Механізми цитотоксичної дії ландоміцину е на пухлинні клітини in vitro

Размещено на http://www.allbest.ru/

[Введите текст]

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЇ ПАТОЛОГІЇ,

ОНКОЛОГІЇ І РАДІОБІОЛОГІЇ ім. Р.Є.КАВЕЦЬКОГО

УДК 615.33+616-006.6

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Механізми цитотоксичної дії ландоміцину е

на пухлинні клітини in vitro

14.01.07 - онкологія

Київ - 2009

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті біології клітини НАН України, м.Львів.

Науковий керівник: член-кореспондент НАН України,

доктор біологічних наук, професор

Стойка Ростислав Степанович,

Інститут біології клітини НАН України,

завідувач відділу регуляції проліферації клітин і апоптозу.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

Матишевська Ольга Павлівна,

Київський національний університет імені Тараса Шевченка, професор кафедри біохімії;

кандидат біологічних наук

Фільченков Олексій Олексійович,

Інститут експериментальної патології, онкології

і радіобіології ім. Р.Є.Кавецького НАН України,

старший науковий співробітник

відділу експериментальних клітинних систем.

Захист відбудеться “ 14 ” жовтня 2009 р. о 15⁰⁰ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.155.01 в Інституті експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є.Кавецького НАН України за адресою: 03022, м. Київ, вул. Васильківська, 45.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці ІЕПОР НАН України.

Автореферат розісланий 12_ вересня 2009 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наукЛ.М.Шлапацька

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Найбільш ефективними в лікуванні онкологічних хворих вважають антибіотики антрациклінової та блеоміцинової груп, які синтезуються різними штамами стрептоміцетів (Henkel T. et al., 1990). Ландоміцин Е (ЛЕ) - новітній ангуцикліновий антибіотик, представник родини ландоміцинів, яка поряд із антрациклінами та блеоміцинами відноситься до ароматичних полікетидів (Rohr J. et al., 1993). ЛЕ синтезується штамом Streptomyces globisporus 1912 при рості на соєвому середовищі. Крім типової хромофорної групи, молекула ЛЕ містить О-зв'язаний трисахарид (-L-родиноза-(13)--D-олівоза-(14)--D-олівоза). Протипухлинний потенціал цього антибіотика вперше був продемонстрований in vivo на моделі карциноми Герена в щурів (Поліщук Л.В. та ін., 1996). Проте, механізми його протипухлинної активності не досліджувалися. Єдиний з представників родини ландоміцинів, що раніше досліджувався, ландоміцин А, інгібував синтез ДНК у пухлинних клітинах на стадії переходу із G₁ у фазу S клітинного циклу (Crow R.T. et al, 1999). Було показано, що ЛЕ більш ефективно, ніж ландоміцин А, проникає через цитоплазматичну мембрану всередину клітини, та проявляє сильнішу бактерицидну дію на мікроорганізми (Мацелюх Б.П. та ін., 1998).

Серед найважливіших чинників, що обмежують клінічне використання протипухлинних препаратів, є швидкий розвиток у пухлинних клітин множинної лікарської резистентності (МЛР), через що 30% протипухлинних препаратів втрачають ефективність у процесі лікування (Hunum Y., 1997). Надекспресія більшості МЛР-опосередкованих АВС-транспортерів, що включають білки P-gp, MRP1 і BCRP, забезпечує зменшення накопичення клітиною протипухлинних препаратів, що і призводить до суттєвого зниження їх цитотоксичної активності (Nielsen D. et al., 1996; Szakacs G. et al., 2006). Виникнення набутої множинної резистентності та дослідження механізмів її уникнення набувають актуальності особливо в світлі розгляду питання про можливість застосування нових протипухлинних препаратів. Стосовно ЛЕ ці питання не вивчались, тому дана робота була скерована на їх дослідження.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами.

Дисертаційну роботу виконано в рамках держбюджетної теми Інституту біології клітини НАН України «Механізми індукції антипроліферативної та цитотоксичної активності у нормальних і трансформованих клітин» (2003-2005 рр., номер державної реєстрації №0103U001404) та теми «Дослідження процесів, що відбуваються під час апоптозу, індукованого антинеопластичними препаратами з різним механізмом дії» (2005-2008 рр., номер державної реєстрації №0106U002599).

Мета роботи. Дослідити молекулярні механізми дії ЛЕ на пухлинні клітини, зокрема індукцію апоптозу та його вплив на клітини з резистентністю до лікарських препаратів.

Основні завдання дослідження.

1. Дослідити антипроліферативну дію ЛЕ на пухлинні клітини різного тканинного ґенезу.

2. Порівняти антипроліферативну активність ЛЕ та інших протипухлинних препаратів, зокрема адріаміцину, вінкристину, цисплатину, флуороурацилу, метотрексату; дауноміцину, блеоміцину, мітоксантрону.

3. Дослідити цитоморфологічні зміни в пухлинних клітинах під впливом ЛЕ.

4. Провести порівняльний аналіз впливу ЛЕ та адріаміцину на фізико-хімічні властивості ДНК.

5. Дослідити молекулярні механізми апоптотичної загибелі пухлинних клітин під впливом ЛЕ.

6. Вивчити особливості дії ЛЕ на пухлинні клітини з різними типами резистентності до хіміотерапевтичних препаратів.

7. Дослідити вплив інгібіторів АВС-транспортерів на антипроліферативну дію ЛЕ.

Об'єкт дослідження: злоякісно трансформовані лінії клітин з різною чутливістю до дії ЛЕ.

Предмет дослідження: механізми цитотоксичної дії ЛЕ на пухлинні клітини in vitro. ландоміцин апоптоз пухлинний вінкристин

Методи дослідження: культивування клітин in vitro, світлова і флуоресцентна мікроскопія, термоденатурація ДНК, тонкошарова хроматографія, виділення ДНК, спектрофотометрія, електрофорез ДНК і білків у гелі, Вестерн-блот аналіз, проточна цитометрія, метод радіоактивних ізотопів, статистичні методи аналізу.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше охарактеризовано антипроліферативну дію нового антибіотика ЛЕ на 27 лініях клітин різного тканинного та видового походження. Проведено порівняльний аналіз активності ЛЕ та відомих протипухлинних препаратів - адріаміцину, метотрексату, цисплатину, вінкристину, флуороурацилу. Доведено загибель пухлинних клітин шляхом апоптозу під впливом ЛЕ. Показано, що апоптотична дія ЛЕ відбувається за участі мітохондріального сигнального шляху й обумовлена генерацією активних кисневих метаболітів, запуском каспазного каскаду за участі каспази-3 та -7, що призводить до розщеплення ензиму PARP-1, задіяного в репарації ДНК.

