Роль загальних і місцевих чинників у розвитку кальцифікації артеріальної стінки, зумовленої гіпервітамінозом D

Размещено на http://www.allbest.ru/

Міністерство охорони здоров'я України

Харківський національний медичний університет

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук

РОЛЬ ЗАГАЛЬНИХ І МІСЦЕВИХ ЧИННИКІВ У РОЗВИТКУ КАЛЬЦИФІКАЦІЇ АРТЕРІАЛЬНОЇ СТІНКИ, ЗУМОВЛЕНОЇ ГІПЕРВІТАМІНОЗОМ D

Спеціальність: Патологічна фізіологія

Хижня Ярослава Володимирівна

Харків, 2011 рік

1. ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Проблема етіології та патогенезу склеротичних уражень кровоносних судин - основної причини фатально небезпечних ускладнень: інфаркту міокарда, інсультів, аневризми аорти та ін. - посідає одне з перших місць серед наукових проблем як клінічної, так і експериментальної медицини. Це зумовлено тим, що у високорозвинених країнах світу, а також в Україні поширеність та смертність від серцево-судинних недуг є вкрай високими.

Численні теорії, що пояснюють механізми уражень судинної стінки, залежно від того, як вони відповідають на питання про співвідношення загальних і місцевих чинників у розвитку артеріосклерозу, можуть бути об'єднані у дві основні концепції. Відповідно до першої з них визначальним механізмом уражень судинної стінки є первинні розлади обміну речовин в організмі (зокрема метаболізму ліпідів, фосфорно-кальцієвого обміну), які спричиняються до змін біохімічного складу плазми крові, що у свою чергу зумовлює розвиток вторинних дистрофічних і склеротичних змін у стінці кровоносних судин (Н.Н. Аничков, 1933, А.Н. Климов, 1987, Fredrickson, 1972, D. Zilversmit, 1973, Goldstein and Brown, 1980). Прихильники другої концепції вважають, що патогенетичну основу уражень кровоносних судин складають місцеві зміни у судинній стінці, які є первинними по відношенню до загальних метаболічних порушень в організмі. Вплив останніх на судини найчастіше носить вторинний характер.

Одним з інструментів вивчення співвідношення загальних і місцевих механізмів у розвитку склеротичних уражень судин є D-гіпервітамінозна модель артеріосклерозу, яка відтворює основні риси артеріосклерозу Менкеберга - медіанекроз, медіакальциноз і медіасклероз. Розвиток уявлень про механізми біологічних впливів вітаміну D на фосфорно-кальцієвий обмін взагалі і процеси, що відбуваються в кровоносних судинах, зокрема створює необхідні передумови для пошуку відповіді на позначене питання.

Крім того, і сама проблема гіпервітамінозу D набуває все більшої актуальності. Так, у значної частини населення (дорослих і дітей) ряду європейських країн відмічають надмірне споживання вітаміну D як харчової добавки. У країнах, що розвиваються, гіпервітаміноз D у дітей часто є наслідком проведення профілактики рахіту за так званими ударними схемами. Для попередження і лікування остеопорозу й уражень кісток, зокрема, у хворих з хронічною нирковою недостатністю, використовують високі дози препаратів вітаміну D. Не так уже й рідко бувають випадки гострих побутових і виробничих отруєнь спиртовими та олійними розчинами ергокальциферолу кальцифікації артеріальних судин, патогенез якої до кінця не з'ясований. Нема остаточної відповіді і на питання, яким чинникам - загальним (порушення фосфорно-кальцієвого обміну) чи місцевим (первинні дистрофічні зміни судинної стінки) - належить провідне значення в розвитку судинних проявів D-вітамінної інтоксикації. Саме ця обставина і спонукала нас до проведення власних досліджень.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертацію виконано відповідно до плану наукових досліджень Сумського державного університету МОНМС України.

Вона є самостійним фрагментом науково-дослідної теми «Вивчення стану здоров'я дитячого та дорослого населення Сумської області в умовах впливу несприятливих соціальних, економічних та екологічних чинників» (номер держреєстрації 0101U002098).

Мета дослідження - з'ясування ролі загальних порушень фосфорно-кальцієвого обміну і місцевих змін судинної стінки в патогенезі кальцифікації артерій, що виникає за умов експериментального гіпервітамінозу D.

Для досягнення поставленої мети вирішувались такі завдання.

1. Вивчити загальні показники, що характеризують стан фосфорно-кальцієвого обміну в організмі тварин з гіпервітамінозом D: вміст кальцію і неорганічного фосфору, активність лужної фосфатази в сироватці крові;

2. Дати характеристику змін, що відбуваються у кістковій тканині і можуть впливати на загальні показники фосфорно-кальцієвого обміну та мінералізацію судинної стінки при введенні тваринам високих доз вітаміну D (вміст кальцію, магнію та мікроелементів у кістковій тканині щурів, біомеха-нічні властивості кісток, структура кристалів біоапатиту);

3. Отримати докази ушкоджувальної дії високих доз вітаміну D на артеріальну стінку шляхом вивчення показників пероксидного окиснення ліпідів (ПОЛ) і активності антиоксидантних ферментів, вмісту води, кальцію, магнію та мікроелементів у тканинах судин, визначення об'єму інулінового простору, дослідження гістологічних препаратів аорти;

4. Дослідити вплив гіпервітамінозу D на активність прокальциногенних (лужна фосфатаза) і антикальциногенних (екто-АТФаза) ферментів артеріальної стінки;

5. Застосувати бісфосфонати (етан-1-гідрокси-1,1-дифосфонову кислоту, ЕГДК) для вивчення ролі загальних порушень фосфорно-кальцієвого обміну в розвитку кальцифікації артерій за умов гіпервітамінозу.

Об'єкт дослідження - механізми кальцифікації кровоносних судин.

Предмет дослідження - участь загальних порушень фосфорно-кальцієвого обміну і ушкодження судинної стінки в розвитку уражень артерій, зумовлених токсичними дозами вітаміну D.

