Роль процесів метаболічної активації та оксидативного стресу в механізмах токсичного ураження нирок ксенобіотиками

Размещено на http://www.allbest.ru/

Міністерство охорони здоров'я України

Державний заклад "Луганський державний медичний університет"

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук

Роль процесів метаболічної активації та оксидативного стресу в механізмах токсичного ураження нирок ксенобіотиками

Машевська О.В.

14.01.32 - медична біохімія

Луганськ - 2011

Вступ

Актуальність проблеми. Проблема хімічно індукованих уражень нирок весь час зростає в зв'язку з впровадженням в практичну медицину нових високоактивних і токсичних лікарських засобів. Ксенобіотики здатні викликати різноманітні ураження нирок - від гострих (які можуть проявлятись розвитком гострої ниркової недостатності) до латентних пошкоджень, які в кінцевому підсумку ведуть до формування хронічної ниркової недостатності. Серед ксенобіотиків, нефротоксичність яких є найбільш актуальною проблемою для практичної медицини виділяють аміноглікозидні антибіотики, цитостатичні препарати на основі платини, рентгенконтрастні засоби та нестероїдні протизапальні засоби.

Молекулярні механізми ураження нирок ксенобіотиками є предметом інтенсивних досліджень. Один із механізмів нефротоксичності пов'язаний з утворенням в процесі біотрансформаціі ксенобіотиків в нирках чи позаниркових тканинах реакційно-здатних метаболітів. Зокрема, такий механізм притаманний парацетамолу та фенацетину, які утворюють в печінці і нирках токсичні метаболіти - N-ацетил-пара-бензохінонімін та пара-амінофенол [А.А. Пентюк та співавт., 2002]. Слід зауважити, що в нирках активно відбувається біотрансформація ксенобіотиків за участі цитохром Р450-залежних монооксигеназ, ферментів метаболізму глутатіонових кон'югатів та меркаптурових кислот [L.H. Lash, 1994; J.W. Lohr et al., 1998; M.W. Anders, 2008], яка часто супроводжується генерацією високоактивних інтермедіатів. Тому, використовуючи модулятори вищевказаних ферментів (діетилдітіокарбамат, амінооксиоцтову та етакринову кислоти) можна розробити нові підходи до зменшення нефротоксичної дії ксенобіотиків.

Ще одним механізмом ураження нирок ксенобіотиками є їх здатність ініціювати оксидативний стрес шляхом посиленого утворення активних форм кисню та азоту [S. Cuzzocrea et al., 2002; E. Devrim et al., 2005; U. Haeussler et al., 2006; Y. Kawai et al., 2006; S.Y. Han et al., 2006]. Так, в патогенезі міоглобінуричного ураження нирок роль оксидативного стресу можна вважати більш-менш доведеною, тоді як вклад цього процесу в реалізацію нефротоксичних ефектів цисплатину та бромбензолу залишається до кінця не вивченим. Не з`ясовано також протективну здатність перехоплювача гідроксильних радикалів диметилтіосечовини, хелатора іонів заліза дисфериоксаміну, антиоксиданту та препарату метаболічної дії триметазидину за умов ураження нирок цисплатином, бромбензолом та гліцеролом - речовинами, механізми дії яких досліджувалися в нашій роботі.

Вибір вказаних нефротоксикантів зумовлений тим, що цисплатин - широко вживаний в онкології лікарський препарат, який має виражену нефротоксичність; бромбензол - нефротоксикант, механізм дії якого моделює вплив лікарських препаратів - джерел реакційно-здатних інтермедіатів; гліцерол за умов внутрішньом'язового введення викликає міоглобінуричне ураження нирок з превалюванням оксидативного стресу, яке притаманне як ускладнення при застосуванні багатьох лікарських препаратів.

Різноманітність механізмів нефротоксичної дії цих та інших ксенобіотиків породжує значний поліморфізм клінічних проявів токсичних нефропатій та тривалий безсимптомний їх перебіг. Тому питання дослідження молекулярних механізмів токсичної дії ксенобіотиків на нирки набуває особливої уваги з огляду на можливість виявлення і створення ранніх високочутливих маркерів ураження нирок та розробки патогенетично обґрунтованих підходів до попередження і лікування відповідної патології.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана в рамках планової НДР кафедри біологічної та загальної хімії Вінницького національного медичного університету ім. М.І.Пирогова: “Використання модуляторів активності метаболізуючих ферментів та сорбентів в якості засобів корекції фармакологічної активності та токсичності лікарських засобів”(№ держреєстрації - 0101V002832). Автор є співвиконавцем НДР.