Вперше показано, що зниження чутливості до ЛЕ клітин, які резистентні до протипухлинних препаратів (адріаміцину, мітоксантрону, дауноміцину) внаслідок надекспресії у них білків родини АВС-транспортерів, таких як P-gp, MRP1 і BCRP, відрізняється не більше як у 2,5 разів у порівнянні з вихідними пухлинними клітинними лініями.

Практичне значення одержаних результатів. Результати, представлені в дисертаційній роботі, вказують на перспективність проведення доклінічних випробувань ЛЕ. Методичні підходи щодо вивчення цитотоксичної дії нового антибіотика на пухлинні клітини in vitro, основні результати цього дослідження й теоретичні узагальнення, що стосуються сигнальних механізмів дії ЛЕ, використовуються при викладанні спецкурсу “Молекулярні механізми регуляції проліферації і диференціювання клітин” для магістрів біологічного факультету Львівського національного університету ім. Івана Франка.

Особистий внесок здобувача. Дисертант самостійно опрацювала літературу за темою роботи, оволоділа необхідними методиками досліджень, виконала весь обсяг експериментальної частини дисертації, провела статистичну обробку результатів і брала участь у підготовці до друку наукових публікацій за участю співавторів та наукового керівника роботи.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації були представлені на: Міжнародній Вейгелівській мікробіологічній конференції (Львів, 2003), VI Конференції молодих онкологів України (Київ, 2003), Першому (Установчому) Українському з'їзді клітинних біологів (Львів, 2004), Міжнародній науковій конференції студентів та аспірантів "Молодь і поступ біології" (Львів, 2005), конференції молодих науковців "Сучасні проблеми біохімії та біотехнології" (Київ, 2005), 5-й Міжнародній Парнасівській конференції (Київ, 2005), Всеукраїнській науково-практичній конференції з міжнародною участю “Молекулярні основи і клінічні проблеми резистентності до лікарських засобів” (Київ, 2006), ІХ Українському біохімічному з'їзді (Харків, 2006), 2-му Українському з'їзді клітинних біологів (Київ, 2007).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 13 наукових праць, з них 5 - у фахових періодичних виданнях, рекомендованих ВАК України, і 8 - у матеріалах конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, опису матеріалів та методів досліджень, вісьми підрозділів результатів власних досліджень, аналізу та узагальнення результатів досліджень, висновків, списку використаної літератури та додатків.

Дисертацію викладено на 126 сторінках комп'ютерного набору, проілюстровано 49 рисунками та 6 таблицями. Бібліографічний список налічує 195 джерело, з них 23 українською або російською мовами та 172 англійською мовою.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи дослідження. У роботі використовували ЛЕ, який було отримано у лабораторії проф. Мацелюха Б.П. (Інститут мікробіології та вірусології ім. Д.К.Заболотного НАН України, Київ, Україна) (Поліщук Л.В. та ін., 1996; Мацелюх Б.П. та ін., 1998). Структуру ЛЕ було з'ясовано проф. J. Rohr (Rohr J. et al., 1997). Активність ЛЕ на злоякісно трансформовані клітини порівнювали з дією протипухлинних препаратів адріаміцину, мітоксантрону, метотрексату, цисплатину (Ebeve, Австрія), вінкристину (Richter, Угорщина), флуороурацилу (Дарниця, Україна), дауноміцину, блеоміцину (Sigma, США). Використовували інгібітори ABC-транспортерів верапаміл (Abbott, Австрія), іматиніб (Novartis, Швейцарія), гефітиніб (Teva, Ізраїль).

У роботі було використано 27 клітинних ліній (25 з яких лінії пухлинних клітин і 2 - нормальних), представлених широким спектром тканинного поход-ження, як вихідних, так і резистентних до хіміопрепаратів.

Клітини вирощували згідно з рекомендаціями АТСС (American Type Culture Collection) у культуральному середовищі DMEM або RPMI 1640 (Sigma, США) за присутності 10% декомплементованої (56⁰C, 30 хв) сироватки крові ембріонів корів (РАА, Австрія) і 50 мкг/мл гентаміцину (Sigma, США) в СО₂-інкубаторі з 5% вмістом СО₂ при 37⁰С і 95% вологості. Клітини пересівали через кожні дві-три доби розведенням клітинної суспензії у співвідношенні 1:5. У дослідах використовували клітини, серед яких кількість мертвих не перевищувала 3%.

Антипроліферативну дію препаратів оцінювали кількісно за величиною ІС₅₀, яка дорівнювала концентрації препарату, що необхідна для зменшення загальної кількості живих клітин на 50% порівняно з контролем.

Підрахунок кількості живих і мертвих клітин при фарбуванні трипановим синім здійснювали в гемоцитометричній камері.

Дослідження впливу різних препаратів на життєдіяльність клітин визначали МТТ-тестом із використанням барвника тетразолію, принцип дії якого базується на здатності дегідрогеназ мітохондрій живих клітин відновлювати тетразолій жовтого кольору до формазану пурпурового кольору. Через 72 год інкубації клітин із препаратом визначали кількість живих клітин згідно з рекомендаціями виробника набору EZ4U (Biomedica, Австрія).

Морфологію клітин досліджували прижиттєвим фарбуванням клітин акридином оранжевим і фарбуванням фіксованих препаратів азур-еозином за Романовським-Гімза. Для флуоресцентного контрастування структури ядер клітин КВ-3-1 використовували барвник DAPI (Sigma, США) в концентрації 1 мкг/мл.

Для дослідження здатності ЛЕ до інтеркаляції в ДНК сперми лосося (Sigma, США) використовували метод термоденатурації ДНК (Krey A.H. et al., 1969) та метод конкурентного витіснення метилового зеленого з його комплексу з ДНК (Schmeller T. et al., 1997). Здатність ЛЕ зв'язуватися з ДНК оцінювали за допомогою методу тонкошарової хроматографії на силуфольних пластинках (Avalier, Чехія) за зниженням хроматографічної рухливості, що свідчить про зростання спорідненості речовини до ДНК (Maier A. et al., 1999), а також за впливом ЛЕ на електрофоретичну рухливість продуктів розщеплення ДНК фага л (NEB, США) рестриктазою Pst 1 (Sigma, США) на фрагменти розміром ~200-11500 пар нуклеотидів.

