29

Размещено на http://www.allbest.ru/

ДОНЕЦЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

ІМ.М. ГОРЬКОГО

МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ'Я УКРАЇНИ

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора медичних наук

Нейрофізіологічні механізми та системні прояви модуляції опіоїдної рецепції (експериментальне дослідження)

14.03.03 - нормальна фізіологія

Панова Тетяна Іванівна

Донецьк - 2009

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Донецькому національному медичному університеті ім. М. Горького Міністерства охорони здоров'я України

Науковий консультант:

академік АМН України, доктор медичних наук, професор Казаков Валерій Миколайович, завідувач кафедри фізіології, ректор Донецького національного медичного університету ім. М. Горького

Офіційні опоненти:

доктор медичних наук, професор Скляров Олександр Якович, завідувач кафедри біологічної хімії Львівського національного медичного університету ім. Д. Галицького;

доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Войтенко Нана Володимирівна, провідний науковий співробітник відділу загальної фізіології рецепції Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України;

доктор медичних наук, професор Абрамець Ігор Ігорович, професор кафедри фармакології Донецького національного медичного університету ім.М. Горького.

Захист відбудеться 25 листопада 2009 р. об 11.00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 11.600.01 у Донецькому національному медичному університеті ім. М. Горького (83003, Донецьк, пр. Ілліча, 16).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Донецького національного медичного університету ім. М. Горького (83003, Донецьк, пр. Ілліча, 16).

Автореферат розісланий "_____" жовтня 2009 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

д. мед. н., професор Д.О. Ластков

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Механізмам опіоїдної рецепції приділяється увага, перш за все, тому, що задіяність і ушкодження саме опіоїдної системи є причиною формування такої "чуми" ХХ і ХХІ століть, як наркозалежність.

Але не всі опіоїдні ліганди мають наркогенний потенціал. Нещодавно висунуте припущення, що причиною наявності чи відсутності наркогенного потенціалу є особливості взаємодії опіоїдних лігандів із різними сайтами рецептора (Головко А.И. и др., 2003). Екзогенні ліганди (алкалоїди) зв'язуються з рецептором тільки в одному місці - у так званій кишені, а ендогенні ліганди (пептиди) зв'язуються і з кишенею, і з ділянками селективності.

Активація кишені призводить до активації зв'язаних із рецептором G-білків, розташованих на внутрішній поверхні мембрани, і далі - до внутрішньоклітинної відповіді, яка полягає у функціональних, енергетичних, структурних, пластичних змінах. Формується новий рівень гомеостазу клітини. Великі концентрації екзогенних лігандів спричиняють зменшення афінності рецепторів (Dang V. C. et al., 2004), пригнічення синтезу ендогенних (пептидних) лігандів і опіоїдних рецепторів - down-regulation (Williams J. T. et al., 2001). На системному рівні це проявляється як звикання і залежність від наркотиків (Bailey C. P. et al., 2005).

Ендогенні ж опіоїдні ліганди (ендорфіни, енкефаліни) не призводять до таких наслідків, тому що рецептори "ховаються" від надлишків лігандів у мембрану (Ueda Н., 2004). Активація ділянок селективності призводить до інтерналізації рецепторів у ендосоми у мембрані, у кислому середовищі яких рецептори відновлюються, тобто повертаються до первинної (мономерної) форми (Pfeiffer M. еt al., 2001), до нормальної конформаційної структури і розподілу електростатичного заряду всередині кишені, змінених внаслідок попереднього зв'язування з лігандом (Li J. G. et al., 1999). З ендосом одна частина рецепторів повертається на поверхню мембрани у відновленому стані, а інша частина потрапляє в лізосоми, де піддається розпаду (Segredo V. et al., 1997). У подальшому продукти розпаду активують геном клітини і сприяють синтезу нових рецепторних молекул, що запобігає виникненню down-regulation (Gruenberg J., 2001; Katzmann D.J., 2002).

Існуючі методи лікування наркозалежності базуються на використанні алкалоїдних лігандів: або "легких" наркотиків (замісна терапія), або блокаторів рецепторів (блокуюча терапія). Ці методи мають недоліки: "легкі" наркотики (метадон) викликають звикання та залежність, а блокатори (налоксон) - важкий абстинентний синдром. Зрозуміло, що ідеальним варіантом допомоги наркозалежним хворим було б введення синтетичних аналогів ендогенних пептидів енкефалінів та ендорфінів, але вони не проходять через гематоенцефалічний бар'єр.

Ця робота спрямована на винайдення такого варіанту взаємодії ліганду з рецептором, коли б лігандом активувалися лише ділянки селективності, але не кишеня рецептора. Теоретично, така взаємодія не зможе запустити відповідь внутрішньоклітинну, але зможе викликати самостійну інтерналізацію рецепторів і всі пов'язані з нею процеси: відновлення нормальних властивостей рецепторів і активізацію синтезу нових рецепторних молекул. У науковій літературі не знайдено ні теоретичних припущень щодо принципіальної можливості такої модуляції, ні повідомлень про хімічні молекули з відповідними властивостями. Відповідно, досі не було відомо і про можливість проявів такої модуляції на системному рівні.

Нашу увагу привернула коменова кислота, дотепер відома лише як антибактеріальна та ранозагоююча речовина (Шурыгин А.Я., 2002). Але нещодавно методом фіксації ефективного заряду мембрани (patch-clamp) показано, що ця молекула чинить на повільні натрієві канали мембрани вплив, схожий на вплив морфіну, а саме: дозозалежно зменшує потенціалчутливість активаційного воротного устрою повільних натрієвих каналів і ефективний заряд мембрани сенсорного нейрона (Дербенёв А.В. и др., 1999; Крылов Б.В. и др., 1999). Причому знайдений ефект коменової кислоти, як і морфіну, усувався попереднім введенням у позаклітинний розчин антагоніста опіоїдних рецепторів налтрексону. На цій підставі було зроблене припущення щодо гіпотетичної можливості взаємодії молекули коменової кислоти з опіоїдним рецептором. Дискусійність такого припущення зумовлена хімічною будовою цієї молекули: в основі її знаходиться ізохінолінове кільце. Адже вважається, що необхідним елементом екзогенного ліганду для взаємодії з опіоїдним рецептором є обов'язкова наявність у нього піперидинового або псевдопіперидинового кільця, яке є в молекулах алкалоїдних лігандів (Машковский М.Д., 2002). Логічно припустити, що механізм взаємодії молекули коменової кислоти з рецептором може бути іншим і відрізнятися від уже винайденого і добре вивченого традиційного.

