Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЇ ПАТОЛОГІЇ, ОНКОЛОГІЇ І РАДІОБІОЛОГІЇ ім. Р.Є. КАВЕЦЬКОГО

УДК: 616-006.6:576.385

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Рівень гіпоксії у злоякісних пухлинах та оцінка його прогностичного значення (експериментально-клінічне дослідження)

14.01.07 - онкологія

КОВЕЛЬСЬКА АНТОНІНА ВАСИЛІВНА

Київ - 2009

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України.

Науковий керівник - доктор медичних наук, професор

Осинський Сергій Петрович,

Інститут експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України, завідувач відділу мікрооточення пухлинних клітин.

Офіційні опоненти: -доктор біологічних наук, професор

Орел Валерій Еммануїлович,

Національний інститут раку МОЗ України,

завідувач лабораторії медичної фізики та біоінженерії;

доктор біологічних наук,

Колотилов Микола Миколайович,

Науково-практичний центр променевої діагностики АМН України, провідний науковий співробітник відділу комп'ютерної і магнітнорезонансної томографії.

Захист дисертації відбудеться 11 листопада 2009 року о 15.00 на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.155.01 в Інституті експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України (03022, м. Київ, вул. Васильківська, 45).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці ІЕПОР ім. Р.Є. Кавецького НАН України.

Автореферат розісланий « » жовтня 2009 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

кандидат біологічних наук Л.М. Шлапацька

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. Результати лікування онкологічних хворих залишаються незадовільними. Незважаючи на певні успіхи як у хірургічній техніці, так і в ад'ювантній системній терапії, продовжують зростати показники смертності, що спричинено раннім розвитком метастазів. Вирішення проблеми метастазування потребує визначення молекулярних та біологічних характеристик первинної пухлини, які відповідають за реалізацію найхарактерніших рис новоутворення, а саме здатності до інвазії та метастазування.

Існують експериментальні та клінічні докази того, що гіпоксія солідних пухлин, тобто низький рівень оксигенації, чинить вплив на їх ріст, посилює злоякісну прогресію, зокрема метастатичний потенціал, а також зменшує чутливість до хіміотерапевтичних заходів та іонізуючої радіації (Tatum J. L. et al., 2006; Vaupel P., Mayer A., 2007; Vaupel P., 2008). Гіпоксія розглядається сьогодні як ключовий фактор патогенезу злоякісних новоутворень. Показано, що низька величина парціального тиску кисню (рО₂), тобто високий рівень гіпоксії, та підвищення рівня експресії гіпоксія-асоційованих білків у пухлині вказують на несприятливий перебіг захворювання (Mayer A., Hockel M., Vaupel P., 2008). Результати клінічних спостережень дозволили запропонувати використання рівня гіпоксії та експресії гіпоксія-асоційованих білків у якості прогностичних маркерів (Loncaster J.A. et al., 2001; Airley R.E. et al., 2003; Le Q-T. еt al., 2007). Гіпоксія оцінюється прямим вимірюванням величини рО₂ у пухлині полярографічними мікроелектродами, що слугує за своєрідний “золотий стандарт” визначення рівня оксигенації біологічних тканин (Vaupel P., Hockel M., Mayer A., 2007). В той же час цей метод має певні обмеження, головне з яких пов'язане з недоступністю багатьох пухлин для введення мікроелектродів. Існують імуногістохімічні (ІГХ) методи оцінки рівня гіпоксії за допомогою визначення експресії екзогенних та ендогенних маркерів гіпоксії. До перших відноситься пімонідазол, який після введення в організм накопичується у тканинах з низьким рівнем оксигенації і метаболізує у субстанцію, яка фіксується ІГХ методом (Bussink J. еt al., 2003). Цей метод обмежується необхідністю внутрішньовенного введення пімонідазолу до оперативного втручання або взяття біопсії (Evans S.M., Koch C.J., 2003; Bussink J. еt al., 2003). Використання ендогенних маркерів, до яких відносяться так звані гіпоксія-асоційовані білки, набуло широкого розповсюдження, але вони не завжди регулюються виключно гіпоксією (Evans S.M., Koch C.J., 2003).

В останні десятиріччя поширення набув метод ядерного магнітного резонансу (ЯМР) як інформативний метод дослідження біологічних об'єктів in vitro та in vivo. Останній метод у поєднанні з магнітно-резонансною томографією (МРТ) широко застосовується в біології та медицині і дає можливість неінвазивно визначати місце знаходження та об'єм пухлини, здійснювати моніторинг цілої низки важливих метаболітів і за зміною їх рівня оцінювати ефективність запровадженої терапії (Cheng L.L. et al., 2005; Knopp M.V. et al., 2003; Evelboch J. еt al., 2005). При дослідженнях in vitro метод ³¹Р ЯМР спектроскопії дозволяє проаналізувати рівень в клітині всіх фосфоровмісних сполук, включаючи фракцію водорозчинних фосфоліпідів.

За допомогою метаболічних показників є можливість оцінити біоенергетичний статус пухлинної тканини, а оскільки метаболічний обмін в тканині адаптується до рівня її оксигенації, то зміни цих показників свідчать про рівень гіпоксії (Rofstad E.K. et al., 1988; Vaupel P. еt al., 1989). Об'єктом досліджень при ³¹Р ЯМР спектроскопії in vitro можуть слугувати перхлорні екстракти (ПХЕ) тканин або клітин, самі клітини та кров.

Існує тісний взаємозв'язок між біоенергетикою та оксигенацією в пухлинній тканині. Вивчаючи біоенергетику та метаболічний статус перещеплюваних пухлин мишей за допомогою ³¹Р ЯМР спектроскопії, було встановлено, що співвідношення Pi/PCr, Pi/вNTP, де Рі - фосфор неорганічний, PCr - фосфокреатин, вNTP - в-аденозинтрифосфат, корелюють з величиною рО₂ (Vaupel P.et al., 1989). Показано їх використання для оцінки енергетичного статусу і рівня гіпоксії в тканині (Li S-J. еt al., 1988). Проте, так як у клінічній практиці, як правило, фахівці мають справу з розвиненими пухлинами, в яких рівні PCr та/або вNTP часто знижуються до невимірюваних величин, для оцінки біоенергетичного статусу тканини і рівня її гіпоксії вельми цінним є такий метаболічний показник, як PME/Pi, де РМЕ - фосфомоноефіри, який є дуже чутливим до рівня тканинної оксигенації. Більш того, визначена достовірна кореляція між величиною рО₂ і даним співвідношенням, що вперше було встановлено в експерименті з фібросаркомою FSaII у мишей (Vaupel P. еt al., 1989).

