Размещено на http://www.allbest.ru/

ЛУГАНСЬКИЙ ДЕРЖАВНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

На правах рукопису

14.01.32 - медична біохімія

УДК: 577.1: 616.718 - 005.4: 616 - 092.9

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

БіохімічнІ особливості ішемії нижньої кінцівки при введенні алогенних мезенхімальних стовбурових клітин в експерименті

Шипілова Інна Володимирівна

Луганськ 2009

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Луганському державному медичному університеті Міністерства охорони здоров'я України

Науковий керівник : доктор медичних наук, професор, заслужений діяч науки і техніки України Комаревцева Ірина Олександрівна, завідувачка кафедри медичної хімії Луганського державного медичного університету МОЗ України

Офіційні опоненти: доктор медичних наук, начальник Головного управління охорони здоров'я Луганської обласної державної адміністрації Малиш Павло Миколайович;

доктор медичних наук, професор, заслужений діяч науки і техніки України, Лук'янчук Віктор Дмитрович, Луганський державний медичний університет , завідувач кафедри фармакології.

Захист дисертації відбудеться «18» лютого 2010 р. о 12 ⁰⁰ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 29.600.03 при Луганському державному медичному університеті МОЗ України за адресою: 91045, м. Луганськ, кв. 50-річчя Оборони Луганська, 1.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Луганського державного медичного університету МОЗ України за адресою: м. Луганськ, кв. 50-річчя Оборони Луганська, 1.

Автореферат розісланий «13» січня 2010 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, кандидат біологічних наук І.А. Вишницька

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

стовбуровий клітина ішемія

Актуальність теми: Хвороби серцево-судинної системи є одною з головних проблем охорони здоров'я усіх економічно розвинутих країн світу, оскільки кількість таких хворих не тільки достатньо велика, але й продовжує зростати. Актуальність проблеми лікування критичної ішемії нижніх кінцівок обумовлена неухильно зростаючою захворюваністю на оклюзійні хвороби судин, в основному - нижніх кінцівок [Бочков Н.П., 2006; Савельев В.С., Кошкин В.М., 1997]. При цьому розвиток критичної ішемії, яка свідчить про повну декомпенсацію кровообігу, спостерігається з частотою 400-1000 на 1 млн. населення на рік або у 15-20% хворих з оклюзійними захворюваннями судин нижніх кінцівок і за прогнозами в найближчі роки буде збільшуватися на 5-7%. За даними літератури, очікувана смертність пацієнтів з ішемією нижніх кінцівок збільшиться від 25% протягом першого року розвитку синдрому до 60-70%. Потреба у високій ампутації сягає рівня 52-95% і супроводжується загальною смертністю до 71% [Пиптюк О.В., 2005]. До теперішнього часу реконструктивно-відновні операції є єдиним ефективним методом лікування даної категорії хворих. Консервативна терапія, яка традиційно використовується, не є достатньо ефективною і супроводжується втратою кінцівки у 37% хворих протягом 1 року. Проте адекватна реваскулярізація артеріального русла нижньої кінцівки на практиці виявляється можливою лише у 37,3-58% пацієнтів. Останнє пов'язане з сумнівним успіхом ізольованої хірургічної реваскуляризації у пацієнтів з багаторівневим типом та переважно дистальною локалізацією пошкодження. Результати хірургічних втручань, особливо при дистальних пошкодженнях, також не можуть бути визнані задовільними [Бокерия Л.А., 2004].

Сучасний розвиток біотехнології, молекулярної та клітинної біології зробив клітину не тільки головним об'єктом дослідження, але й засобом лікування багатьох захворювань. Так для лікування цукрового діабету широко використовується трансплантація культур островків підшлункової залози; для лікування різноманітних форм печінкової недостатності застосовується екстракорпоральне підключення донорських гепатоцитів та спленоцитів; клітинна терапія використовується для лікування опіків, міодістрофії Дюшена і т.п. [Шумаков В.И., 2006; Спивак И.Я., 2007]. Однак можливості клітинних технологій в судинній хірургії залишаються недостатньо вивченими та нереалізованими.

Протягом останніх років поряд з медікаментозними та хірургічними методами лікування ішемічних станів використовують методику терапевтичного ангіогененезу, яка регулює утворення та розвиток нових кровоносних судин [Madeddu P., 2007]. Вона ґрунтується на застосуванні існуючого у судинній системі потенціалу для росту судин і включає ангіогенез та артеріогенез. Перший дає можливість збільшити щільність капілярів, зменшити судинний опір у ділянці ішемії, другий - створити новий кровотік в обхід ділянки обструкції [Asahara T., et al. 2007].

Дослідження у галузі клітинних біотехнологій знаходяться на початковому етапі свого розвитку і використання даних методик ще не досить поширено. В останні роки було показано позитивний вплив трансплантації клітин різних фенотипів на експериментальних моделях ішемії нижньої кінцівки. Матеріалом для пересадки служили алогенні фетальні кардіоміоцити, фібробласти, антологічні скелетні міобласти, мезенхімальні стовбурові клітини, гладком'язові клітини, ген-трансфецовані [Bianco P., et al. 2006; Summer R., 2004].

Ці дослідження дозволили почати вивчення ефективності методу клітинної трансплантації в клініці. Так з'явилися повідомлення про позитивний вплив трансплантації аутологічних клітин кісткового мозку в ішемізовану м'язову тканину нижньої кінцівки на ангіогенез по клінічним та інструментальним методам обстеження [Bianco P., 2004; Mheid I.A., 2008; Hawley R.G., 2004; Пальцев М.А. , 2004].

У літературі нами не знайдено даних про біохімічні особливості впливу трансплантації мезенхімальних стовбурових клітин на відновлення функцій та кровопостачання пошкодженої м'язової тканини. Тому це дозволило нам сформулювати головну спрямованість наших досліджень, як ідентифікацію нових аспектів впливу клітинної терапії, що повинна призвести до більш глибокого розуміння механізмів дії та утворення принципово нових напрямків клітинної терапії .

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дана робота виконана в рамках державної бюджетної теми МОЗ України: «Механізми апоптоза в культурах клітин та репараційні процеси у тканинах» (№ державної реєстрации 0107U001159).

Мета дослідження. Вивчити у динаміці вплив введення алогенних мезенхімальних стовбурових клітин на показники апоптозу та біохімічні характеристики стану мязової тканини на експериментальній моделі ішемії нижньої кінцівки.