У разі винайдення та вивчення цього механізму, а також дослідження на системному рівні наслідків його реалізації і, беручи до уваги, що при формуванні наркотичної залежності ушкоджується саме опіоїдна рецепція, можна вважати, що фундаментальне дослідження невідомого раніше механізму взаємодії лігандів (коменової кислоти) із опіоїдним рецептором може стати теоретичною основою для розробки принципово нового підходу до модуляції опіоїдної рецепції, а отже, і до лікування опіоїдної залежності.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація була фрагментом науково-дослідницької роботи кафедри фізіології Донецького державного медичного університету ім. М. Горького "Механізми опіоїдної рецепції" (державний реєстраційний номер 0101U007982, шифр УН.02.01.06), у якій здобувач була відповідальним виконавцем.

Тему дисертації та наукового керівника затверджено на засіданні Вченої ради Донецького державного медичного університету ім. М. Горького 31 березня 2005 року (протокол № 2).

Робота була підтримана грантом Президента України № 34 на 2005 рік.

Робота виконувалась відповідно до "Програми реалізації державної політики у сфері боротьби з незаконним обігом наркотичних засобів, психотропних речовин і прекурсорів на 2003-2010 рр.", затвердженої Постановою Кабінету Міністрів України №877 від 4 червня 2003 р. Для виконання цієї Програми головою Донецької обласної державної адміністрації було видано розпорядження № 723 від 02.12.2003 р.

Мета дослідження: виявити та вивчити на молекулярному та клітинному рівнях новий механізм модуляції опіоїдної рецепції, дослідити на системному рівні прояви такої модуляції та обґрунтувати нову концепцію втручання в перебіг опіоїдної залежності.

Для досягнення цієї мети поставлені такі завдання:

З'ясувати самостійний вплив коменової кислоти на базальну активність G-білків мембран мозку щурів.

Визначити вплив коменової кислоти на зв'язування з опіоїдними рецепторами "класичних" лігандів у залежності від їх хімічної природи, а також від типу і стану рецептора.

Оцінити можливість взаємодії коменової кислоти з різними сайтами опіоїдного рецептора.

Виявити вплив коменової кислоти на регуляцію синтезу рецепторів.

З'ясувати можливість взаємодії коменової кислоти з плазматичними АТФазами.

З'ясувати можливість впливу коменової кислоти через взаємодію з ендогенними опіоїдами.

Встановити її вплив на вираженість соматовегетативних, алгічних і психоемоційних компонентів абстинентного синдрому різної етіології у щурів.

Оцінити можливість наявності наркогенного потенціалу коменової кислоти.

опіоїдна залежність коменова кислота

Дослідити на щурах можливість метаболічних перетворень, умовнотерапевтичні дози, дозозалежну токсичність, кумуляцію коменової кислоти в організмі.

Об'єкт дослідження: вплив модуляції опіоїдної рецепції на функціональні зміни у щурів на різних рівнях: молекулярному (ентальпії комплексів "ліганд-рецептор"), мембранному (активність G-білків, плазматичних АТФаз), системному (психоемоційна, соматовегетативна, больова поведінка).

Предмет дослідження: базальна активність G-білків плазматичних мембран мозку щурів при додаванні до них опіоїдних лігандів, що мають різну хімічну будову (пептид, алкалоїд, ізохінолін) і різну спорідненість до різних типів рецепторів (мю-, дельта-); ентальпії зв'язків цих лігандів із різними сайтами опіоїдного рецептора; активність плазматичних натрій-калієвої і кальцієвої АТФаз; вираженість соматовегетативних, алгічних, психоемоційних проявів абстинентного синдрому різної етіології під впливом лігандів різної хімічної природи; властивості коменової кислоти: метаболічні перетворення, зв'язування з ендогенними пептидами, терапевтичні та токсичні дози, здатність до кумуляції, наркогенний потенціал, вибірковість дії.

Методи дослідження. Для досягнення поставленої мети був використаний комплексний підхід, що полягає в тому, що були досліджені явища, що відбуваються як на системному, так і на молекулярному і мембранному рівнях при певних впливах на організм. Використані методи нейрохімічні (радіолігандний та радіоактивний аналіз); фізичні (спектрофотометрія); електрофізіологічні (електрична самостимуляція мозку через вшиті електроди; електрокардіографія); напівемпіричний метод РМ-3 для моделювання зв'язків між молекулами лігандів і рецепторами та квантовохімічних розрахунків ентальпій цих зв'язків; методи дослідження поведінки (больової, соматовегетативної, психоемоційної, орієнтовно-дослідницької); методи моделювання різних видів наркотичної залежності; експрес-метод визначення середньолетальної дози речовини, дозозалежної токсичності і кумуляції; статистичні методи обробки отриманих результатів.

Наукова новизна одержаних результатів.

Відкрито принципово новий механізм вибіркової модуляції опіоїдних рецепторів мозку. Унікальність винайденої модуляції полягає в тому, що молекула модулятора утворює зв'язки не з усіма, а тільки з окремими сайтами опіоїдних рецепторів - з ділянками селективності, на відміну від усіх інших відомих класичних лігандів, які комплексуються або з усіма сайтами (ендогенні пептиди), або тільки з точками кишені (екзогенні алкалоїди). Вказана особливість модулятора призводить до того, що сам по собі, окремо, він не призводить до активації G-білків, запуску внутрішньоклітинної відповіді, тому не дає самостійних ефектів; не впливає на зв'язування пептидних лігандів, бо у цьому випадку для молекули модулятора не залишається місць для з'єднання; але впливає (зменшує) на зв'язування алкалоїдних лігандів за рахунок того, що зв'язується з рецептором одночасно з ними.

Вперше встановлено, що застосування винайденої модуляція відновлює природній життєвий цикл опіоїдних рецепторів, ушкоджених тривалою морфінізацією, завдяки відтворенню інтерналізації.

Вперше доведено, що винайдена модуляція підвищує сенситивність і стимулює синтез нових рецепторних молекул, кількість яких зменшена при наркозалежності.

Вперше показано, що завдяки відновленню інтерналізації і зменшенню зв'язування опіоїдних рецепторів із алкалоїдними лігандами (морфіном) нівелюється вплив морфіну на системному рівні.

Вперше виявлено, що завдяки складній модуляції опіоїдної рецепції можна вибірково впливати тільки на мозок із пригніченою ендогенною опіоїдною системою, тобто на наркозалежний мозок, але не на здоровий.