Мета роботи. З'ясувати біохімічні механізми цисплатинового, бромбензолового та міоглобінуричного ураження нирок та обґрунтувати на цій основі підходи до зменшення їх нефротоксичності за допомогою модуляторів ксенобіотик-метаболізуючих ферментів, антиоксидантів, хелаторів іонів заліза.

Завдання дослідження:

1. Дослідити вплив цисплатинового, бромбензолового та міоглобінуричного ураження нирок щурів на функціональний стан органу, а саме на показники гломерулярної фільтрації та функцію канальцевого апарату.

2. Вивчити показники обміну заліза, оксидативного стресу, антиоксидантного захисту, активність ферментних систем першої та другої фаз біотрансформації ксенобіотиків за умов цисплатинового, бромбензолового та міоглобінуричного ураження нирок.

3. Дослідити нефропротекторну дію триметазидину, диметилтіосечовини, хелатора іонів заліза - дисфериоксаміну за цисплатинової, бромбензолової та міоглобінуричної нефропатії.

4. Оцінити вплив індукторів та інгібіторів ферментів першої та другої фаз метаболізму ксенобіотиків (ацетону, діетилдітіокарбамату, амінооксиоцтової кислоти, етакринової кислоти, метимазолу та б-кетоглутарату) на нефротоксичність цисплатину, бромбензолу та гліцеролу у щурів.

5. Вивчити здатність модуляторів ксенобіотик-метаболізуючих ферментів впливати на індуковані нефротоксикантами порушення обміну заліза та процеси пероксидації білків та ліпідів в нирках.

Об'єкт дослідження: процеси окисидативного стресу і метаболічної активації та їх роль в розвитку токсичного ураження нирок цисплатином, бромбензолом та гліцеролом (міоглобінуричне ураження).

Предмет дослідження: активність ензимів метаболізму ксенобіотиків та генерації активних форм кисню за умов цисплатинового, бромбензолового та міоглобінуричного ураження нирок.

Методи дослідження: біохімічні, патофізіологічні, фармакологічні, статистичні.

Наукова новизна одержаних результатів. На основі комплексного дослідження ензимних систем генерації активних форм кисню, метаболізму ксенобіотиків в нирках оцінено роль оксидативного стресу і метаболічної активації в формуванні ураження нирок цисплатином, бромбензолом, гліцеролом та патогенетично обґрунтовано шляхи профілактики нефротоксичної дії ксенобіотиків антиоксидантами, хелаторами іонів заліза та інгібіторами ксенобіотик-метаболізуючих ферментів.

Вперше оцінено місце та вклад процесів генерації активних форм кисню та мобілізації заліза в реалізацію токсичної дії на нирки гліцеролу, бромбензолу та цисплатину. Зокрема, показано, що введення цих нефротоксикантів супроводжується накопиченням в нирках та сироватці крові нехелатованих іонів заліза, активацією прооксидантних (ксантиноксидаза, NADPH-оксидаза) та гальмуванням антиоксидантних (глутатіонпероксидази) ензимів, виснаженням запасів глутатіону та дестабілізацією внутрішньоклітинних мембран (знижується активність глюкозо-6-фосфатази та формується дефіцит АТФ) в нирках.

Показана здатність антиоксидантів (триметазидину, диметилтіосечовини, дисфериоксаміну) попереджувати індуковані модельними нефротоксикантами пошкодження тубулярного і гломерулярного апаратів нирок, порушення метаболізму заліза та гему в нирках, зменшувати прояви оксидативного стресу та запобігати формуванню дефіциту глутатіону в нирках.

Доведена причетність ензимних систем метаболізму ксенобіотиків (цитохрому Р4502E1, флавінмонооксигенази та глутатіон-S-трансферази), які здатні утворювати реакційноздатні інтермедіати, до розвитку цисплатинової та бромбензолової нефропатії. В той же час ці механізми не інтегровані в формування міогобінуричного ураження нирок.

Встановлено, що інгібітори ксенобіотик-метаболізуючих ензимів (діетилдітіокарбамат, амінооксиоцтова кислота, метимазол, етакринова кислота) попереджують ураження нирок цисплатином, бромбензолом та гліцеролом, що пов'язано з їх здатністю стримувати процеси метаболічної активації, запобігати вивільненню каталітично-активних катіонів заліза та розвитку оксидативного стресу в нирках.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані результати щодо ролі оксидативного стресу та процесів метаболічної активації в розвитку ураження нирок модельними нефротоксикантами (цисплатином, бромбензолом, гліцеролом) поглиблюють існуючі уявлення про молекулярні механізми несприятливої дії ксенобіотиків на функціональний стан нирок.