Завдання дослідження:

1. Вивчити вплив введення алогенних мезенхімальних стовбурових клітин на динаміку апоптозу в мязовій тканині нижньої кінцівки в умовах ішемії за біохімічною детекцією з використанням ядерного фарбника Hoechst 33342 та за рівнем ДНК-фрагментації.

2. Дослідити рівень стабільного метаболіту оксиду азоту - нітрит-аніону і вмісту вільного сфінгозину при ішемії нижньої кінцівки після застосування алогенних мезенхімальних стовбурових клітин.

3. Вивчити стан енергетичного обміну мязової тканини нижньої кінцівки за умов експериментальної ішемії та при введенні алогенних мезенхімальних стовбурових клітин.

4. Дослідити рівень оксидантної та антиоксидантної систем мязової тканини за умов ішемії нижньої кінцівки та при застосуванні алогенних мезенхімальних стовбурових клітин.

5. Вивчити динаміку лактатдегідрогенази та креатинфосфокінази у сироватці крові при ішемії нижньої кінцівки та введенні алогенних мезенхімальних стовбурових клітин.

6. Дослідити морфологічні зміни у м'язовій тканині при ішемії нижньої кінцівки після введення алогенних мезенхімальних стовбурових клітин.

Об'єкт дослідження. Ішемічний процес у м'язовій тканині при введенні алогенних мезенхімальних стовбурових клітин.

Предмет дослідження. Біохімічні показники апоптозу, його індукторів і модуляторів; біохімічні показники ішемії нижньої кінцівки при введенні алогенних мезенхімальних стовбурових клітин в експерименті.

Методи дослідження: спектрофотометричний, диференціальне центрифугування, тонкошарова хроматографія, гістологічний, флуоресцентна мікроскопія та статистичні.

Наукова новизна отриманих результатів. В результаті проведеного дослідження вперше вплив введення мезенхімальних стовбурових клітин оцінювали з позиції біохімічного аналізу метаболічних змін м'язової тканини в умовах експерименту.

У результаті проведеного дослідження з використанням біохімічних методів уперше досліджено вплив введення мезенхімальних стовбурових клітин на динаміку апоптоза та вільнорадикального окиснення біосубстратів у ішемізованій тканині. Встановлено, що введення мезенхімальних стовбурових клітин модулює процеси апоптозу та вільнорадикального окислення при ішемічному процесі у м'язовій тканині. Виявлено, що мінімальна апоптотична активність спостерігається на більш ранніх строках спостереження після введення мезенхімальних стовбурових клітин.

Дослідження рівня аденілових нуклеотидів, креатинфосфокінази та лактатдегідрогенази вперше дозволило охарактеризувати стан енергетичного обміну у м'язовій тканині при ішемічному процесі і пояснити механізм протекторної дії алогенних стовбурових клітин в умовах модельованого патологічного процесу.

Вперше дослідження рівня показників оксидантно-антиоксидантної систем м'язової тканини дозволило зробити висновок про те, що ішемічний процес протікає в умовах значної активації вільнорадикального окиснення, залежить від терміну дії ішемічного фактору і модулюється введенням алогенних мезенхімальних стовбурових клітин.

Практична значимість роботи. Виявлені біохімічні зміни можуть суттєво вплинути на розуміння механізму дії мезенхімальних стовбурових клітин та відповідь організму на даний тип впливу, що дозволить розробити методологічний підхід до застосування стовбурових клітин у медицині для лікування хвороб ішемічного ґенезу з урахуванням ранніх та пізніх змін при застосуванні клітинної терапії.

Виявлені показники фрагментації ДНК, оксидантно-антиоксидантної системи, енергетичного обміну в м'язовій тканині ішемізованої нижньої кінцівки можуть бути додатковим критерієм діагностики патологічного процесу.

Результати досліджень використовуються у науково-дослідній роботі при оцінюванні біохімічних процесів при ішемічних ураженнях тканин.

Широко розповсюджені методи клітинної терапії при ішемічних патологіях за своїми характеристиками можуть бути розглянуті через регуляцію метаболічних процесів, що зробить позитивний внесок у клінічну практику.

Особистий внесок здобувача. Автором здійснено аналіз попередніх наукових літературних даних, обґрунтована актуальність і необхідність дослідження, його мета й завдання, сформовано групи спостереження. Особисто розроблено програму дослідження, обґрунтовано й відібрано методи дослідження, розроблено протокол для фіксації результатів і структуру бази даних. Самостійно проведені лабораторні дослідження впливу мезенхімальних стовбурових клітин на біохімічні процеси при ішемії м'язової тканини у сформованих групах тварин. Здобувач безпосередньо приймала участь у проведенні гістологічного аналіза. Заповнена база даних, проведений статистичний аналіз та інтерпритація отриманих результатів. Особисто виконано інформаційний пошук, написання всіх розділів, створення ілюстрацій та формування висновків.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації були повідомлені й апробовані на II-й регіональній науково-практичній конференції молодих учених і студентів “Перспективи розвитку фармацевтичної науки та практики в Україні” (м. Луганськ, 2006 р.); 60-й ювілейній науково-практичній конференції студентів і молодих вчених “Актуальні проблеми сучасної медицини” (м. Київ, 2006 р.); 61-й науково-практичній конференції студентів і молодих вчених “Актуальні проблеми сучасної медицини” (м. Київ, 2007 р.); ІІІ-й регіональній науково-практичній конференції молодих учених і студентів “Перспективи розвитку фармацевтичної науки та практики в Україні” (м. Луганськ, 2007 р.); міжкафедральних засіданнях працівників кафедри медичної хімії й науково-дослідницького центру Луганського державного медичного університету.

Публікації. За результатами дисертаційної роботи опубліковано 12 наукових праць. Серед них: 5 статей у фахових виданнях (1 - без співавторів), 2 патенти на корисну модель, 5 тез доповідей у матеріалах п'ятьох наукових конференцій.

Структура й обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, 4 розділів основної частини (огляду літератури, матеріалів і методів дослідження, розділу результатів власних досліджень, аналізу й узагальнення результатів досліджень), висновків і списку використаних літературних джерел. Робота ілюстрована 4 таблицями й 35 рисунками. Повний обсяг дисертації - 124 сторінок. Список літератури 250 джерел (87 кирилицею, 163 латиницею).