¹Н ЯМР спектри дають можливість оцінити рівні таких важливих сполук, як лактат, холін та холінпохідні сполуки, які є маркерами пухлинної прогресії (Leach M.O. et al., 1996; Zakian K.L. et al., 2003; Back H-M. еt al., 2008). Визнання лактату як маркера пухлинної прогресії є результатом багаторічних досліджень, які остаточно встановили, що посилений аеробний гліколіз у пухлині, відомий ще з ранніх робіт O. Warburg, є феноменом, притаманним злоякісним новоутворенням. В низці робіт показано, що в первинних пухлинах шийки матки (Walenta S. еt al., 2000), голови та шиї (Brizel D.M. et al., 2001), колоректальних карциномах (Walenta S., et al., 2003) різко зростає вміст лактату. Встановлено, що високий вміст лактату корелює з більшою частотою утворення як віддалених метастазів, так і невисокими показниками виживаності хворих (Walenta S., Mueller-Klieser W.F., 2004). Висловлено припущення, що вміст лактату у первинній пухлині може бути основою нової метаболічної класифікації пухлин, яка буде сприяти підвищенню ефективності лікування онкологічних хворих (Walenta S. et al., 2004).

Виходячи з вищенаведеного, стає зрозумілим необхідність та важливість проведення дослідження, метою якого є оцінка стану оксигенації злоякісних пухлин за допомогою ³¹Р ЯМР спектроскопії з використанням співвідношення PME/Pi у якості показника рівня гіпоксії пухлини, здійснення порівняльного аналізу методів визначення вмісту лактату у пухлині біохімічним методом і за допомогою ¹Н ЯМР спектроскопії, виявлення взаємозв'язку між вищезгаданими показниками метаболізму пухлини, встановлення їх клінічного значення та можливості використання в якості прогностичних маркерів.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами.

Дисертаційна робота виконана в Інституті експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України у відділі мікрооточення пухлинних клітин у відповідності з планами науково-дослідних робіт Інституту як фрагмент теми 2.2.5.230 “Експресія матриксних металопротеіназ і гіпоксія-індукованого фактору у злоякісних пухлинах шлунка та підшлункової залози: вплив на метастазування і перебіг захворювання” (2002-2004 рр., № державної реєстрації 0102U000393), теми 2.2.5.263 “Експресія гіпоксія-асоційованих білків у пухлинній тканині та їхня роль у появі циркулюючих пухлинних клітин: вплив на злоякісну прогресію” (2005-2007 рр., № державної реєстрації 0104U009842) та в рамках програми “Особливості функціонування онкогеному” як фрагмент теми “Експресія васкулярного ендотеліального фактору росту та її зв'язок з гіпоксія-індукованим фактором у злоякісних пухлинах підшлункової залози та шлунка: вплив на ангіогенез та метастазування” (2002-2006 рр., № державної реєстрації 0102U003228).

Мета дослідження. Встановити характер впливу гіпоксії пухлини на злоякісну прогресію та визначити фактори прогнозу перебігу раку шлунка людини, які асоційовані з гіпоксією.

Задачі дослідження.

1. Визначити рівень гіпоксії карциноми легені Льюїс (3LL) у динаміці її росту за допомогою ³¹Р ЯМР спектроскопії перхлорних екстрактів (ПХЕ) тканини.

2. Визначити рівень гіпоксії у пухлинній тканині та оточуючій її “нормальній” слизовій оболонці хворих на рак шлунка (РШ), використовуючи ³¹Р-ЯМР спектроскопію ПХЕ тканини.

3. Обґрунтувати інформативність використання ³¹Р ЯМР спектроскопії ПХЕ тканини для оцінки рівня її гіпоксії.

4. Визначити вміст лактату у пухлині біохімічним методом і ¹Н ЯМР спектроскопією ПХЕ тканини та оцінити його інформативність як маркеру прогнозу перебігу захворювання.

5. Виявити наявність кореляції рівня гіпоксії пухлини з клініко-патологічними характеристиками хворих та визначити прогностичне значення факторів, асоційованих з гіпоксією.

Об'єкт дослідження: тканина РШ та оточуюча її “нормальна” слизова оболонка шлунка, тканина раку шийки матки (РШМ), карцинома 3LL мишей С₅₇Bl/6. рак шлунок гіпоксія спектроскопія

Предмет дослідження: ЯМР спектроскопічні та біохімічні характеристики метаболізму тканини, гіпоксія-асоційовані білки.

Методи дослідження: ³¹Р та ¹Н ЯМР спектроскопія, методи ІГХ (виявлення експресії ендогенного маркеру гіпоксії СА-9 (карбоангідраза вуглецевої кислоти 9), біохімії (визначення вмісту лактату) та статистичні.

Наукова новизна отриманих результатів. Встановлено пряму кореляцію рівня гіпоксії первинної пухлини (карцинома 3LL) з її агресивністю, зокрема з активністю метастазування.

Вперше визначена можливість оцінки рівня гіпоксії пухлинних та нормальних тканин людини за допомогою співвідношення PME/Pi, яке визначається методом ³¹Р ЯМР спектроскопії ПХЕ тканини.

Визначено, що РШ людини за станом його оксигенації може бути поділений на три групи: пухлини з глибокою гіпоксією - 29% новоутворень, помірною - 58% та слабкою - 13%.

Вперше доведено, що глибока гіпоксія РШ є фактором несприятливого прогнозу, зокрема, у хворих з категорією N₀, у яких ризик смерті зростає більш, ніж вдвічі.

Виявлено пряму кореляцію між співвідношенням Lac/Cr (лактат/креатин), визначеним ¹Н ЯМР спектроскопією ПХЕ тканини, та стадіями розвитку пухлинного процесу.

За умов глибокої гіпоксії (PME/Pi<1,0) в тканині РШ виявлений зворотній кореляційний зв'язок між рівнем гіпоксії та вмістом лактату.

Вставлено, що співвідношення PME/Pi та Lac/Cr можуть слугувати маркерами прогнозу перебігу захворювання.

Практичне значення отриманих результатів. Метод ³¹Р ЯМР спектроскопії ПХЕ тканин (нормальної та пухлинної) може застосовуватись для оцінки рівня тканинної гіпоксії. Співвідношення PME/Pi (³¹Р ЯМР спектроскопія) та Lac/Cr (¹Н ЯМР спектроскопія) у пухлинній тканині можуть бути використані у клініці в якості прогностичних маркерів. ³¹Р та ¹Н ЯМР спектроскопія ПХЕ пухлинної тканини, отриманої під час оперативного втручання, і ³¹Р та ¹Н ЯМР спектроскопія in vivo може бути впроваджена при прогнозуванні перебігу захворювання і моніторингу лікування.