Вперше показано, що вибірковий вплив винайденого модулятора на ліганд-рецепторну взаємодію можна використовувати для втручання в перебіг абстинентного синдрому (наприклад, морфінного) у щурів. При цьому купіруються деякі соматовегетативні, алгічні, психоемоційні прояви синдрому. Отримано дані про можливість його тривалого застосування без ризику викликати звикання і залежність.

Вперше отримано нові знання про можливість метаболічних перетворень модулятора (коменової кислоти) в різних тканинах організму (крові, мозку, печінці), про неможливість взаємодії з ендогенними опіоїдними лігандами.

Вперше виконано доклінічне випробування модулятора як потенційної лікарської речовини - на лабораторних тваринах (щурах). Підібрано мінімальні, оптимальні і максимальні терапевтичні дози. Розраховано коефіцієнти кумуляції, встановлено середні летальні дози при одноразовому і тривалому введенні.

Одержано 4 патенти України на винаходи (№ 4300 від 17.01 2005; № 9430 від 15.09.2005; № 9609 від 17.10.2005; № 11000 від 15.12.2005).

Практичне значення одержаних результатів.

Отримані результати можуть бути покладені в основу розробки нової концепції лікування патологічних станів, пов'язаних з ушкодженням ендогенної опіоїдної системи (наприклад морфінного абстинентного синдрому). Найсуттєвіша перевага такого підходу в тому, що він заснований на етіологічному принципі - відновленні природнього життєвого циклу опіоїдних рецепторів; компенсації характерного для наркозалежності зменшення кількості рецепторів за рахунок активації їх синтезу; зменшенні патологічного впливу алкалоїдних лігандів (наркотиків) на опіоїдні рецептори; відновленні зниженої активності ендогенної опіоїдної системи; підвищенні резервних можливостей організму - за допомогою винайденого нового механізму модуляції опіоїдної рецепції.

Ґрунтуючись на отриманих даних про відсутність аддиктивного потенціалу у дослідженої модуляції опіоїдної рецепції, можна сподіватися на те, що розроблений підхід буде мати значні переваги саме в тій частині, що не викликатиме звикання і фізичної залежності навіть при тривалому застосуванні модулятора.

Здатність модулятора вибірково впливати тільки на мозок з пригніченою ендогенною опіоїдною системою (тобто на наркозалежний), але не на здоровий, може вважатися перевагою у сенсі нешкідливості при його випадковому вживанні.

Отримані дані про терапевтичні та летальні дози, про здатність до кумуляції коменової кислоти дозволять провести перше клінічне випробування винайденого модулятора опіоїдної рецепції на наркоманах-добровольцях з метою визначення можливості його антиабстинентного ефекту на людях.

Можна використовувати отримані знання про більш важкий перебіг морфінного абстинентного синдрому і його гірше купірування у молодих щурів, ніж у дорослих, для виховної роботи серед молоді проти вживання наркотиків.

Викладання теорії нового механізму модуляції опіоїдної рецепції при вивченні фізіології, фармакології, наркології у вузах медико-біологічного профілю дозволить розширити уявлення майбутніх спеціалістів про клітинно-мембранний рівень функціонування і регуляції.

Впровадження результатів дослідження в практику.

Результати дослідження впроваджено у навчальний процес на кафедрах фізіології Запорізького державного медичного університету (акт впровадження від 28.11.05), Вінницького національного медичного університету ім. М.І. Пирогова (акт впровадження від 18.01.06), Таврійського національного університету ім. В.І. Вернадського (акт впровадження від 24.01.06), Донецького національного університету (акт впровадження від 01.02.06), Одеського державного медичного університету (акт впровадження від 03.02.06), Львівського національного медичного університету ім.Д. Галицького (акт впровадження від 05.02.06), Дніпропетровської державної медичної академії (акт впровадження від 09.02.06), Луганського державного медичного університету (акт впровадження від 07.03.06), Української державної стоматологічної академії, м. Полтава (акт впровадження від 25.03.06), Донецького національного медичного університету ім.М. Горького (акт впровадження від 26.02.09).

Особистий внесок здобувача. Дисертація є особистою науковою роботою автора. Дисертанткою самостійно сформована концепція роботи, визначені напрямки й обсяги досліджень, сформульовані мета і завдання наукової розробки, розроблена методологія дослідження і відпрацьовано методи, організовані дослідження і забезпечено їх виконання, проведено самостійне узагальнення і аналіз спеціальної літератури.

Здобувачем самостійно проведено моделювання можливих зв'язків "ліганд-рецептор" та квантовохімічні розрахунки їх ентальпій. Самостійно проведено формування морфінної, алкогольної, нікотинової, ефедринової залежності у щурів та дослідження впливу коменової кислоти на різні прояви абстинентних синдромів указаної етіології, а також вивчення кумулятивних і токсичних властивостей коменової кислоти.

Самостійно проведено математичну обробку первинного матеріалу, зроблено аналіз та узагальнення результатів дослідження. Формулювання наукової гіпотези, новизни, наукових положень, висновків, практичних рекомендацій і впровадження в практику належить особисто авторці.

Авторкою не були використані ідеї та розробки співавторів публікацій та матеріали кандидатської дисертації.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації оприлюднено й обговорено на: IV міжнародній конференції з функціональної нейроморфології "Колосовские чтения-2002" (Санкт-Петербург, 2002); ІІІ Всеросійській конференції з міжнародною участю, присвяченій 175-річчю з дня народження Ф.В. Овсяннікова (Санкт-Петербург, 2003); VІІІ Міжнародній конференції "Центральні і периферичні механізми вегетативної нервової системи" (Донецьк - Слов'янськ, 2003); ІІІ конференції Українського товариства нейронаук з міжнародною участю (Донецьк - Слов'янськ, 2005); XVII з'їзді Українського фізіологічного товариства з міжнародною участю (Чернівці, 2006); ІХ Міжнародній конференції "Центральні і периферичні механізми вегетативної нервової системи" (Донецьк - Слов'янськ, 2007); IV конференції Українського товариства нейронаук з міжнародною участю, присвяченій 100-річчю з дня народження академіка НАНУ Ф.М. Сєркова (Донецьк - Слов'янськ, 2008); ІІ з'їзді фізіологів країн СНД (Кишинів, 2008).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 55 наукових праць (із них 25 без співавторів): 22 статті у наукових фахових виданнях, затверджених ВАК України, 4 патенти України, 9 статей у збірниках наукових праць,20 тез.

