пересаджених у різний термін ЕНК і КСКМ, індукованих за нейрональним шляхом.

5. На моделях ПС і КТМ з'ясувати шляхи розподілу маркованих КСМК, індукованих за нейрональним шляхом, залежно від способу і терміну їх введення.

6. Оцінити ефективність трансплантації ЕНК і КСКМ, індукованих за нейрональним шляхом, на тваринах з експериментальними моделями ПС і КТМ шляхом спостереження за процесами відновлення рухів, динамікою вмісту ДА в структурах головного мозку та їх морфологічними змінами.

7. Дослідити ефективність клінічного застосування аутологічних нейроіндукованих стромальних стовбурових клітин у хворих з різними формами паркінсонізму.

8. Розробити принципи диференційованого використання методів комплексного лікування хворих на паркінсонізм з урахуванням форми захворювання.

9. Оптимізувати застосування стереотаксичного методу в лікуванні хворих на паркінсонізм.

Об'єкт дослідження: нейротрансплантація аутологічних стромальних стовбурових клітин при паркінсонізмі в клініці та на експериментальних моделях паркінсоноподібного синдрому і кріогенної травми мозку.

Предмет дослідження: диференційоване комплексне лікування хворих на паркінсонізм з використанням різних стереотаксичних втручань, застосуванням аутологічних нейроіндукованих стромальних стовбурових клітин; механізм дії введених суспензій ЕНК і КСКМ, індукованих за нейрональним шляхом, при ПС і КТМ.

Методи дослідження: морфологічні, біохімічні, кріобіологічні, комп'ютерно-томографічні, нейрохірургічні методи і методи математичного аналізу. Дослідження проводилися в трьох напрямках:

– вивчення впливу кріоконсервування на морфофункціональний стан ЕНК і КСКМ;

– вивчення механізмів взаємодії введених клітин з організмом реципієнта в різний термін після моделювання ПС і КТМ;

– вивчення ефективності клінічного застосування аутологічних нейроіндукованих стромальних клітин при паркінсонізмі.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше на експериментальній моделі ПС і КТМ обґрунтовано доцільність введення КСКМ, індукованих за нейрональним шляхом, з метою корекції рухових розладів, вивчено ефективність застосування КСКМ, індукованих за нейрональним шляхом, у хворих на паркінсонізм.

Розроблено принципи диференційованого лікування хворих з різними формами паркінсонізму. При тремтливо-ригідній та ригідно-тремтливій формах паркінсонізму найбільш ефективними є кріоталамотомія та комбіноване лікування, а саме: поєднання стереотаксичної кріоталамотомії з введенням у субталамічну ділянку КСКМ, індукованих за нейрональним шляхом. У хворих з акінетико-ригідною формою паркінсонізму найбільш ефективним є введення ізольованих КСКМ, індукованих за нейрональним шляхом, в субталамічну ділянку.

Вперше виявлено залежність між термінами відновлення рухових розладів, нормалізацією рівня вмісту ДА в структурах головного мозку і морфологічними змінами пересаджених клітинних трансплантатів ЕНК при ПС; встановлено залежність шляхів розподілу КСКМ, індукованих за нейрональним шляхом, від терміну та методу їх введення при ПС і КТМ.

На моделях ПС і КТМ доведено, що застосування КСКМ, індукованих за нейрональним шляхом, є більш ефективним, ніж введення ЕНК, головним чином, за рахунок відсутності формування грубого гліального рубця в зоні введення стромальних клітин.

Практичне значення отриманих результатів. На підставі аналізу результатів експериментального дослідження була проведена клінічна апробація застосування аутологічних КСКМ, індукованих за нейрональним шляхом, у хворих на паркінсонізм. Застосування зазначених суспензій клітин дозволило одержати позитивний результат у вигляді корекції рухових розладів у хворих на паркінсонізм, що сприяло їх соціальній адаптації. Оптимізація проведення стереотаксичних операцій здійснена завдяки тому, що стереотаксичні розрахунки виконуються за допомогою розрахунково-графічного програмного забезпечення, що дозволяє візуалізувати зону оперативного втручання і формувати параметри керування стереотаксичним апаратом для наведення хірургічного інструмента. Використання інтраопераційної комп'ютерної томографії дозволило покращити на 30% результати стереотаксичних втручань у хворих на паркінсонізм.

Удосконалено моделі ПС і КТМ на щурах і кролях, що дозволяє рекомендувати їх як універсальні для дослідження диференційованих методів лікування паркінсонізму та наслідків черепно-мозкової травми.

Дослідження з вивчення шляхів розподілу КСКМ, індукованих за нейрональним шляхом, маркованих флуоресцентним барвником, довели, що найбільш ефективним є інтрацеребральне стереотаксичне введення клітин.

Удосконалено технологію кріоконсервування ЕНК, що дозволяє зберегти високу життєздатність ЕНК, придатних для подальшої трансплантації.