Особистий внесок здобувача. Дисертантом визначена мета та завдання даного дослідження, проаналізована наукова література з обраної теми, здійснено планування та виконання експерименту на мишах з карциномою легені Льюїс, самостійно виконана обробка ЯМР спектрів та дана їх інтерпретація. ЯМР спектроскопія проведена в ІЕПОР НАН України (карцинома легені Льюїс) та в Центрі колективного користування науковим обладнанням “ЯМР спектроскопія” на базі Інституту металофізики ім. Г.В. Курдюмова НАН України (пухлини людини). Дисертант самостійно провів статистичну обробку отриманих результатів, сформулював висновки та основні положення дисертаційної роботи, підготував ілюстративний матеріал.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації були представлені та обговорені на: VI Міжнародній конференції молодих онкологів ”Сучасні проблеми експериментальної та клінічної онкології” (Київ, 2003), III съезде онкологов и радиологов СНГ (Минск, 2004), 22nd Annual Meeting of the Eur. Soc. Hyperthermic Oncology (Graz, 2005), VIІ Міжнародній конференції молодих онкологів “Сучасні проблеми експериментальної та клінічної онкології” (Київ, 2006), XI з'їзді онкологів України (Судак, 2006), IV съезде онкологов и радиологов СНГ (Баку, 2006), ІХ Міжнародній конференції молодих онкологів “Сучасні проблеми експериментальної та клінічної онкології” (Київ, 2008), Міжнародній конференції “Tumor Hypoxia and Malignant Progression” (Київ, 2008), Міжнародній конференції “Cancer Immunotherapy&Immunomonitoring (CITIM)” (Київ, 2009).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 18 наукових праць, з яких 4 статті у провідних фахових виданнях, затверджених ВАК України, 1 патент на корисну модель та 13 тез у матеріалах вітчизняних та міжнародних конференцій, конгресів та з'їздів.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота викладена на 125 сторінках машинописного тексту і складається із вступу, огляду літератури, розділів матеріалів і методів дослідження, власних досліджень та їх обговорення, аналізу та узагальнення результатів дослідження, висновків та списку використаної літератури, який включає 152 посилання, у тому числі 144 зарубіжних авторів. Дисертаційна робота ілюстрована 25 рисунками та 17 таблицями.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи дослідження. Дослідження проведені на 195 мишах лінії С₅₇Bl/6 (самки, маса 22-25 г) розведення віварію ІЕПОР ім. Р.Є. Кавецького НАН України з перещепленою карциномою 3LL (внутрішньом'язово, 0,5x10⁶ клітин на тварину). Усі досліди на тваринах здійснювались згідно вимогам регіонального Комітету з етики роботи з піддослідними тваринами та з додержанням правил роботи з лабораторними тваринами.

Розмір пухлини вимірювали 5 разів на тиждень. Об'єм пухлини визначали за загальноприйнятою формулою об'єму еліпсоїду.

Тварини були розподілені на 7 експериментальних груп в залежності від доби після перещеплення, коли пухлини були використані у дослідженні: 1 група - 12 доба (об'єм пухлини 0,4 ± 0,1 см³); 2 - 14 доба (0,8 ± 0,2 см³) ; 3 - 16 доба (0,9 ± 0,2 см³); 4 - 18 доба (1,1 ± 0,3 см³); 5 - 21 доба (1,4 ± 0,3 см³); 6 - 24 доба (1,9 ± 0,5 см³) та 7 - 27 доба (2,3 ± 0,4 см³).

Для ЯМР спектроскопії зразок тканини, що досліджувалась, складав 2,9 г. При невеликих розмірах пухлин для отримання одного тканинного зразка для ³¹Р ЯМР спектроскопії, пухлини одного і того ж об'єму поєднували разом. Для кожної часової точки було отримано від 5 до 7 зразків. Одночасно для кожної експериментальної групи були отримані зразки м'язової тканини.

Хворі, операційний матеріал яких було використано для досліджень, передопераційної терапії не отримували. Матеріал був наданий відділеннями абдомінальної онкології та гінекології Інституту онкології АМН України (нині Національний інститут раку МОЗ України) у період із 2002 по 2006 р. та Міською онкологічною лікарнею м. Києва МОЗ України у період із 2004 по 2007 р. Всі хворі були проінформовані про обстеження та дали згоду на використання хірургічного матеріалу в дослідницьких цілях. Стадія пухлинного процесу (РШ і РШМ) визначалася у відповідності до класифікації пухлин за системою TNM (6 видання, 2002) та FIGO (2006) для РШМ.

Зразки пухлинної тканини були отримані від хворих на РШ (n=118), з них 70 чоловіків і 48 жінок. Середній вік хворих становив 57 ± 0,9 року (віковий діапазон від 31 до 80 років). 13 (11%) пацієнтів становили хворі з І, 27 (23%) - з ІІ, 46 (39%) - з ІІІ, 32 (27%) - з ІV стадією пухлинного процесу.

Крім того, в роботі були дослідженні зразки пухлинної тканини, отримані від хворих на РШМ (n=34). Середній вік хворих становив 43,5 ± 2,9 року (віковий діапазон від 27 до 70 років). Більшість пацієнтів - 16 (47%) склали хворі з І, 9 (26,5%) - з ІІ, 9 (26,5%) - з ІІІ стадією пухлинного процесу.

³¹Р ЯМР спектроскопія проводилась у ПХЕ тканин карциноми 3LL, ³¹Р та ¹Н ЯМР спектроскопія - в ПХЕ операційного матеріалу (тканина РШ, “нормальна” слизова тканина шлунка, тканина РШМ).

³¹Р ЯМР спектри ПХЕ карциноми 3LL реєстрували на спектрометрі Mercury-300BB (Varian, США), ³¹Р та ¹Н ЯМР спектри операційного матеріалу - на спектрометрі Bruker 400 MГц (Widebore Ultrashield, AV-400 electronics, Німеччина). Тринатрієва сіль метилендифосфонієвої кислоти (Sigma) була за внутрішній стандарт (³¹Р ЯМР спектри). Всі ³¹Р хімічні зрушення у спектрах були співвіднесені до сигналу РСr, який був позначений як 0.0 ppm (part per million - міліонна частина). Натрієва сіль 3-(триметилсіліл)пропіонової кислоти слугувала за внутрішній стандарт (0.0 ppm) - для ¹Н ЯМР спектрів. Області сигналів на спектрах вимірювались інтегральним способом, що обчислював прибор.

Для оцінки змін рівня гіпоксії в тканинах використовували співвідношення: Pi/PCr, Pi/вNTP, PME/вNTP та PME/Pi, визначені ³¹Р ЯМР спектроскопією ПХЕ тканини. ³¹Р ЯМР спектри м'язової тканини - спектри нормальної тканини тварин-пухлиноносіїв і одночасно є контролем процедури перхлорної екстракції зразків пухлинної тканини. Для оцінки рівня лактату в тканині РШ використовували співвідношення Lac/Cr, визначене ¹Н ЯМР спектроскопією ПХЕ тканини. Вміст лактату в пухлинах визначали загальновживаним біохімічним методом з використанням лактатдегідрогенази.

Виявлення експресії білку СА-9 на парафінових зрізах тканин РШ та РШМ проводили за допомогою ІГХ методу. В якості первинних антитіл використовували поліклональні кролячі антитіла проти СА-9 (ab15086, “Biozol”, Німеччина). Для візуалізації продукту реакції в ІГХ дослідженнях застосовували EnVision та DAB (Dako Cytomation, Данія).

Результати фарбування оцінювали за A. Mayer та співавт. (2005), а саме: категорія 0 - відсутність фарбування або декілька позитивних клітин ("експресія негативна"); категорія 1 - <10 % позитивних клітин ("низька експресія"); категорія 2 - від 11 % до 50 % позитивних клітин ("помірна експресія"); категорія 3 - > 50 % позитивних клітин ("висока експресія").