Наукова новизна одержаних результатів. Уперше досліджено прояви ушкодження і кальцифікації артеріальної стінки в поєднанні з вивченням змін, що виникають у кістках тварин з гіпервітамінозом D.

Показано, що резорбція і демінералізація кісткової тканини відбуваються паралельно з кальцифікацією артерій. За допомогою ЕГДК встановлено, що вплив порушень кісткової тканини на розвиток кальцифікації судин здійснюється не через збільшення в крові вмісту кальцію, а через інші, ще не досліджені чинники.

Вперше встановлено, що інтоксикація вітаміном D супроводжується різноспрямованими змінами активності основних про- і антикальциногенних ферментів: лужної фосфатази і екто-АТФази. Значне посилення активності першого на тлі зниження екто-АТФазної активності веде до порушення балансу між місцевими про- і антикальциногенними механізмами і є важливим чинником кальцифікації артеріальних судин.

Уперше вивчено вміст магнію і деяких мікроелементів в аортальній стінці тварин з гіпервітамінозом D. Показано, що в тканинах артерій зростає вміст магнію і міді, а у кістках ці показники, навпаки, зменшуються. І в судинах, і в кістках зменшується вміст марганцю, а рівень цинку та заліза залишається без змін.

Практичне значення одержаних результатів. Наведені в роботі експериментальні дані про роль загальних і місцевих механізмів у розвитку D-гіпервітамінозних уражень кровоносних судин розширюють наукові уявлення про механізми розвитку дистрофічно-склеротичних уражень судинної стінки.

Особистий внесок здобувача. Матеріали виконаних експериментальних досліджень, наведені в дисертаційній роботі, є особистим внеском автора у проблему, що вивчається. Особисто автором проведено патентно-інформаційний пошук, сформульовано мету і завдання дослідження, обґрунтовано схему експериментальних робіт та відповідне методичне забезпечення. Автор самостійно виконав експериментальні дослідження, провів статистичну обробку, науковий аналіз та узагальнення одержаних результатів, оформлення останніх у вигляді таблиць, діаграм і графіків, сформулював та опублікував основні положення дисертації і висновки.

Апробація результатів дослідження. Основні положення дисертації доповідались і обговорювались на VIII читаннях ім. В.В. Підвисоцького (Одеса, 2009), Міжнародній науково-практичній конференції студентів, молодих вчених, лікарів та викладачів «Актуальні питання теоретичної медицини» (Суми, 2009), IX читаннях ім. В.В. Підвисоцького (Одеса, 2010), Міжнародній науково-практичній конференції студентів, молодих вчених, лікарів та викладачів «Мікроелементози в клінічній медицині» (Суми, 2010), V пленумі наукового товариства патофізіологів України, присвяченого 110-річчю з дня народження М.М. Горєва (Луганськ, 2010), Всеукраїнській науково-практичній конференції молодих учених «Медична наука - 2010» (Полтава, 2010).

Публікації. За результатами дослідження опубліковано 11 наукових праць, з них 5 статей у фахових виданнях, що входять до переліку ВАК України, решта - у матеріалах конференцій. 6 наукових праць опубліковано за одноосібною участю автора.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів дослідження, трьох підрозділів, в яких викладено результати власних досліджень з обговоренням, їхній аналіз і узагальнення, висновків, списку використаних літературних джерел у кількості 261 (52 - кирилицею, 209 - латиницею). Роботу викладено на 135 сторінках, вона ілюстрована 13 таблицями і 16 рисунками, які займають 11 повних сторінок.

2. ОСНОВНИЙ ЗМІСТ

Матеріал і методи дослідження. Досліди виконано на 123 щурах обох статей віком 3-6 місяців, масою 100-250 г. Тварин утримували у стандартних умовах віварію. Досліди проводили з дотриманням Міжнародних принципів «Європейської конвенції про захист хребетних тварин, які використовуються для експериментів та інших наукових цілей» (Страсбург, 1986), протокол засідання комісії з питань біомедичної Медичного інституту Сумського державного університету №6 від 25.01.11.

З метою моделювання ушкодження судинної стінки тваринам вводили високі дози вітаміну D у шлунок через зонд (0,125%-вий олійний розчин ергокальциферолу з розрахунку 300 000 МО/кг щодоби протягом 3 і 7 днів). Використана в роботі доза зумовлювала розвиток гострої інтоксикації (G.M. Hass et al., 1958). Через 24 години після останнього введення препарату щурів забивали шляхом декапітації й одразу забирали матеріал для досліджень. Об'єктами вивчення були: сироватка крові, стегнова кістка й аорта. В окремій серії дослідів щурам одночасно з вітаміном D уводили ЕГДК з розрахунку 150 мг/кг щоденно протягом 7 діб.

У роботі використано дві групи методик. Першу - склали ті, що дозволяють оцінювати загальний стан фосфорно-кальцієвого обміну в організмі (відповідні показники сироватки крові і кісток). Друга група охоплювала методики, що дають змогу характеризувати стан артеріальної стінки з огляду на розвиток у ній ранніх дистрофічних змін та відкладання солей кальцію (вміст води, об'єм інулінового простору, показники ПОЛ, активність антиоксидантних ферментів, лужної фосфатази, екто-АТФази, вміст кальцію, магнію та деяких мікроелементів, гістологічні препарати).

Концентрацію загального кальцію в сироватці крові визначали колориметричним методом з використанням набору реагентів «Кальцій-Ново» фірми «Вектор-Бест» (Росія). Вміст неорганічного фосфору в сироватці крові оцінювали фотометрично за утворенням молібденової сині за наявності молібдату амонію і відновлювача - аскорбінової кислоти (K.P. DuBois, 1943). Аналіз вмісту кальцію, магнію, марганцю, міді, заліза, цинку в кістковій тканині і стінці аорти проводили на спектрофотометрі С-115-М-1 в атомно-абсорбційному режимі при довжині хвилі: Са - 422,2 нм, Mg - 285,0 нм, Mn - 279,5 нм, Cu - 324,4 нм, Fe - 248,6 нм, Zn - 213,6 нм.