Розроблені та видані методичні рекомендації з технології виділення, культивування аутологічних КСКМ для клінічного застосування у хворих на паркінсонізм та з наслідками черепно-мозкової травми.

Основні результати дисертаційної роботи впроваджено в клінічну практику Харківської обласної клінічної лікарні, дані про особливості морфологічних змін пересаджених суспензій кріоконсервованих ЕНК і КСКМ, індукованих за нейрональним шляхом, включено в курс лекцій і практичних занять кафедри нейрохірургії Харківського національного медичного університету МОЗ України.

Особистий внесок здобувача. Дисертаційна робота є самостійним науковим дослідженням автора, ним було обрано та узгоджено з науковим консультантом тему дисертації, відпрацьовано структуру роботи. Здобувач самостійно провів клініко-діагностичні та нейрохірургічні дослідження на базі нейрохірургічного відділення Харківської обласної клінічної лікарні (яка є клінічною базою кафедри нейрохірургії Харківського національного медичного університету МОЗ України).

Автором особисто виконані експериментальні роботи на базі віварію і лабораторій Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, на кафедрі фізіології Харківського національного університету ім. В.Н. Каразіна, на кафедрах гістології, біохімії і нейрохірургії Харківського національного медичного університету МОЗ України.

Морфологічні дослідження проведено на кафедрі гістології, біохімічні - на кафедрі біохімії Харківського національного медичного університету МОЗ України.

Дисертантом самостійно проведені інформаційний і патентний пошук з використанням ресурсів Internet, аналіз отриманих результатів; ним особисто написані всі розділи дисертації, сформульовані висновки.

Апробація результатів дослідження. Основні положення дисертаційного дослідження доповідалися на міжнародній науково-практичній конференції «Проблеми клітинної і тканинної терапії» (Івано-Франківськ - Яремча, 2003 р.), III з'їзді трансплантологів України (Донецьк, 2004 р.), школі-семінарі «Клітинна і тканинна трансплантація» (Алушта, 2004 р.), міжнародній конференції «Структурна і функціональна організація стовбурових клітин в умовах дії низьких температур» (Харків, 2005 р.), I з'їзді нейрохірургів України (Київ, 1993 р.), II з'їзді нейрохірургів України (Одеса, 1998 р.), III з'їзді нейрохірургів України (Алушта, 2003 р.), III, IY з'їздах нейрохірургів Росії (Санкт-Петербург, 2002 р.; Москва, 2006 р.), Всеукраїнській науково-практичній конференції «Сучасні методи в дослідженні структурної організації органів та тканин» (Судак, 2006 р.), науковій конференції з міжнародною участю, присвяченій 90-річчю НАН України і 10-річчю кафедри ЮНЕСКО з кріобіології (Харків, 2008 р.), засіданнях Харківського науково-медичного товариства нейрохірургів (1995-2008 рр.), конференціях Харківської обласної клінічної лікарні (2002-2008 рр.).

Апробація результатів дисертації відбулася на спільному засіданні кафедр нейрохірургії, неврології, травматології та військово-польової хірургії, офтальмології Харківського національного медичного університету МОЗ України, Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України 12 січня 2008 р., протокол №1 та на сумісному засіданні Вченої ради ДУ «Інститут нейрохірургії ім. акад. А.П. Ромоданова АМН України», кафедр нейрохірургії Національного медичного університету імені О.О. Богомольця МОЗ України та Національної медичної академії післядипломної освіти ім. П.Л. Шупика МОЗ України 26 вересня 2008 р., протокол №18.

Публікації. Результати дисертаційного дослідження висвітлені у 29 друкованих роботах, з них 21 стаття у фахових виданнях, рекомендованих ВАК України, 7 патентів України на винахід, 1 тези доповіді.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається з вступу, огляду літератури, 5 розділів власних досліджень, підсумку, висновків, практичних рекомендацій, списку використаних літературних джерел, додатків. Робота викладена на 293 сторінках машинописного тексту, містить 31 таблицю, 108 рисунків. Список літературних джерел містить 348 посилань, з них 171 кирилицею, 177 - латиницею.

2. Основний зміст роботи

Робота виконана на основі результатів експериментальних та клінічних досліджень.

Матеріали і методи експериментальних досліджень. Матеріалом для дослідження in vitro служили нативні та кріоконсервовані ЕНК щурів 9-11 доби гестації (150 зразків від 50 тварин), а також нативні та кріоконсервовані КСКМ щурів (80 зразків від 40 тварин) і кролів (50 зразків від 25 тварин). Вивчення рухових, морфологічних змін і змін рівня ДА було проведене на 104 безпородних щурах-самцях 10-12-місячного віку масою тіла 250-300 г з експериментальними моделями ПС і КТМ, які були розподілені на наступні групи. ПС: I - інтактна (n=12); II - (контрольна) - двобічна деструкція SN (n=12); III - двобічна деструкція SN і наступне введення кріоконсервованих ембріональних клітин (КЕНК) (n=22), IV - двобічна деструкція SN і наступна імплантація КСКМ, індукованих за нейрональним шляхом (n=22). КТМ: I - контрольна (n=11); II - КТМ та дослідження СКТ і МРТ (n=11); III - дослідження розподілу КСКМ, індукованих за нейрональним шляхом, які мітили спеціальним барвником (n=14).