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали й методи дослідження. Експеримент було проведено на 220 білих щурах-самцях 16-18-тижневого віку, маса яких становила 250-300 грамів. При постановці експерименту ми керувалися «Загальними етичними правилами експериментів на тваринах», ухваленими I Національним конгресом з біоетики від 20 вересня 2001 року, Київ, Україна. Протокол експерименту узгоджений з комісією з біоетики Луганського державного медичного університету.

У тварин формували ішемію нижньої кінцівки (ІНК) шляхом лігування з подальшим пересіченням стегнової артерії під тиопенталовим наркозом. Кістковий мозок отримували зі стегнових, великогомілкових та плечових кісток. Клітини кісткового мозку вимивали з порожнини кісток 3 мл середовища Ігла МЕМ у стерильну пробірку, мезенхімальні стовбурові клітини строми (МСК) відділяли від гемопоетичних шляхом ресуспензування, фільтрували через капронову сітку, підраховували кількість життєздатних клітин за допомогою трипанового синього. Крім того розподіл досягався за рахунок адгезії до культурального пластику. Кінцеву концентрацію життєздатних клітин доводили до 5х10⁴ у мл і розливали у культуральний посуд, площею 25 см². Культивування клітин проводили у середовищі Ігла МЕМ, збагаченому L- глютаміном, 10% ембріональною телячою сироваткою із додаванням антибіотиків протягом 12 днів зі зміною Ѕ середи кожні 5 діб. При досягненні 80 - 90 % монослою в острівках клітин первинної культури чи подальших субкультурах МСК проводили їх пасивування. При цьому використовували 20 мМ фосфатний буфер, розчин 0,05% трипсину та розчин Версену. Щільність культури клітин складала 2000 кл/см². Культивування у стандартних умовах проводили при температурі 37°С у атмосфері 5% СО₂ у HF151UV СО₂ - інкубаторі.

Протягом усього терміну культивування проводили фенотипування культури клітин непрямим імунофлюорисцентним методом з використанням специфічних маркерів до мезенхімальних стовбурових клітин: моноклональних антитіл (МКАТ) CD44, CD54, СD90, СD73 (SH3/4) та СD105 (SH2) мічених FITC, (Sigma, США), а також маркерів до гемопоетичних стовбурових клітин СД34 і СД45, мічених FITC (Sigma). Мікроскопію проводили за допомогою люмінесцентного мікроскопу МС300 (Micros Austria) при 400-кратному та 1000 - кратному збільшенні, для зйомки використовували відеокамеру САМ400 (Micros Austria) з програмним забезпеченням Bio Vision version 2.0.

Введення мезенхімальних стовбурових клітин проводили через тиждень після операції. Кількість введених клітин одній тварині складало 5 мільйонів. Клітини вводили внутрішньом'язово за ходом судинно-нервового пучка.

У кожній експериментальній групі тварин проводили морфологічну детекцію апоптозу міоцитів за допомогою флуоресцентної мікроскопії з використанням барвника Хехст 33342, який зв'язується з ДНК; у тій же тканині методом фотометрії визначали відсоток ф-ДНК (Messmer U.K., 1996), активність супероксиддисмутази (СОД), каталази і вміст вільного сфінгозину (модифікований метод Прохорової М.І., 1982); рівень NO₂^- (Орлова Е.А., 2001); рівень спонтанного та індукованого перекисного окислення білка (ПОБ) за рівнем ранніх - альдегіддинітрофенілгідразонів (АФГ) при л=274 нм та пізніх - кетондинітрофенілгідразонів (КФГ) при л=274 нм маркерів ПОБ (Сидорова О.А. та ін., 2005); рівень глутатіону та вільних SH-груп, загальну оксидантну активність (ЗОА) і загальну антиоксидантну активність (ЗАА) сироватки.

За допомогою тонкошарової хроматографії на сілікогелевих пластинах «Сілуфор» (Росія) [Зарубина И.В. и др., 1982] визначали кількість аденілових нуклеотидів, а далі підраховували показники енергетичного обміну в м'язовій тканині [Лук'янчук В.Д., Шевчук О.В., 2006]: енергетичний заряд (ЕЗ) за формулою = АТФ+Ѕ АДФ)/(АТФ+АДФ+АМФ); енергетичний потенціал (ЕП) за співвідношенням = АТФ/АДФ; порівняльний коефіцієнт (К_пор.) за формулою = (АТФ+АМФ)/АДФ; індекс фосфорилювання (ІФ) за співвідношенням = АТФ/(АДФ+АМФ); термодинамічний контроль дихання (ТКД) за співвідношенням = АДФ/АМФ; співвідношення компонентів аденілаткіназної реакції (Г_АК )за співвідношенням = ([АТФ] Ч [АМФ]) / [АДФ]² [Каминский Ю.Г., 1987];

Рівень лактатдегідрогенази та креатинфосфокінази вимірювали з використанням наборів фірми «Bio Systems» (Фінляндія) на біохімічному аналізаторі COBUS INTEGRO 400 фірми Roche (Франція) на базі Луганської діагностичної лабораторії міської поліклініки № 9.

Статистична обробка результатів досліджень. Статистичну обробку результатів проводили з використанням критерію Стьюдента. Зокрема визначали середнє арифметичне значення (М), стандартну помилку (m), середнє квадратичне відхилення (у), провели кореляційний аналіз. Коефіцієнт достовірності змін визначали за Стьюдентом (Р) [Деркач М.П. та інш., 1977] за допомогою комп'ютерної програми Microsoft Exel. Результати розцінювалися як достовірні при р < 0,05.

Результати дослідження та їх обговорення. В ході експерименту, як відомо, одним з найбільш характерних біохімічних критеріїв оцінки активності процесів апоптозу в тканині, а саме термінальної його фази, є показник фрагментації виділеної ДНК (Walker P.R., 1994).

Судячи з цього введення МСК зумовлює антиапоптотичну дію на клітини м'язової тканини в умовах ішемічного процесу, що може бути пов'язано з індуктивними та інформаційними властивостями МСК: продукцією проангиогенних та антиапоптотичних цитокінів, регуляцією запалення та імунних реакцій, стимуляцією регенерації клітин та підвищенням стійкості до ішемічних уражень.



Рис. 1. Рівень фрагментації ДНК (%) у м'язовій тканині при формуванні ІНК та введенні МСК.

