Зміни вуглеводної частини поверхневих глікокон’югатів клітин крові при новоутвореннях

Размещено на http://www.allbest.ru/

Міністерство охорони здоров'я України

Національний медичний університет ім. О.О. Богомольця

УДК 577.112.85:575.6:616-006

Автореферат

дисертації на здобуття наукового

тупеня кандидата медичних наук

Зміни вуглеводної частини поверхневих глікокон'югатів клітин крові при новоутвореннях

14.01.32 - медична біохімія

Хижняк Олександр Миколайович

Київ - 2009

Дисертацією є рукопис

Роботу виконано у Дніпропетровській державній медичній академії МОЗ України.

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор Бразалук Олександр Захарович, Дніпропетровська державна медична академія МОЗ України, завідувач кафедри біохімії, медичної та фармацевтичної хімії.

Офіційні опоненти: доктор медичних наук, професор Мхітарян Лаура Сократівна, Національний Науковий Центр «Інститут кардіології ім. акад. М.Д. Стражеска» АМН України, завідувач відділом біохімії

доктор біологічних наук, професор Ушакова Галина Олександрівна, Дніпропетровський національний університет ім. Олеся Гончара МОН України, професор кафедри біофізики та біохімії

Захист відбудеться 14.01.2010 року о _13_ год. 30 хв. на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.003.07 Національного медичного університету імені О.О. Богомольця (03057, пр. Перемоги, 34, фізико-хімічний корпус НМУ)

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного медичного університету імені О.О. Богомольця (03057, м. Київ, вул. Зоологічна, 1) мембрана біохімічний кров

Автореферат розісланий 12.12.2009 року

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, кандидат біологічних наук О.І. Толстих

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Вивчення змін плазматичної мембрани під час росту, міграції, диференціювання та злоякісної трансформації клітин різного генезу представляє собою одне з найактуальніших напрямків сучасних досліджень, який об'єднує широке коло вчених різних галузей науки і медицини (Лукьянов П.А., Журавлева Н.В., 2004; Шевцова А.І. та ін., 2007).

Формування вуглеводної складової поверхневих глікокон'югатів, які є центральною ланкою у відтворенні механізмів клітинної рецепції, відбувається за наступними правилами: чітка структурна та хронологічна етапність, тісна залежність від індукторів і загального біохімічного та функціонального стану клітини (Болдырев А. А. и др., 2006; Vatki A. та ін., 1999; Галич И. П., Евтушенко Н. В., 2003). Цей процес є специфічним для кожного типу клітин і характеризує перебіг основних внутрішньо- та позаклітинних процесів. Зміна умов існування клітини впливає на хімічну структуру поверхневих глікокон'югатів і є достовірним критерієм для визначення функціонального «здоров'я» клітини.

Існує багато даних, які свідчать про зв'язок між порушенням процесів глікозилювання та розвитком онкопатології (Couldrey C., Green J., 2000; Hakomori S., 2002). Однак серед них небагато інформації про механізми змін як процесів глікозилювання (Анисимов В. Н., 2003; Schuman J. та ін., 2000; Kobata A., Amano J., 2005), так і змін кінцевих характеристик поверхневих глікокон'югатів формених елементів крові при онкогенезі (Степовая Е. А. и др., 2004; Hemmoranta H. та ін., 2007). Відомо, що деякі компоненти на поверхні формених елементів крові можуть функціонувати як ліганди для селектинів (молекул адгезії) і, таким чином, беруть участь у взаємодії онкотрансформованої клітини та інших клітин в процесі інвазії при метастазуванні (Luca Z., Dvorac K., 2004; Guo H. та ін., 2003).

Очевидним є те, що вуглеводні компоненти поверхневих глікокон'югатів, які відповідальні за процеси міграції, адгезії та утворення міжклітинних контактів, змінюються при новоутвореннях (Антонюк В. О., 2005; S. Ali та ін., 2008). Слід зауважити, що зміни біохімічних характеристик глікокон'югатів виникають раніше, ніж зміни експресії онкопротеїнів (Danishefsky S., Allen J., 2000; Ho J., 2000; Burchel J. та ін., 2001). Отже, пошук характерних рис в структурі гліканів пухлинних клітин відкриває нові можливості для діагностики онкозахворювань на ранніх стадіях.

Більшість дослідників, які вивчали структуру глікокон'югатів на поверхні лейкоцитів при онкотрансформації, ставили за мету встановлення їхніх біохімічних характеристик при пухлинах системи крові та гемопоезу ( Tang Z. та ін., 2009; Поддубная И. В., 2001). Але дані, які стосуються закономірностей системних змін вуглеводних структур поверхневих глікокон'югатів формених елементів крові при онкогенезі в інших органах, залишаються майже не висвітленими, враховуючи, що система крові безсумнівно реагує на онкопроцес.

Все вищевикладене свідчить про доцільність дослідження вуглеводного компоненту поверхневих глікокон'югатів формених елементів крові при новоутвореннях не тільки в теоретичному аспекті, але і як перспективний напрямок пошуку ранніх маркерів онкопроцесу.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційну роботу проведено в межах державної теми кафедри біохімії, медичної та фармацевтичної хімії Дніпропетровської державної медичної академії «Структурно-функціональні зміни глікокон'югатів в онтогенезі та при патологічних станах» (номер державної реєстрації 0104U0010389).

Мета та завдання досліджень. Метою роботи було встановлення кількісних та якісних біохімічних змін вуглеводної частини поверхневих глікокон'югатів формених елементів крові за умов розвитку онкопроцесу в органах голови та шиї.

Відповідно до поставленої мети необхідно було вирішити такі завдання:

1. Вивчити ступінь сіальованості, сіальованість на фоні сульфатованості, розподілення фракцій за молекулярними масами і типами глікозидних зв'язків у вуглеводній частині поверхневих глікокон'югатів формених елементів крові у контролі, при розвитку фонових (аденома, поліпозні розростання) та онкологічних захворювань (аденокарцинома, недиференційований рак) органів голови та шиї.

2. Вивчити характер розподілення та відносну кількість олігосахаридів, що містять залишки б-D-манози, в-D-галактози, L-фукози та N-ацетил-D-глюкозаміна, N-ацетилнейрамінової кислоти, які є основними у структурі поверхневих глікокон'югатів гранулоцитів, лімфоцитів, моноцитів.

3. Вивчити зв'язок та характер впливу один на одного різних параметрів гліканової складової в умовах розвитку фонової та онкопатології з використанням тетрахоричного показника зв'язку.