Дослідження рухових порушень, комп'ютерно-томографічних та морфологічних змін було проведене також на 30 кролях-самцях 6-8-місячного віку породи шиншилла масою тіла 2-2,5 кг, що утримувалися в стандартних умовах віварію Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України.

Експерименти проводили відповідно до «Загальних принципів експериментів на тваринах» (Київ, 2004 р.) згідно з правилами «Європейської конвенції про захист хребетних тварин, які використовуються для експериментальних та інших наукових цілей» (Страсбург, 1985 р.). Усі маніпуляції з тваринами, включаючи декапітацію, проводили під внутрішньовенним тіопенталовим наркозом.

Нервові клітини виділяли з тканини головного мозку ембріонів щурів в термін гестації 17-18 діб. Після видалення надосаду, строми і ушкоджених клітин кінцева концентрація клітин становила 1Ч10⁶ в 1 мл, життєздатність за суправітальним забарвленням 1% розчином трипанового синього - 92-95%.

КСКМ виділяли з кісткового мозку, що одержували зі стегнових кісток щурів і кролів, об'ємом 1 см³ і розсівали в культуральні флакони площею 80 см² у середовищі DMEM/F 12 з 20% фетальної сироватки бика і 50 мг/кг гентаміцину. КСКМ людини у тому ж об'ємі одержували з кістково-губчастого трансплантату клубової кістки в стерильних умовах операційної, переносили в бакпакет з розчином Хенкса (Sigma) зі 100 мг/кг гентаміцину і транспортували в культуральну лабораторію в охолодженому термосі не пізніше 2-3 годин після забору.

Індукцію стромальних клітин у нервові проводили за допомогою ретіноєвої кислоти. Життєздатність клітинної суспензії становила не менше 92%.

Виконували гістологічні зрізи головного мозку товщиною 7 мкм і забарвлювали за методом Ніссля та гематоксилін-еозином за загальноприйнятою методикою.

Для визначення розподілу КСКМ, індукованих за нейрональним шляхом, перед трансплантацією їх мітили суправітальним зеленим флуоресцентним барвником DDC, синтезованим в Інституті сцинтиляційних матеріалів НТК «Інститут монокристалів НАН України».

Інтрацеребральне введення суспензії КСКМ, індукованих за нейрональним шляхом, проводили щурам в стереотаксичній установці для мікроелектродних досліджень головного і спинного мозку тварин СЕЖ-3 ОВ Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України.

Верифікацію локалізації кріогенної травми і розмірів вогнища кріодеструкції проводили за допомогою спірального комп'ютерного томографа «Siemens Somatom Emotion» (Німеччина) і магнітно-резонансного томографа «Siemens Magnetom Concerto» (Німеччина).

Рухові порушення досліджували на експериментальних моделях у кролів та щурів.

1. Модель паркінсонізму (Берченко О.Г., 2001; Anden N.E., 1966; Klawans H.L., 1974). Модель паркінсонізму створювали двобічним анодним електролізом SN. Анод виготовляли зі сталевого дроту діаметром 0,3 мм, ізольованого по всій довжині медичним лаком, за винятком робочої частини довжиною до 1 мм. Катод поміщали в рот тварини. Електроліз виконували за допомогою струму напругою 12 В, силою 0,3 мА при експозиції 6-8 с. Аби влучити точно у заплановану ціль, використовували атлас стереотаксичних координат мозку щура Фіфкової і Маршалла та стереотаксичний апарат.

2. Модель кріогенної травми головного мозку у щурів (Кандель Е.І., 1974; Марущенко М.А., 2005). Для створення моделі кріогенної травми головного мозку експериментальних тварин (щурів) використовували автономний нейрохірургічний кріозонд, розроблений у Фізико-технічному інституті низьких температур НАН України (м. Харків).

3. Модель кріогенної травми мозку у кролів (власна розробка автора дослідження). Після трепанації в лівій тім'яній ділянці в проекції моторної зони та розрізу твердої мозкової оболонки спеціальним кріоаплікатором з мідним наконечником (зовнішній діаметр 4 мм) проводили триразову, тривалістю 30 с, кріодеструкцію речовини головного мозку, що дозволило сформувати зону кріодеструкції діаметром 4-6 мм і глибиною до 8-9 мм та моторний дефіцит у вигляді пірамідної недостатності або монопарезу. Для одержання судомних нападів аплікацію кріоприладу виконували одноразово через інтактну тверду мозкову оболонку протягом 30 с.