Проводилася відповідна статистична обробка отриманих результатів: різницю між показниками оцінювали використовуючи t-критерій Стьюдента. Кореляційний аналіз проводили з використанням коефіцієнтів кореляції Пірсона (r) та Спірмана (r_s). Прогностичне значення показників оцінювали за допомогою пропорційної моделі Cox з використанням ч² тесту та коефіцієнту ризику (Нazard ratio (HR)). Виживаність хворих визначали за методом Kaplan-Meier, розбіжності між кривими виживаності аналізували за допомогою log-rank тесту. Статистична значимість прийнята при р<0,05. Для аналізу та інтерпретації даних використовували пакет прикладних програм NCSS 2000/PASS 2000 та Prism, version 4.0.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Рівень гіпоксії у карциномі 3LL та м'язовій тканині мишей-пухлиноносіїв. Аналіз спектрів первинної тканини (карцинома 3LL) показав, що пухлини невеликого розміру (об'єм <0,4 см³) мали повні профілі всіх фосфоровмісних сполук, але зі збільшенням об'єму пухлин реєструвалося поступове суттєве зниження сигналів PCr та вNТP з одночасним зростанням сигналів PME в 1,3 рази (p = 0,046) та Pi в 2,2 рази (p = 0,037), відповідно (рис. 1).

Таке зниження сигналів вNTP і PCr з одночасним зростанням сигналів Pi та PME відображається в змінах відповідних співвідношень: Pi/PCr, Pi/вNTP, PME/вNTP. Протягом експерименту, починаючи з 12-ї доби після перещеплення, по мірі збільшення об'єму пухлини було виявлено поступове збільшення співвідношень Pi/PCr, Pi/вNТP і PME/вNTP: на 18-у добу після перещеплення, співвідношення Pi/PCr, Pi/вNТP і PME/вNTP збільшувались від 2 до 2,5 разів; на 21-у добу - від 3 до 3,5 разів у порівнянні зі значеннями цих показників, які були зафіксовані на 12-у добу після перещеплення.

Слід зазначити, що в інтервалі 16-18-а доба після перещеплення, зміни співвідношень (зменшення Pi/вNTP та PME/вNTP) вказували на незначне покращення її оксигенації, і, таким чином, на деяке посилення біоенергетичного статусу пухлини. Цей період після перещеплення, вірогідно, є ключовим у початку процесу активного метастазування, яке потребує підвищення рівня енергозабезпечення (Osinsky S. P. et al., 2005).

Крім того, слід зазначити, що в пухлинах з великим об'ємом (від 1,5 до 2,3 см³) сигнали PCr і вNТP знижувались майже до невимірно малих величин у 23% та 15% зразків пухлинної тканини, відповідно, що не давало змоги оцінити рівень гіпоксії за допомогою співвідношень Pi/PCr, Pi/вNТP і PME/вNTP в усіх зразках пухлин. В цьому випадку було використане співвідношення PME/Pi, яке є дуже чутливим до рівня тканинної оксигенації (Vaupel P. et al., 1989). За умов задовільного надходження кисню (тобто, в пухлинах об'ємом <0,4 см³) на 12-у добу після перещеплення співвідношення PME/Pi було 0,8±0,06. По мірі росту пухлини, коли об'єм її збільшується, співвідношення PME/Pi поступово зменшується до значення 0,39±0,08 на 27-у добу, тобто у 2 рази у порівнянні з таким, що спостерігалося на початку експерименту.

Встановлено, що збільшення об'єму пухлини супроводжується зростанням кількості метастазів і це співпадає зі значним зростанням рівня гіпоксії у первинній пухлині. З 12-ї доби після перещеплення, по мірі збільшення об'єму первинної пухлини, спостерігається поступове зростання кількості метастазів у легенях. Найбільш активне метастазування спостерігається, починаючи з 18-ї доби після перещеплення. Так, на 18-у добу після перещеплення, кількість метастазів у легенях тварин збільшилась у 2 рази, на 20-у добу - у 4 рази, на 21-у добу - у 7 разів та на 27-у - майже у 10 разів, відповідно, у порівнянні з їх кількістю, що була зафіксована на 16-у добу після перещеплення.

Виявлено, що зміни співвідношень Pi/PCr, Pi/вNТP і PME/вNTP у первинній тканині достовірно корелюють з об'ємом пухлини та кількістю метастазів у легенях, починаючи з 12-ї і до 27-ї доби (табл. 1).

Таблиця 1 Кореляційний зв'язок між співвідношеннями, визначеними ³¹Р ЯМР спектроскопією, розміром первинної пухлини та кількістю метастазів у легенях

	Pi/PCr	Pi/вNTP	PME/ вNTP	Об'єм первинної пухлини
Об'єм первинної пухлини	r = 0,87 p = 0,0045	r = 0,90 p = 0,0012	r = 0,764 p = 0,05	---
Кількість метастазів у легенях	rs = 0,761 p = 0,028	rs = 0,86 p = 0,0049	rs = 0,77 p = 0,040	rs = 0,915 p = 0,001

Примітка: r - коефіцієнт Пірсона, r_s = коефіцієнт Спірмана.

Для м'язової тканини в стані спокою характерним є високий сигнал PCr у порівнянні з сигналом Pi, високий сигнал вNTP і майже повна відсутність сигналу PМE на відміну від пухлинної тканини. Співвідношення Pi/PCr, Pi/вNTP та PME/вNTP у м'язовій тканині за своїм значенням значно менші, ніж у пухлинній тканині, і впродовж всього експерименту практично залишаються на постійному рівні. Але, на 21-у добу після перещеплення, спостерігалось поступове зростання співвідношень Pi/PCr, Pi/вNTP та PME/вNTP на 10,4% і залишалося приблизно на тому ж рівні до 27-ї доби. Це вказує на те, що у м'язовій тканині відбувається незначне, але поступове пригнічення біоенергетичного статусу, що призводить до погіршення оксигенації м'язової тканини, що, вірогідно, зв'язано з впливом розвиненої пухлини на організм-пухлинноносія на термінальних стадіях росту пухлини.

На моделі карциноми 3LL було показано, що за допомогою співвідношень Pi/PCr, Pi/вNТP, PME/вNTP і PME/Pi, отриманих методом ³¹Р ЯМР спектроскопії ПХЕ тканини, можна оцінити рівень внутрішньопухлинної гіпоксії, який достовірно корелює як з розміром пухлини, так і з кількістю метастазів у легенях. Тому, ми припускаємо, що метод ³¹Р ЯМР спектроскопії ПХЕ тканини може бути застосований для визначення рівня гіпоксії в пухлинах людини.

Рівень гіпоксії у пухлинній тканині та оточуючій її слизовій оболонці у хворих на РШ та його прогностичне значення. Виявлено, що в тканині РШ сигнали PCr та вNTP були знижені в 3,2 та 2,5 рази, відповідно, порівняно з такими у “нормальній” слизовій оболонці шлунка. Слід зазначити, що зниження сигналів PCr та вNTP відбувалося з одночасним зростанням сигналу Pi в тканині РШ (рис.2).