Структура дисертації. Дисертація викладена на 339 сторінках комп'ютерного тексту і складається зі вступу, аналітичного огляду літератури, 8 розділів власних досліджень, аналізу та узагальнення отриманих результатів, висновків, практичних рекомендацій, списку використаних джерел, додатків. Проілюстрована 30 таблицями (на 19 сторінках), 32 малюнками (на 19 сторінках), 7 додатками (на 19 сторінках). Список використаних джерел містить 492 джерела (141 кирилицею і 351 латиницею), його викладено на 52 сторінках.

Основний зміст роботи

Матеріал і методи дослідження. Вирішення поставлених завдань здійснювалося шляхом проведення комплексних досліджень, які виконано на 775 білих щурах: 443 тварин увійшли до експериментальної групи, 332 - до контрольної.

Метаболізм коменової кислоти в організмі досліджували за допомогою спектрів флюоресценції та флюоресцентної поляризації опіатних пептидів під впливом коменової кислоти, а також абсорбційної спектрофотометрії коменової кислоти.

У першому випадку до препаратів різних опіатних пептидів - лей - та мет-енкефалінів, в-ендорфіну, ендоморфінів-1,-2 (10 мкМ) додавали коменову кислоту в різних концентраціях (1, 10, 100, 500 мкМ). Ці суміші інкубували, після чого спектрофотометрували при постійній довжині хвилі збудження 280 нм і довжині хвилі емісії, яка змінювалася від 300 нм до 400 нм, у кварцевих кюветах із товщиною пропускаючого шару 0,5 см. Дані флюоресценції інкубаційного розчину використовували в якості базальних значень флюоресценції і математично віднімали від результатів вимірювань у присутності пептидів і/або коменової кислоти. Для кожного опіату і для кожної концентрації коменової кислоти робили по 3 спроби. Використовували флюоресцентний спектрофотометр Hitachi Н-4000 (Японія).

У другому випадку вивчали характерний спектр абсорбції коменової кислоти (250 мкМ) при додаванні її в гомогенати мозку, печінки, крові щурів при певних умовах інкубування, різних концентраціях коменової кислоти, при різних температурах (4°, 37°, 99°С). Оптичну щільність розчинів вимірювали за допомогою абсорбційного спектрофотометра Ultrospec-3300 pro (Amersham) в інтервалі довжин хвиль 220 нм - 450 нм в кварцевих кюветах товщиною поглинаючого шару 1 см.

Взаємодію коменової кислоти з опіоїдними рецепторами, зв'язаними з G-білковою системою, вивчали радіолігандним методом на плазматичних мембранах, виділених із мозку самців щурів (n=10). У якості агоністів опіоїдних рецепторів використовували аналог лей-енкефаліну DALE (повний агоніст дельта-рецепторів, пептид), гідрохлорид морфіну (повний агоніст мю-рецепторів, алкалоїд), промедол (частковий агоніст і дельта-, і мю-рецепторів, алкалоїд), налтрибен (повний інверсний агоніст дельта-рецепторів, алкалоїд), налоксон (повний інверсний агоніст мю-рецепторів, алкалоїд), бета-хлорналтрексамін (антагоніст, алкалоїд). До гомогенату мембран при певних умовах інкубування додавали радіоактивний негідролізований аналог гуанозінтрифосфорної кислоти (ГТФ) - [³⁵S] ГТФгS, який зв'язується з б-субодиницями G-білків при активації агоністом відповідних рецепторів (Gilman A. G., 1987). Оскільки ГДФ-зв'язана форма б-субодиниць є неактивною у відношенні ефекторів, то й оцінити ступінь активації рецепторно-G-білкової системи з використанням [³⁵S] ГТФгS на фоні значного надлишку ГДФ можна з великою вірогідністю (Kiebler M. A. et al., 1999). Активність зв'язування агоністів під впливом коменової кислоти і без неї оцінювали за радіоактивністю проб, яку визначали в сцинтиляційному лічильнику Rackbetta LKB-4000 (LKB, Sweden). Статистична обробка результатів цих експериментів проводилася з використанням програми Origin 4.0 (Microcal Software, Inc. Northampton, США).

Ентальпії (ДДН) утворення комплексних зв'язків між лігандами і ключовими амінокислотами сайтів зв'язування опіоїдного рецептора розраховували напівемпіричним методом РМ-3, який дозволяє отримувати коректні результати при квантовохімічних розрахунках систем із відкритими оболонками, у яких є неспарені електрони (радикали, іони, радикал-іони). Амінокислоти знаходяться в організмі у вигляді полярних іонів (переважно біполярних). Молекула коменової кислоти вочевидь також існує у вигляді іона, адже в ній є полярна дисоціююча група - СООН, а також менш полярна група - ОН. Для того, щоб програма самостійно знайшла локальний мінімум на поверхні потенціальної енергії, дві молекули віддаляли одну від одної на достатньо велику відстань (50 Е). Запускали оптимізацію геометрії, після чого отримували пошукувану структуру та її термохімічні параметри. Оптимізація геометрії полягає в пошуку із безлічі можливих структур тієї структури, яка знаходиться в мінімумі поверхні потенціальної енергії. Поверхня потенціальної енергії це залежність значень енергії, яка міститься у зв'язках структури, від певних координат (від довжини зв'язків, кута між зв'язками, торсіонного кута та ін. - чим більше параметрів, тим складніше вигляд пошукованої поверхні потенціальної енергії).

Вплив коменової кислоти на активність Са²⁺-АТФази і Nа⁺-К⁺-АТФази вивчали, додаючи її до окремих фракцій гомогенату плазматичних мембран із тканин мозку (n=12). У преінкубаційну суміш, окрім коменової кислоти, морфіну, хлориду кальцію, інгібітора Са²⁺-АТФази тапсигаргіну тощо (в залежності від потреби) додавали непомічений і помічений АТФ (250000 розпадів на пробу). Суміш інкубували 30 хв при 37°С в Thermomixer comfort (Eppendorf). Аліквоти супернатанту переносили в сцинтиляційну рідину і аналізували у сцинтиляційному лічильнику Rackbetta (Amersham). Дані представляли у вигляді значень радіоактивності та відповідної їм активності ферментів, виражених у вигляді визволеного із АТФ ортофосфату на 1 мг білка за 1 хв. Радіолігандні дослідження взаємодії коменової кислоти з мембранними рецепторами і АТФазами, спектрофотометричні досліди по вивченню метаболізму цієї речовини виконані за технічного сприяння фахівців відділу нейрохімії Інституту фізіології ім.О. О. Богомольця НАНУ (м. Київ).