Біомеханічні властивості стегнових кісток оцінювали, вимірюючи їх мікротвердість на приладі ПМТ-3, а також визначаючи силу розриву за допомогою спеціального мікрогвинта (Д.В. Великородный с соавт., 2008). Рентгендифракційне дослідження кристалів біоапатиту виконували на автоматизованому дифрактометрі ДРОН-4-07, використовуючи опромінення CuK (довжина хвилі 0,154 нм) і фокусування за Бреггом-Брентано 2. Зразки кісток спалювали при 400 і 900 ?C (S.N. Danilchenko et al., 2006).

Вміст загальних ліпідів у тканинах кровоносних судин визначали за методом J. Folch et al. (1957) у модифікації E.G. Bligh і W.J. Dyer (1975). Вміст гідропероксидів ліпідів визначали спектрофотометрично за характерним для дієнових кон'югат УФ-спектром поглинання розчину ліпідів у метанол-гексані (5:1) за довжини хвилі 232-234 нм (J.L. Bolland, J.P. Koch, 1945). Вміст основ Шиффа визначали спектрофлюорометрично (максимум збудження флюоресценції - 360 нм, максимум випромінення - 420-440 нм) (A.S. Csallany, K.L. Ayal, 1976).

Супероксиддисмутазну (СОД) активність визначали спектрофотометрично (довжина хвилі 540 нм) за відсотком інгібування відновлення нітротетразолію синього (R. Fried, 1975). Каталазну (КТ) активність визначали спектрофотометрично (довжина хвилі 410 нм) за здатністю цього ферменту гальмувати утворення з солями молібдену стійкого забарвленого комплексу (М.А. Королюк зі співавт., 1988). Глютатіонпероксидазну (ГП) активність встановлювали за методом B.E. Pinto і W. Bartley (1969) у модифікації Г.А. Кругликової і Ц.М. Штутман (1976). Як субстрат окиснення використовували пероксид водню. Активність ГП оцінювали за різницею між кількістю відновленого глютатіону в досліджуваній та контрольній (без H2O2) пробах (J. Sedlak, R.H. Lindsay, 1968). Ферментну активність розраховували на одиницю маси загального білка, вміст якого в тканинах визначали за методом O.H. Lowry (1973).

Активність лужної фосфатази сироватки крові і в тканинах аорти визначали з використанням p-нітрофенілфосфату як субстрату реакції (O.A. Bessey et al., 1946). Екто-АТФазну активність ізольованих поздовжніх смужок аорт оцінювали за приростом концентрації неорганічного фосфату, що вивільнюється в середовище за час інкубації.

Вміст води визначали, фіксуючи зміну маси зразка тканини при його повному висушуванні до постійної маси в сушильній шафі при температурі 105°C. Об'єм інулінового простору визначали дифеніламіновим методом (А.Д. Браун, 1937, Н.А. Виноградова, 1967). Для вивчення патоморфологічних змін кровоносних судин використовували звичайні методи гістологічних досліджень - забарвлювання гематоксилін-еозином, алізарином червоним. Матеріал статистично опрацьовано з використанням параметричних (В.Ю. Урбах, 1985) і непараметричних (критерій Вілкоксона-Манна-Уїтні, точний метод Фішера) критеріїв статистики (В.Е. Гублер, А.А. Генкін, 1973).

Результати дослідження та їхній аналіз.

Загальні чинники кальцифікації судинної стінки за умов гіпервітамінозу D. До загальних чинників кальцифікації кровоносних судин, зумовлених токсичною дією вітаміну D, відносять перш за все порушення, що виникають у результаті розладів фосфорно-кальцієвого обміну в організмі. Останні, як відомо, є наслідком впливу гормонально-активної форми вітаміну D на дві основні біологічні мішені - кишечник і кісткову тканину. Дія на клітини тонкої кишки призводить до значного посилення всмоктування кальцію і фосфатів, а взаємодія з клітинами кісток - до резорбції і демінералізації останніх.

З огляду на це характеристиками, що відображають стан фосфорно-кальцієвого обміну в організмі, можуть бути дві групи показників. З одного боку, це - показники сироватки крові, а з іншого - властивості кісток, які залежать від складу і структури їх мінеральних компонентів.

Саме ці дві групи показників і стали об'єктом наших досліджень при з'ясуванні ролі загальних чинників у розвитку кальцифікації судин за умов гіпервітамінозу D.

Вивчення показників сироватки крові показало, що токсична дія вітаміну D супроводжується значним зростанням у ній концентрації кальцію і неорганічного фосфору.

Так, вміст загального кальцію в сироватці щурів збільшився на 11% через 3 доби і майже на 40% через 7 діб від початку введення тваринам ергокальциферолу.

Враховуючи те, що рівень кальцію крові є важливим гомеостатичним параметром, який підтримується щонайменше трьома гормонами (паратгормоном, кальцитоніном і гормонально-активною формою вітаміну D), виявлене істотне збільшення цього показника є свідченням значних порушень гомеостазу, проявом яких є розвиток гіперкальціємії. Паралельно зі зростанням вмісту кальцію збільшується і концентрація неорганічного фосфору в сироватці крові щурів, що отримували високі дози вітаміну D. Так, рівень цього показника при порівнянні з контрольними значеннями був вищим на 67% через 3 доби і більш ніж у 3 рази через 7 діб від початку експерименту. Це дає підстави стверджувати, що D-вітамінна інтоксикація супроводжується розвитком значної гіперфосфатемії.

Розвиток гіперкальціємії і гіперфосфатемії закономірно веде до збільшення майже у 5 разів кальцій-фосфатного добутку: Ca2 та Pi.

Цей показник має важливе значення для обміну іонів кальцію та неорганічних фосфатів між кістковою тканиною і кров'ю.