4. Виявити сукупні ознаки та визначити основні риси змін вуглеводної частини поверхневих глікокон'югатів формених елементів крові при розвитку фонової та онкопатології.

Об'єкт дослідження - поверхневі глікокон'югати формених елементів крові при розвитку фонової та онкопатології органів голови та шиї.

Предмет дослідження - зміни вуглеводної частини поверхневих глікокон'югатів формених елементів крові при новоутвореннях.

Методи дослідження: клінічної гематології (приготування мазків крові, забарвлення, підрахунок еритроцитів та лейкоцитів), препаративної біохімії (одержання еритроцитів та лейкоцитів із стабілізованої крові, виділення мембран, відокремлення глікокон'югатів), аналітичної біохімії (афінна хроматографія, гель-фільтрація, спектрофотометрія, лектин-блот аналіз, електрофорез), гістохімічні та лектиногістохімічні у сукупності з протоковою цитофлуориметрією (визначення кількісних та якісних характеристик вуглеводних компонентів різних субпопуляцій клітин крові), біометричні (варіаційний, порівняльний аналіз, визначення тетрахоричного показника зв'язку).

Наукова новизна отриманих результатів. У виконаній роботі вперше встановлено біохімічні особливості вуглеводної частини поверхневих глікокон'югатів еритроцитів та лейкоцитів у контролі та при розвитку фонових і онкозахворювань голови та шиї різного генезу. Виявлені зміни електрофоретичної рухливості еритроцитів та лейкоцитів в умовах онкогенезу. Вперше встановлено зміну співвідношення сульфатованих та сіальованих глікокон'югатів у структурі плазматичних мембран формених елементів крові при онкотрансформації в іншій тканині, що супроводжується зниженням кількості L-фукозовмісних та сіаловмісних вуглеводних детермінант з паралельним зростанням термінальних в-D-галактозильних, б-D-манозильних та N-ацетил-D-глюкозамінних залишків олігосахаридів з дифузним характером їх розподілення по поверхні клітин.

Встановлено, що у хворих на фонову і онкопатологію органів голови та шиї в плазматичних мембранах еритроцитів та лейкоцитів спостерігається зміна співвідношення фракцій глікопротеїнів з різними молекулярними масами із появою важких фракцій у складі поверхневих глікокон'югатів мембран лейкоцитів. Вперше встановлено, що при онкогенезі у складі поверхневих глікокон'югатів лейкоцитів відбувається поява фракцій глікопротеїнів з молекулярною масою більше 96 кД, що містять N-ацетилнейрамінову кислоту, поєднану з вуглеводним ланцюгом б2> 6 та б2> 3 глікозидними зв'язками, які відсутні у контролі та при фонових захворюваннях. Виявлений тісний зв'язок між змінами молекулярно-масового профілю формених елементів крові, зміною сіальованості поверхневих глікокон'югатів еритроцитів та лейкоцитів та перерозподілом вуглеводних детермінант в субпопуляціях лейкоцитів.

Практичне значення результатів дослідження. Отримані у роботі дані щодо кількісно-якісних змін вуглеводної частини поверхневих глікокон'югатів формених елементів крові при фоновій патології та онкогенезі є важливими для удосконалення теоретичної бази в питаннях з'ясування механізмів розвитку онкопроцесу та імунної відповіді на нього. Матеріали дисертаційної роботи впроваджені у навчальний процес та наукову роботу кафедр біохімії Вінницького національного медичного університету імені М. І. Пирогова, Луганського державного медичного університету, Львівського національного медичного університету імені Данила Галицького, Запорізького державного медичного університету, Тернопільського державного медичного університету імені І. Я. Горбачевського та можуть бути використані при експериментальних та клінічних дослідженнях з метою ранньої діагностики онкологічних захворювань.

Особистий внесок здобувача. Результати, викладені в дисертаційній роботі, отримано здобувачем при виконанні протокової цитофлуориметрії з лектиногістохімією. При проведенні та аналізі даних протокової цитофлуориметрії автор отримував консультації керівника ЦНДЛ НМАПО імені П. Л. Шупика, ст.н.сп., к.мед.н. Ігрунової К. М. Дисертант самостійно провів пошук і проаналізував теоретичні та експериментальні дані дослідних робіт вітчизняних та зарубіжних вчених за темою дисертації. Автором розроблено програму вирішення поставлених задач, інтерпретовано отримані результати, сформульовано основні висновки, здійснено статистичну обробку даних та аналіз її результатів, підготовлено до друку основні матеріали за результатами дисертаційної роботи.

Апробація результатів досліджень. Основні положення дисертаційної роботи доповідалися та обговорювалися на науково-практичній конференції „Досвід і проблеми застосування сучасних морфологічних методів досліджень органів і тканин у контролі та при діагностиці патологічних станів” (м. Тернопіль, 2007), науковій конференції „Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии” (Одеса, 2007), VII міжнародній конференції студентів та молодих учених „Новини і перспективи медичної науки” (Дніпропетровськ, 2007), конференції „Актуальні проблеми сучасної біохімії та клітинної біології” (Дніпропетровськ, 2008) розширених засіданнях міжкафедральних наукових симпозиумів (2006, 2007, 2009).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 4 статті у фахових наукових журналах та 5 тез доповідей у збірках наукових конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація містить такі розділи: вступ, аналітичний огляд літератури, матеріали та методи досліджень, результати досліджень, який включає 3 розділи власних досліджень, аналіз та узагальнення результатів досліджень, висновки, список використаної літератури. Дисертацію викладено на 172 сторінках машинописного тексту і проілюстровано 46 рисунками та 23 таблицями. Список цитованої літератури налічує 193 найменування.

Основний зміст роботи

Матеріали і методи дослідження. У дослідженні використано кров умовно здорових людей (52), пацієнтів з фоновими захворюваннями (аденома щитоподібної залози (21), поліпоз гортані (9) та носоглотки (17)) та онкохворих (аденокарцинома, недиференційований рак щитоподібної залози (26), рак гортані (8), пухлини головного мозку (19)). Усього було досліджено проби крові від 152 чоловік.

У роботі використані біохімічні, гістохімічні, лектиногістохімічні методи дослідження вуглеводів та глікокон'югатів, протокова цитофлуориметрія, біометричний та статистичний аналіз.

Електрофоретичну рухливість формених елементів крові визначали за Михайличенко Л. А. (2004), а також за методикою Ошевенського Л. В. зі співав. (2005).