Можливість наявності наркогенного потенціалу у коменової кислоти перевіряли шляхом вивчення її впливу на інтенсивність реакції самостимуляції латерального гіпоталамуса, який є ланкою мозкової системи нагороди. Для цього самцям щурів (n=13) в стереотаксичному приладі під кетаміновим наркозом у ділянку латерального гіпоталамуса (А 1,5 мм, L 1,5 мм, H 8,5 мм) (Pellegrino L. J. et al., 1979) були вшиті біполярні електроди. Через 5-7 днів після операції щурів саджали в експериментальну камеру (40х40х60 см) з важелем, натискання на який замикало ланцюг струму і подачу на електрод зі стимулятора ЕСУ-1 на 0,5с пачки імпульсів. Реєстрували кількість натискань за 10 хв. Використовували чорнильний самописець H320-5. Крім цього, на комп'ютері здійснювалася побудова гістограми і таблиці кількості натискань на важіль протягом 10 хв до ін'єкції коменової кислоти, відразу після і через 30 хв, 60 хв, 90 хв і 120 хв після ін'єкції, з одночасною обробкою середньої величини. Спостерігали за змінами порога реакції самостимуляції. Визначали вірогідність різниці отриманих даних за критерієм Стьюдента-Фішера. Після завершення експериментів здійснювали коагуляцію місць самостимуляції. Експерименти на щурах із самостимуляції латерального гіпоталамуса проведені за технічного сприяння співробітників лабораторії загальної фізіології рецепції Інституту фізіології ім.І.П. Павлова РАН (м. Санкт-Петербург).

Вплив коменової кислоти на прояви абстинентного синдрому вивчали в поведінкових експериментах. Для цього спочатку у щурів формували залежність різної етіології.

Морфінну (n=643), алкогольну (n=10), ефедринову (n=10) залежність у щурів викликали шляхом щоденного протягом 18 діб внутрішньочеревинного введення в зростаючих дозах, відповідно, або 1 % гідрохлориду морфіну - від 10 мг/кг до 50 мг/кг (від 0,2 мл до 1 мл) (Судаков С.К. и др., 1994), або 20 % етилового спирту від 0,5 мл до 1,5 мл (Анохина И.П. и др., 2002), або 5 % ефедрину від 0,2 мг/кг до 1 мг/кг під шкіру (Лукачер Г.Я. и др., 1987).

Щоб викликати нікотинову залежність (Yonoszai M. K. et al., 1969), протягом 18 діб щоденно один раз на добу тварин (n=10) піддавали пасивному палінню (у камеру об'ємом 27000 см³ нагнітали дим сигарети "Прима", що згорала). Тривалість паління поступово зростала від 10 хв до 30 хв.

Різні види стресування проводили таким чином: ноцицептивного (n=10) - шляхом стискання хвоста кліпсою (Вербицкая Е.В. и др., 1997); іммобілізаційного (n=10) - іммобілізація у вузькому плексигласовому пеналі з дірочками для вентиляції (Butkevich I. P. et al., 2003); температурного (n=10) - в термостаті при 45°С (Фурдуй Ф.И., 1986). Усі види стресування проводили протягом 18 діб, поступово збільшуючи час від 10 хв до 30 хв.

Для оцінки глибини уражень при розвитку залежності і стресу використовували ряд поведінкових тестів у експериментальних (ін'єкції коменової кислоти, 50 мг/кг) і контрольних (фізіологічний розчин - ізотонічний розчин хлориду натрію) щурів.

Соматовегетативні ураження оцінювали у щурів (n=96) за такими характерними проявами абстиненції, як епізоди судом, діареї, "струсів мокрого собаки", струшувань передніми кінцівками, чхання, скреготу зубами, сгорблювань, птозу, пілоерекції (Судаков С.К. и др., 1994). Індекс ступеня важкості синдрому скасування рахували як арифметичну суму індексів окремих ознак, які спостерігалися. У випадку наявності ознаки використовували відповідний коефіцієнт. Найбільший коефіцієнт (3) був запропонований для трьох найбільш специфічних проявів абстиненції у щурів - судом, діареї, "струсів мокрого собаки". Коефіцієнт для птозу, епізодів скреготу зубами і струшувань передніми кінцівками дорівнював двом, а для решти симптомів абстиненції (сгорблювання, пілоерекція, чхання) - одиниці.

Алгічні порушення при абстинентному синдромі вивчали у тесті "гаряча пластина" (n=130) і формаліновому тесті (n=60).

На гарячу пластину (54С) висаджували щура (Вербицкая Е.В. и др., 1997). Реєстрували латентний період (ЛП) больової реакції позбавлення - облизування задніх кінцівок або вистрибування. Для вивчення впливу коменової кислоти на алгічні порушення при абстиненції використано чотири її дози - 30, 50, 70 і 90 мг/кг.

У формаліновому тесті щурам під шкіру підошви задньої кінцівки вводили 0,05 мл 2,5 % формаліну (Butkevich I. P. et al., 2003). Протягом 60 хв кожну хвилину реєстрували кількість згинань і тривалість вилизування ін'єкованої кінцівки - показники інтенсивності болю. Аналізували загальну тривалість першої і другої фаз.

Психоемоційні порушення при морфінній залежності і абстинентному синдромі вивчали у тестах вимушеного плавання (n=100), відкритого поля, хрестоподібного лабіринту (n=60), а також спостерігаючи за грумінгом (n=96).

Для виявлення схильності щурів до депресивно-подібного стану в тесті вимушеного плавання щура поміщали в бак з водою заввишки 50 см. Протягом 3 хв реєстрували тривалість активного плавання і іммобілізації, також фіксували спроби визволення з води - вистрибування, пірнання (Porsolt R.D. et al., 1992).

Рівень орієнтовно-дослідницької активності, страху і тривожності визначали у відкритому полі (Буреш Я. и др., 1991) і хрестоподібному лабіринті (Dawson G.R. et al., 1995). У відкритому полі рахували кількість заходів окремо у центральні яскраво освітлені і периферичні затемнені квадрати, загальну кількість пересічених квадратів, кількість обстежених отворів, кількість вставань на задні кінцівки, кількість болюсів за 5 хв, співвідношення числа центральних до числа периферичних квадратів, співвідношення числа центральних квадратів до числа болюсів. У припіднятому хрестоподібному лабіринті протягом 5 хв лічили кількість вертикальних стійок, кількість заходів у темні та світлі рукави лабіринту, співвідношення заходів у відкриті і закриті рукави, кількість підходів до дистального кінця відкритого рукава, кількість зважувань з відкритих рукавів.