В нашій роботі сформульовані положення, які дозволяють запропонувати високочутливі біохімічні тести з метою ранньої діагностики пошкодження нирок нефротоксикантами, в тому числі цисплатином - лікарським препаратом, що широко використовується в онкологічній практиці. До таких біохімічних маркерів ми віднесли: вміст заліза в сироватці крові, загальна та латентна залізозв'язуюча здатність сироватки та маркери оксидативного стресу (рівень карбонільних груп білків та малонового діальдегіду в сироватці крові).

На основі дослідження механізмів нефротоксичної дії ксенобіотиків нами обґрунтовано доцільність призначення антиоксидантів (триметазидину, диметилтіосечовини), хелатору іонів заліза (дисфериоксаміну) та інгібіторів кенобіотик-метаболізуючих ферментів (діетилдітіокарбамату, амінооксиоцтової кислоти, метимазолу, етакринової кислоти) в якості коректорів функціонального стану нирок за умов цисплатинової, гліцеролової та бромбензолової нефропатії.

Впровадження результатів дослідження в практику. Основні положення дисертаційної роботи використовуються в навчальному процесі кафедри біологічної та загальної хімії, кафедри фармакології Вінницького національного медичного університету ім. М.І. Пирогова, кафедри фармакології з клінічною фармакологією, кафедри медичної біохімії та клініко-лабораторної діагностики Тернопільського державного медичного університету ім. І.Я. Горбачевського, кафедри фармакології, клінічної фармакології та фармакоекономіки, кафедри біохімії, медичної та фармацевтичної хімії Дніпропетровської державної медичної академії. Результати роботи впроваджено в науковий процес відділу біохімічних досліджень Науково-дослідного інституту реабілітації інвалідів ВНМУ ім. М.І. Пирогова.

Особистий внесок здобувача. Автором проаналізована література за темою дисертації, самостійно проведено патентний пошук, виконані експериментальні дослідження. Сумісно із науковим керівником поставлено мету та завдання дослідження, дана інтерпретація та узагальнення отриманих результатів. Дисертантом написані розділи дисертації та висновки, оформлені публікації. В роботах опублікованих у співавторстві, здобувачу належить основна ідея дослідження та фактичний матеріал.

Апробація результатів дослідження. Основні матеріали дисертації були викладені на науково-практичній конференції "Безпечна фармакотерапія в Україні" (м. Тернопіль, 2008), науково-практичній конференції "Медична наука-2009" (м. Полтава, 2009), всеукраїнській науково-практичній конференції "Досягнення і перспективи експериментальної і клінічної біохімії" (м. Тернопіль, 2009), 6-й міжнародній конференції молодих вчених "Молодь та медична наука на початку ХХІ століття" (м. Вінниця, 2009), Х Українському біохімічному з'їзді (Одеса, 2010).

Публікації. За матеріалами досліджень опубліковано 8 наукових праць: 5 статті у виданнях рекомендованих ВАК України (2 з них самостійно), 3 тез в матеріалах наукових конференцій і з'їздів.

Обсяг та структура дисертації. Матеріали дисертації викладено на 134 сторінках комп'ютерного друку. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, розділу "Матеріали та методи дослідження", 2-х розділів результатів власних досліджень, аналізу та узагальнення результатів дослідження, висновків, практичних рекомендацій та списку використаних джерел, який містить 198 джерел, з них 159 - латиницею. Дисертація ілюстрована 46 таблицями та 6 рисунками.

1. Основний зміст роботи

Матеріали та методи дослідження. Досліди проведені на 295 білих нелінійних щурах-самцях науково-експериментальної клініки Вінницького національного медичного університету ім. М.І.Пирогова, частково - віварію ДУ "Інститут фізіології АМН України ім. О.О. Богомольця". Всі етапи дослідження виконані згідно правил гуманного відношення до експериментальних тварин та затверджені комітетом з біоетики Вінницького національного медичного університету ім. М.І. Пирогова (протокол № 3 від 30.05.2010 рік) та Міжнародних вимог про гуманне поводження з тваринами відповідно до правил "Европейської конвенції захисту хребетних тварин, яких використовують з експериментальною та іншою науковою метою" (м. Страсбург, 1986).