Примітка: * - показники достовірні по відношенню до групи контролю (р0,05);

** - показники достовірні по відношенню до групи ІНК (р0,05);

# - показники достовірні по відношенню до групи ІНК (р0,001).

Проведені нами дослідження показали (Рис. 1), що найбільший рівень ф-ДНК при моделюванні ІНК був на сьому добу експерименту - 71,7 % (р<0,05) з подальшим зниженням значень до двадцять восьмої доби - 56,17 % (р<0,05). Введення МСК призвело до достовірного зниження рівня ф-ДНК по відношенню до групи ІНК на 3, 5, 7, 21 й 28 добу - падіння відсотка фрагментації склало 34,02 % (р<0,05), 38,46 % (р<0,05) , 44,97 % (р<0,001), 32,3 % (р<0,05) й 42,2 % (р<0,05) відповідно.

Ці дані мали своє підтвердження при морфологічній оцінці зрізів мязової тканини відповідних експериментальних груп із застосуванням гематоксилин-еозину та імунофлуоресцентного забарвлення за Хехстом.

Характерною рисою пошкодження м'язової тканини в умовах ішемії та оксидантного стресу є активація кислої сфінгомієлінази, яка супроводжується частковим гідролізом мембранних фосфоліпідів (Dyntar D., et al., 2001; Son J.H., et al., 2007). Нами було проведене визначення рівня вільного сфінгозину у м'язовій тканині при ІНК (Рис. 2).

Так, у щурів контрольної групи вміст вільного сфінгозину дорівнював 2,09±0,28 мкг/г. Експериментальна ІНК супроводжувалася збільшенням концентрації вільного сфінгозину, яка складала: 5,45±0,13 мкг/г (p<0,05), 5,82±1,13 мкг/г (p<0,05), 6,91±1,17 мкг/г (p<0,05), 6,78±1,14 мкг/г (p<0,05), 5,69±0,28 мкг/г (p<0,05) і 5,01±0,19 мкг/г (p<0,05) відповідно до діб спостереження. При введенні МСК підвищення рівня сфінгозину мало такі значення: 3,67±0,36 мкг/г (p<0,05), 4,03±0,47 мкг/г (p<0,05), 4,28±0,38 мкг/г (p<0,001), 7,04±0,61 мкг/г, 4,02±0,38 мкг/г (p<0,05) та 3,6±0,39 мкг/г (p<0,05) відповідно до діб спостереження. Більш низький відсоток збільшення сфінгозину може констатувати менш виражений рівень медіації для подальшої деструкції фосфоліпідних компонентів клітинних мембран та апоптотичної загибелі клітин м'язової тканини в умовах ішемії (Рис. 2).

У зв'язку з тим, що NO розглядається як біфункціональна молекула, механізм дії якої залежить від умов, за яких вона синтезується (Манухина Е.Б. и др., 2002), нами було вивчено концентрацію його стабільного метаболіта - нітрит-аніона (Рис. 3). Формування ІНК характеризувалося різною динамікою вмісту нітрит-аніону уже з першої доби спостереження: на 3, 21 та 28 добу рівень нітратів збільшувався на 56,7% (р<0,001), на 21 - 49,04 % (р<0,001) та 42,2% (р<0,001) відповідно у порівнянні з групою тварин, яким не вводили МСК. Зниження рівня даного показника спостерігалося на 7 добу спостереження на 21,1% (p<0,05).

Це підтверджується літературними даними, що МСК підвищують активність e-NOS безпосередньо або через VEGF, що і призводить до гіперпродукції NO.

Рис. 2. Рівень вільного сфінгозину (нг/мг білка) у м'язовій тканині при формуванні ІНК та введенні МСК.

Примітка: * - показники достовірні по відношенню до групи контролю (р0,05);

** - показники достовірні по відношенню до групи ІНК (р0,05);

# - показники достовірні по відношенню до групи ІНК (р0,001).

Рис. 3. Рівень нітрит-аніону (мкг/мг) в м'язовій тканині при формуванні ІНК та введенні МСК.

Примітка: * - показники достовірні по відношенню до групи контролю (р0,05);

** - показники достовірні по відношенню до групи ІНК (р0,05);

# - показники достовірні по відношенню до групи ІНК (р0,001).

Також, NO є активатором сателітних клітин, які приймають участь у постнатальній репарации м'язової тканини. Крім того, шляхом гіперпродукції NO МСК реалізують свій протизапальний та імуносупресивний ефект, що важливо в умовах модельованого експеримента, враховуючи те, що ми використовували алогенний клітинний матеріал і саме цей механізм протидіє розвитку реакції відторгнення трансплантату.

Таблиця 1. Показники активності спонтанного та індукованого перекисного окислення білків у м'язовій тканині за умов ІНК та введені МСК (ум. од.)

Група тварин	Доба	АФГ (л=270 нм)	КФГ (л=363 нм)
		СПОБ	ІПОБ	СПОБ	ІПОБ
Контроль	-	2,87±0,56	1,504±0,05	3,89±0,53	2,061±0,08
ІНК	3	4,33±0,56 *	1,82±0,11 *	5,26±0,51*	2,56±0,17
	5	4,48±0,26 *	1,81±0,12 *	5,73±0,38*	2,93±0,24
	7	5,86±0,83 *	2,43±0,34 *	6,86±0,96*	3,83±0,28*
	14	4,08±0,78 *	2,07±0,13 *	6,9±0,73*	3,76±0,15*
	21	3,66±0,67 *	2,04±0,19 *	5,86±0,87*	2,86±0,27
	28	3,66±0,34 *	1,94±0,12 *	5,86±0,57	2,86±0,23
ІНК +МСК	3	3,9±0,28 *	1,36±0,11*,**	4,97±0,23*	2,36±0,34
	5	4,16±0,23 *	1,065±0,09 *,**	4,36±0,43	2,64±0,21
	7	3,66±0,5 **	1,36±0,06 *	5,93±0,89*	2,28±0,07**
	14	4,66±0,65 *	1,91±0,07 *	6,3±0,51**	2,7±0,06**
	21	3,31±0,71	1,46±0,12 **	4,75±0,58	2,04±0,08**
	28	3,22±0,24	1,604±0,11**	4,01±0,25**	2,29±0,19**

Примітка: * - показники достовірні по відношенню до групи контролю (р0,05);

** - показники достовірні по відношенню до групи ІНК (р0,05);

Відомо, що ішемічний процес протікає на фоні активації вільнорадикального окислення, необхідно зазначити необхідність вивчення динаміки показників оксидантно-антиоксидантної системи тканини при ІНК та введенні МСК. Виявлено, що введення МСК пригнічує перекисне окислення білків в умовах ІНК, за рахунок зниження вмісту альдегіддинітрофенілгідразонів та кетондинітрофенілгідразонів при спонтанному та індукованому перекисному окисленні білків у м'язовій тканині (Табл. 1).