Сульфатовані та сіальовані глікокон'югати визначали забарвленням альціановим блакитним (Луппа Х., 1980). Відокремлення тільки сульфатованих залишків досягали шляхом інкубації мазків у розчині нейрамінідази (Ромейс Б., 1953).

Популяцію лейкоцитів та еритроцитів отримували за Архиповим Н. В. (2005); мембранну фракцію глікокон'югатів отримували за Козинецем Г. І. (2002).

Глікопротеїни виділяли методом афінної хроматографії на сефарозі CL-6B. Дослідження молекулярно-масового розподілення проводили методом колонкової гель-фільтрації денатурованих білків (D=2 см, h=100см Sephadex G-100) (Остерман Л. А., 1985). За калібрувальним графіком розраховували молекулярну масу окремих фракцій, для оцінки кількісного співвідношення фракцій використовували метод внутрішньої нормалізації (Скодынский К. И., 1993). Визначення вуглеводного компоненту фракцій глікопротеїнів проводили лектин-блот аналізом на активованих гідрохіноном нітроцелюлозних мембранах Hybond (Amersham) з використанням лектинів бузини чорної (SNA-1) і маакії амурської (МАL) («Лектинотест», Львів), кон'югованих з пероксидазою хрону (Антонюк В. О., 2005).

Для визначення лектиногістохімічних характеристик формених елементів крові ми використали лектини кори золотого дощу, конканаваліну А, арахісу, кореня кропиви, кон'юговані з флуоресцином ізотіоціанатом (ФІТЦ). Дослідження проводили у протоковому цитофлуориметрі PAS Partec.

З метою оцінки зв'язку між якісними характеристиками поверхневих глікокон'югатів, що були вивчені, нами використаний тетрахоричний показник зв'язку (Дмитриев Е. А., 1970). Проведений аналіз взаємозв'язку між змінами молекулярно-масового профілю формених елементів крові, зміною сіальованості поверхневих глікокон'югатів еритроцитів та лейкоцитів та перерозподілом вуглеводних детермінант у субпопуляціях лейкоцитів.

Біометричну обробку кількісних даних за кожним вивченим параметром проводили з попереднім визначенням необхідного об'єму вибірки і графічним аналізом статистичного розподілення величин. Відповідність отриманих (емпіричних) розподілень якому-небудь із стандартних розподілень оцінювали критерієм J Ястремського. Визначення достовірності відмінностей між вибірками проводили з урахуванням критерію t Стьюдента.

Результати дослідження та їх обговорення

Характеристика електрофоретичної рухливості формених елементів крові. Згідно з сучасними уявленнями, загальний електричний заряд клітин є результатом сумації складної мозаїки позитивних і негативних зарядів поверхневих катіонних та аніонних груп з перевагою останніх. Переважна більшість негативних зарядів клітинної поверхні обумовлена вуглеводними комплексами поверхневих глікокон'югатів, зокрема карбоксильними групами сіалових кислот. Зміни рівня сіальованості поверхневих структур призводить до коливань загального електричного заряду клітин і, внаслідок цього, зміни електрофоретичної рухливості (ЕФР) клітини.

Встановлено, що у нормі електрофоретична рухливість еритроцитів у віковій групі від 25 до 62 років становила 1,131±0,01 мкм·см·В-1·с-1. Електрофоретична рухливість еритроцитів у групі з фоновими захворюваннями, яку ми розглядали як «перехідну» між контролем та онкохворими, знижувалася і становила у середньому 1,109±0,01 мкм·см·В-1·с-1 (р<0,001).

При порівняльному аналізі рівня електрофоретичної рухливості еритроцитів у онкохворих з контролем спостерігалося її зниження. При порівнянні даних груп з онкозахворюваннями та з фоновою патологією зберігалася така сама залежність, особливість полягала у тому, що зниження ЕФР еритроцитів у хворих на фонову патологію мало повільний характер на відміну від групи онкохворих, де відбувалося різке падіння показника (табл.1).

Таблиця 1 Рівень електрофоретичної рухливості формених елементів крові, мкм·см·В-1·с-1, М±m

Примітка: Е - еритроцити, Л - лейкоцити

У популяції лейкоцитів хворих на фонову патологію, порівняно з контролем, рухливість знижувалася в середньому у 1,3 рази. При цьому зміни мали більш яскраву динаміку, ніж в еритроцитах (табл. 1).

ЕФР лейкоцитів у досліджуваній групі з онкозахворюваннями органів голови та шиї мало більш виразну динаміку зменшення показника, порівняно з групою контролю, ніж у еритроцитів. Його рівень у середньому становив 0,763±0,01 мкм·см·В-1·с-1 (р<0,05), що було у 1,5 рази менше, ніж у контролі.

Таким чином, зміна електричних властивостей плазматичних мембран еритроцитів та лейкоцитів характеризувалася зниженням електрофоретичної рухливості клітин у хворих на фонові захворювання та рак органів голови та шиї, порівняно з контролем, що свідчить про зниження загального рівня сіальованості клітинної поверхні. При цьому характер цих змін був різним: сіальованість еритроцитів знижувалася у групі хворих з фоновою патологією та мало місце різке падіння показника у онкохворих, у той же час сіальованість клітинної поверхні лейкоцитів повільно знижувалася в обох групах досліджуваних.

Зміни сульфатованості та сіальованості поверхневих глікокон'югатів формених елементів крові у контролі, у хворих на фонову та онкопатологію. Зміна структури глікокон'югатів (насамперед, рівня сульфатованості та сіальованості) мембран еритроцитів та, у першу чергу, лейкоцитів - є відображенням імуносупресивних та імунодепресивних станів, які обов'язково супроводжують онкозахворювання, а також спостерігаються при захворюваннях, які у клініці відносять до групи передракових. Для визначення рівня сульфатованості та сіальованості гліканової складової поверхневих глікокон'югатів у контролі та при певних патологічних станах, а також для оцінки співвідношення сульфатованих та сіальованих вуглеводних ланцюгів глікокон'югатів плазматичних мембран формених елементів крові було проведено гістохімічне дослідження клітин крові до та після обробки нейромінідазою.