Експериментальні моделі. Моделі нефротоксичності. В дослідах використані три моделі гострого ураження нирок: цисплатинова, бромбензолова та гліцеролова. Пошкодження нирок ініціювали одноразовим введенням цисплатину (7 мг/кг інтраперитонеально) [K. Akamatsu et al., 1991; B.H. Ali et al., 2008], бромбензолу (1 г/кг перорально) [С.О. Качула та співавт., 2002, 2004] та гліцеролу (5 г/кг внутрішньом'язово) [E. Kertai et al., 2000; H.Y. Kim et al., 2004].

Введення антиоксидантів та модуляторів ензимів. Диметилтіосечовину - перехоплювач гідроксильних радикалів [M. Yoshida et al., 2003; Y.I. Chirino еt al., 2008; M. Wasil et al., 1987; M.S.Paller et al., 1994; R.C. Sprong еt al., 1997] - вводили щурам внутрішньоочеревинно тричі: перший раз в дозі 500 мг/кг за 1 годину перед введенням цисплатину, а потім в дозі 125 мг/кг через 12 та 24 години після введення цисплатину, бромбензолу чи гліцеролу. Дисфериоксамін (дисферал) - хелатор іонів заліза - вводили внутрішньоочеревинно в дозі 100 мг/кг за 1 годину перед введенням цисплатину чи бромбензолу. На гліцероловій моделі ураження нирок дисфериоксамін вводили двічі, через 6 та 24 години після введення гліцеролу [D.R. Blake et al., 1983; R. Omar et al., 1989]. Триметазидин - препарат антиоксидантної та метаболічної дії - вводили перорально (один раз на день) в дозі 10 мг/кг у вигляді водної суспензії протягом 5 днів перед та 2 дні після введення цисплатину, бромбензолу або гліцеролу [I. Iskesen et al., 2006; Н.О. Пентюк, 2000; A.F. Kara et al., 2004]. Ацетон є індуктором цитохрому Р4502Е1, його вводили щурам тричі 1 раз на добу в дозі 1000 мг/кг [J.V. Bruckner et al., 2002; С.О. Качула, О.О. Пентюк, 2004]. Діетилдітіокарбамат - інгібітор цитохрому Р4502Е1 [T.K. Chang et al., 1994; V.A. Eagling et al., 1998] - вводили перорально двічі в дозі 100 мг/кг один раз на добу (перше введення за 24 години, а друге введення за 2 години перед застосуванням цисплатину чи бромбензолу). При використанні гліцеролової моделі, діетилдітіокарбамат вводили перорально в дозі 100 мг/кг двічі: через 2 та 12 годин після введення гліцеролу [С.О. Качула та співавт., 2002; О.Х. Герич, О.О. Пентюк, 2008]. Етакринова кислота - субстрат і суіцидальний інігбітор глутатіон-S-трансферази [H.W. Dirr et al., 1991; S. Awasthi et al., 1993; J.H. Ploemen et al., 1993] - вводили перорально в дозі 50 мг/кг два рази, за дві та одну добу до введення цисплатину чи бромбензолу [I.F. Zverev et al., 1985]. Метімазол, який є інгібітором флавінвмісної монооксигенази, вводили щурам інтраперитонеально двічі (перший раз в дозі 40 мг/кг за 0,5 години перед введенням цисплатину, другий раз в дозі 20 мг/кг через 12 год після введення токсиканту) [S.K. Krueger, D.E. Williams, 2005]. Амінооксиоцтову кислоту - інгібітор бета-ліазного шляху метаболізму цистеїнових кон'югатів - використали в сумарній дозі 30 мг/кг, яку вводили під шкіру за 2 прийоми (по 15 мг/кг): за 1 годину перед та через 5 годин після введення цисплатину, бромбензолу чи гліцеролу [S.K. Hong et al., 1997; Y. Kurozumi et al., 1999]. Альфа-кетоглутарова кислота - стимулятор активності ферментів трансамінування та бета-ліази - застосовували в дозі 200 мг/кг інтраперитонеально за 0,5 години перед та через 3 години після введення цисплатину, бромбензолу чи гліцеролу [M.W. Anders , 2008].