Характеризуючи прооксидантну та антиокисну рівновагу в тканинах ми оцінили активність СОД (Рис. 4), як ключового ферменту антиоксидантного захисту (Molavi B. et al., 2004; Childs C. et al., 2002).

Встановлено, що введення МСК істотно попереджає інактивацію СОД, та сприяє підвищенню активності даного ферменту особливо на 3, 5, 7 та 21 доби спостереження; підвищення склало 36,5% (р<0,001), 70,6% (р<0,001), 85,7% (р<0,001) та 38,4% (р<0,001) відповідно у порівнянні з групою тварин, яким не вводили МСК. Зниження активності СОД спостерігалося на 14 та 21 добу експерименту, і становить 51,4% (р<0,001) та 58,4% (р<0,001) відповідно.

Рис. 4. Рівень активності СОД у м'язовій тканині при формуванні ІНК та введенні МСК (% інгібіювання аутоокислення адреналіну).

Примітка: * - показники достовірні по відношенню до групи контролю (р0,05);

** - показники достовірні по відношенню до групи ІНК (р0,05);

# - показники достовірні по відношенню до групи ІНК (р0,001).

Динаміка активності іншого компонента ферментативної системи антирадикального захисту - каталази була східною, що свідчить про підвищення резистентності тканини до генерації вільних радикалів та більш ефективне знешкодження їх при введенні МСК. Також нами було проведено дослідження неферментативної ланки антиоксидантної системи тканини, що включає глутатіон відновленний та сульфгідрільні групи. Встановлено, що введення МСК позитивно впливає на рівень сульфгідрильних груп та глутатіону, попереджуючи їх використання у окисних реакціях та більш швидкому відновленню.

З метою підтвердження системного характеру зазначених впливів ми провели біохімічне дослідження ЗОА й ЗАА сироватки крові. Ці показники досить виразно говорили про наявність найбільших пошкоджень у системі антиоксидантного захисту в групі ІНК, переважно на третю й п'яту добу, коли вони мали статистично достовірну відмінність щодо контрольних величин. Також дуже чітко простежувалася динаміка змін у бік активації антиоксидантного захисту при введенні МСК.

Енергетичний обмін є найбільш характерним біохімічним критерієм оцінки активності ішемічного процесу в тканині. Проведені нами дослідження виявили (Табл. 2), що формування ІНК призводить до істотного зниження рівня аденозинтрифосфату (АТФ) проти контрольної групи на 61,8% (р<0,05), 59,7% (р<0,05), 53,6% (р<0,05), 42,19% (р<0,05), 43,5% (р<0,05) та 22,9% (р<0,05) відповідно до діб спостереження. Введення МСК призвело до достовірного підвищення рівня АТФ по відношенню до групи ІНК на 3-ю, 5-у, 7-у, 21-у, 28-у добу - підвищення рівня АТФ склало 35,17 % (р<0,001), 29,6 % (р<0,001), 13,39 % (р<0,05) , 17, 26% (р<0,05) та 17,7% (р<0,05) відповідно. На 14 добу в групі ІНК+МСК спостерігалось зниження рівня АТФ на 41% (р<0,001) проти групи ІНК. Рівень аденозиндифосфату (АДФ) та аденозинмонофосфату (АМФ) в групі ІНК був підвищений впродовж всіх діб спостереження проти контрольної групи особливо на 3-ю, 5-у, 7-у, та 14-у доби спостереження. Група ІНК+МСК характеризувалася більш низьким рівнем АДФ та АМФ проти групи ІНК.

Для максимально повної оцінки стану енергозабезпечення м'язової тканини при ІНК та введенні МСК, важливо знати співвідношення аденілових нуклеотидів. За їх рівнем нами було підраховано показники енергетичного обміну. Доведено, що введення МСК перерозподіляє пул аденілових нуклеотидів на користь синтезу АТФ, збільшуючи при цьому такі параметри енергетичного обміну як енергетичний заряд (Рис. 5), енергетичний потенціал, термодинамічний контроль дихання та зменшує співвідношення компонентів аденілаткіназної реакції.

Таблиця 2. Вміст аденілових нуклеотидів у м'язовій тканині при ІНК та введенні МСК (мікромоль/кг)

Показник	Група	Доба спостереження
		3	5	7	14	21	28
АТФ	контроль	7108,78±24,56
	ІНК	2714,2 ±25,84*	2864,3 ±59,79*	3297,3 ±46,33*	4109,4 ±26,52*	4015 ±18,01*	5479,8 ±45,9*
	ІНК+МСК	4188,3 ±11,84*,**,#	4069,4 ±33,68*,**,#	3807,2 ±44,29*	2378,3 ±16,76*,**,#	4853,5 ±43,93*,**	6661,7 ±57,74*,**
АДФ	контроль	975,35±35,64
	ІНК	1857,2 ±19,7*	1749,3 ±11,43*	1289,8 ±56,74*	1506,9 ±11,8*	1275,9 ±30,92*	1458,8 ±17,8*
	ІНК+МСК	1790,3 ±13,8*	1661,7 ±11,25*	1571,4 ±35,28*	2422,9 ±39,61*,**	879,08 ±37,53*,**	1104,2 ±10,28*,**
АМФ	контроль	941,98±8,2
	ІНК	2295,8 ±80,44*	2233,2 ±67,33*	1673,1 ±13,19*	1875,2 ±13,92*	1358,6 ±21,56*	1583,3 ±14,26*
	ІНК+МСК	1785,9 ±39,74*,**	1682,9 ±57,9*,**,#	1748,9 ±33,3*	3337,8 ±21,68*,**,#	1070,1 ±38,4*,**	1014,2 ±11,92*,**,#

Примітка: * - показники достовірні по відношенню до групи контролю (р0,05);

** - показники достовірні по відношенню до групи ІНК (р0,05);

# - показники достовірні по відношенню до групи ІНК (р0,001).



Рис. 5. Рівень енергетичного заряду у м'язовій тканині при формуванні ІНК та введенні МСК (ум. од.).