При вивченні мінеральних компонентів, з яких складаються кістки, було встановлено, що вміст кальцію у кістковій тканині експериментальних тварин зменшився на 19% проти контролю. У тому ж напрямі змінювався вміст магнію (на 11%), міді (у 3,5 разу) і марганцю (більш ніж у 4 рази). Вміст двох інших мікроелементів - заліза та цинку - у кістках D-гіпер-вітамінозних тварин залишався без змін. Виявлене нами зменшення вмісту кальцію у кістковій тканині щурів з гіпервітамінозом D є свідченням процесів демінералізації, що відбуваються за умов D-вітамінної інтоксикації. Механізми цього явища ще не відомі, але не викликає сумніву той факт, що в результаті втрати кальцію кістковою тканиною вміст цього елементу в крові повинен збільшуватись. Магній та вивчені нами мікроелементи також є мінеральними компонентами кісткової тканини. Не маючи самостійного значення, вони можуть зв'язуватися з кристалами гідроксіапатиту і змінювати його властивості. Той факт, що у досліджених кістках вміст магнію, марганцю і міді істотно зменшується наштовхнув на думку про можливі зміни структури кристалів кісткового мінералу (біоапатиту) за умов D-вітамінної інтоксикації. Для перевірки такої можливості нами проведено рентгендифракційне вивчення зразків нанодисперсного біоапатиту стегнових кісток після їх спалювання при температурах 400 і 900°С. У цих дослідженнях ніяких істотних кристалохімічних особливостей в біоапатиті кісток D-гіпервітамінозних тварин не виявлено. Очевидно, при інтоксикації вітаміном D структура і склад нанокристалів біогенного апатиту не змінюється, а порушення кісток, що виникають, зумовлені зменшенням кількості мінеральних складових кісткової тканини, а не змінами її якісних характеристик. Демінералізація кісток, ознаками якої є зменшення вмісту в них кальцію, магнію і деяких мікроелементів, а також резорбція кісткової тканини, якщо вона відбувається у D-гіпервітамінозних тварин, мають вести до змін біомеханічних властивостей кісток. Аби з'ясувати, чи це так, ми вивчали декілька показників, що відображають ці властивості, а саме: мікротвердість і силу розриву.

Результати цих досліджень показали, що показник мікротвердості стегнових кісток у щурів з D-вітамінною інтоксикацією зменшується вдвічі через 7 діб від початку експерименту. Одночасно з цим відмічали зменшення зовнішньої сили, яку треба докласти, щоб розірвати кістку. Про це свідчило зниження відповідного показника на 34%, якщо порівнювати з контролем.

Таким чином, є підстави стверджувати, що токсична дія вітаміну D через 7 днів від початку введення щурам ергокальциферолу виявляє себе значними порушеннями кісткової тканини. Такими, зокрема, є зменшення вмісту у кістках кальцію, магнію, марганцю і міді, зменшення мікротвердості кісток і сили їх розриву. При цьому рентгендифракційні властивості кристалів біоапатиту залишаються незмінними.

Місцеві чинники розвитку уражень артерій за умов токсичної дії вітаміну D. Стосовно D-гіпервітамінозних уражень судин немає одностайної думки про провідний механізм патогенезу кальцифікації судинної стінки. З одного боку, інтоксикація вітаміном D супроводжується розвитком гіперкальціємії і гіперфосфатемії, тобто чинників, що зумовлюють метастатичний варіант мінералізації м'яких тканин. З іншого боку, у багатьох роботах показано, що D-гіпервітаміноз призводить до ушкодження клітин і позаклітинного матриксу артеріальних судин, що само по собі може бути основою дистрофічної кальцифікації. У цій частині розділу наведено власні дані, які свідчать про розвиток процесів ушкодження аортальної стінки щурів, що отримували високі дози ергокальциферолу, а також результати вивчення двох ферментів, що мають безпосередній стосунок до кальцифікації, але по-різному впливають на цей процес: лужну фосфатазу (прокальциногенний фермент) і одну з ектонуклеотидаз - екто-АТФазу (антикальциногенний чинник).

У проведених нами дослідженнях було вивчено вміст проміжних (гідропероксиди ліпідів) і кінцевих (шиффові основи) продуктів ПОЛ у тканинах аорти щурів у динаміці гострої інтоксикації вітаміном D. Встановлено, що гіпервітаміноз D супроводжується значним збільшенням вмісту гідропероксидів ліпідів в аортальній стінці експериментальних тварин. Так, уже через 3 доби від початку введення ергокальциферолу вміст гідропероксидів ліпідів у тканинах артерій був у 3,3 разу більший, ніж у контрольній групі - (5,42 ± 0,90) проти (1,63 ± 0,30) нмоль/мг ліпідів (p < 0,001), а через 7 діб він перевищував контрольні величини більш ніж у 7 разів і дорівнював (12,05 ± 0,90) нмоль/мг ліпідів.

Схожа картина була характерна і для іншого показника ПОЛ. Зростання вмісту шиффових основ у тканинах аорти D-гіпервітамінозних щурів становило 2,6 разу через 3 доби експерименту - (22,60 ± 1,98) проти (8,80 ± 0,11) відн. од./мг ліпідів (p < 0,001) і 6,4 разу - через 7 діб - (56,40 ± 4,62) відн.од./мг ліпідів. Таким чином, є підстави констатувати, що гостра інтоксикація вітаміном D супроводжується активацією ПОЛ в артеріальних судинах, про що свідчить значне зростання в їх тканинах вмісту проміжних (гідропероксиди ліпідів) і кінцевих (шиффові основи) продуктів цього процесу. Виявлена нами активація ПОЛ може бути пов'язана як з посиленим первинним генеруванням вільних радикалів і пероксидних сполук, так і з недостатністю систем антиоксидантного захисту. У судинній стінці такими є антиоксидантні ферменти, серед яких ГП, СОД і КТ.

Результати досліджень активності цих ферментів у тканинах аорти щурів, що отримували високі дози вітаміну D, наведено у таблиці. Привертає до себе увагу те, що активність усіх трьох вивчених ферментів істотно падає упродовж 7 днів експерименту. Так, найбільш стрімким є падіння активності ГП: через 3 доби від початку введення ергокальциферолу активність цього ферменту складала 44%, а через 7 діб - 32% від контрольних величин. Схожі зміни відбувалися з іншим антиоксидантним ферментом - СОД. Його активність через 3 доби експерименту зменшилась більш ніж удвічі, а через 7 діб складала 31,5%, якщо порівнювати з відповідним показником у контролі. Менш вираженим було зменшення активності КТ. Через 3 доби D-вітамінної інтоксикації цей показник зменшився на 33%, а через 7 діб - у 2,7 разу.