У контролі еритроцити мали велику кількість сульфатованих та сіальованих олігосахаридних залишків та розподілялися на декілька груп за принципом розташування зон концентрації цих структур: на деяких клітинах вони розташовувалися рівномірно та щільно, і такі клітини були забарвлені тотально. Інші клітини мали регіони, де сіалові та сульфатні залишки не виявлялися. Нами спостерігалася також група клітин, що не мала на поверхні сульфатованих та сіальованих структур, тобто формувала повністю незабарвлену мембрану. Такі мембрани складали 26,8±3,0% (р<0,05) від загальної кількості еритроцитів у полі зору. Інтенсивність забарвлення глікокон'югатів мембран еритроцитів до обробки їх нейрамінідазою дорівнювала 3-м балам. Після ензиматичного гідролізу кількість барвник-позитивних зон різко знижувалася і становила 8,30,9% (р<0,05) позитивних клітин, а інтенсивність складала 1 бал. При порівнянні відносної кількості глікокон'югатів клітин, що зв'язували барвник, до та після десіалювання встановлено, що основну частину на поверхні мембран еритроцитів у контролі займають сіалоглікокон'югати, оскільки після десіалювання кількість забарвлених клітин зменшилася на 64,9±6,3% (р<0,05) відносно загальної кількості барвник-позитивних клітин до обробки ензимом.

У групі пацієнтів із фоновими захворюваннями кількість первинно позитивних еритроцитів зменшувалася, порівняно з групою контролю, на 16,1±1,5% (р<0,05). Інтенсивність забарвлення становила, як і у контролі, 3 бали. Поверхневі глікокон'югати клітин, що не несли жодного з досліджуваних залишків і візуалізувалися як барвник-негативні, статистично вагомо склали 42,9±3,3%, що становило більше, ніж у контролі. Це свідчить про зменшення кількості сіало- та сульфатвмісних глікокон'югатів на поверхні еритроцитів. Після ензиматичної десіалізації, кількість клітин що «випали» з реакції, була незначною і становила лише 16,8±1,3%, що у 3,9 рази менше порівняно з контролем. Інтенсивність реакції після обробки ензимом зменшувалася на 1 бал. Це свідчить про зниження ролі сіалового компоненту, порівняно з контролем.

При дослідженні еритроцитів хворих на онкопатологію встановлено, що відсоток клітин, які не містили на поверхні сульфатних та сіалових залишків збільшився на 24,0±2,5% (р<0,05), порівняно з контролем, а після десіалізації лише незначна кількість глікокон'югатів еритроцитів «випала» з реакції і становила 17,3±1,8% (р<0,05), що, порівняно з контролем, було статистично вагомо у 3,7 рази менше. Інтенсивність гістохімічної реакції на еритроцитах при первинному забарвленні дорівнювала 2 балам і після обробки ензимом не знижувалася. Це свідчить про те, що кількість сіалових кислот на поверхні еритроцитів, які несуть і стальовані, і сульфатовані глікокон'югати значно зменшена, порівняно з контролем. При порівнянні даних груп з фоновими захворюваннями та онкохворих відбувалося незначне збільшення кількості клітин, які випали з реакції, але ці зміни не знаходилися у межах статистичної достовірності. Проте статистично вагомо відбувалося зменшення інтенсивності реакції до обробки ензимом у групі онкохворих.

При аналізі поверхневих глікокон'югатів лейкоцитів ми окремо оцінювали гістохімічну реакцію для гранулярних та агранулярних лейкоцитів. У контролі кількість сіало- та сульфатвмісних глікокон'югатів гранулоцитів до обробки ензимом була вища ніж на агранулоцитах у 4,8 рази (р<0,05); інтенсивність реакції також переважала. Загальна кількість лейкоцитів, які прореагували з барвником, склала майже половину (47,3±4,2%, р<0,05). Після обробки ензимом виявлялося, що відсоток хімічно активних ділянок зменшувався на 10,6±1,0% (р<0,05). Падіння рівня інтенсивності реакції на 1 бал свідчило про рівний внесок сіальованих і сульфатованих глікокон'югатів. Хімічно-позитивні агранулоцити складали значно менший відсоток, порівняно з гранулоцитами (8,2%0,9, р<0,05) і мали низький рівень інтенсивності. Після проведення десіалізації лише незначна кількість ділянок «випала» з реакції (2,8%0,3, р<0,05), що відбивалося і у відсутності змін інтенсивності забарвлення.

Кількість гранулоцитів, які забарвлювалися до ензиматичного гідролізу, у групі хворих з фоновою патологією була значно нижче, порівняно з контролем, - у 3,9 рази (р<0,05), що свідчить про падіння кількості сіалоглікокон'югатів на поверхні цієї субпопуляції. Рівень інтенсивності забарвлення також був нижчим, ніж у контролі. Однак після проведення десіалізації кількість ділянок, що «випала» з реакції, була вища, тобто у групі з фоновою патологією спостерігався перерозподіл різних видів глікокон'югатів із зростанням ролі виключно сіальованих глікокон'югатів. Агранулоцити цієї групи також мали переформатування хімічних характеристик поверхні - зниження експресії сіало- та сульфокон'югатів в популяції відбувалося без зниження інтенсивності реакції. Після проведення десіалізації відсоток хімічно активних клітин впав до 2,2±0,2% (р<0,05), що складало у 2,5 рази менше, порівняно з контролем. Але хімічний «провал» на агранулоцитах був більшим, ніж у групі контролю. Це, скоріше за все, свідчить про збільшення ролі сіалоглікокон'югатів у формуванні поверхні цих клітин при розвитку фонової патології.

Глікокон'югати клітинної поверхні гранулярних лейкоцитів групи досліджуваних з онкозахворюваннями до обробки ензимом характеризувалися значним зниженням кількості сіало- та сульфатвмісних сполук на їх поверхні у 4,3 рази (р<0,05), порівняно з контролем. Інтенсивність забарвлення дозволила зробити припущення про зниження рівня сіальованості поверхні клітин. Аналіз забарвлення після обробки ензимом вказав на збільшення ролі сіальованих глікокон'югатів, оскільки група клітин, що лишилися незабарвленими після обробки ензимом, збільшилася. Агранулоцити у групі онкохворих характеризувалися наступними змінами: відбувалося збільшення кількості хімічно-позитивних клітин у 1,6 рази (р<0,05), порівняно з контролем, із відповідним зростанням інтенсивності реакції. При цьому, після проведення ензиматичного гідролізу ми спостерігали зростання кількості ділянок, що «випали» з реакції, у 2,7 рази (р<0,05), порівняно з групою контролю. Це підтверджує наше припущення про збільшення вмісту сіалових кислот у структурі поверхневих глікокон'югатів імунокомпетентних клітин у хворих на рак органів голови та шиї.

Порівняння рівня сіальованості поверхневих глікокон'югатів обох субпопуляцій лейкоцитів при фонових захворюваннях та при онкопатології дозволило встановити незначне зростання ролі сіалокон'югатів у структурі їхніх плазматичних мембран. Особливість змін інтенсивності реакції ми спостерігали тільки при аналізі агранулоцитів до обробки ензимом - вона збільшувалася на один бал, порівняно з групою хворих на фонові захворювання.