Біохімічні методи дослідження. Визначення вмісту низькомолекулярних речовин та білку. Дослідження екскреції метаболітів бромбензолу проводили в сечі, зібраній за 18 годин, після перорального введення 50% олійного розчину бромбензолу. Вміст меркаптурових кислот визначали за кількістю утворених після лужного гідролізу сечі тіоефірів [P.T. Henderson et al., 1984], рівень вільних та кон'югованих бромфенолів - за реакцією з 4-аміноантипірином [И.М. Коренман, 1975], вміст бромкатехолів - за реакцією з хлоридом кобальту [W.M. Azouz et al., 1953]. Вміст негемового заліза в плазмі крові та нирках, залізозв'язуючу здатність трансферину сироватки крові визначали батофенатроліновим методом [В.В. Меньшиков, 1987; C.J. Rebouche et al., 2004], рівень гему - піридин-гемохромогеновим методом [R. Druyan, A. Kelly, 1972; A. Agarwal et al., 1995]. Вміст АТФ досліджували методом тонкошарової хроматографії [С.Е. Северин, Г.А. Соловьева, 1989]. Білкові сульфгідрильні (тіольні) групи оцінювали за реакцією з реактивом Елмана (И.В. Веревкина и соавт., 1977; S. Potdevin et al., 1998). Вміст відновленого глутатiону визначали в глутатiонтрансферазнiй реакції [K. Asaoka, K. Takahashi, 1981]. Вміст білкових карбонільних груп досліджували за реакцією з 2,4-динітрофенілгідразином [R.L. Levine et al., 1994; Е.Е. Дубинина и соавт., 2000]. Процеси пероксидації ліпідів оцінювали за утворенням малонового діальдегіду (ТБК-реагуючих продуктів) [Ю.А. Владимиров, А.И. Арчаков, 1972]. Вміст креатиніну в сироватці крові та сечі, рівень глюкози в сечі та вміст сечовини в сироватці крові оцінювали уніфікованими методами [В.В. Меньшиков, 1987]. Вміст молекул середньої маси визначали спектрофотометричним методом [Н.И. Габриэлян и соавт., 1985]. Кількість білка в гомогенаті нирок та в сечі визначали біуретовим методом [Г.А. Кочетов, 1980].

Визначення активності ензимів. Активність гама-глутамілтрансферази (КФ.2.3.2.2) в сечі оцінювали уніфікованим методом [В.В. Меньшиков, 1987]. Інші ензими визначали в постядерному гомогенаті та мітохондріальній фракції нирок. Активність гемоксигенази (КФ 1.14.99.3) визначали за утворенням білірубіну, що утворився при окисленні геміну [П.А. Калиман, И.В. Беловецкая, 1986; A.I. Goodman et al., 2003]. Активність ксантиноксидоредуктази оцінювали за утворенням сечової кислоти, яку визначали за збільшенням поглинання при 293 нм. Активність NADPH-оксидази (КФ 1.6.3.1) вимірювали спектрофотометрично за падінням поглинання NADPH при 340 нм [J.R. Gillette et al., 1957; T. Fukui et al., 1997], а активність аконітази (КФ 4.2.1.3) - за зростанням поглинання при 240 нм при перетворенні цитрату в цис-аконітову кислоту [J.Z. Melnick et al., 2000; N.A. Santos et al., 2008]. Активність цистатіонін-гама-ліази (КФ 4.4.1.1) оцінювали за вмістом утвореного гідроген сульфіду в реакції з N,N-диметил-пара-фенілендіаміном [M.H. Stipanuk, P.W. Beck, 1982]. В гомогенаті нирок оцінювали монооксигеназні активності множинних форм цитохрому Р450 [И.И. Карузина, А.И. Арчаков, 1977]. Анілінгідроксилазну активність визначали за швидкістю утворення пара-амінофенолу [И.И. Карузина, А.И. Арчаков, 1977], амідопірин-N-деметилазну активність - за утворенням формальдегіду [И.И. Карузина, А.И. Арчаков, 1977]. Пара-нітрофенолгідроксилазну активність оцінювали за швидкістю перетворення пара-нітрофенолу в пара-нітрокатехол [D.R. Koop, 1986]. Активність флавінвмісної монооксигенази (КФ 1.14.13.8) визначали за утворенням N-оксиду диметиланіліну [Карузина И.И., А.И. Арчаков, 1977]. Активність глутатіон-S-трансферази (КФ 2.5.1.18) оцінювалась за утворенням кон'югатів глутатіону з 1-хлор-2,4-динітробензолом - субстратом з широкою специфічністю до більшості ізоформ глутатіон-S-трансферази, включаючи альфа, мю та пі форми [W.H. Habig, W.B. Jacobi, 1981; J.P. Ploemen et al., 1996]. У випадку 1-хлор-2,4-динітробензолу активність глутатіон-S-трансферази визначали за утворенням кон'югатів цього субстрату з глутатіоном [W.H. Habig, W.B. Jacobi, 1981]. Активність глутатіонпероксидази (КФ 1.15.1.1) визначали за падінням вмісту відновленого глутатіону [D. Roy, J.G. Liehr , 1989].