На ³¹Р ЯМР спектрах пухлинної тканини багатьох хворих на РШ сигнали PCr і вNTP були невимірно малими: сигнали вNTP і PCr зменшувались до невимірюваних величин у 52% та 78% випадків, відповідно. Таке становище є характерною особливістю розвинених пухлин, особливо пухлин людини, що не дає можливості використовувати загальноприйняті в ³¹Р ЯМР спектроскопії співвідношення, такі як Pi/PCr, Pi/вNTP та PME/вNTP, для порівняльної оцінки рівня гіпоксії у пухлинах всіх обстежених хворих.

Тому, для отримання інформації щодо рівня гіпоксії в пухлинах усіх хворих, в дослідженні було використане співвідношення PME/Pi. Результати попередніх досліджень на карциномі 3LL, їх аналіз та співставлення з даними літератури дозволили використовувати співвідношення PME/Pi для оцінки рівня гіпоксії у тканині. Слід зазначити, що співвідношення PME/Pi може бути вичислене у кожному випадку, що дає змогу порівнювати між собою всі отримані зразки пухлинних тканин щодо рівня їх гіпоксії.

Для підтвердження правомірності використання співвідношення PME/Pi у роботі з клінічним матеріалом з метою оцінки рівня гіпоксії в пухлинній тканині, був проведений кореляційний аналіз між цим співвідношенням та загальновизнаними у ³¹Р ЯМР спектроскопії співвідношеннями, а саме Pi/вNTP і PME/вNTP, на тих спектрах де спостерігався сигнал вNTP. Щодо співвідношення Pi/PCr, то для проведення кореляційного аналізу не було достатньо даних. Встановлено, що між співвідношеннями Pi/вNTP та PME/вNTP в пухлинній тканині хворих на РШ існує дуже тісний взаємозв`язок (р=0,001). Отримана зворотня кореляція між співвідношеннями Pi/вNTP та PME/Pi в тканині РШ (табл. 2).

На підставі отриманих кореляцій можна констатувати, що існує реальний зв'язок між даними співвідношеннями та PME/Pi, і, головне, що використання останнього є правомірним для оцінки рівня гіпоксії в пухлинній тканині хворих на РШ.

Таблиця 2 Кореляційний зв'язок між співвідношеннями, визначеними ³¹Р ЯМР спектроскопією, в пухлинній тканині хворих на рак шлунка

31Р ЯМР метаболічний показник	PME/вNTP	PME/Pi
Pi/вNTP	r = 0,88 р = 0,001	r = - 0,38 р = 0,046

Результати визначення рівня гіпоксії у тканині РШ свідчать про значні коливання індивідуальних значень співвідношення PME/Pi від 0,8 до 5,32 (медіана 1,4). Медіану використовували замість середнього значення тому, що розподіл значень PME/Pi мав велике відхилення.

Виявлено, що у “нормальній” слизовій оболонці шлунка співвідношення PME/Pi майже в 2 рази вище у порівнянні з даним співвідношенням у тканині РШ. Крім того, показано, що співвідношення PME/вNTP та Pi/вNTP у тканині РШ були вищими у порівнянні з такими в слизовій оболонці, а саме у 1,4 та 2,4 рази, відповідно.

Таким чином, на підставі визначення співвідношення PME/Pi можна зробити висновок, що межа розподілу між умовно «добре» та «бідно» оксигенованими пухлинами складає 1,4 для всіх обстежених пухлин, що відповідає медіані вищевказаного співвідношення. Встановлено при цьому, що «гіпоксичний» РШ складає 44%, а «оксигенований» - 56% випадків. При аналізі отриманих даних було виявлено три умовні групи хворих на РШ за рівнем гіпоксії у пухлині: група хворих, у яких співвідношення PME/Pi < 1,0, тобто пухлини з надто глибоким рівнем гіпоксії; 1,0< PME/Pi < 2,0 - з помірним рівнем гіпоксії; та PME/Pi > 2,0 -задовільно оксигеновані пухлини (29%, 58% та 13% хворих, відповідно). Рівень оксигенації в останній групі співвідноситься з рівнем гіпоксії у нормальних тканинах. Цей факт вказує на те, що така пухлина достатньо оксигенована та знаходиться в дуже сприятливих для свого розвитку умовах.

Для того, щоб пересвідчитися, що співвідношення PME/Pi дійсно відображає рівень оксигенації тканини РШ, було проведено співставлення ³¹Р ЯМР спектрів пухлинних тканин хворих на РШ та на РШМ. РШМ, як добре відомо, є злоякісним новоутворенням, що находиться в стані глибокої гіпоксії, що було показано за допомогою мікроелектродної техніки (Hoeckel M., Vaupel P., 2001). На відміну від ³¹Р ЯМР спектрів РШ, на спектрах тканини РШМ характерним є більш сильний сигнал Pi, не такий виразний сигнал PDE (рис. 3).

При співставленні рівнів гіпоксії в тканинах РШ та РШМ було виявлено, що співвідношення PME/Pi в тканині РШМ нижче приблизно в 2 рази у порівнянні з даним співвідношенням у тканині РШ.

Встановлено, що індивідуальні значення співвідношення PME/Pi в тканині РШМ не перевищують 1,0, зі значенням медіани - 0,84 (0,51-1,0), тоді як у тканині РШ вони значно вище: 1,4 (0,8 - 5,32), що підтверджує дані про глибокий рівень гіпоксії в тканині РШМ (Hoeckel М., Vaupel Р., 2001).

Таким чином, на підставі проведеного співставлення значень співвідношення PME/Pi тканин РШ і РШМ, можливо зробити висновок, що співвідношення PME/Pi дійсно відображає рівень оксигенації у пухлинній тканині.

При порівняльному аналізі рівня гіпоксії в пухлинній тканині з основними клініко-патологічними характеристиками не було виявлено значних коливань рівня гіпоксії. Крім того, не були отримані кореляції рівня гіпоксії пухлини зі стадіями розвитку процесу, категоріями рТ, рN і рМ, гістологічною структурою, ступенем диференціації, анатомічним розташуванням пухлин, віком та полом хворих на РШ. Це співпадає з відомим положенням, що гіпоксія пухлини не залежить від клініко-патологічних характеристик, і тому її рівень може розглядатися як незалежний фактор прогнозу перебігу захворювання .

Проведений аналіз зв'язку між тривалістю життя хворих на РШ та рівнем гіпоксії, оціненим співвідношенням PME/Pi у пухлинній тканині. Встановлено, що тривалість життя хворих, в пухлинах яких PME/Pi < 1,4 (умовно гіпоксичні), була коротша, ніж в групі хворих, в пухлинах яких PME/Pi > 1,4 (задовільно оксигеновані) (р=0,029) (рис. 4).

Слід зазначити, що рівень смертності серед хворих на РШ, в пухлинах яких співвідношення PME/Pi < 1,4, спостерігався у 88% випадків.