Примітка: * - показники достовірні по відношенню до групи контролю (р0,05);

** - показники достовірні по відношенню до групи ІНК (р0,05);

Поряд з цим при ІНК при введенні МСК знижується активність лактатдегідрогенази (Рис. 6) та підвищується активність креатинфосфокінази (Рис. 7) у порівнянні з контролем, що таким чином сприяє індукції ефективних шляхів ресинтезу макроергів.

Такого роду зміни за літературними даними можуть бути пов'язані з можливостями МСК надавати протекторну дію на енергетичний гомеостаз шляхом синтезу великої кількості цитокінів та факторів росту, які стимулюють синтез ферментів гліколізу та циклу Кребса, підвищують споживання глюкози з подальшим її окисненням та синтезом АТФ. Таким чином, відбувається активація швидких та ефективних шляхів синтезу АТФ, що реалізується стабілізацією рівня останнього та відновленням ступеня заповнення системи АТФ-АДФ-АМФ високоенергетичними фосфатними зв'язками. Також необхідно враховувати те, що в умовах експерименту ми вводили значну кількість МСК, які також приймають участь у тканинному енергообміні та вносять додаткову частку макроергів у загальний пул аденілових нуклеотидів. Динаміка вмісту макроергів на 14 добу спостереження свідчить, згідно з літературними даними, про істотний рівень клітинної проліферації як МСК так і сателітних клітин, що веде до превалювання енергоспоживання над енергосинтезом. Після закінчення «хвилі» проліферації відбувається нормалізація співвідношення компонентів аденіннуклеотидної системи, що співпадає з отриманими нами даними.

Рис. 6. Рівень активності лактатдегідрогенази (МО/літр) у плазмі при формуванні ІНК та введенні МСК.

Примітка: * - показники достовірні по відношенню до групи контролю (р0,05);

** - показники достовірні по відношенню до групи ІНК (р0,05);

# - показники достовірні по відношенню до групи ІНК (р0,001).

При мікроскопічному дослідженні гістологічних препаратів після введення алогенних МСК виявлено, підвищення активності сателітних клітин зі скопиченням їх у місцях пошкодження м'язових волокон. У судинах перимізію відмічалося утворення великої кількості судинних бруньок та вростання їх у напрямку круглоклітинних інфільтратів.

Рис. 7. Рівень активності креатинфосфокінази (МО/літр) у плазмі при формуванні ІНК та введенні МСК.

Примітка: * - показники достовірні по відношенню до групи контролю (р0,05);

** - показники достовірні по відношенню до групи ІНК (р0,05);

# - показники достовірні по відношенню до групи ІНК (р0,001).

Висновки

За результатами експериментального дослідження отримано важливі дані стосовно впливу алогенних мезенхімальних стовбурових клітин на процеси апоптозу та біохімічні показники при ішемії нижньої кінцівки в експерименті. Отже, застосування мезенхімальних стовбурових клітин обумовлює зменшення активності апоптотичних процесів та сприяє більш ефективному функціонуванню адаптивно-копменсаторних реакцій у м'язовій тканині. А також, введення алогенних мезенхімальних стовбурових клітин при ішемії нижньої кінцівки, призводить до поліпшення показників енергетичного обміну у м'язовій тканині, запобіганню дисбалансу у системі АТФ-АДФ-АМФ, підвищенню активності антиоксидантної системи та пригніченню вільнорадикального окиснення.

1. Встановлено, що застосування алогенних мезенхімальних стовбурових клітин призводить до пригнічення процесів апоптозу в мязовій тканині при ішемічному ураженні. При цьому, більш істотне зниження деградації ДНК спостерігалося на 5-у, 7-у и 28-у доби після введення мезенхімальних стовбурових клітин.

2. Встановлено збільшення продукції нітрит-аніону на 3-тю, 21-у та 28-у добу та його зниження на 7-у добу під впливом алогенних мезенхімальних стовбурових клітин у мязовій тканині нижньої кінцівки за умов ішемії. Динаміка вмісту вільного сфінгозину характеризувалась протилежною динамікою, максимальна продукція була зафіксована на 14-ту добу, тоді як мінімальна на 3-тю, 5-ту, 28-му доби після введення алогенних мезенхімальних стовбурових клітин.

3. При введенні мезенхімальних стовбурових клітин спостерігається зменшення активності вільнорадикального окиснення за зниженням вмісту ранніх та пізніх продуктів спонтанного та індукованого перекисного окиснення. Поряд з цим відбувається збільшення активності компонентів ферментативної (супероксиддисмутаза, каталаза) та збереження пулу не ферментативної ланки (глутатіон відновлений, SH-групи) антиоксидантного захисту тканини.

4. Встановлена протекторна дія мезенхімальних стовбурових клітин на енергетичний метаболізм при ішемічному ураженні мязової тканини, що реалізується за рахунок стабілізації показників енергетичного обміну та усуненні дисбалансу в системі аденілових нуклеотидів.

5. Застосування алогенних мезенхімальних стовбурових клітин підвищує активність креатинфосфокінази та знижує антивність лактатдегідрогенази, що сприяє індукції більш ефективних шляхів ресинтезу макроергічних фосфатів.

6. Показано, що введення мезенхімальних стовбурових клітин призводить до підвищення активності сателітних клітин, утворення великої кількості судинних бруньок, що свідчить про активацію репараційних процесів у м'язовій тканині.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ РОБІТ

1. Шипилова И.В. Динамика содержания лактатдегидрогеназы и креатинкиназы в сыворотке крови при ишемии нижней конечности на фоне применения аллогенных мезенхимальных стволових клеток / Шипилова И.В. // Український журнал екстремальної медицини імені Г.О. Можаєва. - 2008. - № 3. - С. 98-101.

2. Патент на корисну модель 25410 Україна, МПК C12N 5/08 G01N 24/00. Метод ранньої діагностики апоптотичніх процесів в культурах клітин / Комаревцева І.О.; заявники та власники патенту Комаревцева І.О., Клімочкіна О.М., Орлова О.А., Андронова М.Є., Шипілова І.В., Бріндак Д.В. - № u 2007 02992 ; заявл. 21.03.07 ; опубл. 10.08.07, Бюл. № 12.