Реєстрація часу і патерну грумінгу обрані як адекватна модель для оцінки стресорних впливів морфіну, коменової кислоти тощо. Щоденно протягом 30 хв реєстрували кількість повних і перерваних актів грумінгу. Повним грумінговий акт вважався при наявності послідовних семи стадій грумінгу:

1) лизання передніх кінцівок,

2) умивання мордочки,

3) умивання голови і шиї,

4) умивання тулуба,

5) чухання і викусування,

6) умивання задніх кінцівок і хвоста,

7) умивання геніталій. Перерваним вважали акт у двох випадках. Переривання акту першого типу - грумінг закінчувався на першій або другій стадіях. Переривання акту другого типу - після першої або другої стадії була невелика пауза в 2-7 с (тварина завмирала), після чого грумінг відновлювався, але вже відразу з шостої або сьомої стадії. Оцінювали кожну з стадій грумінгу балом за 7-бальною шкалою. Першій стадії присвоювали 1 бал, і т.д., а останній стадії - 7 балів.

Для реєстрації частоти серцевих скорочень (ЧСС) тварин фіксували в спеціальній камері з плексигласу (Западнюк И.П. и др., 1983). ЧСС вимірювали за допомогою електрокардіографа ЭК1К-01 з комплектом електродів для тварин, а ректальну температуру (tєС) - за допомогою ректального датчика електротермометра ТПЭММ-1. Для усунення перешкод від рухової активності при реєстрації ЧСС і tєС тварин позбавляли рухомості інгаляцією фторотаном.

При статистичній обробці експериментальних матеріалів поведінкових експериментів було використано пакет програм "Statistika 5.5" (StatSoft Inc., США) та MedStat версія 3 № MS 00032 (Лях Ю. Є., Гур'янов В.Г., 2006). Оцінювали значущість розходжень між контрольними і експериментальними групами в кожен із днів експерименту, а також усередині кожної групи між різними днями експерименту. Відмінності вважалися значущими з p<0,05.

Гостру токсичність коменової кислоти визначали шляхом однократного введення доз, які у 10-40 разів перевищували умовнотерапевтичну дозу (n=32). Користувалися табличним експрес-методом визначення середніх ефективних заходів впливу на біологічні об'єкти, запропонованим Прозоровським В.Б. (1998).

Кумулятивні властивості визначали в субхронічному експерименті, де тварини (n=120) отримували терапевтичні дози 90 днів, що складає приблизно 10 % середньої тривалості життя щура. При виборі доз керувалися рекомендаціями щодо проведення субхронічних дослідів (Стефанов А.В., 2002), рекомендаціями з оцінки кумулятивних властивостей хімічних речовин (Каган Ю.С. и др., 1986), а також власними даними. Реєстрували випадки летальних кінців. Розраховували індекс кумуляції І_к= 1 - LD_{50 (14)} /LD_{50 (1)} і коефіцієнт кумуляції К_к = LD_{50 (n)} / LD_{50 (1),} де LD₅₀ - середня смертельна доза речовини, введення якої викликає загибель 50 % тварин або у першу добу (LD_{50 (1))}, або протягом 14 діб (LD_{50 (14}) після одноразового введення.

Комітет iз біоетики Донецького національного медичного університету ім.М. Горького (протокол № 143/16 від 14.02.2006 р.) встановив, що проведені дослідження відповідають принципам Гельсінської декларації, прийнятої Генеральною асамблеєю Всесвітньої медичної асоціації (1964-2000 рр.), Конвенції Ради Європи про права людини та біомедицину (1997 р.), Європейської конвенції з використання хребетних тварин для експериментів (1986 р.), відповідним положенням ВООЗ, Міжнародної ради медичних наукових товариств, Міжнародного кодексу медичної етики (1983 р.) та законам України.

Результати досліджень та їх обговорення. Було перевірено припущення, чи пов'язані системні ефекти коменової кислоти з її можливою взаємодією з ендогенними пептидами та впливом на їх метаболізм. Не знайдено змін у спектрах флюоресценції і флюоресцентної поляризації пептидів після додавання до них цієї речовини (до 100 мкМ). Вона гасить флюоресценцію як пептидів, так і базального розчину в рівній мірі. Це свідчить про те, що в присутності коменової кислоти в розчині опіоїдних пептидів не з'являються нові молекули. Тобто вона не вступає в реакцію з ендогенними опіоїдними пептидами, не створює з ними сполук і не впливає на їх метаболізм.

Основний максимум поглинання коменової кислоти відбувається на хвилі 225 нм. Інкубація крові щура з коменовою кислотою не викликає змін у спектрі поглинання, а в гомогенатах мозку і печінці відбувається помітне зменшення її початкової концентрації (визначено за основним максимумом її поглинання на довжині хвилі 225 нм). На цій підставі можна вважати, що коменова кислота в живому організмі метаболізується - це відбувається найбільше в печінці, трохи менше - в мозку, але не відбувається в крові. Крім того, в гомогенаті печінки присутність коменової кислоти сприяє зростанню поглинання з максимумами на довжинах хвиль 260 нм і 380 нм. Це свідчить про те, що під впливом цієї речовини в печінці утворюються молекули двох нових речовин.

Радіолігандні дослідження показали, що коменова кислота (1мкМ - 100 мкМ) сама не чинить помітного впливу на базальне зв'язування [³⁵S] ГТФгS (р>0,05). Тому першою робочою гіпотезою була така: це ще один, дотепер невідомий, антагоніст опіоїдних рецепторів. На відміну від антагоністів, усі інші "класичні" ліганди опіоїдних рецепторів вірогідно змінюють базальне зв'язування [³⁵S] ГТФгS: повні агоністи DALE і морфін збільшують з р<0,001; частковий агоніст промедол збільшує з р<0,01; інверсні агоністи налтрибен і налоксон зменшують з р<0,001.