В той же час виявлений важливий взаємозв'язок між високим рівнем гіпоксії у первинній пухлині та статусом реґіонарних лімфатичних вузлів. Встановлено, що в групі хворих з категорією рN₀, в пухлинах яких спостерігається глибока гіпоксія (PME/Pi <1,0), має місце несприятливий перебіг захворювання і загроза смерті (HR) зростає більш, ніж вдвічі (табл. 3).

Таблиця 3 Показники регресійного аналізу за Сох для хворих на рак шлунка

Категорія N	Коефіцієнт ризику (Нazard ratio)	95% довірчий інтервал	p
N0 PME/Pi < 1,0	2,1	0,42-2,57	< 0,035
N1+2 PME/Pi < 1,0	4,5	0,67-4,67	< 0,027

Ці результати свідчать, що наявність гіпоксії у пухлині може визначити групи хворих з ризиком розвитку метастазів, які повинні отримувати додаткову терапію до такої, що призначена на підставі традиційних ознак пухлинного процесу.

Імуногістохімічне визначення експресії СА-9 у пухлинних тканинах хворих на РШ та РШМ. ІГХ визначення експресії білку СА-9 було проведено на зрізах тканини РШ. Позитивна реакція з поліклональними антитілами (ПКАТ), специфічними до СА-9, спостерігалась у переважній більшості досліджуваних зразків, а саме у 99% випадків. Не отримано будь-яких кореляційних зв'язків стадій розвитку процесу, категорій системи TNM, анатомічним розташуванням пухлин та віку хворих на РШ з кількістю клітин в пухлині, які експресують СА-9. В той же час спостерігалась тенденція до зв'язку між збільшенням кількості клітин, які експресують СА-9, та зростанням стадії пухлинного процесу (р=0,058).

При встановленні зв'язку кількості клітин, які експресують СА-9, залежно від гістологічного типу пухлин було показано, що кількістьСА-9 позитивних клітин у зразках тканин аденокарцином була достовірно вищою (р=0,017) у порівнянні зі слизовим РШ.

Виявлено достовірну кореляцію між кількістю клітин, що експресують СА-9 в тканинах РШ, зі ступенем диференціації: у помірнодиференційованих пухлинах шлунка вона у два рази менша (р=0,025) у порівнянні з такою в недиференційованих пухлинах.

ІГХ визначення експресії білку СА-9 було проведено на зрізах тканини РШМ. Позитивна реакція з ПКАТ, специфічними до СА-9, спостерігалась у 100% пухлинних зразків. Не отримано будь-яких кореляційних зв'язків стадій розвитку процесу, категорій системи TNM, гістологічним типом та віку хворих на РШМ з кількістю клітин в пухлині, які експресують СА-9.

Слід зазначити, що у більшості хворих переважала аденокарцинома (82%) тоді як плоскоклітинна карцинома склала 18% випадків. Виявлено, що найбільша кількість СА-9 позитивних клітин (>50%) спостерігалась, як правило, у низькодиференційованих пухлинах шийки матки обох досліджуваних гістологічних типів РШМ. Отримані дані дозволили зробити висновок щодо наявності зв'язку між експресією СА-9 та гістологічними типами РШМ з різними ступенем диференціації.

Проведено співставлення рівня гіпоксії в тканинах РШ та РШМ за експресією маркера гіпоксії СА-9. Встановлено, що висока експресія СА-9 в тканинах РШ та РШМ спостерігається у 50% та у 81% хворих, відповідно.

Показано, що за даними ³¹Р ЯМР спектроскопії індивідуальні значення співвідношення PME/Pi для тканини РШМ не перевищують 1,0, тому з метою порівняння кількості клітин, які експресують СА-9 в цих новоутвореннях, була відібрана група хворих на РШ, в первинній пухлині яких спостерігався глибокий рівень гіпоксії (PME/Pi <1,0). Виявилося, що в тканині РШ за умов глибокої гіпоксії більш ніж 60% клітин експресують СА-9 (р< 0,05). Таким чином, можна констатувати, що співвідношення PME/Pi відображає стан оксигенації тканини, а ендогенний маркер гіпоксії СА-9 виявляється показовим тільки тоді, коли в тканині реєструється глибока гіпоксія (табл. 4).

Таблиця 4 Співвідношення PME/Pi та кількість клітин, позитивних за СА-9, у тканинах раку шлунка і раку шийки матки

Пухлина	PME/Pi (медіана, розкид)	CA-9 (медіана, розкид, %)
Рак шлунка	1,4 (0,8 - 5,32)	49,0 (0 - 96,0)
Рак шийки матки	0,84 (0,51 - 1,0)	65,0 (35,9 - 95,9)

Вміст лактату у пухлинній тканині та оточуючій її слизовій оболонці у хворих на РШ та його прогностичне значення. Метод ЯМР спектроскопії дозволяє отримати на одних тих самих зразках тканин як ³¹Р, так і ¹Н ЯМР спектри. На ¹Н ЯМР спектрах було виявлено, що в тканині РШ сигнал Lac збільшений у пухлині майже у 2 рази у порівнянні з таким в оточуючій її “нормальній” слизовій оболонці шлунка (рис. 5).

Для оцінки рівня лактату використовували співвідношення Lac/Cr. Креатин, як відомо, відноситься до енергетичної складової метаболізму клітини, яка за будь-яких умов намагається підтримувати пул креатину на відносно постійному рівні, і на ¹Н ЯМР спектрах сигнал Cr завжди чітко визначений. Тому співвідношення Lac/Cr є більш стабільним показником, який співвідноситься із загальним метаболічним станом клітини на момент її фіксації.

Для того, щоб пересвідчитися, що співвідношення Lac/Cr дійсно відображає рівень лактату в тканині РШ, було проведено співставлення рівня лактату у пухлині, оціненого методом ¹Н ЯМР спектроскопії, та вмістом лактату, визначеним загальновживаним біохімічним методом.

Результати оцінки рівня співвідношення Lac/Cr у тканині РШ свідчать про значні коливання індивідуальних значень від 1,36 до 32,5 із значенням медіани 4,6. Медіана вмісту лактату, визначеного біохімічним методом, для РШ становила 18,72 (8,32-49,9) µмоль/г. Медіана співвідношення Lac/Cr та медіана вмісту лактату у слизової оболонки шлунка - 1,5 (0,62-4,4) і 9,57 (3,33-22,18) µмоль/г, відповідно.

Показано, що вміст лактату, визначений як за допомогою ¹Н ЯМР спектроскопії, так і біохімічним методом, у пухлинній тканині хворих на РШ значно вищий, ніж такий в оточуючій її “нормальній” слизовій оболонці шлунка приблизно в 3 рази (р<0,001) та у 2 рази (р<0,001), відповідно. Отримані дані співпадають з експериментальними та клінічними дослідженнями інших авторів (Walenta S. et al., 2000; Brizel D. M. et al., 2001; Walenta S, 2003).