Загальна характеристика клінічного матеріалу. Дослідження основане на обстеженні та лікуванні 93 хворих на паркінсонізм, що знаходились під нашим спостереженням протягом 1989-2008 рр. За переважанням певних клінічних симптомів хворі розподілені на три групи: з ригідно-тремтливою, тремтливо-ригідною та акінетико-ригідною формою паркінсонізму. Чоловіків було 60,2%, жінок - 39,8%; вік хворих у середньому 54,8±9,5 років. Чоловіки переважали у всіх групах.

Обчислений ч²=0,779 значно нижчий за ч² критичний = 7,815 при Р<0,05. Таким чином, з ймовірністю похибки 5% ми можемо стверджувати, що стать хворого достовірно не впливає на форму паркінсонізму.

З метою об'єктивізації стану хворих на різних етапах лікування і визначення ефективності проведених лікувальних заходів ми використовували шкалу Hoen&Yahr у модифікації Lindvall і співавторів (1989).

На підставі отриманих даних нами було проведено оцінку вірогідності розбіжностей у групах пацієнтів з різною формою і тяжкістю паркінсонізму за методом «хі-квадрат (ч²)».

Обчислений ч²=9,445 незначно, але нижче за ч² критичний=9,488 при Р<0,05. Таким чином, з вірогідністю похибки в 5% ми можемо стверджувати, що форма паркінсонізму достовірно не впливає на тяжкість стану хворого.

Результати експериментальних досліджень та їх обговорення. Інкубація суспензії ЕНК щурів і кролів у розчинах кріопротекторів (10% розчин ДМСО і 15% розчин 1,2-пропандіолу) при температурі 4°С на базисному розчині Хенкса протягом 10 хвилин дозволила зберегти життєздатність ЕНК: щурів 87-93%, кролів 78-89%. Збільшення часу інкубації до 30 хвилин, а також підвищення температури до 37°С призвели до достовірного зниження життєздатності ЕНК щурів до 39-62%, кролів - 28-55%.

Заморожування ЕНК після інкубації в розчинах кріозахисних речовин проводили за трьома режимами. Зразки відігрівали на водяній бані при температурі 40°С до зникнення льоду (протягом 3-5 хвилин), після чого суспензії клітин відмивали одноразово від кріозахисних середовищ і оцінювали індекс життєздатності.

Заморожування суспензій після інкубації в 10% розчині ДМСО і 15% розчині 1,2-пропандіолу протягом 10 хвилин при 4°С зі швидкістю 1°С/хв до -80°С та наступним зануренням у рідкий азот (-196°С), а також використання швидкості заморожування 400°С за 1 хвилину (занурення в рідкий азот) знижували життєздатність ЕНК щурів на 37 і 21% порівняно з початковим рівнем, ЕНК кролів - на 28 і 13% відповідно. Оптимальною була двоетапна програма заморожування зі швидкістю 10-15°С/хв до -80°С та наступним зануренням у рідкий азот, що незначно знижувала життєздатність клітин до 63-75% щурів і 58-61% - кролів.

КСКМ щурів і кролів, індуковані за нейрональним шляхом, після культивування інкубували в 10% розчині ДМСО, після чого життєздатність становила 87% для клітин щурів і 82% - кролів. Заморожування проводили за двоетапною програмою (зі швидкістю 10-15°С/хв до -80°С та наступним зануренням у рідкий азот) під захистом 10% розчину ДМСО, кріопротектор видаляли після відігрівання на водяній бані. Було зареєстровано зниження життєздатності деконсервованих КСКМ, індукованих за нейрональним шляхом, на 2-5% порівняно з початковим рівнем.

Результати досліджень, проведених на клітинах експериментальних тварин, стали основою для кріоконсервування КСКМ людини. Життєздатність деконсервованих КСКМ людини, індукованих за нейрональним шляхом, становила 72% (Р<0,05).

В усіх випадках термін зберігання кріоконсервованого матеріалу становив від 1 доби до 2 років. Рівень життєздатності клітин не залежав від термінів зберігання і вірогідно не знижувався.

Критеріями ефективності застосування кріоконсервованих ЕНК і КСКМ, індукованих за нейрональним шляхом, при ПС були: 1) динаміка рухових порушень; 2) морфологічні дослідження; 3) динаміка вмісту ДА у структурах головного мозку.

При моделюванні у щурів ПС шляхом білатеральної деструкції SN були отримані грубі рухові порушення у вигляді насильницьких монотонних рухів головою, «горбоподібного» вигину тулуба, причому в деяких тварин були неприродно витягнуті кінцівки і вертикально піднятий хвіст. Описані рухові розлади виникали у всіх тварин на 1-2 добу після деструкції. Одним з характерних проявів ПС у тварин був руховий акт у вигляді «манежного» бігу. Необхідно підкреслити, що рухові порушення у тварин контрольної групи зберігалися протягом всього періоду спостереження - до 50 доби.

Морфологічне дослідження, проведене у тварин через 5-15 діб після деструкції SN, виявило явища помірного перицелюлярного набряку, дифузну лімфатичну інфільтрацію, вакуолярну дистрофію і некротизацію нейронів. З боку гліальних клітин при забарвленні препарату гематоксилін-еозином істотних змін не відзначалось.