За даними Рапопорт Е. М. та співавт. (2006) сульфатовані і сіальовані глікокон'югати є рецепторами до інтегринів та лектинів різних популяцій імунокомпетентних клітин і відіграють важливу роль у міжклітинних взаємодіях при запальних процесах та при канцерогенезі. Вони опосередковують процеси міжклітинної адгезії, адгезії до клітинного матриксу, проліферацію та апоптоз клітин. На нашу думку, на перебіг та реалізацію цих клітинних реакцій впливає не тільки «нормальна» глікокарта, але і співвідношення різних за олігосахаридним залишком поверхневих глікокон'югатів між собою. На це вказують дані Crocker P. та співав. (1997), отримані за допомогою використання лектинів, які свідчать про те, що співвідношення D-галактоза/сіалова кислота у складі глікокон'югатів надмембранного комплексу клітин може слугувати показником відповідної активності в системі “адгезія-міграція”.

Співвідношення сіальовані/сульфатовані глікокон'югати у складі плазматичних мембран еритроцитів вказало на те, що у контролі на мембранах еритроцитів воно становило 8,8:1. Дещо відрізнявся цей показник у лейкоцитарних клітин: відношення сіальовані/сульфатовані глікокон'югати у складі плазматичних мембран гранулоцитів становило 1,4:1, у той час як на мембранах моноцитів та лімфоцитів воно було 0,5:1 (рис. 1). Таким чином виявляється, що еритроцити у контролі більш сіальовані, ніж лейкоцити, при цьому популяція агранулоцитів містить у складі плазматичних мембран більше глікокон'югатів з сульфатованими олігосахаридними залишками. Це збігається з даними Луцика О. Д. та співавт. (1989), які вказують на те, що для клітин з високим рівнем міграційної активності, або тих, які не формують контактів з оточуючими клітинами, характерною є сіалізація поверхневих глікокон'югатів. Враховуючи той факт, що еритроцити є форменими елементами, які циркулюють у судинному руслі, а лейкоцити через судинну стінку виходять в оточуючі тканини, на мембранах лейкоцитів співвідношення сіальовані/сульфатовані глікокон'югати характеризується перевагою останніх для реалізації процесів адгезії.

Співвідношення сіальовані/сульфатовані вуглеводні залишки на поверхні еритроцитів групи хворих з фоновими захворюваннями становило 1,4:1, а для лейкоцитів цей показник дорівнював: для гранулоцитів 0,7:1, для агранулоцитів - 2,36:1 (див. рис. 1)

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 1. Співвідношення між сульфатованими та сіальованими поверхневими глікокон'югатами клітин крові в досліджуваних групах хворих. Визначення коефіцієнта статистичної значущості різниці показників співвідношення сіальованих/сульфатованих залишків між групами встановлено: для еритроцитів РІ-ІІ , РІ-ІІІ <0,001, РІІ-ІІІ <0,05; для гранулоцитів - РІ-ІІ, РІІ-ІІІ <0,05, РІ-ІІІ<0,01; для агранулоцитів - РІ-ІІ, РІ-ІІІ <0,001, РІІ-ІІІ <0,01.

Це свідчить про зниження кількості сіальованих глікокон'гатів на поверхні еритроцитів і гранулоцитів та про збільшення сіальованості поверхневих глікокон'югатів агранулоцитів, порівняно з контролем.

Ivanov G. та співав. (1999) вказували на те, що адгезія лейкоцитів до судиного ендотелію та міграція їх вздовж стінки судин опосередковуються селектинами за механізмом, що передбачає взаємодію із залишками SiaLex вуглеводного ланцюга та з кластером сульфатизованих тирозинів, розташованих на поліпептидному ланцюзі PSGL-l. Доповнюючи це даними наших досліджень, можна припустити, що зниження кількості сіалогліканів та сульфатованих олігосахаридних ланцюгів у структурі поверхневих глікокон'югатів лейкоцитів вже у хворих на фонову патологію призводить до порушення процесів міграції лейкоцитів у патологічне вогнище та порушення в цілому процесів імунологічного та протипухлинного захисту організму.

Співвідношення сіальовані/сульфатовані вуглеводні залишки на поверхні еритроцитів для групи з онкопатологією (див. рис. 1) становило 0,5:1, що свідчить про значне зниження вмісту сіалоглікокон'югатів, порівняно як з контролем, так і з групою фонової патології. У гранулоцитах та агранулоцитах цей показник дорівнював відповідно 1,6:1 та 2,28:1, що було вище, порівняно з усіма досліджуваними групами.

Характеристика профілю молекулярно-масового розподілення глікокон'югатів плазматичних мембран формених елементів крові у контролі, при фонових та онкозахворюваннях. Вивчення електрофоретичної рухливості та гістохімічних характеристик, як показників загального рівня сіальованості поверхні клітин крові пов'язане, перш за все, з вивченням експресії поверхневих глікопротеїнів, що несуть сіальовані олігосахаридні залишки. Тому, використовуючи методи афінної хроматографії та гель-фільтрації, ми розділили мембранні глікопротеїни по фракціях з метою вивчення профілю молекулярно-масового розподілення поверхневих глікопротеїнів формених елементів крові. Для визначення ступеня сіальованості та типу кінцевого глікозидного зв'язку вуглеводного компоненту з N-ацетилнейраміновою кислотою у складі фракцій глікопротеїнів проводили лектин-блот аналіз.

У контролі профіль молекулярно-масового розподілення поверхневих глікопротеїнів еритроцитів характеризувався полімодальністю. Їх молекулярна маса містилася у межах від 15 до 86 кД. Основний об'єм в загальній структурі профілю займали молекули з масою від 46 до 55 кД (біля 70,0±7,7%, р<0,05). Також група контролю характеризувалася відсутністю сіалоглікопротеїнів у легкій фракції, у той час як середня та важка фракції мали у складі N-ацетилнейрамінову кислоту з відповідно б2> 3, б2> 6 та тільки б2> 6 типом зв'язку з прекінцевою галактозою (табл. 2).

Ступінь сіальованості важкої фракції глікопротеїнів еритроцитів та тип кінцевого глікозидного зв'язку у групі з фоновими захворюваннями, порівняно з контролем, не змінювався, але відбувалося зниження рівня сіальованості фракції з середніми молекулярними масами.