Порівняльний аналіз рівня лактату за співвідношенням Lac/Cr і вмісту лактату в пухлинній тканині, визначеного біохімічним методом, з основними клініко-патологічними характеристиками, не виявив кореляції з категоріями рТ і рN, гістологічною структурою, ступенем диференціації, анатомічним розташуванням пухлини, віком та статтю хворих на РШ.

Отримані достовірні кореляції як рівня лактату за співвідношенням Lac/Cr, так і вмісту лактату у пухлині зі стадією пухлинного процесу (р=0,0412 та р=0,029, відповідно). При встановленні зв'язку як рівня лактату за співвідношенням Lac/Cr, так і вмісту лактату у пухлині з рТ категорією спостерігалась тенденція до збільшення вмісту лактату в пухлинній тканині, проте ця різниця не була достовірною (р=0,785, р=0,0652, відповідно).

При аналізі зв'язку вмісту лактату в тканині РШ, визначеного біохімічним методом, з виживаністю хворих виявилось, що при низькому вмісті лактату в пухлині спостерігається достовірна більша тривалість життя, ніж за умов, коли вміст лактату в пухлині був високим (ч²=9,086, р=0,0026). Це положення дійсне і у випадках, коли рівень лактату оцінювали співвідношенням Lac/Cr (ч²=3,876, р=0,049). Ці дані чітко вказують, що високий вміст лактату пов'язаний з несприятливим прогнозом перебігу захворювання, що співпадає з роботами інших авторів (Walenta S. et al., 2004; Walenta S., Mueller-Klieser W.F., 2004) (рис. 6).

При аналізі співставлення рівня лактату, визначеного методом ¹Н ЯМР спектроскопії ПХЕ тканини, з вмістом лактату, визначеним біохімічним методом, в одних і тих самих зразках пухлинної тканини, отримана пряма кореляція між співвідношенням Lac/Cr та вмістом лактату в тканині РШ (r_s=0,439, p=0,008). Це вказує на те, що співвідношення Lac/Cr достовірно відображає рівень лактату в пухлинній тканині.

Для підтвердження правомірності використання співвідношення PME/Pi для оцінки рівня гіпоксії в пухлинній тканині хворих на РШ був проведений також кореляційний аналіз між цим співвідношенням та рівнем лактату. Аналіз отриманих даних показав, що спостерігається статистично достовірний зворотній кореляційний зв'язок (r=-0,29, р=0,0487) між рівнем гіпоксії і вмістом лактату в пухлині, визначеного біохімічним методом, у тканині РШ за умов, коли пухлинна тканина є глибоко гіпоксичною (PME/Pi<1,0).

Слід зазначити, що за умов, які оцінюються як сприятливі для перебігу захворювання, а саме при PME/Pi>1,4 у пухлині, але при високому рівні лактату, оціненому ¹Н ЯМР спектроскопією, та при високому вмісті лактату, визначеному біохімічним методом, ризик несприятливого перебігу захворювання зростає майже вдвічі (HR=1,76, р=0,0446 і HR=2,0, р=0,0398, відповідно).

ВИСНОВКИ

У результаті експериментально-клінічного дослідження доведено, що певні співвідношення метаболічних показників біоенергетичного статусу пухлини є репрезентативними для оцінки рівня її оксигенації та можуть бути використані в якості факторів прогнозу перебігу РШ людини.

1. Рівень гіпоксії в карциномі 3LL достовірно корелює з розміром первинної пухлини та кількістю метастазів.

2. Використання метаболічного співвідношення PME/Pi, визначеного методом ³¹Р ЯМР спектроскопії, є правомірним для оцінки рівня гіпоксії в пухлинній тканині, зокрема, хворих на РШ та РШМ людини.

3. Встановлено, що РШ людини за станом оксигенації може бути розподілено на три групи: пухлини з глибокою гіпоксією, помірною та слабкою (29%, 58% і 13% пухлин, відповідно).

4. Рівень гіпоксії у тканині РШ не корелює з загальноприйнятими клініко-патологічними характеристиками хворих.

5. У хворих на РШ з категорією N₀ при наявності глибокої гіпоксії у пухлині (PME/Pi <1,0) має місце негативний перебіг захворювання, і ризик смерті зростає у 2 рази.

6. Встановлено залежність між високим рівнем гіпоксії пухлин та кількістю клітин, що експресують СА-9.

7. Співвідношення Lac/Cr, визначене методом ¹Н ЯМР спектроскопії, є достовірним показником рівня лактату в тканині, зокрема пухлинній.

8. Cпіввідношення Lac/Cr у пухлинній тканині, яке перевищує 4,6 та вміст лактату (>18,72 µмоль/г) свідчать про агресивний характер росту пухлини та несприятливий перебіг захворювання.

9. Cпіввідношення PME/Pi та Lac/Cr у пухлинній тканині можуть використовуватись у якості факторів прогнозу перебігу захворювання хворих на РШ.

10. ³¹Р та ¹Н ЯМР спектроскопія ПХЕ пухлинної тканини, отриманої під час оперативного втручання, може бути використана з метою уточнюючої діагностики та прогнозування перебігу захворювання.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Hypoxia level and matrix metalloproteinases -2 and -9 activity in Lewis lung carcinoma: correlation with metastasis / S. Osinsky, I. Ganusevich, L. Bubnovskaya, N. Valkovskaya, A. Kovelskaya, T. Sergienko, S. Zimina // Exp. Oncol. - 2005. - V. 27, № 3. - P. 202-205. (Особистий внесок здобувача: брала участь у виконанні експериментальних досліджень та визначенні рівня гіпоксії у пухлинній тканині мишей за допомогою ³¹Р ЯМР спектроскопії та аналізі результатів).

2. Bioenergetic status and hypoxia in Lewis lung carcinoma assassed by ³¹P NMR spectroscopy: correlation with tumor progression / L. Bubnovskaya, V. Michailenko, A. Kovelskaya, S. Osinsky // Exp Oncol. - 2007. - V. 29, № 3. - Р. 207-211. (Особистий внесок здобувача: брала участь у виконанні експериментальних досліджень та визначенні рівня гіпоксії у пухлинній тканині мишей за допомогою ³¹Р ЯМР спектроскопії, в обробці наукових даних та аналізі результатів).

3. Рівень гіпоксії у тканині раку шлунка та перебіг захворювання / Л.М. Бубновська, А.В. Ковельська, І.Є. Болдескул, Д.С. Осинський, С.П. Меренцев, І.В. Гончарук, Г.П. Олійніченко, С.П. Осинський // Онкология - 2009. - № 1. - С. 39-44. (Особистий внесок здобувача: брала участь у виконанні досліджень та у визначенні рівня гіпоксії у тканинах хворих на РШ та РШМ за допомогою ³¹Р ЯМР спектроскопії та ІГХ методом, аналізі результатів, статистичних розрахунках, написанні та оформленні статті).

4. Ковельська А.В. Рівень лактату та ¹Н ЯМР метаболічне співвідношення лактат/креатин у тканині раку шлунка людини і прогноз перебігу захворювання / А.В. Ковельська, С.П. Меренцев, І.Є. Болдескул, Л.М. Бубновська // Онкология - 2009. - № 2. - С.104-108.