Таким чином, наведені результати свідчать про розвиток недостатності антиоксидантних ферментів у кровоносних судинах тварин з гіпервітамінозом D, що само собою є чинником, якщо не ініціювання, то посилення ПОЛ.

Активація ПОЛ в артеріях D-гіпервітамінозних тварин супроводжується ушкодженням клітинних структур і розвитком унаслідок цього ранніх дистрофічних порушень, на що вказують зміни показників вмісту води та об'єму інулінового простору у вивчених нами судинах. Так, через 7 діб від початку експерименту вміст води в аортальній стінці достовірно збільшувався, якщо порівнювати з контрольними показниками: (77,90 ± 0,68) проти (74,45 ± 0,56)% (p < 0,05). Крім того, токсична дія вітаміну D супроводжується істотним зростанням об'єму інулінового простору судинної стінки. У дослідних тварин цей показник був на 16% вищим, ніж у контролі - (48,70 ± 0,83) проти (41,80 ± 0,43) мл/100 г. вогкої тканини (p < 0,001).

Паралельно з розвитком набряку судинної стінки змінюється вміст кальцію, магнію і деяких мікроелементів у тканинах аорти D-гіпервітамінозних тварин. Так, вміст кальцію (тут і далі в мг/0,1 г. сухої речовини) в аортальній стінці дослідних тварин зростав майже в 9 разів (44,90 ± 2,58 проти 5,07 ± 0,56, p < 0,001), а магнію - у 2,5 разу, якщо порівнювати з контролем (2,19 ± 0,20 проти 0,90 ± 0,22, p < 0,001).

Слід зазначити, що таке значне збільшення вмісту цих елементів у судинній стінці відбувається на тлі демінералізації кісток, про що свідчить зменшення вмісту в їхніх тканинах тих таки кальцію і магнію (див. вище). При гіпервітамінозі D відбувається по суті переміщення значних кількостей мінеральних компонентів з кісток у судинну стінку. З одного боку, розвивається демінералізація кісткової тканини, а з іншого - ектопічна кальцифікація артерій.

Що стосується кількісного складу мікроелементів судинної стінки, то він також зазнає певних змін у тварин з D-гіпервітамінозом. Так само, як і в кістках, у тканинах аорти змінюється вміст марганцю (0,160 ± 0,004 проти 0,29 ± 0,01 у контролі, p < 0,001) і міді (0,430 ± 0,007 проти 0,210 ± 0,009, p < 0,01), а рівень заліза (3,22 ± 0,32 проти 3,46 ± 0,11, p > 0,05) і цинку (1,63 ± 0,12 проти 1,88 ± 0,13, p > 0,05) залишається без змін. Відмінності полягають лише в тому, що в кістках D-гіпервітамінозних щурів вміст міді істотно зменшується, а в аортальній стінці, навпаки, зростає. Щодо марганцю, то спрямованість його змін в обох тканинах була однаковою: і в кістках, і в судинах вміст цього елементу зменшувався.

Ушкодження судинної стінки і значне накопичення в ній кальцію знайшли своє відображення в морфологічних змінах, що їх виявили за допомогою гістологічних методів дослідження. Через 7 діб від початку введення тваринам ергокальциферолу у стінці аорти щурів можна було бачити ознаки ранніх дистрофічних змін, а саме: випрямлення ходу еластичних волокон з елементами їх фрагментації, збільшення проміжків між сусідніми еластичними мембранами, що є свідченням розвитку набряку судинної стінки. Водночас в аортах дослідних щурів виявляли осередки кальцифікації різної величини: від дрібних зерноподібних кальцифікатів до відносно великих масивів обвапнення. Часто ці осередки були розташовані поблизу еластичних структур, що дає підстави думати про певний зв'язок між дистрофічними змінами останніх і процесами відкладання солей кальцію. Розвиток кальцифікації кровоносних судин залежить від співвідношення так званих прокальциногенних і антикальциногенних чинників. Серед останніх важливу роль відіграє неорганічний пірофосфат (PPi), концентрація якого в тканинах визначається, з одного боку, активністю ектонуклеотидаз - ферментів, що вивільнюють PPi з нуклеозидтрифосфатів, а з іншого - лужною фосфатазою, яка розщеплює PPi на дві молекули неорганічного фосфату. З огляду на це ми обрали для вивчення про- і антикальциногенних чинників судинної стінки два ферменти - лужну фосфатазу і екто-АТФазу, яка є одним з представників ектонуклеотидаз. Як випливає з наведених у таблиці даних, активність лужної фосфатази артеріальної стінки стрімко зростає: після трьох введень ергокальциферолу вона стає у 4,5 разу, а через 7 днів - у 7,6 разу вищою за аналогічний показник у контролі. Проведене вивчення активності лужної фосфатази в сироватці крові показало, що рівень цього ферменту істотно не змінюється ні через 3, ні через 7 діб від початку введення тваринам високих доз вітаміну D (в ум. од./мг білка: контроль - 42,00 ± 6,11, через 3 дні - 52,0 ± 8,0, через 7 днів - 54,7 ± 7,3, p > 0,05). Це дає підстави думати, що високі дози вітаміну D впливають на зазначений фермент артеріальної стінки або безпосередньо, або опосередковано через певні місцеві механізми. Протилежну спрямованість змін, якщо порівнювати з лужною фосфатазою, було виявлено при вивченні екто-АТФазної активності ізольованих поздовжніх смужок аортальних судин у щурів з D-гіпервітамінозом (таблиця). Так, здатність розщеплювати екзогенний АТФ препаратами аортальної стінки зменшувалася майже на 18% через 3 доби і більш ніж у 2 рази через 7 діб від початку D-вітамінної інтоксикації. Таким чином, введення високих доз вітаміну D призводить до істотного зростання активності одного з ключових прокальциногенних ферментів - лужної фосфатази з одночасним пригніченням ектонуклеотидазної активності - чинника, що перешкоджає кальцифікації м'яких тканин. З огляду на це є підстави стверджувати, що за умов гіпервітамінозу D порушується баланс між прокальциногенними і антикальциногенними властивостями судинної стінки, що створює умови для відкладання солей кальцію в її структурах.