Вплив ЛЕ на синтез ДНК в клітинах лінії KB-3-1 вивчали за інтенсивністю включення ³Н-тимідину (Amersham Biosciences, США). Отримання клітинних лізатів і вимірювання радіоактивності на проточному сцинтиляційному лічильнику Tri-Carb 1900TR (Packard, США) здійснювали згідно з рекомендаціями (Heffeter P. et al., 2006).

Дослідження клітинного циклу після фарбування пропідію йодидом здійснювали на проточному цитометрі FACS Calibur (Becton Dickinson, Palo Alto, США).

Міжнуклеосомну фрагментацію ДНК апоптотичних клітин досліджували за допомогою електрофорезу в гелі 1,5% агарози (Singh N. et al., 1988; Кудрявец Ю.И. та ін., 1996). Зони ДНК виявляли в ультрафіолетовому світлі та фотографували через оранжевий світлофільтр цифровою камерою Olympus C4000 (Японія).

Для детекції внутрішньоклітинної продукції вільних радикалів використовували 2,7-дихлорфлуоресцеїн диацетат (DCF-DA) (Elbling L. et al., 2005).

Для інгібування утворення активних метаболітів кисню використовували поглинач радикалів N-ацетил-цистеїн (Sigma, США) в кількості 1 або 2 ммоль/л.

Внутрішньоклітинний вміст АТФ визначали з використанням люциферази, оцінюючи рівень біолюмінесценції, що властива метаболічно активним клітинам, за допомогою наборів реагентів ViaLight MDA Plus Cytotoxicity та Cell Proliferation BioAssay Kit (Cambrex, Verires, Бельгія ) згідно з рекомендаціями виробника.

Функціонування мітохондрій під впливом ЛЕ оцінювали за їх здатністю накопичувати флуоресцентний барвник родамін-123 (Heffeter P. et al., 2005), а також із використанням барвника JC-1, що входить до набору Mitochondrial Membrane Potential Detection Kit (Stratagene, США). У живих клітинах JC-1 акумулюється в мітохондріальному матриксі й зафарбовує його в яскраво-червоний колір, а в апоптотичних клітинах, де має місце втрата мембранного потенціалу, він залишається в цитоплазмі в мономерній формі, обумовлюючи зелене забарвлення.

Вестерн-блот аналіз лізатів клітин використовували для виявлення прокаспаз-3 і -7 та розщепленої форми каспаз-3 і -7, а також репараційного ензиму PARP-1 і його розщепленої форми за допомогою відповідних антитіл (Cell Signaling, США). Для нормалізації кількості нанесення білка використовували антитіла AC-15 до Я-актину (Sigma, США).

Cтатистичну обробку отриманих даних проводили за допомогою програм GraphPad Prizm 5 (Каліфорнія, США) та Origin 7 (Microcal, США). Варіаційно-статистичне опрацювання отриманих результатів здійснювали з використанням

t - критерію Ст'юдента за допомогою комп'ютерної програми Microsoft Excel 2007.

Результати досліджень та їх обговорення

Аналіз антипроліферативної активності ЛЕ та порівняння її з дією інших протипухлинних препаратів. Протипухлинний ефект ЛЕ був уперше продемонстрований in vivo в 1996 році (Поліщук та ін., 1996). Однак, механізми дії ЛЕ тривалий час залишалися нез'ясованими.

Нами досліджено вплив ЛЕ на проліферативну активність клітин різного тканинного походження (табл. 1). Найбільш чутливими до ЛЕ виявилися клітини аденокарциноми молочної залози людини MDA-MB-468 і MDA-MB-231, значення IC₅₀ для яких було 0,37±0,08 і 0,76±0,09 мкг/мл, відповідно. Для двох інших ліній клітин аденокарциноми молочної залози MCF-7 і T47D значення IC₅₀ при дії ЛЕ становило відповідно 1,28±0,16 і 6,68±1,01 мкг/мл. Найменш чутливими до дії ЛЕ виявилися клітини епітелію легені норки CCL-64 (IC₅₀ - 15,04±2,65 мкг/мл).

Для порівняння дії ЛЕ з іншими протипухлинними препаратами, що застосовують при хіміотерапії, було використано адріаміцин, цисплатин, флуороурацил, вінкристин і метотрексат. Тестування проводили на трьох лініях пухлинних клітин людини: SW-480 і НТ29 (клітини карциноми товстого кишківника) та MCF-7 (клітини аденокарциноми молочної залози). Встановлено, що в концентраціях від 0,1 до 10 мкг/мл антипроліферативна активність ЛЕ суттєво не відрізняється від такої вищезгаданих препаратів у тих же концентраціях.

Цитоморфологічні зміни в клітинах під впливом ЛЕ. При дії ЛЕ (4 мкг/мл) на трансформовані фібробласти миші лінії L929 спостерігали вип'ячування плазматичної мембрани клітин, які дають початок апоптотичним тільцям. Морфологічні зміни в клітинах лінії А549 під впливом ЛЕ виявлялися вже в концентрації 2 мкг/мл, а при концентрації 4 мкг/мл спостерігалось утворення великої кількості дрібних вакуолей. Зміни в морфології цитоплазми та ядра виявляли при обробці 2-4 мкг/мл ЛЕ клітин КВ/S карциноми гортані людини після 24 год дії.

Дослідження цитологічних препаратів клітин HT-1080 (фібросаркома вертлюжної впадини людини) та клітин NIH 3T3 (ембріональні фібробласти миші) із прижиттєвим фарбуванням акридиновим оранжевим показали наявність апоптотичних змін, що мають місце в цих клітинах при дії 4 мкг/мл ЛЕ після 48 год. Акридин оранжевий здатний до інтеркаляції в ДНК та РНК і за своїми фізико-хімічними властивостями відноситься до двохвильових люмінофорів, що дозволяє оцінювати метаболізм як одно- (яскраво-червоне свічення), так і дволанцюгових (яскраво-зелене свічення) молекул нуклеїнових кислот. Під впливом ЛЕ спостерігалося зменшення інтенсивності флуоресценції ядер клітин у зеленій області спектру, що було обумовлено зростанням вмісту одноланцюгових нуклеїнових кислот і, можливо, є наслідком порушення процесів репарації ДНК під впливом ЛЕ як прояву його цитотоксичної активності.