Через 30 діб після ушкодження у вогнищі деструкції були виявлені повна атрофія нейронів і дифузна гіперплазія гліальних клітин з гіперемічною дилатацією оточуючих судин.

Через 50 діб після деструкції вогнище ушкодження ставало більш щільним, некротизовані структури розсмоктувалися, і на їх місці утворювалася порожнина, оточена гліальним валом. Навколо вогнища деструкції були помітні гіпертрофія нейронів і дифузна гіперплазія гліальних клітин зі слабо вираженою лімфатичною інфільтрацією.

Суспензії ЕНК і КСКМ, індукованих за нейрональним шляхом, вводили через 7 діб після моделювання ПС на 2 мм вище зони деструкції. Вибір цього строку зумовлений тим, що рухові порушення у нігректомованих щурів починають розвиватися з 1 доби після деструкції SN і спричинені як деструкцією самих нейронів, так і набряком головного мозку, який до 7 доби значно зменшується.

Після введення КСКМ, індукованих за нейрональним шляхом, будь-яких суттєвих змін рівня ДА в структурах мозку тварин з ПС не відмічено.

Аналіз результатів проведених досліджень показав, що введення кріоконсервованих ЕНК тваринам з модельованим ПС ефективно впливає на відновлення рухової функції, сприяє нормалізації рівня ДА в структурах мозку.

Аналіз отриманих даних свідчить про те, що білатеральна деструкція SN за допомогою анодного електролізу викликає у щурів розвиток моделі ПС з характерними руховими розладами і зниженням рівня ДА в структурах мозку, а також відповідними морфологічними змінами в зоні введення клітин; трансплантація КСКМ щурів, індукованих за нейрональним шляхом, щурам з ПС сприяє нормалізації рухів і рубцюванню зони деструкції.

При дослідженні моделі КТМ на щурах виявлено, що рухові розлади, які проявляються у вигляді монопарезу, глибокого геміпарезу, практично до геміплегії, виникали у всіх тварин одразу після проведення кріодеструкції моторної зони кори головного мозку. Крім рухових порушень, у тварин відмічали поведінкові розлади у вигляді сонливості протягом перших 3-5 годин після операції, відмови від їжі протягом 1 доби, млявості, гіподинамії. У контрольній групі судомний синдром спостерігали у 6 тварин, явища монопарезу і геміпарезу - у 5. Частині тварин було зроблено СКТ за допомогою комп'ютера «Somatom Emotion» і МРТ («Sсient Magic View-300»).

Доцільно відзначити, що дані дослідження є інформативними і об'єктивно виявляють локалізацію і розміри вогнищ кріодеструкції у кролів. Як вже зазначалося, введення суспензії клітин виконували двома шляхами: стереотаксично та субокципітально.

Найбільш позитивний ефект у вигляді регресу судомних нападів був відзначений у тварин зі стереотаксичним введенням КСКМ, індукованих за нейрональним шляхом. Якщо спонтанне відновлення рухів у тварин з КТМ наставало на 25 добу, а судомний синдром регресував на 15 добу, то при стереотаксичному введенні суспензії клітин ці явища спостерігалися відповідно на 7 і 2 добу після введення. Ознаки відновлення рухових порушень у тварин контрольної групи починалися з 10-11 доби. Регрес геміплегії у 73% тварин спостерігався з передньої кінцівки, у 27% - з задньої. Повне відновлення рухів відбулося у 30% тварин через 25 діб після моделювання КТМ. У інших тварин (70%) явища геміплегії зменшилися, однак повного відновлення рухів у кінцівках не спостерігалося навіть через 60 діб.

При дослідженні шляхів розподілу мічених клітин було визначено, що при інтрацеребральному введенні мічених КСКМ, індукованих за нейрональним шляхом, вони скупчуються в ділянці введення, тобто в зоні речовини мозку, що межує з кріогенною травмою, згодом ці клітини мігрують до зони кріонекрозу; при субокципітальному введенні відбувається проникнення суспензії мічених клітин з ліквору до вогнища кріодеструкції, а потім - до тканини мозку, що межує з ділянкою кріогенної травми.

Також було встановлено, що терміни введення і скупчення мічених КСКМ, індукованих за нейрональним шляхом, в основному збігаються з термінами відновлення рухової функції; введення суспензії клітин сприяє відновленню зони ушкодження кори головного мозку, і, ймовірно, запобігає формуванню післятравматичного сполучнотканинного мозкового рубця, що й визначає незворотність травматичних змін.

Таким чином, отримані дані свідчать про ефективність трансплантації стромальних клітин, індукованих за нейрональним шляхом, незалежно від термінів і шляхів введення, однак, все ж таки перевагу варто надати локальній стереотаксичній імплантації суспензії клітин.