Профіль молекулярно-масового розподілення глікопротеїнів еритроцитів у групі онкохворих характеризувався розподіленням на три базові фракції: фракція з середніми молекулярними масами (46-55 кД) становила 52,7±5,0% (р<0,05) від загальної концентрації глікопротеїнів у зразку, що на 17,8±1,5% менше, ніж у контролі, і на 17,3±1,4% менше, ніж у групі з фоновими захворюваннями; відносні концентрації легких та важких фракцій збільшувалися. Крім того, молекулярна маса важких фракцій знижувалася, порівняно з першими двома групами, і склала для групи онкохворих 76-85 кД, що, на нашу думку, може бути пов'язано з розгалуженням олігосахаридних ланцюгів цих глікопротеїнів.

Крива елюювання глікопротеїнів плазматичних мембран лейкоцитів виявляла розподілення речовин на чотири основні фракції: дві фракції, з відносною концентрацією 7,5±0,7% та 10,7±0,8%, які були представлені глікопротеїнами відповідно з малою (15-25 кД) та великою (86-95кД) молекулярними масами; дві фракції з молекулярними масами 36-45 кД та 46-55 кД складали 24,6±2,5% та 57,2±5,5% від загальної концентрації глікопротеїнів у пробі.

Таблиця 2. Характеристика типу хімічного зв'язку кінцевої N-ацетилнейрамінової кислоти з прекінцевою галактозою у складі вуглеводних ланцюгів фракцій глікопротеїнів мембран формених елементів крові

Примітка: «--» - фракція не сіальована; ф. в. - фракція відсутня;

б2> 6, б2> 3 - тип глікозидного зв'язку

Поверхневі глікопротеїни лейкоцитів з масою до 26 кД, а також фракція з молекулярною масою від 86 до 95 кД у контролі не сіалювалися, натомість фракціі з середніми молекулярними масами, несли залишки сіалових кислот (див. табл. 2.), відіграючи значну роль у формуванні сіальованості поверхні лейкоцитів.

Хроматографічне розподілення мембранних глікопротеїнів лейкоцитів групи з онкозахворюваннями характеризувалося формуванням п'яти фракцій, концентраційне взаємовідношення яких розподілялося наступним чином: 1:0,7:1,4:1,2:0,3, тобто відбувалася зміна профілю молекулярно-масового розподілення у бік зростання кількості речовин з найбільшою та найменшою масами. Відносна концентрація глікопротеїнів з молекулярною масою у межах від 46 до 55 кД, порівняно із групою контролю, достовірно знижувалася у 1,9 рази, а доля молекул з молекулярними масами у проміжку між 36-45 кД, знижувалася у 1,6 рази, у той час як відносна концентрація молекул у фракціях великого розміру зростала у 3 рази, малого розміру відповідно у 2,9 рази.

Порівняльний аналіз профілей молекулярно-масового розподілення груп з фоновою патологією та онкохворих, також вказував на зменшення долі сполук із середньою молекулярною масою. При цьому найбільш виразним було зменшення відносної концентрації фракції масою 46-55кД - у групі онкохворих він змінювався у 1,6 рази, порівняно з групою фонових захворювань. Найбільш показове збільшення відбувалося у фракції легких молекул, відносна концентрація глікопротеїнів яких змінювалася у 1,8 рази. Крім того, у профілі розподілення лейкоцитарних глікопротеїнів групи онкохворих спостерігалася поява специфічної фракції з масою більше 96 кД, що була відсутня і у групі контролю, і у групі пацієнтів з фоновими захворюваннями.

Порівняння сіальованості фракцій, розділених за молекулярними масами, у групі онкохворих з іншими групами виявляло появу специфічної фракції сіалоглікопротеїнів з молекулярною масою 96-105 кД, які можуть бути охарактеризовані, як носії N-гліканового компоненту комплексного типу з одночасною присутністю двох різних типів кінцевих сіаловмісних структур.

Глікозильованість поверхневих глікокон'югатів мембран лейкоцитів за даними протокової цитофлюориметрії з ФІТЦ-лектинами. Вивчення поверхневих глікокон'югатів лейкоцитів проводилося нами з використаням лектинів кори золотого дощу (LABA), конканаваліну А (con A), арахісу (PNA), кореня кропиви, що були кон'юговані ФІТЦ. Після інкубації з вказаними лектинами клітини були аналізовані в протоковому цитофлюориметрі. Плазматична мембрана лімфоцитів характеризувалася рівномірним розподіленням глікокон'югатів, що містили залишки L-фукози, б-D-манози, в-D-галактози та N-ацетил-D-глюкозаміну. Рівень експресії лектин-специфічних зв'язувальних центрів у даній субпопуляції був різний: кількість клітин з високою інтенсивністю експресії L-фукозильних олігосахаридних залишків на поверхні мембран лімфоцитів складала 0,4±0,04% (р<0,05), б-D-манозильні олігосахариди у великій кількості концентрувалися на 4,9±0,5% клітин, у той час як N-ацетил-D-глюкозамінвмісні глікани у великій кількості були присутні на 1,5±0,1% досліджуваних лімфоцитів. Концентрація лектин-зв'язувальних сайтів на окремій клітині дає можливість розташування її у зоні з високим ступенем флуоресценції. Це підтверджується даними Blackledge G. та співавт. (1989), які досліджували живі лейкоцити за допомогою лектиногістохімії в сукупності з протоковою цитофлюориметрією та вказали на формування кластерів рецепторних комплексів на поверхні клітини. Глікановий профіль мембран гранулоцитів характеризувався рівномірним розподіленням L-фукозовмісних, б-D-манозильних олігосахаридів, та таких, що мали N-ацетил-D-глюкозамінні термінальні залишки. Найменшу кількість у структурі поверхневих глікокон'югатів гранулоцитів складали структури, що містили в-D-галактозильні олігосахаридні залишки. Отже, профіль поверхневих глікокон'югатів плазматичної мембрани лімфоцитів та гранулоцитів був схожим, глікокарта ж поверхні моноцитів, навпаки, мала ознаки, що були специфічні саме для цієї субпопуляції: високий вміст L-фукозильних та б-D-манозильних олігосахаридних залишків на поверхні плазматичних мембран, помірна кількість N-ацетил-D-глюкозамінних олігосахаридів та низький рівень в-D-галактозильних термінальних залишків. Дані нашого дослідження також підтверджуються результатами Chang Y. та співавт. (2006), які за допомогою флуоресцентної мікроскопії клітин, мічених ФІТЦ-лектином, визначили, що рецептори на поверхні моноцитів мають, у більшості, відкриті залишки сіалових кислот.