Щоб охарактеризувати морфологічні зміни в ядрі клітин карциноми шийки матки людини лінії КВ-3-1 під впливом ЛЕ, через 24 год інкубації з препаратом було проведено фарбування клітин флуоресцентним барвником DAPI. Як видно з рис. 1, ЛE спричиняв конденсацію хроматину та фрагментацію ядра, причому вже після 24 год інкубації з 1 мкг/мл ЛE апоптотичні зміни були помітні у більше ніж 20% клітин. Подальше підвищення концентрації ЛE призводило до зростання кількості клітин, що зазнали апоптотичних змін. Окрім того, після інкубування клітин у присутності 1 мкг/мл ЛЕ суттєво зменшувалась кількість клітин у стадії мітозу (з 14 до 2,5%). У цих клітинах спостерігали аномальну мітотичну картину, зокрема, неповну сегрегацію і нерівний розподіл хромосомного матеріалу. Відомо, що порушення нормального перебігу мітозу призводять до анеуплоїдії та подальшої загибелі клітини.

Порівняльний аналіз впливу ЛЕ та адріаміцину на фізико-хімічні властивості ДНК. Для з'ясування можливості безпосередньої взаємодії ЛЕ з ДНК було досліджено вплив ЛЕ на деякі фізико-хімічні властивості ДНК. У цій серії дослідів проводили дослідження впливу ЛЕ порівняльно з адріаміцином, беручи до уваги дані про інтеркаляційну активність адріаміцину (Zeman et al., 1998).

Використовуючи метод тонкошарової хроматографії, встановлено, що присутність адріаміцину значно знижує хроматографічну рухливість ДНК, що пояснюється здатністю даного антрацикліну інтеркалювати в структуру ДНК, чого не було виявлено у випадку інкубації ДНК із ЛЕ, де довжина хроматографічного треку залишалась без змін.

Інтеркаляція антрациклінів у структуру ДНК вважається одним із важливих механізмів їх цитотоксичної дії (Zeman et al., 1998). Використовуючи тест із барвником метиловим зеленим встановлено, що навіть при високій концентрації ЛЕ (50 мкг/мл), що в 3-15 разів перевищує діючі концентрації цього препарату, не відбувається його інтеркаляції в ДНК, тоді як адріаміцин проявляє інтеркаляційну здатність у концентрації 10 мкг/мл.

Для вивчення впливу ЛЕ на електрофоретичну рухливість ДНК використовували також Pst I-рестрикти ДНК фага л. Показано, що ЛЕ суттєво не впливає на електрофоретичну рухливість ДНК, тоді як адріаміцин помітно гальмує рух ДНК.

Ще одним об'єктивним показником, за яким можна судити про можливість безпосередньої взаємодії тієї чи іншої речовини з ДНК, є зміна температури плавлення ДНК у суміші з речовиною, що досліджується. Виявлено, що ЛЕ (10 мкг/мл) не впливав на цей показник, на відміну від адріаміцину (10 мкг/мл), після інкубації з яким спостерігалося підвищення температури плавлення на 18,5^о С.

Отримані результати можна інтерпретувати, виходячи зі стереохімічної структури досліджуваних препаратів. Відомо, що ефективними інтеркаляторами ДНК є поліциклічні сполуки, які містять систему ароматичних кілець в одній площині, як у випадку адріаміцину. Відновлення кількох подвійних зв'язків у ароматичних кільцях, що має місце у ЛЕ, призводить до зміни кутів між валентними зв'язками вуглецю і викривлення плоскої конформації молекули, що й веде до втрати сполукою здатності інтеркалювати в спіралі ДНК.

Вплив ЛЕ на синтез ДНК і проходження фаз клітинного циклу. Вплив ЛE на синтез ДНК визначали за включенням ³H-тимідину в ДНК клітин. Тимідин знаходиться виключно в структурі ДНК і включення радіоактивноміченого тимідину може слугувати показником проліферативної активності клітини. Паралельно з методом, що базується на включенні тимідину, використовували МТТ-тест для оцінки процесів життєдіяльності клітин лінії КВ-3-1. Уже після 24 год інкубації з 1 мкг/мл ЛЕ в клітинах КВ-3-1 спостерігали зменшення майже на 50% включення радіоактивного тимідину в ДНК. Подібний ефект ЛЕ мав місце також при його дії на клітини лінії A549 аденокарциноми легені людини.

Слід зазначити, що дозозалежне зниження рівня синтезу ДНК відбувалося значно стрімкіше, ніж відповідні зміни, що фіксували в клітинах із використанням МТТ-тесту. Наведені дані вказують на те, що ЛE має сильний інгібіторний вплив на синтез ДНК пухлинних клітин.

Для дослідження впливу ЛЕ на перерозподіл фаз клітинного циклу було використано фарбування клітин пропідію йодидом із подальшим їх аналізом методом проточної цитометрії. При дії ЛЕ на лейкемічні клітини людини ліній HL-60/adr і HL-60/vinc, які мають набуту резистентність до протипухлинних препаратів адріаміцину і вінкристину, відповідно, спостерігали появу характерного для апоптотичних клітин піку в пре-G₁ фазі, зростання числа клітин у фазі G₂/M до 29,12% (при 15,89% у контролі) і зменшення кількості клітин в S-фазі до 40,23% (при 59,22% у контролі) для клітин HL-60/adr. Для клітин HL-60/vinс відмічено зростання числа клітин у фазі G₀/G₁ до 48,17% (при 27,77% у контролі) і зменшення кількості клітин в S-фазі до 33,06% (при 58,76% у контролі). Вплив ЛЕ на клітинний цикл досліджуваних клітин був виражений при його концентрації 2 мкг/мл.

Вплив ЛЕ на цілісність ДНК клітин-мішеней. Специфічна міжнуклеосомна фрагментація ДНК вважається однією з найважливіших біохімічних характеристик апоптозу. З метою виявлення апоптотичних змін у ДНК пухлинних клітин під впливом ЛЕ, було досліджено фрагментацію ДНК клітин ліній L1240 і КВ-3-1, використовуючи електрофорез ДНК у гелі агарози. Після 24 год інкубації клітин із 5 мкг/мл ЛЕ на електрофореграмах було виявлено нуклеосомну фрагментацію ДНК клітин лінії КВ-3-1, але в меншій мірі, ніж у клітинах L1210. Це, ймовірно, обумовлено підвищеною чутливістю лейкемічних клітин до ЛE.

Дія ЛЕ на функціонування мітохондрій. Подальші дослідження були скеровані на з'ясування питання, чи залучений мітохондріальний сигнальний шлях у апоптотичну загибель клітини, що обумовлена дією ЛЕ. Для виявлення змін у проникливості мітохондріальної мембрани, був використаний флуоресцентний катіонний барвник JC-1.