Позитивні експериментальні результати використання кріоконсервованих ЕНК і КСКМ, індукованих за нейрональним шляхом, при моделях ПС і КТМ дозволили нам провести клінічні дослідження з застосуванням аутологічних КСКМ, індукованих за нейрональним шляхом, у хворих на паркінсонізм.

Результати клінічних досліджень та їх обговорення. Порівняльну групу хворих на паркінсонізм складали пацієнти, яким було проведено кріодеструкцію підкіркових структур (кріоталамотомію).

За видом оперативних втручань всі хворі на паркінсонізм були розподілені на 3 групи:

I - хворі на паркінсонізм, яким була проведена стереотаксична кріодеструкція вентро-латерального ядра таламуса - кріоталамотомія (КТ); (51 хворий, 62 операції, у 11 пацієнтів були виконані двобічні втручання);

II - хворі на паркінсонізм, яким було проведено стереотаксичне введення КСКМ, індукованих за нейрональним шляхом, в субталамічну ділянку (18 хворих, 26 операцій, у 8пацієнтів було виконано двобічні втручання);

III - хворі на паркінсонізм, яким було проведено комбіноване лікування (кріоталамотомія + нейротрансплантація) (КТ + НТ) (24 хворих, 30 операцій, у 6 пацієнтів було виконано двобічні втручання).

Повторні операції у віддаленому періоді також виявилися ефективнішими за односторонні: стан жодного хворого не погіршився до доопераційного рівня. Хоча за формами паркінсонізму і видами лікування динаміка ефективності трохи відрізнялася. Так, у хворих з ригідно-тремтливою та тремтливо-ригідною формою, яким було проведено кріоталамотомію, ефективність повторної операції у віддаленому періоді знизилася: хороший результат спостерігали лише у 2 хворих порівняно з 8 у найближчому періоді. Серед хворих з акінетико-ригідною формою кількість «хороших результатів» і «значного покращення» зменшилась з 6 до 4. Водночас у групі хворих з тремтливо-ригідною формою паркінсонізму після комбінованого лікування збільшилась кількість хороших результатів з 2 у найближчому періоді до 4 - у віддаленому, зменшилась кількість хворих з незначним покращенням з 2 до 1.

Як видно з табл. 11 і 12, ефективність повторного оперативного втручання у віддаленому періоді залежить від форми і методу лікування паркінсонізму.

Повторна кріоталамотомія при тремтливо-ригідній формі (рис. 5) є високоефективною у найближчому післяопераційному періоді (у 5 з 6 хворих відзначений хороший результат, в 1 - значне покращення). У віддаленому післяопераційному періоді стан цих хворих дещо погіршився: хороший результат визначився тільки в 1 хворого, значне покращення - у 5. Зовсім іншими були результати у хворих з тремтливо-ригідною формою паркінсонізму, яких піддавали комбінованому лікуванню. У віддаленому післяопераційному періоді порівняно з найближчим їх стан поліпшився.

Після повторної нейротрансплантації в найближчому періоді у 6 з 8 хворих з акінетико-ригідною формою паркінсонізму спостерігалися високі показники (хороший результат і значне покращення). У віддаленому періоді стан хворих дещо погіршився (хороший результат і значне покращення) у 4 пацієнтів.

Для оцінки ефективності різних методів лікування за різних видів паркінсонізму ми також використовували шкалу Hoen&Yahr у модифікації Lindvall і співавторів (1989), наведену у табл. 3. Її перевага в тому, що вона виражена у дискретних величинах (1; 1,5; 2 тощо). Використовуючи цю шкалу, ми визначили середні показники тяжкості стану хворих з кожною формою захворювання при різних видах лікування до операції та найближчому і віддаленому періоді після хірургічного втручання.

Таким чином, ефект від деструктивних втручань у вигляді нормалізації м'язового тонусу й регресу тремору проявляється одразу після стереотаксичної операції і є сталим протягом досить тривалого часу у більш ніж 30% хворих на паркінсонізм. Слід зазначити, що тенденція до послаблення ефекту спостерігається після деструкції підкіркових вузлів. Введення індукованих за нейрональним шляхом стромальних аутоклітин сприяє покращенню стану хворих на паркінсонізм, що можна пояснити, по-перше, функціональною активністю введених КСКМ, індукованих за нейрональним шляхом, і, по-друге, включенням власних метаболічних механізмів, яке відбувається через 3 місяці після введення клітинних суспензій.

Аналіз отриманих результатів у клінічних та експериментальних дослідженнях дозволив зробити наступні висновки.

Висновки

1. У дисертації наведено теоретичне узагальнення і нове вирішення наукової проблеми застосування нейротрансплантації аутологічних стромальних стовбурових клітин з метою корекції рухових розладів при паркінсонізмі, які базуються на результатах клінічних та експериментальних досліджень.

2. Розроблено програму заморожування ЕНК експериментальних тварин з використанням кріопротектора 1,2-пропандіолу в концентрації 15% і двоетапного режиму: I - зі швидкістю 15°С/хв до -80°С; II - занурення в рідкий азот, та програму заморожування КСКМ з використанням 10% розчину ДМСО і також двоетапним режимом кріоконсервування. Такі режими дозволяють зберегти до 72-75% життєздатних клітин.