(Особистий внесок здобувача: брала участь у виконанні досліджень та у визначенні рівня лактату у тканині РШ за допомогою ¹Н ЯМР спектроскопії та біохімічним методом, аналізі результатів, статистичних розрахунках, написанні та оформленні статті).

5. Пат. на корисну модель. U200802486 Україна, МПК (2006) G01N27/00. Спосіб визначення рівня гіпоксії в пухлині як фактора прогнозу перебігу раку шлунка / Бубновська Л.М., Ковельська А.В., Болдескул І.Є., Осинський Д.С., Меренцев С.П., Осинський С.П.; заявник і патентовласник ДУ «Інститут онкології Академії медичних наук України». - № 33260; заявл. 26.02.08; опубл. 10.06.08, Бюл. №11. (Особистий внесок здобувача: брала участь у виконанні досліджень та у визначенні рівня гіпоксії у тканині хворих на РШ за допомогою ³¹Р ЯМР спектроскопії, у обробці наукових даних та в аналізі результатів, статистичних розрахунках, написанні та оформленні патенту).

6. Вальковская Н.В. Гипоксия опухоли и активность матриксных металлопротеиназ: влияние на метастазирование / Н.В. Вальковская, А.В. Ковельская // VI Міжнародна конференція молодих онкологів “Сучасні проблеми експериментальної та клінічної онкології”, 4-5 грудня 2003. - Україна, Київ, 2003. - С. 10.

7. Гипоксия-регулируемые белки как маркеры опухолевой прогрессии: исследование у больных раком желудка / С.П. Осинский, Л.Н. Бубновская, И.И. Ганусевич, И.А. Лисняк, Д.С. Осинский, В.А. Черный, О.В. Юрченко, А.В. Ковельская, Н.В. Вальковская, Л.Д. Гуменюк // Материалы ІІІ съезда онкологов и радиологов СНГ, 25-28 мая 2004. - Беларусь, Минск, 2004. - С. 346.

8. Hypoxia-regulated proteins (HRPs) and matrix metalloproteinases (MMPs) in gastric cancer: impact on malignant progression / S. Osinsky, L. Bubnovskaya, I. Ganusevich, A. Kovelskaya, О. Yurchenko, N. Valkovskaya, D. Osinsky, L. Gumenyuck, А. Chorny // Abstr. of British Cancer Research Meeting, 27-30 June 2004. - Manchester, UK, Br J Cancer. - 2004. - V. 91, №1. - P 83.

9. Hypoxia and hypoxia-regulated proteins in gastric cancer: prognostic significance for clinical outcome / S. Osinsky, L. Gumenyuck, L. Bubnovskaya, S. Shalimov, D. Osinsky, S. Merentsev, A. Kovelskaya, G. Olijnichenko // Book of Abstracts. 22^nd Annual Meeting of the Europ. Soc. Hyperthermic Oncology, 8-11 June 2005. - Austria, Graz, 2005. - Р. 83-84.

10. Рівень гіпоксії у пухлинній тканині хворих на рак шлунку, визначений за допомогою ³¹Р ЯМР спектроскопії та його вплив на перебіг та прогноз захворювання / С.П. Меренцев, А.В. Ковельська, С.В. Зіміна, Д.С. Осинський // VIІ Міжнародна конференція молодих онкологів “Сучасні проблеми експериментальної та клінічної онкології”, 2-3 лютого, 2006. - Україна, Київ, 2006. - С. 59.

11. Гипоксия и гипоксия-регулируемые белки в ткани рака желудка: прогностическое значение / С.П. Осинский, Л.Д. Гуменюк, Л.Н. Бубновская, С.П. Меренцев, А.В. Ковельская, С.В. Зимина, Г.П. Олийниченко, Д.С. Осинский // Матеріали XI-го зґїзду онкологів України, 29 травня - 02 червня, 2006. - Україна, Судак, 2006. - С. 152-153.

12. Гипоксия и гипоксия-ассоциированные белки в ткани рака желудка человека: прогностическое значение / С.П. Осинский, С.П. Меренцев, Л.Н. Бубновская, А.В. Ковельская, Л.Д. Гуменюк, С.В. Зимина, Г.П. Олийниченко, Д.С. Осинский // Материалы IV съезда онкологов и радиологов СНГ, 28 сентября - 01 октября, 2006. - Азербайджан, Баку, 2006. - С. 32 (116).

13. Гипоксия и гипоксия-ассоциированные белки в ткани рака желудка человека: прогностическое значение / С.П. Осинский, С.П. Меренцев, Л.Н. Бубновская, А.В. Ковельская, Л.Д. Гуменюк, С.В. Зимина, Г.П. Олийниченко, Д.С. Осинский // В кн.: «Избранные лекции и доклады» IV съезда онкологов и радиологов СНГ, 28 сентября - 01 октября, 2006. - Азербайджан, Баку, 2006. - С. 94-96.

14. Ковельська А.В. Рівень гіпоксії та її вплив на злоякісну прогресію / А.В. Ковельська, С.П. Меренцев, И.В. Гончарук // ІХ Міжнародна конференція молодих онкологів “Сучасні проблеми експериментальної та клінічної онкології”, 23-24 квітня, 2008. - Україна, Київ, 2008. - С. 63.

15. Гипоксия-ассоциированные механизмы прогрессии рака желудка (РЖ) и рака поджелудочной железы (РПЖ) / С.П. Осинский, Л.Н. Бубновская, И.И. Ганусевич, Н.В. Вальковская, А.В. Ковельская, Л.Д. Гуменюк, Д.С. Осинский, С.П. Меренцев, Г.П. Олийниченко // Материалы V-го съезда онкологов и радиологов СНГ, 14-16 мая, 2008. - Узбекистан, Ташкент, 2008. - С. 49.

16. ММП-2 и -9 как гипоксия-зависимые маркеры метастазирования рака желудка (РЖ) / И.И. Ганусевич, Л.Н. Бубновская, А.В. Ковельская, Л.Д. Гуменюк, С.П. Меренцев, С.П. Осинский // Материалы V-го съезда онкологов и радиологов СНГ, 14-16 мая, 2008. - Узбекистан, Ташкент, 2008. - С. 283.

17. Carbonic anhydrase 9 (CA9) expression and PME/Pi ratio evaluated by ³¹P NMR spectroscopy in human tumors with different levels of hypoxia / A. Kovelskaya, N. Lukyanova, S. Merentsev, I. Goncharuk, L. Bubnovskaya // Abstracts of the Int. Conference “Tumor Hypoxia and Malignant Progression”, 1-4 October, 2008. - Ukraine, Kyiv, 2008. - Р. 36.

18. Hypoxia, tumor-associated macrophages and matrix metalloproteinases in human gastric cancer: Role in tumor progression / A. Kovelskaya, I. Ganusevich, L. Gumenyuck, L. Bubnovskaya // Abstracts of the First Int. Conference “Cancer Immunotherapy & Immunomonitoring. (CITIM)”, 18-21 May, 2009. - Ukraine, Kyiv, 2009.