Відомо, що втрата клітинами мітохондріального мембранного потенціалу є початковим етапом у процесі індукції апоптозу. В інтактній клітині барвник JC-1 акумулюється й утворює агрегати в мітохондріях, що реєструється як свічення яскраво-червоного забарвлення. В апоптотичних клітинах, у зв'язку з колапсом мембранного потенціалу, JC-1 не накопичується в мітохондріях, а розміщений дифузно в цитоплазмі в мономерній формі з флуоресценцією в зеленій області спектру.

На рис. 2 наведено результати цитофлуориметричного аналізу після фарбування барвником JC-1 клітин ліній HL-60, КВ-3-1 і HCT116, що зазнали дії ЛЕ протягом 24 год. Після обробки лейкемічних клітин лінії HL-60 ЛЕ в концентрації 2^омкг/мл у 14% клітин виявили втрату трансмембранного мітохондріального потенціалу, а після підвищення концентрації ЛE до 4 мкг/мл уже 92% клітин втрачали цей потенціал. ЛЕ також мав сильний вплив на мітохондріальний трансмембранний потенціал у клітинах ліній КВ-3-1 і HCT116, причому повна втрата потенціалу відмічена при концентрації 10 мкг/мл ЛЕ.

Дослідження утворення активних метаболітів кисню. Більшість антрациклінів викликають оксидативний стрес клітини через утворення активних метаболітів кисню (AMK). Для з'ясування можливості залучення AMK у механізмах дії ЛЕ був використаний відомий поглинач радикалів N-ацетил-цистеїн (NAC). Встановлено, що 30-хвилинна інкубація клітин із NАС та подальше культивування клітин лінії KB-3-1 із ЛЕ (24 год) призводять до суттєвого пригнічення антипроліферативної дії ЛE (рис. 3А). Цей ефект був навіть більш вираженим, аніж при використанні блеоміцину, який застосовували як позитивний контроль у цих експериментах.

Для визначення рівня внутрішньоклітинних АМК використовували нефлуоресцентний барвник карбокси-H₂-DCF-DA, який, проникаючи в клітини, деацетилюється естеразами за присутності неспецифічних AMK, причому окислюючись, відновлений флуоресцеїновий компонент емітує зелене свічення. Дія ЛЕ протягом 1 год на клітини лінії HL-60 (рис. 3Б) призводила до значного дозозалежного зростання (до 4 разів) внутрішньоклітинної флуоресценції. Адріамі-цин у цитотоксичних концентраціях викликав зростання флуоресценції в 2 рази порівняно з контролем.

Зміна вмісту внутрішньоклітинного АТФ під впливом ЛЕ. Інкубація клітин лінії КВ-3-1 із ЛE призводила до дозозалежного зниження вмісту ATФ у клітинах (рис. 4). Аналіз даних, отриманих з використанням MTT-тесту, дозволив зробити припущення про порушення енергетичного метаболізму пухлинних клітин під впливом ЛЕ.

Індукція розщеплення ензиму репарації ДНК PARP-1. Відомо, що апоптоз характеризується впорядкованою послідовністю подій, що призводять до активації каспазного каскаду в клітинах-мішенях. Каспази - це протеази, які після активації, розщеплюють білки, необхідні для забезпечення життєдіяльності клітини. Для дослідження процесів, що відбуваються під впливом ЛЕ і призводять до загибелі пухлинних клітин, зокрема за посередництва ефекторних каспаз-3, -7 і субстрату каспаз - репараційного ензиму PARP-1 (полі(АДФ-рибозил) полімерази), була досліджена експресія цих білків в клітинах ліній КВ-3-1 і А549 за допомогою Вестерн-блот аналізу. Використовуючи антитіла, специфічні до прокаспаз і активних форм цих білків, відмічено зміни рівня експресії як інтактних, так і активних форм каспаз, які задіяні в процесах апоптозу. Після 24 год інкубації клітин із ЛE на електрофореграмі було виявлено активну форму каспази-3 (17 кДа), причому чітко спостерігалось дозозалежне зростання рівня експресії цього білка. Крім того, констатовано появу продукту розщеплення прокаспази-7, що відповідає її активній формі з масою 20 кДa. Також при дії ЛЕ було виявлено появу фрагментів PARP-1 із молекулярною масою 89 кДа і 24 кДа, що свідчить про ензиматичну активність каспаз-3 і -7 (рис. 5).

Дія ЛЕ на пухлинні клітини з різними типами резистентності до хіміотерапевтичних препаратів. Для з'ясування впливу ABC-транспортерів на активність ЛE щодо резистентних клітинних ліній, в яких чутливість до деяких препаратів зменшується в десятки й сотні разів у порівнянні з вихідною клітинною лінією, нами було протестовано клітини, поява резистентності в яких обумовлена різними механізмами, а саме надекспресією MRP1, P-gp чи BCRP білків. Досліджено 13 клітинних ліній пухлин (табл. 2), включаючи як резистентні, так і вихідні чутливі лінії клітин. Крім того, досліджували вплив набутої резистентності на дію ЛЕ у порівнянні з дією інших антрациклінових протипухлинних препаратів, зокрема адріаміцину, мітоксантрону і дауноміцину.

Встановлено, що надекспресія P-gp та MRP1 незначно знижувала антипроліферативну активність ЛE, що проявлялося у 1,5-2,5 - кратному збільшенні значення IC₅₀ для клітинних ліній, резистентність яких обумовлена відповідною надекспресією цих білків. У той же час, ці лінії клітин були надзвичайно стійкими до дії адріаміцину, а значення IC₅₀ було у 20 (для клітин 2R120 та 2R160) - 162 рази (для клітин KB-C-1) більшим порівняно з відповідними величинами для вихідних ліній клітин. Клітинна лінія MCF-7/bcrр із надекспресією BCRP виявилась однаково чутливою до дії ЛЕ (ІС₅₀ 1,39±0,18 мкг/мл), як і відповідна вихідна лінія клітин MCF-7 (ІС₅₀ 1,38±0,18 мкг/мл). І це при тому, що для клітин аденокарциноми молочної залози лінії MCF-7/bcrp характерним є підвищений більш як у 1000 разів рівень резистентності до дії мітоксантрону в порівнянні з вихідною клітинною лінією MCF-7. Подібні результати були отримані при тестуванні ще двох клітинних ліній аденокарциноми молочної залози - MDA-MB-231 і резистентної клітинної лінії MDA-MB-231/bcrp (з надекспресією білків BCRP). Ці клітинні лінії виявились найбільш чутливими до цитотоксичної дії ЛЕ (ІС₅₀ 0,77±0,03 та 0,79±0,01 мкг/мл, відповідно).