Роль загальних порушень фосфорно-кальцієвого обміну і місцевих факторів судинної стінки у розвитку кальцифікації артерій за умов інтоксикації вітаміном D (аналіз і узагальнення результатів).

Одержані нами дані свідчать про те, що інтоксикація вітаміном D супроводжується, з одного боку, загальними порушеннями фосфорно-кальцієвого обміну в організмі (гіперкальціємія, гіперфосфатемія, демінералізація кісток), а з іншого - змінами аортальної стінки, що сприяють її кальцифікації (активація ПОЛ, ушкодження клітин і еластичних структур, збільшення локальної концентрації кальцію, порушення балансу між прокальциногенними і антикальциногенними ферментами). Яку роль відіграють ці дві групи змін у розвитку кальцифікації? Який механізм - метастатичний чи дистрофічний - є провідним у цьому процесі?

Аби ближче підійти до розв'язання даного питання, ми провели дослідження з використанням одного з представників бісфосфонатів - етан-1-гідрокси-1,1-дифосфонової кислоти (ЕГДК), яку вводили щурам разом з високими дозами вітаміну D протягом 7 діб. Дослідження вмісту кальцію у трьох пов'язаних фосфорно-кальцієвим обміном тканинах (кістках, крові, аортальній стінці) показало, що ЕГДК при поєднаному введенні з вітаміном D істотно збільшує вміст кальцію в кістковій тканині і зменшує його в аортальній стінці, якщо порівнювати з відповідними показниками тварин з одним лише гіпервітамінозом D. Іншими словами, ЕГДК значною мірою перешкоджає, з одного боку, демінералізації кісток, а з іншого - відкладанню солей кальцію в судинах. Проте повної нормалізації вмісту кальцію у зазначених тканинах під впливом ЕГДК усе ж таки не відбувається (рисунок). Ефект ЕГДК стосовно аортальної стінки вражаючий: під його впливом вміст кальцію в артеріальній тканині тварин з гіпервітамінозом D зменшувався у 2,2 разу, що свідчить про виражені ангіопротекторні властивості цієї сполуки. Одним з механізмів антикальциногенної дії ЕГДК може бути зменшення концентрації кальцію в крові через пригнічення виходу останнього з кісткової тканини. Проте одержані нами дані спростовують даний механізм, оскільки під впливом ЕГДК вміст кальцію у сироватці крові D-гіпервітамінозних тварин не змінювався (p > 0,05): іншими словами, фактор гіперкальціємії не зникав і навіть не зменшувався.

Таким чином, одержані результати розділили на три групи:

1. За умов гіпервітамінозу D виникають зміни фосфорно-кальцієвого обміну в організмі, які виявляють себе збільшенням вмісту в сироватці крові кальцію, неорганічного фосфату, а також порушеннями з боку кісток: зменшенням вмісту в кістковій тканині кальцію і магнію, порушенням біомеханічних властивостей. Вміст кальцію в тканинах кісток та аорти і в сироватці крові щурів, яким одночасно вводили вітамін D (300 000 МО/кг) і ЕГДК (150 мг/кг) протягом 7 діб, (M ± m), n = 6 у кожній групі:

2. Токсична дія вітаміну D супроводжується збільшенням вмісту в тканинах аорти проміжних (гідропероксиди ліпідів) і кінцевих (шиффові основи) продуктів ПОЛ з одночасним зменшенням активності антиоксидантних ферментів - ГП, СОД, КТ. Вплив високих доз вітаміну D характеризується також значним зростанням активності лужної фосфатази і пригніченням екто-АТФазної активності аортальної стінки. Зазначені зміни слід вважати такими, що відображають місцеві механізми ураження кровоносних судин;

3. D-вітамінна інтоксикація проявляется набряком аортальної стінки (збільшенням вмісту води та об'єму інулінового простору), морфологічними змінами еластичних структур, значним збільшенням вмісту кальцію і відкладанням його солей у товщі судинної стінки. Наведені зміни віддзеркалюють розвиток ушкодження і кальцифікації кровоносних судин.

На підставі узагальнених власних результатів і даних літератури роль загальних і місцевих механізмів у розвитку кальцифікації артерій, зумовленої гіпервітамінозом D, може бути представлено таким чином.

З одного боку, в організмі виникають загальні по відношенню до судинної стінки зміни, які сприяють її кальцифікації. Такими є:

1) гіперкальціємія і гіперфосфатемія, що зумовлюють збільшення кальцій-фосфатного добутку до рівнів, при яких починають випадати в осад у м'яких тканинах солі кальцію (метастатичний механізм кальцифікації). Причинами зростання вмісту кальцію і неорганічного фосфату в крові є посилене їх всмоктування в кишечнику (результат дії 1б,25(OH)2D) і резорбція та демінералізація кісткової тканини, що настає під впливом високих доз вітаміну D;

2) чинники, що вивільнюються в кров із кісткової тканини внаслідок резорбції і демінералізації останньої. Одним з таких може бути виявлений нещодавно сироватковий фактор кальцифікації (SCF), який, осідаючи в м'яких тканинах, здатен ініціювати утворення кристалів гідроксіапатиту в артеріальній стінці;

3) порушення гомеостазу (гіпоксія, ацидоз, інтоксикація та ін.), що настають у результаті D-гіпервітамінозних уражень інших органів і тканин (легень, нирок та ін.). Хоча роль зазначених змін в ушкодженні і кальцифікації кровоносних судин важко оцінити, проте поза сумнівом вони впливають на судинну стінку і можуть сприяти її ураженням.

З іншого боку, під впливом токсичних доз вітаміну D в артеріальних судинах виникають зміни, що їх можна розцінювати як місцеві чинники ушкодження і кальцифікації судинної стінки.