3. Патент на корисну модель 24577 Україна, МПК С12N 5/08 G01N 33/49. Спосіб визначення вмісту стабільних метаболітів оксиду азоту в культурі клітин / Комаревцева І.О.; заявники та власники патенту Комаревцева І.О., Клімочкіна О.М., Андронова М.Є., Шипілова І.В. - № u 200700413; заявл. 16.01.07; опубл. 10.07.07, Бюл. № 10.

4. Комаревцева И.А. Уровень адениловых нуклеотидов в мышечной ткани ишемизированной конечности при ведении мезенхимальных стволовых клеток в эксперименте / И.А. Комаревцева, И.В. Шипилова // Український медичний альманах. - 2007. - № 4. - С. 77-81.

5. Комаревцева И.А.Содержание нитрит-аниона, супероксиддисмутазы в мышечной ткани и общей оксидантной и антиоксидантной активности плазмы при ишемии нижней конечности и коррекции этого состояния мезенхимальными стволовыми клетками в эксперименте / Комаревцева И.А., Шипилова И.В. // Український медичний альманах. - 2007. - № 6. - С. 72-75.

6. Комаревцева И.А. Динамика содержания окислительно модифицированных белков при ишемии нижней конечности на фоне применения аллогенных стволовых клеток / И.А. Комаревцева, И.В. Шипилова // Український медичний альманах. - 2007. - № 5. - С. 72-75.

7. Комаревцева И.А. Состояние уровня фрагментированной ДНК, свободного сфингозина и их связь с антиоксидантной системой при введении мезенхимальных стволовых клеток животным с ишемией нижней конечности / И.А. Комаревцева, И.В. Шипилова // Український журнал екстремальної медицини імені Г.О. Можаєва. - 2008. - № 4. - С. 92-96.

8. Уровень адениловых нуклеотидов в мышечной ткани ишемизированной конечности при ведении мезенхимальных стволовых клеток в эксперименте / И.В. Шипилова, Г.Т. Порчхидзе, Д.С. Салыкин [и др.] // Тези 61 науково - практичної конференції студентів та молодих вчених Національного медичного університету імені О.О.Богомольця з міжнародною участю “Актуальні проблеми сучасної медицини”. - Київ, 2007. - С. 258.

9. Биохимические показатели ишемии мышечной ткани в эксперименте / И.В. Шипилова, Г.Т. Порчхидзе, Д.С. Салыкин [и др.] // Тези 60 науково - практичної конференції студентів та молодих вчених Національного медичного університету імені О.О.Богомольця з міжнародною участю “Актуальні проблеми сучасної медицини”. - Київ, 2007. - С.56.

10. Динаміка вмісту продуктів окислювальної модифікації білків під час тривалої ішемії нижньої кінцівки на фоні застосування мезенхімальних стовбурових клітин в експерименті / І.В. Шипілова, П.Е. Голубков, В.В. Орлова [та ін.] // Перспективи розвитку фармацевтичної науки та практики в Україні: Тези IIІ регіональної науково-практичної конференції молодих вчених і студентів. - Луганськ, 2007. - С. 52-53.

11. Бриндак Д.В. Трансплантация культивированных мезенхимальных стволовых клеток костного мозга крыс животным с ишемией ткани / Д.В. Бриндак, И.В.Шипилова, А.С. Приходько // Перспективи розвитку фармацевтичної науки та практики в Україні: Тези II регіональної науково-практичної конференції молодих вчених і студентів. - Луганськ, 2006. - С. 20-21.

12. Шипилова И. В. Определение базового уровня фрагментации ДНК и стабильных метаболитов оксида азота в скелетной мышечной ткани / И. В. Шипилова, Д.С. Андреев // Матеріали другої міжнародної науково-практичної конференції «Наукові дослідження та експеримент». - Полтава, 2006. - С.112-113.

АНОТАЦІЯ

Шипілова І. В. Біохімічні особливості ішемії нижньої кінцівки при введенні алогенних мезенхімальних стовбурових клітин в експерименті. ? Рукопис.

Дисертація на здобуття вченого ступеня кандидата медичних наук за фахом 14.01.32 - медична біохімія. ? Луганський державний медичний університет, м. Луганськ, 2009 р.

Дисертаційна робота присвячена вивченню біохімічних особливостей протікання ішемічного процесу у м'язовій тканині при застосуванні мезенхімальних стовбурових клітин за рівнем енергозабезпечення, динаміки ферментів креатифосфокінази та лактатдегідрогенази, оксидантно-антиоксидантного статусу м'язової тканини, динаміки процесів апоптозу та морфологічного дослідження.

Мезенхімальні стовбурові клітини виділяли та культивували за методикою Декстера. У м'язовій тканині визначали: енергетичний обмін за рівнем аденілових нуклеотидів; показники оксидантно-антиоксидантної системи за рівнем перекисного окислення білків, супероксиддисмутази, каталази, глутатіону, SH-груп, нітрит-аніону; рівень апоптозу за ДНК-фрагментацією та рівнем вільного сфінгозину; морфологічні зміни при окрасці гістологічних препаратів гематоксилін-езином, по Ван-Гізон та азур-2-еозином. У сироватці оцінювали показники загальної лактатдегідрогенази та креатинфосфокінази, загальної оксидантної та антиоксидантної активності. Дослідження вищезазначених показників проводили на 3, 5, 7, 14, 21 та 28 доби після введення МСК .

За результатами проведеного дослідження встановлено, що введення МСК має протекторну дію на енергетичний метаболізм, шляхом підвищення рівня АТФ, нормалізації співвідношення у системі АТФ-АДФ-АМФ, зниження вмісту лактатдегідрогенази та підвищення активності креатинфосфокінази; пригнічує перекисне окиснення білків у тканині та підвищує активність системи антирадикального захисту. Також встановлено, що введення МСК зменшує активність апоптотичних процесів, що в свою чергу, сприяє більш швидкому та ефективному протіканню репаративних процесів та відновленню кровообігу у ішемізованій тканині, про що свідчать результати гістологічного дослідження.

Ключові слова: ішемія нижньої кінцівки, мезенхімальні стовбурові клітини, енергетичний обмін, оксидантно-антиоксидантна система, апоптоз.

АННОТАЦИЯ

Шипилова И. В. Биохимические особенности ишемии нижней конечности при введении аллогенных мезенхимальных стволовых клеток в эксперименте.- Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук по специальности 14.01.32 ? медицинская биохимия. ? Луганский государственний медицинский университет, г. Луганск, 2009 г.