3. Оптимальною експериментальною моделлю паркінсоноподібного симптомокомплексу у щурів з розвитком характерних рухових порушень, зміною вмісту ДА у структурах головного мозку і морфологічними особливостями є двобічна електролітична деструкція сірої речовини.

4. Відпрацьовано модель кріогенної травми головного мозку шляхом дозованого кріовпливу на моторну зону кори у щурів і кролів, верифіковану за допомогою СКТ, МРТ і морфологічних досліджень.

5. Механізм корегуючого впливу введених ЕНК на рухові порушення вірогідно пов'язаний з нормалізацією рівня ДА у структурах головного мозку.

6. Істотною перевагою введених КСКМ, індукованих за нейрональним шляхом, порівняно з ЕНК на моделі ПС є відсутність реактивної гіперплазії глії навколо зони введення, що сприяє більш швидкому та ефективному усуненню рухових розладів у експериментальних тварин.

7. У експериментальних тварин з моделями ПС і КТМ оптимальним методом імплантації КСКМ, індукованих за нейрональним шляхом, є їх стереотаксичне введення, що доведено вивченням морфологічних змін у зоні імплантації клітин, мічених флуоресцентним барвником.

8. Найбільш ефективними методами лікування хворих з тремтливо-ригідною та ригідно-тремтливою формами паркінсонізму є кріоталамотомія та поєднання стереотаксичної кріоталамотомії з введенням у субталамічну ділянку КСКМ, індукованих за нейрональним шляхом.

9. Комбіноване лікування хворих з тремтливо-ригідною та ригідно-тремтливою формами паркінсонізму характеризується наростанням позитивного ефекту у віддаленому періоді, що свідчить про потенційні властивості введених КСКМ, індукованих за нейрональним шляхом.

10. Введення в субталамічну зону ізольованих КСКМ, індукованих за нейрональним шляхом, є ефективним у хворих з акінетико-ригідною формою паркінсонізму та менш ефективним - у пацієнтів з тремтливо-ригідною та ригідно-тремтливою формами захворювання.

11. Використання розробленою нами розрахунково-графічного програмного забезпечення дозволяє проводити візуалізацію зони оперативного втручання та визначати параметри стереотаксичного наведення хірургічного інструменту, що забезпечує підвищення ефективності подібного втручання на 30%.

Практичні рекомендації

1. Розвиток рухових порушень у хворих на паркінсонізм пов'язаний з дегенерацією дофамінергічних нейронів чорної субстанції. Консервативна терапія у вигляді призначення пацієнтам препаратів, які містять ДА та його аналоги, не може запобігти цій дегенерації. Деструктивні та стимулюючі нейрохірургічні методи, які сприяють регресу тремору та нормалізації м'язового тонусу, також носять симптоматичний характер. Одним з патогенетично обумовлених напрямків у лікуванні паркінсонізму може бути клітинна терапія, спрямована на відновлення дофамінергічних нейронів, уникнення апоптозу, оксидантного стресу та мітохондріальної дисфункції. Використання ЕНК впливає на дофамінергічну дисфункцію клітин чорної субстанції, але морально-правові аспекти не дозволяють широко застосувати ці клітини в клініці. Альтернативним методом клітинної терапії рухових розладів у хворих на паркінсонізм є аутологічні КСКМ, індуковані за нейрональним шляхом. Їх використання в комбінації з кріоталамотомією у хворих з тремтливо-ригідною та ригідно-тремтливою формами паркінсонізму є методом вибору. Ізольоване введення аутологічних нейроіндукованих стромальних клітин ефективне при акінетико-ригідній формі паркінсонізму.

2. Критеріями вибору хворих на паркінсонізм є достовірний клінічний діагноз паркінсонізму, який відповідає 2,5-4 ступеню тяжкості захворювання за шкалою Hoen&Yahr, верифікований за допомогою електроміографії.

3. При проведенні стереотаксичних операцій у хворих на паркінсонізм виникає низка проблем анестезіологічного характеру: забезпечення психо-емоційного спокою, адекватного знеболювання на всіх етапах втручання, повної керованості життєво важливими функціями організму з готовністю до проведення корекції при їх порушенні, забезпечення «безкровного» операційного поля, а також можливості мінімального вербального контакту з пацієнтом для контролю точності влучення канюлі в точку «мішені».

4. Максимально ефективними у хворих з тремтливо-ригідною та ригідно-тремтливою формами паркінсонізму є кріоталамотомія та сполучення кріоталамотомії з введенням аутологічних КСКМ, індукованих за нейрональним шляхом, у субталамічну зону.

5. Найбільш позитивний ефект у хворих з акінетико-ригідною формою паркінсонізму досягається за рахунок введення аутологічних КСКМ, індукованих за нейрональним шляхом, у субталамічну зону.