До таких слід віднести:

1) оксидаційний стрес, в ініціюванні якого провідну роль відіграють прооксидантні властивості самого вітаміну D. Активація ПОЛ, що закономірно настає за умов гіпервітамінозу D, може бути причетною до запрограмованої загибелі клітин судинної стінки (апоптозу), перетворення гладких м'язових клітин медії в клітини, подібні до остеобластів, порушення структури еластину і змін властивостей еластичних волокон та мембран. Іншими словами, оксидаційний стрес може запускати всі відомі на цей час варіанти кальцифікації судинної стінки;

2) активацію прокальциногенних чинників судинної стінки. Одним з таких є лужна фосфатаза - фермент, який, з одного боку, розщеплює пірофосфат (PPi) і зменшує концентрацію в тканинах цього важливого антикальциногенного фактора, а з іншого - збільшує внаслідок такого розщеплення локальну концентрацію неорганічного фосфату (Pi) до рівнів, необхідних для осадження солей кальцію;

3) пригнічення антикальциногенних механізмів, що в нормі запобігають мінералізації м'яких тканин. Серед таких важливе місце посідають ектоферменти, здатні гідролізувати аденінові нуклеотиди з вивільненням пірофосфату (ектонуклеотидази), і матриксний Gla-протеїн (MGP). Очевидно, що вплив високих доз вітаміну D на про- і антикальциногенні ферменти судинної стінки здійснюється через надмірне утворення його гормонально-активної форми - 1б,25.

Оцінити відносне значення загальних і місцевих механізмів у розвитку D-гіпервітамінозних уражень судин не просто. Одним з інструментів вивчення цього питання стали бісфосфонати - сполуки, що є синтетичними аналогами пірофосфату. Будучи ефективними засобами, що запобігають резорбції і демінералізації кісток, бісфосфонати одночасно виявляють ангіопротекторну дію, яка не залежить від їх впливу на рівень кальцію та фосфатів крові і на процеси, що зумовлюють ушкодження клітин. Досліди з ЕГДК дають підстави патогенетично розділити між собою дві групи змін, характерних для D-гіпервітамінозних уражень артеріальної стінки: ушкодження клітин та позаклітинного матриксу і власне кальцифікацію.

Якщо мова йде про першу з них, то вирішальне значення у розвитку ушкодження судинної стінки мають місцеві чинники, зокрема оксидаційний стрес, перевантаження кальційтранспортних систем клітин, порушення енергозабезпечення судинної стінки (О.В. Атаман, 1990, В.Ю. Гарбузова, 2004). Щодо власне кальцифікації, то в розвитку цієї складової D-гіпервітамінозних уражень судин, очевидно, провідну роль відіграють загальні чинники, зокрема, надходження у кров з кісткової тканини факторів, які після осадження в тканинах започатковують процеси утворення кристалів гідроксіапатиту. Росту останніх і утворенню масивних кальцифікатів сприяють як загальні чинники, так і місцеві фактори, зокрема порушення балансу між природними антикальциногенними і прокальциногенними механізмами у бік переважання останніх. На завершення слід відмітити, що проблема співвідношення загальних і місцевих чинників у розвитку уражень артерій взагалі і за умов гіпервітамінозу D зокрема ще далека до свого розв'язання. Подальші дослідження у цьому напрямі мають поглибити наші знання з цього фундаментального питання. Вони є важливими, оскільки можуть стати теоретичним підґрунтям для пошуку практичних підходів до запобігання і лікування склеротичних уражень артерій взагалі і такої їх поширеної форми, як артеріосклероз Менкеберга, зокрема.

ВИСНОВКИ

У дисертації наведено теоретичне узагальнення і нове вирішення актуального наукового завдання - патогенезу уражень кровоносних судин, зумовлених високими дозами вітаміну D. При вивченні змін, що виникають у крові, кістках і судинах тварин з гіпервітамінозом D встановлено, що в розвитку кальцифікації артерій за умов інтоксикації вітаміном D важливу роль відіграють як загальні порушення фосфорно-кальцієвого обміну в організмі (зміни показників сироватки крові, резорбція і демінералізація кісток), так і місцеві чинники судинної стінки (оксидаційний стрес, порушення балансу між природними про- і антикальциногенними системами):

1. Експериментальне відтворення гіпервітамінозу D у щурів (300 000 МО/кг протягом 7 діб) супроводжується збільшенням вмісту кальцію і неорганічного фосфату в сироватці крові. Одним з механізмів розвитку гіперкальціємії і гіперфосфатемії за цих умов може бути демінералізація кісткової тканини;

2. Токсична дія вітаміну D виявляє себе зменшенням вмісту кальцію, магнію, марганцю і міді в кістковій тканині. Зміни біомеханічних властивостей кісток (зменшення мікротвердості і зовнішньої сили, яку треба докласти, щоб їх розірвати) свідчать про те, що за умов гіпервітамінозу D розвиваються процеси резорбції і демінералізації кісткової тканини. Водночас методами рентгендифракційного аналізу жодних істотних кристалохімічних особливостей в біоапатиті кісток D-гіпервітамінозних тварин не виявлено. Очевидно, при інтоксикації вітаміном D структура і склад нанокристалів біогенного апатиту не змінюються, а порушення кісток, що виникають, зумовлені зменшенням кількості мінеральних складових кісткової тканини, а не змінами її якісних характеристик;

3. Введення тваринам високих доз вітаміну D призводить до активації пероксидного окиснення ліпідів у тканинах кровоносних судин, про що свідчить накопичення проміжних (гідропероксиди ліпідів) і кінцевих (шиффові основи) продуктів цього процесу в аортальній стінці. Розвитку оксидаційного стресу за цих умов сприяє зменшення активності ферментів, що забезпечують антиоксидантний захист судинної стінки - глютатіонпероксидази, супероксиддисмутази і каталази;