Вплив інгібіторів ABC-транспортерів на цитотоксичність ЛE. При виникненні множинної резистентності до протипухлинних препаратів у клінічній практиці застосовують інгібітори АВС-транспортерів. У нашій роботі було досліджено вплив інгібіторів P-gp, MRP1 і BCRP-білків на антипроліферативну активність ЛЕ. Верапаміл, який є блокатором кальцієвих каналів, як і очікувалося, у концентрації 10 мкг/мл був надзвичайно ефективним у відновленні чутливості до дауноміцину резистентних клітин аденокарциноми легені людини ліній 2R120 і 2R160, що надекспресують білки MRP1, LRP і P-gp, відповідно, вихідною лінією для яких є лінія SW1573. Верапаміл не впливав на дію ЛЕ щодо клітин усіх трьох досліджуваних ліній (рис. 6). Коінкубація клітин (MDA-MB-231/bcrp), що надекспресують BCRP, із відомими інгібіторами іматинібом і гефітинібом (10 мкг/мл) також не мала впливу на високу антипроліферативну активність ЛE. Коли ж до інкубаційного середовища разом із протипухлинним препаратом мітоксантроном вносили інгібітори білків BCRР, відбувалося повне відновлення чутливості резистентної клітинної лінії (MDA-MB-231/bcrp), яка була без застосування інгібіторів в десятки разів стійкішою у порівнянні з вихідною клітинною лінією MDA-MB-231.

Таким чином, виявлено, що надекспресія білків підродин ABCB1 (P-gp ) і ABCC1 (MRP1) мала незначний вплив на антипроліферативну активність ЛЕ у порівнянні з вихідною лінією клітин. Очевидно, що білки підродини ABCG2 (BCRP) не беруть участі в експорті ЛЕ з пухлинних клітин, про що свідчить відсутність різниці в дії ЛЕ на клітини сублінії з надекспресією BCRP та клітини вихідної лінії.

ВИСНОВКИ

У дисертаційній роботі вперше охарактеризовано молекулярні механізми дії на пухлинні клітини нового ангуциклінового антибіотика ландоміцину Е. Встановлено, що цей препарат індукує апоптоз у пухлинних клітинах, які характеризуються різними механізмами резистентності до хіміотерапевтичних препаратів.

1. Ландоміцин Е залежно від дози та тривалості дії пригнічує проліферацію пухлинних клітин різного тканинного походження. Концентрації цього препарату, що інгібують проліферацію клітин на 50% у порівнянні з контролем (ІС₅₀), знаходились у діапазоні від 0,37±0,08 мкг/мл (клітини лінії МDА-MB-468 аденокарциноми молочної залози) до 15,04±2,65 мкг/мл (клітини лінії CCL-64 епітелію норки). Концентрації, при яких індукується антипроліферативна активність ландоміцину Е, суттєво не відрізняються від таких концентрацій інших відомих протипухлинних препаратів - адріаміцину, флуороурацилу, цисплатину, метотрексату та вінкристину.

2. Ландоміцин Е індукує загибель клітин шляхом апоптозу, на що вказують такі морфологічні ознаки як конденсація та фрагментація хроматину, утворення апоптотичних тілець, фрагментація клітин. Ландоміцин Е в концентрації 1 мгк/мл в клітинах КВ-3-1 карциноми шийки матки через 24 год викликає порушення процесів мітозу.

3. Ландоміцин Е не інтеркалює в структуру ДНК, інгібує синтез ДНК, впливає на клітинний цикл, спричиняє міжнуклеосомну фрагментацію ДНК.

4. Ландоміцин Е індукує зниження трансмембранного мітохондріального потенціалу та внутрішньоклітинного вмісту АТФ в пухлинних клітинах.

5. Антипроліферативний ефект ландоміцину Е на клітини обумовлений утворенням активних метаболітів кисню.

6. Дія ландоміцину Е спричиняє активацію ефекторних каспаз-3 і -7 та утворення розщепленої форми їхнього субстрату - репараційного ензиму PARP-1 в пухлинних клітинах.

7. Ландоміцин Е інгібує проліферацію та індукує апоптоз у пухлинних клітинах, резистентних до адріаміцину, дауноміцину та мітоксантрону, що зумовлено надекспресією транспортних білків родини АВС, таких як P-gp, MRP1 та BCRP.

СПИСОК ПублікаціЙ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Korynevska A.V. In vitro study of landomycin E antitumor activity / A.V. Korynevska, B.P. Matselyukh, R.S. Stoika // Experimental Oncology. - 2003. - Т. 25. - Р.98-105. (Дисертант брала участь у підготовці та проведенні всіх дослідів, пошуку та аналізі даних літератури, написанні та підготовці статті до друку).

2. Дослідження механізмів дії ландоміцину Е на клітини ссавців / Р.Р. Панчук., А.В. Кориневська, Ю.Л. Осип, Б.О. Осташ, В.О. Федоренко, Р.С. Стойка // Вісник Львів. ун-ту. Серія біол. - 2004. - Т. 35. - С. 54-59. (Дисертантом проведено всю роботу з культурою клітин, дослідження по резистентності до ЛЕ і адріаміцину, участь у аналізі результатів та написання статті).

3. Mechanisms underlying the anticancer activities of the angucycline landomycin E / A. Korynevska, P. Heffeter, B. Matselyukh, L. Elbling, M. Micksche, R. Stoika, W. Berger // Biochemісаl Pharmacology. - 2007. - V. 74, № 12. - P. 1713-1726. (Дисертант брала участь у підготовці та проведенні всіх дослідів, пошуку та аналізі даних літератури, написанні та підготовці статті до друку).

4. Кориневська А.В. Дія ландоміцину Е на пухлинні клітини з різними механізмами резистентності до хіміотерапевтичних препаратів / А.В. Кориневська, Р.С. Стойка // Клінічна та експериментальна патологія. - 2007. - Т.6, №3. - С. 140-143. (Дисертант брала участь у підготовці та проведенні всіх дослідів, пошуку та аналізі даних літератури, написанні та підготовці статті до друку).

5. Chemistry and Biology of Landomycins, an Expanding Family of Polyketide Natural Products / B. Ostash, A. Korynevska, R. Stoika, V. Fedorenko // Mini-Reviews in Medicinal Chemistry. - 2009. - V. 9, №.9. - P. 1040-1051. (Дисертант брала участь у проведенні дослідів, пошуку та аналізі даних літератури, написанні статті).