6. Використання інтраопераційної комп'ютерної томографії дозволяє з найбільшою точністю влучити в точку «мішені», що підвищує ефективність втручання на 30%.

паркінсонізм аутологічний нейроіндукований клітина

Список робіт, опублікованих за темою дисертації

1. Пятикоп В.А. Динамика изменений уровня дофамина в головном мозге и крови крыс с моделью паркинсонизма после трансплантации клеток стромы костного мозга, индуцированных в нейробласты / В.А. Пятикоп, Е.А. Щегельская, Т.В Горбач, Ю.Е Микулинский, В.В. Кирошка // Проблемы криобиологии. - 2005. - Т.15, №3. - С. 452-454.

2. Сипитый В.И. Опыт проведения стереотаксических расчетов с использованием интраоперационной компьютерной томографии / Сипитый В.И., Пятикоп В.А., Кутовой И.А., Аврунин О.Г. // Укр. нейрохірург. журн. - 2006. - №3. - С. 58-62.

3. Щегельская Е.А. Индукция стромальных клеток костного мозга в нейробласты и их использование в лечении пациентов с болезнью Паркинсона / Щегельская Е.А., Пятикоп В.А., Микулинский Ю.Е., Денисенко Т.В. // Трансплантологія. - 2004. - Т.7, №3. - С. 381-384.

4. Пятикоп В.А. Восстановление структурно-функциональных параметров у крыс с криогенной травмой головного после трансплантации клеток стромы костного мозга, индуцированных в нейробласты / В.А Пятикоп, Е.А. Щегельская, Ю.Е. Микулинский, В.М. Шеверева, В.К. Дворцевой // Проблемы криобиологии. - 2005. - Т.15, №3. - С. 449-451.

5. Пятикоп В.А. Гистологический анализ изменений тканей головного мозга крыс с экспериментальным паркинсонизмом до и после трансплантации криоконсервированных эмбриональных нервных клеток / В.А. Пятикоп, В.Д. Карамышев, В.М. Шеверева, В.К Дворцевой // Проблемы криобиологии. - 2006. - Т.16, №2. - С. 211-216.

6. Пятикоп В.А. Морфологические изменения нейробластов, индуцированных из клеток стромы костного мозга, после их трансплантации в мозг крыс с экспериментальным паркинсонизмом / В.А. Пятикоп, Е.А. Щегельская., Ю.Е. Микулинский и др. // Врачебная практика. - 2006. - №1. - С. 62-64.

7. Пятикоп В.А. Эффективность трансплантации клеток стромы костного мозга, индуцированных в нейробласты, в зависимости от путей их введения при криогенной травме головного мозга в эксперименте / В.А. Пятикоп, С.Ю. Масловский, Е.А. Щегельская и др. // Проблемы, достижения и перспективы развития медико-биологических наук и практического здравоохранения. - 2006. - Т.142, Ч.1. - С. 63-68.

8. Гольцев А.Н. Изучение функционального потенциала эмбриональных нервных клеток крыс до и после криоконсервирования (в ранние сроки культивирования) / А.Н. Гольцев, Н.Н. Бабенко, В.А. Пятикоп // Укр. мед. альманах. - 2007. - Т.10, №1. - С. 48-50.

9. Пятикоп В.А. Результаты изучения функционального потенциала эмбриональных нервных клеток до и после криоконсервирования (в поздние сроки культивирования) / В.А. Пятикоп, А.Н. Гольцев, Н.Н. Бабенко // Проблеми екологічної та медичної генетики і клінічної імунології. - 2007. - Вип. 3-4 (78-79). - С. 5-14.

10. Аврунин О.Г. Этапы развития стереотаксического метода / О.Г. Аврунин, С.Ю. Масловский, В.А. Пятикоп, В.В. Семенец // Експериментальна і клінічна медицина. - 2001. - №.1 - С. 125-127.

11. Пятикоп В.А. Сравнительная оценка эффективности стереотаксической криодеструкции подкорковых структур и применения нейродифференцированных стромальных аутоклеток у больных паркинсонизмом / В.А. Пятикоп, А.В. Генкин // Медицина сегодня и завтра. - 2006. - №3-4. - С. 129-132.

12. Сипитый В.И. Клинико-нейрофизиологические корреляции при стереотаксическом введении нейроиндуцированных стромальных аутологичных клеток в лечении больных паркинсонизмом / В.И. Сипитый, В.А. Пятикоп, И.А. Григорова и др. // Врачебная практика. - 2006. - №.6. - С. 49-52.

13. Пятикоп В.А. Сравнительная характеристика динамики двигательных нарушений и их сопоставления с морфофункциональными особенностями при экспериментальном паркинсонизме после введения криоконсервированных эмбриональных нервных клеток и нейроиндуцированных in vitro стромальных клеток / В.А. Пятикоп, И.А. Григорова // Укр. вісник психоневрології. - 2007. - Т. 15, Вип. 1. - С. 51-53.