4. У стінці аорти D-гіпервітамінозних тварин значно зростає вміст кальцію (майже в 9 разів) і змінюється кількісний склад деяких інших хімічних елементів: збільшується вміст магнію і міді, зменшується рівень марганцю. Водночас вміст заліза і цинку залишається без змін;

5. D-вітамінна інтоксикація у щурів веде до значного збільшення активності лужної фосфатази (майже у 8 разів) у тканинах артеріальних судин на тлі незміненої активності цього ферменту в сироватці крові. Водночас істотно зменшується (більш ніж у 2 рази) екто-АТФазна активність ізольованих поздовжніх смужок аортальних судин. Збільшення активності лужної фосфатази з одночасним зменшенням екто-АТФазної активності судинної стінки може свідчити про порушення балансу між прокальциногенними і антикальциногенними чинниками, внаслідок чого створюються умови, що сприяють процесу кальцифікації;

6. Ушкоджувальна дія вітаміну D на артеріальні судини проявляється розвитком набряку (збільшенням вмісту води та об'єму інулінового простору), а також морфологічними змінами, що характеризуються порушеннями з боку еластичних структур аортальної стінки, відкладанням у ній солей кальцію;

7. При поєднаному введенні щурам високих доз вітаміну D з етан-1-гідрокси-1,1-дифосфоновою кислотою вміст кальцію у кістках зростає, а в аортальній стінці, навпаки, істотно зменшується, якщо порівнювати з відповідними показниками D-гіпервітамінозних тварин. При цьому рівень гіперкальціємії не зазнає змін. Останнє може свідчити про те, що збільшення вмісту кальцію у крові не є визначальним чинником, що пов'язує між собою демінералізацію кісток і кальцифікацію артерій за умов інтоксикації;

8. З огляду на патогенез зміни, що характеризують D-гіпервітамінозні ураження артеріальної стінки, можна розподілити на дві групи: ушкодження клітин та позаклітинного матриксу і власне кальцифікацію. Вирішальне значення для ушкодження судинної стінки мають місцеві чинники, зокрема оксидаційний стрес. Щодо власне кальцифікації, то провідну роль у її розвитку можуть відігравати загальні чинники, зокрема, надходження у кров з кісткової тканини факторів, які після осадження в тканинах започатковують процеси утворення кристалів гідроксіапатиту. Росту останніх і утворенню масивних кальцифікатів сприяють як загальні чинники (гіперкальціємія, гіперфосфатемія), так і місцеві фактори, зокрема, порушення балансу між природними антикальциногенними і прокальциногенними механізмами у бік переважання останніх.

СПИСОК ПРАЦЬ ОПУБЛІКОВАНИХ, ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Хижня Я.В. Біомеханічні властивості стегнової кістки щурів за умов гіпервітамінозу D / Я.В. Хижня // Загальна патологія та патологічна фізіологія. - 2010. - Т. 5, №3. - С. 150-153.

2. Хижня Я.В. Інтенсивність перекисного окиснення ліпідів та антиоксидантна ферментативна активність у стінці аорти щурів за умов гіпервітамінозу D / Я.В. Хижня // Вісник Української медичної стоматологічної академії: Актуальні проблеми сучасної медицини. - 2010. - Т. 10, вип. 4. - С. 162-164.

3. Хижня Я.В. Елементний дисбаланс судинної стінки щурів за умов D-вітамінної інтоксикації / Я.В. Хижня // Вісник Сумського державного університету. Серія Медицина. - 2010. - Т. 2. - С. 48-51.

4. Гарбузова В.Ю. Загальні механізми токсичної дії вітаміну D / В.Ю. Гарбузова, Я.В. Хижня // Вісник Сумського державного університету. Серія Медицина. - 2009. - Т. 1, №2. - С. 49-61.

5. Порівняльна характеристика ферментної антиоксидантної активності судинної стінки при різних експериментальних моделях атеросклерозу Менкеберга / О.В. Атаман, В.Ю. Гарбузова, Р.Ф. Наумко, Ю.О. Атаман, Я.В. Хижня // Загальна патологія та патологічна фізіологія. - 2010. - Т. 5, №3. - С. 31-35.

6. Хижня Я.В. Біомеханічні параметри стегнової кістки у щурів за умов гіпервітамінозу D / Я.В. Хижня, О.В. Атаман // Здобутки клінічної та експериментальної медицини. - 2009. - №2 (11). - С. 148. (Здобувачем виконано експериментальні дослідження, сформульовано висновки, підготовлено матеріал до друку).

7. Хижня Я.В. Вивчення вмісту макро- та мікроелементів в артеріальній стінці щурів за умов гіпервітамінозу D / Я.В. Хижня // Актуальні питання теоретичної медицини: Міжнар. наук. практ. конф., 23-24 квітня 2009 р., м. Суми: тези доп. - Суми, 2009. - С. 216.

8. Хижня Я.В. Вплив гіпервітамінозу D на вміст кальцію в судинній стінці та кістках щурів / Я.В. Хижня // Бюлетень VІІІ читань ім. В.В. Підвисоцького, 28-29 травня 2009 року, Одеса. - Одеса, 2009. - С. 203.

9. Хижня Я.В. Мікротвердість стегнової кістки у щурів за умов гіпервітамінозузу D / Я.В. Хижня // Мікроелементози в клінічній медицині: Міжнар. наук. практ. конф., 21-23 квітня 2010 р. м. Суми: тези доп. - Суми, 2010. - С. 63-64. патогенез артеріосклероз токсичний

10. Антиоксидантна недостатність судинної стінки в умовах експериментального атеросклерозу Менкеберга / О.В. Атаман, В.Ю. Гарбузова, Ю.О. Атаман, Я.В. Хижня // Бюлетень ІХ читань ім. В.В. Підвисоцького, 27-28 травня 2010 року, Одеса. - Одеса, 2010. - С. 38.

11. Хижня Я.В. Вивчення біомеханічних властивостей кісткової тканини щурів за умов D-вітамінної інтоксикації / Я.В. Хижня, В.Ю. Гарбузова // Здобутки клінічної та експериментальної медицини. - 2010. - №2 (13). - С. 155-156.

Размещено на Allbest.ru