6. Antitumor activity of landomycin E: in vitro study / A.V. Korynevska, B.P. Мatselyukh, R.R. Panchuk, R.S Stoika. // International Weigl Microbiological Conference, September 9-11, 2003: Abstract book. - Lviv, 2003. - Р.60.

7. In vitro study of landomycin E effect on mammalian tumor cells / A.V. Korynevska, R.R. Panchuk, B.P. Matselyukh, R.S. Stoika // VI Conference of young oncologists of Ukraine, December 4-5, 2003. Abstract book. - Kyiv, 2004. - Р.47.

8. Cellular and molecular mechanisms of landomycin E antineoplastic action / A.V. Korynevska, R.R. Panchuk, B.O. Ostash, V.O. Fedorenko, R.S. Stoika // First (Inaugural) Ukrainian Congress for Cell Biology, April 25-28, 2004: Abstract book. Lviv, 2004. - Р.138.

9. Панчук Р.Р. Ландоміцин Е викликає апоптоз у пухлинних клітинах, впливаючи на регуляторну систему трансформуючого фактора росту , але не володіючи ДНК-тропнісню / Р.Р. Панчук, А.В. Кориневська, Р.С. Стойка // Перша Міжнародна наукова конференція студентів та аспірантів, Львів, 11-14 квіт. 2005: тези доповідей - Львів, 2005. - С.115.

10. Korynevska A.V. Similar cytotoxic action of landomycin E and adriamycin towards tumor cells does not correlate with their different ability to interact with DNA / A.V. Korynevska, R.R. Panchuk, R.S. Stoika // Український біохімічний журнал.- 2005.- Т.77, №2.- (Спеціальний випуск): 5^th Parnas Conference, - Kyiv, April 26-29, 2005: - Kyiv, 2005. - С.138.

11. Mechanisms of anticancer activity of landomycin E / A.V. Korynevska, P. Heffeter, B.P. Matselyukh, W. Berger, M. Micksche // 1Х Український біохімічний з'їзд, 24-27 жовт. 2006: тези доповідей. Харків, 2006. - Т.2, - С.71.

12. Mechanisms of anticancer action of landomycin E / A.V. Korynevska, P. Heffeter, W. Berger, M. Micksche, R.S. Stoika // Oncology (Special issue): Матеріали Всеукраїнської науково-практичної конференції з міжнародною участю “Молекулярні основи і клінічні проблеми резистентності до лікарських засобів”. - Київ. 2-3 лист., 2006.- С.74.

13. Study of antitumor properties of landomycin E effect towards tumor cells / A.V. Korynevska, P. Heffeter, M. Micksche, W. Berger, R.S. Stoika // 2^nd Ukrainian Congress for Cell Biology, October 23-26, 2007: Abstract book. - Kyiv, 2007. - Р. 122.

анотація

Кориневська А.В. Механізми цитотоксичної дії ландоміцину Е на пухлинні клітини in vitro. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 14.01.07 - онкологія. - Інститут експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є.Кавецького НАН України, Київ, 2009.

Дисертація присвячена вивченню механізмів дії нового ангуциклінового антибіотика ландоміцину Е (ЛЕ) на клітини пухлинних ліній різного тканинного і видового походження.

Показано, що концентрація препарату, що викликає інгібування проліферації клітин (ІС₅₀) знаходиться в діапазоні від 0,37±0,08 мкг/мл (клітини лінії МDА-МВ-468 аденокарциноми молочної залози) до 15,04±2,65 мкг/мл (клітини лінії CCL-64 епітелію легені норки). Проведено порівняльний аналіз активності ЛЕ щодо відомих протипухлинних препаратів (адріаміцину, метотрексату, цисплатину, вінкристину, флуороурацилу) на пухлинних клітинах трьох ліній (MCF-7, SW-480 і T47D). Показано, що при концентраціях 0,1-10 мкг/мл антипроліферативна активність ЛЕ суттєво не відрізнялась від такої у порівнюваних препаратів.

Доведено загибель пухлинних клітин шляхом апоптозу під впливом ЛЕ. Показано, що апоптотична дія ЛЕ відбувається за участі мітохондріального сигнального шляху й обумовлена генерацією активних метаболітів кисню, запуском каспазного каскаду за участі каспази-3 та -7, що призводить до розщеплення репараційного ензиму PARP-1.

Показано, що зниження чутливості до ЛЕ клітин, які резистентні до протипухлинних препаратів (адріаміцину, мітоксантрону, дауноміцину) внаслідок надекспресії у них білків родини АВС-транспортерів (P-gp, MRP1 і BCRP), відрізнялося не більше як у 2,5 рази у порівнянні з вихідними лініями пухлинних клітин.

Ключові слова: ландоміцин Е, пухлинні клітини, апоптоз, активні метаболіти кисню, каспази, PARP-1, резистентність, P-gp, MRP1, BCRP.

аннотация

Кориневская А.В. Механизмы цитотоксического действия ландомицина Е на опухолевые клетки in vitro. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 14.01.07 - онкология. - Институт экспериментальной патологии, онкологии и радиобиологии им. Р.Е.Кавецкого НАН Украины, Киев, 2009.

Диссертация посвящена изучению механизмов действия ландомицина Е (ЛЕ)- нового ангуциклинового антибиотика, продуцируемого Streptomyces globisporus, на опухолевые клетки перевиваемых линий разного тканевого и видового происхождения.

Показано, что концентрация препарата, вызывающая 50% ингибирование пролиферации клеток (ІС₅₀), находится в диапазоне от 0,37±0,08 мкг/мл (клетки линии МDА-МВ-468 аденокарциномы молочной железы) до 15,04±2,65 мкг/мл (клетки линии CCL-64 эпителия легкого норки).

Проведен сравнительный анализ активности ЛЕ и противопухолевых препаратов (адриамицина, метотрексата, цисплатина, винкристина, флуороурацила) на трёх линиях опухолевых клеток (MCF-7, SW-480 и T47D). Показано, что при концентрациях 0,1-10 мкг/мл антипролиферативная активность ЛЕ существенно не отличалась от таковой у сравниваемых препаратов.