Диссертационная работа посвящена изучению биохимических особенностей протекания ишемического процесса при введении аллогенных мезенхимальных стволовых клеток по оценке состояния энергетического обмена, динамики ферментов креатинфосфокиназы и лактатдегидрогеназы, оксидантно-антиоксидантного статуса мышечной ткани, динамике процессов апоптоза а также по результатам морфологического исследования.

Исследования проведены на 220 белых беспородных половозрелых крысах самцах массой 160-200 г в лабораториях Научно-исследовательского центра Луганского государственного медицинского университета. Экспериментальную ишемию нижних конечностей изучали на модели редуцированного кровообращения, которую формировали путем лигирования с дальнейшим пересечением бедренной артерии под тиопенталовым наркозом. Выделение и культивирование мезенхимальных стволовых клеток проводили по методике Декстера. Оценку жизнеспособности и количества клеток проводили по тесту с трипановым синим. Введение мезенхимальных стволовых клеток проводили через неделю после операции. Количество вводимых клеток одному животному составило 5 миллионов клеток. Клетки вводили внутримышечно по ходу сосудисто-нервного пучка. Все исследования проводились в динамике на 3, 5, 7, 14, 21, 28 сутки после введения мезенхимальных стволовых клеток. В мышечной ткани определяли уровень энергетического обмена по содержанию адениловых нуклеотидов; активность свободнорадикального окисления по содержанию метаболитов спонтанного и индуцированного перекисного окисления белков (ПОБ); уровень антиоксидантной защиты ткани по активности супероксиддисмутазы, каталазы, а также по динамике содержания глутатиона и свободных SH-групп; уровень содержания нитрит-аниона; уровень апоптоза по ДНК-фрагментации и содержанию свободного сфингозина. В сыворотке оценивали уровень общей лактатдегидрогеназы, креатинфосфокиназы а также уровень общей оксидантной и антиоксидантной активности. Кроме того, было проведено морфологическое исследование мышечной ткани по окраске гистологических препаратов гематоксилин-эозином, по Ван-Гизон и азур-2-эозином.

Полученные результаты исследований показали, что введение мезенхимальных стволовых клеток оказывает протекторное действие на систему энергообеспечения мышечной ткани в условиях ишемии нижних конечностей, что реализуется путем повышением уровня АТФ и устранением дисбаланса в системе АТФ-АДФ-АМФ. Рассчитанные по уровню адениловых нуклеотидов коэффициенты энергетического статуса (энергетический заряд, индекс фосфорилирования, термодинамический контроль дыхания, энергетический потенциал, соотношение компонентов аденилаткиназной реакции и коэффициент сравнения) также свидетельствуют о положительном влиянии МСК на энергетический метаболизм ткани. Кроме того, введение МСК повышало активность креатинфосфокиназы и снижало активность лактатдегидрогеназы в сыворотке крови.

Установлено, что МСК изменяют динамику продуктов спонтанного и индуцированного ПОБ, путем снижения уровня альдегидфенилгидразонов и кетофенилгидразонов. Также, введение МСК приводило к повышению функциональной активности и содержания компонентов ферментативного и неферментативного звеньев антиоксидантной системы защиты ткани. Уровень нитрит-аниона существенно повышался в результате применения МСК. Как показало наше исследование, уровень фрагментации ДНК и свободного сфингозина существенно снижался после применения МСК, что в свою очередь, коррелирует с угнетением окислительных процессов в мышечной ткани и активацией антиоксидантной системы. Это способствует более быстрому и эффективному протеканию репаративных процессов и восстановлению кровообращения в ишемизированной ткани, что подтверждается результатами гистологического исследования.

Таким образом, установленные изменения при введении МСК позволяют говорить об участии этих клеток в энергетическом и оксидантно-антиоксидантном метаболизме мышечной ткани при ишемии нижней конечности. Это, в свою очередь, дает новые научные представления о механизмах действия клеточной трансплантации влияния при ишемических процессах и способствует продолжению исследований по разработке новых подходов в сосудистой хирургии.

Ключевые слова: ишемия нижней конечности, мезенхимальные стволовые клетки, энергетический обмен, оксидантно-антиоксидантная система, апоптоз.

SUMMARY

Shipilova I. V. The biochemical feature of ischemia of lower extremity under allogenic mesenchymal stem cells introduction in experiment. - Manuscript.

Dissertation on the receipt of graduate degree of candidate of medical sciences on speciality 14.01.32 -medical biochemistry. - Luhansk state medical university, Luhansk, 2009.

Dissertation work is devoted the study of biochemical features of flowing of ischemic process in muscular tissue at application of mesenchimal stem cells by level of energy supplying, enzymes creatine phosphokinase and lactate dehydrogenase dynamics, oxidative-antioxidative status of muscular tissue, apoptosis processes dynamics and morphological investigation.

Mesenchymal stem cells selected and cultivated by Dekster's method. In muscular tissue was determined: an energy exchange by the level of adenylic nucleotides; indexes of the oxidative-antioxidative system by the level of proteins peroxide oxidation, superoxide dismutase, catalase, glutathione, SH-groups, the nitrite anion; a level of apoptosis by the DNA-fragmentation and by the level of free sphingosine; morphological changes by coloring of histological preparations by hematoxilin-eosin, by Van-Gizon and azur-2-eosin. In the serum the indexes of general lactate dehydrogenase and creatine phosphokinase was estimated, general oxidative and antioxidative activity. Researches of afore-mentioned indexes conducted on 3, 5, 7, 14, 21 and 28 days after introduction of MSC.

As a result of the conducted research it is set, that introduction of MSC make protective action on energy metabolism, by the increasing of ATP level, normalizations of correlation in the system ATP-ADP-AMP, the decline of lactate dehydrogenase content and increasing of creatine phosphokinase activity; they represse peroxide oxidation of proteins in tissue and promote activity of the antiradical defense system. It is also set that introduction of MSC diminisheds activity of apoptotic processes, that is in it's turn promotes more rapid and effective flowing of reparative processes and proceeding in circulation of blood in tissue with ischemia, due to the results of histological research.

Key words: ischemia of lower extremity, mesenchymal stem cells, energy exchange, oxidative-antioxidative system, apoptosis.

Размещено на Allbest.ru