Але вплив коменової кислоти на опіоїдну рецепцію все ж таки спостерігається - але це відбувається лише тоді, коли її додавати до мембран разом із іншим, "класичним" лігандом, тобто вона модулює рівень агоністзалежної стимуляції. При цьому модулятор коменова кислота (100 мкМ) не впливає на процес агоністзалежної активації G-білків, з'єднаних з високоафінними до DALE дельта-рецепторами. Адже ЕС_{50 DALE (}концентрація речовини, при якій спостерігається 50 % від максимального ефекту) дорівнює 70 нМ (р>0,05). Але агоністзалежна активація G-білків низькоафінними дельта-рецепторами з EC_{50 DALE} 5 мкМ у присутності коменової кислоти підвищується з BI (вірогідний інтервал) 50% - 130% (p<0,001) .

Що стосується впливу цього модулятора на морфінзалежну активацію G-білків мю-рецепторами, то його присутність послаблює активацію G-білків, зв'язаних з високоафінними до морфіну мю-рецепторами (EC_{50 морфіну} 50 нМ) (p<0,001), і підсилює зв'язування з морфіном низькоафінних рецепторів (EC_{50 морфіну} 4 мкМ) (p<0,01). У присутності коменової кислоти зростає кількість зв'язаного з G-білками [³⁵S] ГТФгS під впливом часткового агоніста промедолу (р<0,01). Причому це стосується як високоафінних (EC_{50 промедолу} 90 нМ), так і низькоафінних (EC_{50 промедолу} 100 мкМ) рецепторів. Тобто на зв'язування алкалоїдних лігандів коменова кислота справляє не таку дію, як на зв'язування пептидних: для промедолу і невеликих концентрацій морфіну вона пригнічуюча, а для DALE - або відсутня, або підсилююча (для великих концентрацій DALE).

Вплив коменової кислоти на агоністзалежне інгібування G-білків налтрибеном позначається в тому, що дельта-рецептори, і високоафінні (EC_{50 налтрибену} 5 нМ), і низькоафінні (EC_{50 налтрибену} 50 мкМ), у присутності цього опіоїдного модулятора зменшують спорідненість до інверсного агоніста налтрибену - це проявляється в тому, що кількість активованих G-білків у присутності налтрибену хоча і зменшується (p<0,01), але не так істотно, як без коменової кислоти (p<0,001).

Коменова кислота також скасовує пригнічуючий вплив на мю-рецептори їх інверсного агоніста налоксону: кількість зв'язаного [³⁵S] ГТФгS у присутності самого тільки налоксону менше, ніж у присутності налоксону разом з коменовою кислотою (p<0,001). Це стосується як високоафінних (EC_{50 налоксону} 12 нМ), так і низькоафінних (EC_{50 налоксону} 60 мкМ) мю-рецепторів.

За 100 % прийняте базальне зв'язування в контролі: 28,1±1,4 пмоль/мг білка.

Таким чином, тип рецептора не мав значення. Модулятор коменова кислота справляла однаковий вплив на дію обох інверсних агоністів-алкалоїдів: і налтрибену (ліганд дельта-рецепторів), і налоксону (ліганд мю-рецепторів). І цей вплив, як і у випадку агоністів-алкалоїдів (промедолу та морфіну), був пригнічуючим.

Також треба відзначити, що сила впливу коменової кислоти залежить від властивостей ліганду: ефекти повних лігандів (морфін, налтрибен, налоксон) модулюються в більшій мірі (р<0,001), ніж неповних (промедол) (р<0,01).

Коменова кислота не змінює кількість зв'язаного [³⁵S] ГТФгS у присутності антагоніста в-хлорналтрексаміну порівняно з контролем, коли плазматичні мембрани преінкубуються лише з в-хлорналтрексаміном (р>0,05).

Для більш детальної перевірки: чи є коменова кислота антагоністом опіоїдних рецепторів, ми порівнювали її вплив на агоніст-залежне зв'язування [³⁵S] ГТФгS з впливом класичного антагоніста в-хлорналтрекаміну. в-хлорналтрекамін повністю скасовував вплив будь-яких лігандів на базальну активність G-білків.

Описані вище ефекти коменової кислоти спостерігаються у присутності NaCl (20 мМ). Але, оскільки іони Na самі по собі мають модулюючу дію на опіатні рецептори, для подальшого дослідження впливу опіоїдного модулятора коменової кислоти на залежність зв'язування [³⁵S] ГТФгS від концентрації агоністів, в деяких випадках іони Na були замінені на іони K, щоб зберегти іонну силу інкубаційного розчину. При цьому відбувається збільшення базального і зниження величини агоністзалежного зв'язування [³⁵S] ГТФгS.

У присутності КCl (20 мМ) коменова кислота (100 мк) зменшує агоніст-залежну активацію G-білків високоафінними до DALE дельта-рецепторами, BI 10% - 18% (p<0,05). Активація G-білків низькоафінними дельта-рецепторами також зменшується, BI 25% -35% (p<0,001). EC_{50 DALE} при цьому не міняється (12 нМ і 10 мкМ для високо - і низькоафінних дельта-рецепторів, відповідно). Відсутність змін у величині EC₅₀ свідчить про те, що коменова кислота сама по собі не впливає на афінність рецепторів до агоніста.

У присутності КCl (20 мМ) коменова кислота (100 мкМ) не впливає на агоністзалежну активацію G-білків високоафінними до морфіну мю-рецепторами (p>0,05). Активація G-білків низькоафінними мю-рецепторами збільшується, BI 6% - 20% (p<0,01). Таким чином, співвідношення G-білків, активованих високо - і низькоафінними рецепторами, змінюється.

Відомо, що кількість опіоїдних рецепторів при формуванні залежності змінюється. Є багато свідоцтв і down-regulation, і up-regulation (відповідно, зменшення і зростання кількості мембранних рецепторів). Але нема єдиної думки, чому ці зміни бувають різноспрямованими. Оскільки кількість рецепторів корелює і оцінюється за базальною активністю G-білків (у відсутності лігандів), цей показник було досліджено на різних етапах морфінізації і введення коменової кислоти і промедолу ("легкий" наркотик, застосовується в замісній терапії).

Базальне зв'язування G-білків у плазматичних мембранах мозку здорових тварин складало (42,3±2,4) пмоль/мг білка. Через 24 години після однократного введення гідрохлориду морфіну воно було більше - (47,5±2,7) пмоль/мг (p<0,05). Кількість зв'язаного [³⁵S] GTP?S у тварин, яких декапітували через 6 діб після початку морфінізації, було знижено до (31,1±3,2) пмоль/мг, а через 18 діб - до (21,1±1,1) пмоль/мг білка (p<0,001). Введення фізіологічного розчину контрольним щурам вірогідно не впливало на базальне зв'язування G-білків (р>0,05).