Цитоморфологическими исследованиями (окрашивание препаратов акридин оранжевым, по Романовскому-Гимза, DAPI) доказано, что гибель опухолевых клеток под влиянием ЛЕ сопровождается появлением характерных признаков апоптоза: конденсацией и фрагментацией хроматина, образованием апоптотических телец, фрагментацией клеток. Нарушение процессов митоза в клетках КВ-3-1 фиксировали при концентрации ЛЕ 1 мкг/мл. Междунуклеосомная фрагментация ДНК клеток L1210 и KB-3-1 также свидетельствует об их апоптотической гибели, обусловленной действием ЛЕ.

Сравнительный анализ влияния ЛЕ и адриамицина на физико-химическую структуру ДНК показал, что ЛЕ не интеркалирует в структуру ДНК, что может быть объяснено ангулярной структурой молекулы ЛЕ.

Изучение влияния ЛЕ на синтез ДНК показало, что уже через сутки инкубации клеток линии КВ-3-1 с 1 мкг/мл ЛЕ наблюдается 50% уменьшение включения ³Н-тимидина в структуру ДНК. При действии ЛЕ в концентрации 2 мкг/мл на лейкемические клетки резистентных линий HL-60/adr и HL-60/vinc наблюдали появление характерного для апоптоза пика в пре-G₁ фазе клеточного цикла.

В опытах с окрашиванием опухолевых клеток родамином 123 и JC-1 продемонстрирован быстрый (уже через 1 час) разрушительный эффект ЛЕ на целостность митохондрий, который сопровождался падением мембранного потенциала и уменьшением содержания внутриклеточного АТФ.

Показано, что процессы апоптотической гибели опухолевых клеток происходят по митохондриальному сигнальному пути и обусловлены образованием активных форм кислорода, запуском каспазного каскада с участием каспаз-3 и -7, что ведет к расщеплению их субстрата - репарационного энзима PARP-1.

Исследовано влияние приобретенной резистентности на действие ЛЕ в сравнении с действием других антрациклиновых противоопухолевых препаратов (адриамицина, митоксантрона и дауномицина). Показано, что гиперэкспрессия белков P-gp- и MRP1 незначительно снижала антипролиферативную активность ЛЕ, что выражалось в 1,5-2,5-кратном увеличении значения IC₅₀ для резистентных линий клеток. Клеточная линия MCF-7/bcrр с гиперэкспрессией BCRP оказалась одинаково чувствительной к действию ЛЕ (ІС₅₀ - 1,39±0,18 мкг/мл), как и материнская линия клеток MCF-7 (ІС₅₀ - 1,38±0,17 мкг/мл), при этом для резистентной линии клеток характерно 1000 кратное понижение чувствительности к действию митоксантрона по сравнению с исходной клеточной линией. Подобные результаты были получены при тестировании еще двух клеточных линий метастазирующей аденокарциномы молочной железы человека - MDA-MB-231 и резистентной клеточной линии MDA-MB-231/bcrp. Эти клеточные линии оказались наиболее чувствительными к цитотоксическому действию ЛЕ (ІС₅₀ - 0,77±0,03 и 0,79 ± 0,01 мкг/мл, соответственно).

При исследовании влияния ингибиторов АВС-транспортеров на антипролиферативную активность ЛЕ было показано, что верапамил в концентрации 10 мкг/мл, будучи эффективным при восстановлении чувствительности к дауномицину резистентных клеток аденокарциномы легких человека линий 2R120 и 2R160, которые гиперэкспрессируют белки MRP1, LRP и

P-gp, соответственно, не влиял на действие ЛЕ. Коинкубация клеток MDA-MB-231/bcrp (гиперэкспрессия BCRP) с иматинибом или гефитинибом (10 мкг/мл) тоже не влияла на антипролиферативную активность ЛЕ.

Ключевые слова: ландомицин Е, опухолевые клетки, апоптоз, активные формы кислорода, каспазы, PARP-1, резистентность, P-gp, MRP1, BCRP.

Summary

Korynevska A.V. Mechanisms of cytotoxic activity of landomycin E towards tumor cells in vitro. - Manuscript.

Thesis for a Philosophy Doctor (PhD) degree in Biology, speciality 14.01.07 - oncology. - R.E.Kavetsky Institute of Experimental Pathology, Oncology and Radiobiology of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2009.

The thesis is devoted to a study of the mechanisms of cytotoxic properties towards a wide range of mammalian tumor cell lines of the anthracycline-related angucycline landomycin E (LE) produced by Streptomyces globisporus.

The range of susceptibility of cell lines under study to LE (IC₅₀ values) varied from 0.37±0.08 µg/ml (MDA-MB-468-human breast adenocarcinoma cells) to 15.04±2.65 µg/ml (CCl-64 - mink lung epithelial cells). Dose dependent growth-inhibiting effects of LE in different tumor cell lines (MCF-7, SW-480 and T47D) were compared with that of other anticancer drugs (adriamycin, cisplatin, methotrexat, vincristine and fluorouracil).

LE treatment resulted in the typical cytomorphological signs of programmed cell death (cell shrinkage, chromatin condensation and formation of apoptotic bodies), apoptotic DNA fragmentation and profound intracellular oxidative stress confirmed by radical scavenger (NAC) pre-treatment and DCF-DA staining experiments.

Apoptotic cell death induced by LE was further confirmed by caspase-(3 and -7) dependent cleavage of PARP-1, and by intensive mitochondrial membrane depolarisation (JC-1 and rhodamine 123 staining) detected as soon as in 1 h after exposure to the drug. Moreover, incubation with LE led to reduced intracellular ATP pools suggesting LE-induced apoptotic cell death as a consequence of rapid mitochondrial damage.

Since drug resistance is a common problem in cancer therapy, we also investigated the influence of ABCB1 (P-gp), ABCC1 (MRP1) and ABCG2 (BCRP) overexpression on the antiproliferative activity of LE. In contrast to adriamycin, daunomycin and mitoxantrone, LE is only a weak substrate for P-gp and MRP1 (up to 2.5 times less sensitivity to the tumor cell lines with MDR comparatively to the wild type of cell lines), and is not transported by BCRP.

Key words: landomycin E, tumor cell lines, apoptosis, mitochondria, ROS, caspases, PARP-1, MDR, P-gp, MRP1, BCRP.

Підписано до друку 9.09.2009

Формат 60х90 1/16. Папір офсетний.

Друк на різографі. Умовн. друк. арк. 1,5.Обл.-видав.арк.0,89

Тираж 100 прим. Зам. 90675.

Полаграфічний центр

Видавництва Національного університету “Львівська політехніка”

вул. Ф.Колеси, 2, 79000, Львів

Размещено на Allbest.ru