Глікокон'югатний профіль плазматичних мембран лейкоцитів різних субпопуляцій у хворих з фоновою патологією мав характерні зміни, порівняно із групою контролю: на поверхні лімфоцитів спостерігалося загальне зниження кількості лектин-зв'язувальних сайтів, що містять у своєму складі N-ацетил-D-глюкозамінні, L-фукозильні та б-D-манозильні олігосахариди. Кількість в-D-галактозильних олігосахаридних залишків на поверхні плазматичних мембран моноцитів, навпаки, різко збільшувалася. У моноцитарній субпопуляції відбувалася зміна співвідношення клітин з помірним та високим рівнем флуоресценції L-фукозильних та б-D-манозовмісних олігосахаридів у загальному профілі лектин-позитивних клітин, а на гранулоцитах, окрім зазначених, ще і таких, які містили залишки в-D-галактози та N-ацетил-D-глюкозаміну.

Ми провели порівняльні дослідження даних глікокон'югатного профілю онкохворих не тільки з контролем, але і з параметрами групи фонової патології. Аналіз поверхні лімфоцитів у дослідній групі з онкозахворюваннями виявив наступні характерні ознаки: зниження кількості вуглеводних детермінант до лектину золотого дощу (L-фукозоспецифічного) та конканаваліну А (специфічного до б-D-манозовмісних глікокон'югатів) з паралельним зростанням лектин-зв'язувальних центрів, що є PNA-позитивними (зростання в-D-галактозильних термінальних залишків), а також тих, які мітилися лектином кропиви (специфічного до N-ацетил-D-глюкозамінних гліканів). За даними літератури, молекули адгезії (інтегрини) зв'язуються з сусідніми клітинами олігосахаридними лігандами, що містять фукозу, сіалову кислоту та інші вуглеводні компоненти (Маянская С. Д., Куимов А. Д., 2001). Інтегрини у складі мембран лімфоцитів та нейтрофілів приймають участь в ранній інфільтрації (метастазуванні) пухлини. Зниження адгезивних молекул на клітинах, що відповідальні за імунний контроль, є проявом зниження протипухлинного імунітету організму людини (Блиндарь В. Н., Зубрихина Г. Н., 2005).

Моноцитарний пул формених елементів крові у хворих на онкопатологію органів голови та шиї мав характерні ознаки глікокон'югатного профілю плазматичних мембран і характеризувався різким збільшенням кількості вуглеводних детермінант, що містять залишки N-ацетил-D-глюкозаміну, в-D-галактози та б-D-манози з паралельним зменшенням у структурі гліканів L-фукозильних олігосахаридів. Крім того, спостерігалися зміни рівня експресії лектин-зв'язувальних сайтів на моноцитах у бік його зменшення та формування дифузної моделі розповсюдження на поверхні мембран всіх гліканів, що були вивчені.

Гранулярні лейкоцити у онкохворих мали особливий глікановий профіль, що характеризувався майже тотальним розповсюдженням лектин-зв`язувальних сайтів, які містять N-ацетил-D-глюкозамінні, в-D-галактозильні, L-фукозильні та б-D-манозильні олігосахаридні залишки у структурі поверхневих глікокон'югатів. Найбільш показовими були зміни характеру кривої флуоресценції, що характеризувалася зниженням кількості піків та зсувом їх у зону, яка формувалася шляхом концентрації клітин з помірним ступенем флуоресценції. Отже, зростання кількості клітин, у структурі поверхневих глікокон'югатів яких були присутні вивчені вуглеводні детермінанти, та паралельне падіння кількості таких, що мали високий рівень флуоресценції при обробці ФІТЦ-кон'югованими лектинами, «вписується» у дифузну модель топологічного розповсюдження глікокон'югатів, що мали N-ацетил-D-глюкозамінні, в-D-галактозильні, L-фукозильні та б-D-манозильні олігосахаридні залишки.

Для встановлення взаємозв'язку між різними параметрами поверхневих глікокон'югатів, а також для визначення його характеру та ступеня ми використали метод обчислення тетрахоричного показника зв'язку (r++), який дозволяє визначити, більш типову сукупність ознак, а також означити тенденції та напрям розвитку процесу, який обумовлює зв'язок ознак, що вивчалися. Аналізуючи різні пари ознак, ми дійшли висновку, що зміна електрофоретичної рухливості формених елементів крові була пов'язана зі зміною в-D-галактозильних, L-фукозовмістних та N-ацетил-D-глюкозамінних глікокон'югатів у хворих з фоновою патологією (r++=0,76, 0,71 та 0,55 відповідно) та у онкохворих (r++=0,68, 0,61 та 0,63) і майже не залежала від кількості б-D-манозильних олігосахаридних залишків (r++=0,12 (група з фоновими захворюваннями); -0,12 (група з онкозахворюваннями)). Зсув кривої молекулярно-масового розподілення у бік речовин з більшою молекулярною масою і у хворих на фонову патологію, і у онкохворих найбільш чітко співпадав зі зміною кількісних характеристик N-ацетил-D-глюкозаміномістних вуглеводів у структурі плазматичних мембран формених елементів крові (r++=0,45 (група з фоновими захворюваннями); 0,53 (група з онкозахворюваннями)), у той час як інші вуглеводні детермінанти, що були вивчені, не мали такого рівня позитивного зв'язку (r++=-0,10, -0,13, -0,26 (група з фоновими захворюваннями); 0,13, 0,11, -0,22 (група з онкозахворюваннями)).

Цей факт, можливо, пояснюється даними досліджень Naka R. та співавт. (2006), які вказали на збільшення кількості периферійних антен у структурі N-гліканів, які містять N-ацетил-D-глюкозамін, і що високий рівень поліантенності N-гліканів - ознака онкогенезу. Ми припускаємо, що збільшення кількості глікозильованих сполук у структурі поверхневих глікокон'югатів формених елементів крові з високою молекулярною масою, завдяки збільшенню вмісту N-ацетил-D-глюкозамінних олігосахаридних залишків, пояснюється збільшенням розгалуженості цього типу гліканів.