Через добу після скасування морфіну і розвитку абстинентного синдрому у щурів експериментальної групи кількість активованих G-білків (19,1±1,7) пмоль/мг білка (p>0,05). Через 6 діб після скасування морфіну базальна активність G-білків у щурів, які отримували коменову кислоту, була (33,8±2,0) пмоль/мг (p<0,001); які отримували промедол - (23,1±1,4) пмоль/мг (p<0,001); які отримували фізіологічний розчин - (28,1±1,9) пмоль/мг (p<0,001). До закінчення експерименту, через 18 днів після скасування морфіну, кількість комплексів "мічений ГТФ + G-білок" ще більше виросла у всіх тварин, але в різній мірі. Введення тваринам протягом 18 діб коменової кислоти призвело до зростання зв'язаного [³⁵S] GTP?S до (44,1±3,4) пмоль/мг білка (p<0,001); введення промедолу - до (32,9±1,7) пмоль/мг (p<0,001); введення фізіологічного розчину - до (37,1±2,0) пмоль/мг (p<0,001)

Введення: а - без введення; б - морфіну; в - фізіологічного розчину здоровим щурам; г - фізіологічного розчину морфінізованим щурам; д - коменової кислоти морфінізованим щурам; ж - промедолу морфінізованим щурам.

Указана похибка середнього.

Аналіз отриманих даних дозволяє припустити наявність кореляції між глибиною поразки мозку морфозалежних та лікованих тварин і станом рецепторної системи. Чим більша тривалість наркотизації, тим менше базальна активність G-білків, це говорить про зменшення загальної кількості рецепторів - down-regulation. А оскільки регулярні ін'єкції коменової кислоти стимулюють більш швидше відновлення базальної активності G-білків, можна припустити, що ця речовина сприяє синтезу нових рецепторних молекул.

Оскільки ефекти коменової кислоти - і на мембранному рівні, і на рівні цілого організму - не проявляються при її окремому додаванні або введенні, а проявляються лише на фоні дії інших, класичних, опіатів чи опіоїдів - морфіну, промедолу, DALE тощо, було припущено, що це може бути зумовлено особливостями її взаємодії з рецепторами, і співставили своє припущення з уявленнями про те, що ліганди пептидної та алкалоїдної природи мають різні сайти зв'язування з рецептором, чим і зумовлені відмінності їх ефектів. Методом генної інженерії доведено, що алкалоїди зв'язуються тільки в одному місці рецептора - у другому трансмембранному домені, в його кишені, ключовою амінокислотою якої є аспарагін. А пептиди зв'язуються з рецептором водночас у двох місцях: і з кишенею і з ділянками селективності, розташованими вище зовнішньої поверхні мембрани, у третій екстрацелюлярній петлі, у місці її контакта з шостим і сьомим трансмембранними доменами. Ключовими амінокислотами тут виступають триптофан і лізин. Суть у тому, що при цьому спостерігаються різні ефекти. Активація кишені призводить до активації G-білка і внутрішньоклітинної відповіді, а активація ділянок селективності - до інтерналізації та десентизації рецептора.

А чи здатна коменова кислота створювати зв'язки з ключовими амінокислотами ділянок рецептування опіоїдного рецептора? Щоб оцінити це, моделювали утворення таких зв'язків і рахували їх ентальпії (ДДН). Ентальпію утворення комплексу розраховували як різницю ентальпій кінцевих продуктів реакції та вихідних речовин: ДДН = ? ДН (кінцевих продуктів) - ? ДН (вихідних речовин). У якості контролю розраховували ентальпії комплексів класичних опіоїдних лігандів морфіну та DALE з ключовими амінокислотами опіоїдного рецептора (табл.1).

Таблиця 1

Ентальпії (ДДН) утворення зв'язків коменової кислоти, морфіну і DALE з ключовими амінокислотами опіоїдного рецептора

Вірогідність утворення комплексного зв'язку між двома молекулами тим вище, чим менше для її створення потрібно енергії (негативні значення ентальпії). І, навпаки, чим більше потребується енергії (позитивні значення ДДН), тим менша можливість утворення такої структури. У коменової кислоти найбільша вірогідність утворення зв'язку з лізином (ентальпія - 27,6 ккал/моль відповідає доволі міцному водневому зв'язку з довжиною зв'язку біля 1,75 Е), дещо менше - з триптофаном, і неможливе створення комплексу з аспарагіном. DALE має високу вірогідність утворення комплексів із амінокислотами і ділянок селективності (триптофан, лізин), і кишені зв'язування (аспарагін). Також звертає на себе увагу низька можливість утворення комплексів "морфін-триптофан" і "морфін-лізин", але високий ступінь вірогідності з'єднання морфіну з аспарагіном. Наші дані узгоджуються зі згаданою вище гіпотезою про те, що алкалоїдні ліганди зв'язуються з опіоїдним рецептором тільки в одному місці - в кишені, а пептидні - і в кишені, і в ділянках селективності.

Вивчення активності Са²⁺-АТФази і Na⁺-К⁺-АТФази показало, що ці ферменти не чутливі до дії коменової кислоти в її фізіологічних концентраціях: 1 мкМ, 10 мкМ, 50 мкМ, 100 мкМ. Активність АТФаз не мінялася також і під впливом морфіну.

Самостимуляцію латерального гіпоталамуса, який входить до мозкової системи підкріплення, використовують як маркер наркотичної речовини. Якщо під впливом речовини зростає самостимуляція структури, що входить до системи нагороди, або ж зростає кількість самовведень цієї речовини, то це розцінюється як наявність аддиктивного потенціалу у речовини. До експерименту число натискань на важіль у щурів була 220-550 за 10 хв. Порогова сила струму 90 мкА - 330 мкА. Коменова кислота в дозі 1 мг/кг не викликала достовірних змін самостимуляції; у дозі 10 мг/кг - незначне зростання; у дозі 30 мг/кг - значне пригнічення реакції самостимуляції. У деяких щурів препарат викликав тільки зменшення частоти натискань, але поріг реакції самостимуляції не мінявся, у деяких - і зменшувалась частота самостимуляції, і зростав поріг самостимуляції. Повторні ін'єкції коменової кислоти на другий день підтвердили пригнічуючий ефект препарата на реакцію самостимуляції, що розцінюється як відсутність у неї аддиктивного потенціалу.