При онкотрансформації відбувається зміна біохімічних кількісно-якісних характеристик поверхневих глікокон'югатів завдяки зміні, в більшості, їх гліканової складової, що відбивається у зміні профілю молекулярно-масового розподілення з превалюванням структур з низькою та середньою молекулярною масою при фонових захворюваннях та з появою додаткової важкої фракції у онкохворих. Зниження сіальованості глікокон'югатів, що входять до складу плазматичних мембран формених елементів крові, впливало на електрофоретичну рухливість еритроцитів і лейкоцитів, та характеризувалося зниженням параметрів ЕФР при досліджених патологіях. Збільшення молекулярних мас глікокон'югатів у загальній структурі плазматичних мембран частіше за все спостерігалося у сукупності зі збільшенням кількості N-ацетил-D-глюкозамінних гліканів у хворих зі злоякісними новоутвореннями, а зміна співвідношення сіальованих та сульфатованих глікокон'югатів мала спряження зі зміною кількості б-D-манозильних, в-D-галактозильних та N-ацетил-D-глюкозамінних гліканів.

Таким чином, зміни, що спостерігалися у структурі вуглеводного компоненту поверхневих глікокон'югатів формених елементів крові у хворих на фонову патологію і у хворих на рак органів голови та шиї, мали схожі риси і тенденції розвитку, які характеризувалися більш вираженими ознаками при поглибленні патологічного процесу.

Висновки

У дисертації викладені узагальнені дані щодо змін вуглеводної частини поверхневих глікокон'югатів формених елементів крові при новоутвореннях; визначені основні закономірності формування специфічних біохімічних ознак поверхневих глікокон'югатів при онкогенезі. Отримані результати можуть слугувати основою для подальших експериментальних та клінічних досліджень в галузі медичної біохімії та онкології.

1. При розвитку онкопроцесу в органах голови та шиї відбуваються кількісні та якісні видозмінення вуглеводних компонентів поверхневих глікокон'югатів еритроцитів та лейкоцитів, які призводять до зміни їхньої електрофоретичної рухливості, зміни кількісних характеристик сульфатованих і сіальованих детермінант клітинної поверхні, зміни спектру молекулярних мас фракцій глікопротеїнів та типу глікозидного зв'язку кінцевих залишків вуглеводних ланцюгів.

2. Рівень загальної сіальованості глікокон'югатів клітинної поверхні еритроцитів і лейкоцитів хворих на онкопатологію (рак щитоподібної залози, гортані, головного мозку) зменшується, що відбивається у достовірному зниженні електрофоретичної рухливості; для досліджуваних із фоновими захворюваннями (аденома щитоподібної залози, поліпоз гортані) цей показник має лише тенденцію до зниження.

3. Встановлено односпрямовані зміни біохімічних характеристик вуглеводної складової поверхневих глікокон'югатів еритроцитів та лейкоцитів у групах онкохворих та хворих із фоновими захворюваннями у бік загального зменшення кількості сіалових кислот на мембранній поверхні та збільшення їхнього відносного вмісту в субпопуляції агранулоцитів зі зміною співвідношення сульфатних та сіалових залишків. Найбільш виражені в кількісному значенні зміни цих показників виявлені у групі хворих зі злоякісними пухлинами органів голови та шиї.

4. Зміни структури глікокон'югатів мембран еритроцитів та лейкоцитів при розвитку онкотрансформації тканин органів голови та шиї характеризуються появою нової додаткової фракції глікопротеїнів з молекулярною масою більше 96 кД у складі мембран лейкоцитів, яка не є характерною для груп контролю та фонових захворювань. Перерозподіл відносної концентрації глікопротеїнів із превалюванням фракцій, що мають велику та малу молекулярну масу, з паралельним зниженням концентрації молекул із середньою молекулярною масою відбувається як при фонових захворюваннях, так і при злоякісних новоутвореннях.

5. Структурні зміни вуглеводної частини поверхневих глікопротеїнів у хворих на фонові захворювання та на онкопатологію односпрямовані, зокрема встановлено зниження сіальованості мембранних фракцій еритроцитів і лейкоцитів, а також переважання у складі вуглеводного компоненту глікопротеїнів лейкоцитів структур із глікозидними зв'язками типу б2> 6 між залишками сіалових кислот та галактози.

6. При розвитку фонових захворювань на поверхні лімфоцитів спостерігається зниження кількості активних рецепторних центрів, до складу яких входять L-фукоза, б-D-маноза та N-ацетил-D-глюкозамін. Значне зниження кількості L-фукозовмістних та б-D-манозовмісних вуглеводних детермінант на поверхні лімфоцитів встановлено при онкозахворюваннях на фоні паралельного зростання термінальних в-D-галактозильних та N-ацетил-D-глюкозамінних залишків олігосахаридів з дифузним характером їх розподілення по поверхні клітин.

7. Аналіз тетрахоричного показника виявив тісний зв'язок між змінами загальної сіальованості поверхневих глікокон'югатів мембран формених елементів крові, їхніх гістохімічних характеристик, молекулярно-масовим профілем, структурними змінами вуглеводної частини поверхневих глікопротеїнів. Високий рівень впливу на збільшення молекулярної маси глікокон'югатів мають олігосахариди, що містять N-ацетил-D-глюкозамін. На зміну профілю молекулярно-масового розподілення глікокон'югатів мембран еритроцитів та лейкоцитів високий рівень впливу.

Список опублікованих праць за темою дисертації

1. Бразалук О. З Характеристика поверхневих глікокон'югатів клітин крові у хворих на рак різного генезу / О. З. Бразалук, О. М. Хижняк // Мед. Хімія. - 2007. - № 4. - С. 35-39. (Автор самостійно провів аналіз отриманих результатів та сформулював загальні висновки).

2. Хижняк О. М. Характеристика поверхневих глікокон'югатів клітин крові при захворюваннях на аденому та рак щитоподібної залози / О. М. Хижняк, Н. І. Стєклєньова // Морфологія. - 2007. - № 2. - С. 67-71. (Автором виконаний аналіз наукової літератури, проведений аналіз отриманих результатів, викладений фрагмент стосовно визначення параметрів на поверхні лейкоцитів, визначені загальні висновки).

3. Хижняк О. М. Особливості глікозильованості компонентів крові при онкопатологіях різного генезу / О. М. Хижняк, Н. В. Лутай // Медичні перспективи. - 2007. - № 4. - С. 25-30. (Автором проведений аналіз спеціальної літератури, аналіз отриманих результатів, викладений фрагмент стосовно визначення лектиногістохімічних характеристик формених елементів крові).

4. Хижняк О. М. Сіальованість поверхневих глікопротеїнів мембран клітин крові при онкозахворюваннях / О. М. Хижняк, Т. О. Зіненко // Медичні перспективи. - 2009. - № 3. - С. 23-26. (Автором проведений аналіз отриманих результатів, викладений фрагмент стосовно кількісних та якісних змін фракцій поверхневих глікопротеїнів еритроцитів та лейкоцитів).