Статистичні методи дослідження. Статистичну обробку результатів проводили в пакеті "STATISTIKA 5,5” (належить ЦНІТ ВНМУ ім. М. І. Пирогова, ліцензійний № AXXR910A374605FA). Достовірність відхилень між результатами оцінювали за допомогою критерію Ст'юдента, при цьому вірогідними вважали розбіжності при р<0,05. Взаємозв'язок ознак визначали за допомогою обчислення коефіцієнта кореляції Пірсона (r) [Е.В. Гублер, 1978; В.Н. Носков, 1990].

Результати дослідження та їх обговорення. На першому етапі роботи ми дослідили вплив цисплатину, бромбензолу та гліцеролу на показники функціонального стану нирок. Встановлено, що ці ксенобіотики викликали виражені порушення фільтраційної функції нирок. Зокрема, у щурів з цисплатиновим ураженням нирок реєструвалось зростання вмісту сечовини, креатиніну сироватки та зниження клубочкової фільтрації в 5,9, 3,3 та 3,0 рази відповідно. Натомість зміни за бромбензолової нефропатії становили 3,5, 2,3 та 2,8 рази, а у тварин з гліцероловою моделлю ураження нирок - 6,0, 3,4 та 7,0 рази. Отже, серед нефротоксикантів саме гліцерол викликав більш виразне порушення фільтрації в нирках. Введення модельних ксенобіотиків також приводило до пошкодження тубулярного апарату нирок. При цьому міоглобінуричне ураження нирок (гліцеролова модель) викликало зростання співвідношення г-глутамілтрансфераза/креатинін, глюкозурії та протеїнурії - в 5,8, 4,7, 4,3 рази при ураженні нирок цисплатином - в 5,2, 4,7 та 4,3 рази, а при пошкодженні бромбензолом - в 3,2 2,9 і 3,3 рази відповідно.

Однією із важливих причин ксенобіотичного ураження нирок є ініціювання оксидативного стресу [Ю.І. Губський та співавт., 2005; B.J. Padanilam, 2003]. На сьогодні доведено, що посилене утворення реактивних кисневих інтермедіатів посідає важливе місце в механізмах міоглобінуричного ураження нирок. В той же час не вирішено питання щодо ролі цих процесів в формування токсичної дії цисплатину та бромбензолу. Ми показали (табл. 1), що введення досліджуваних токсикантів ініціювало розвиток оксидативного стресу, про що доказово свідчило накопичення продуктів пероксидації ліпідів та білків - малонового діальдегіду (МДА) та карбонільних груп (КГ) білків в нирках. Поряд з цим за токсичних нефропатій реєструвалось достовірне збільшення (в 1,8-3,0 рази) активності ензимів - продуцентів активних форм кисню - ксантиноксидази (КСО) і NADPH-оксидази, вірогідне зниження вмісту білкових тіолів на 32-50%, відновленого глутатіону на 39-54%, активності глутатіонпероксидази (ГПО) на 32-57%, глюкоза-6-фосфатази на 35-57% та АТФ на 27-39% в нирках.

Таблиця 1 Показники пероксидації ліпідів, білків та стану анти- і прооксидантних систем в нирках щурів дослідних груп (М±m, n=8-9)

Примітка: * - р<0,05 відносно відповідного контролю.

Проведені нами дослідження (табл. 2) засвідчили, що розвиток оксидативного стресу за токсичних нефропатій асоціюється з накопиченням каталітично-активних іонів заліза: ураження нирок цисплатином, бромбензолом та гліцеролом викликало зростання сироваткового заліза (в 2,4, 2,0 та 3,6 рази) та негемового заліза в нирках (в 2,2, 1,9 та 4,3 рази відповідно). З'ясувалось, що збільшення вмісту заліза за токсичних нефропатій супроводжувалось зниженням загальної (27,7, 15,1 та 27,7%) та латентної (в 4,8, 2,0 та 19 раз відповідно) залізозв'язуючої здатності сироватки (ЗЗС) крові, а також посиленим розпадом гемвмісних протеїнів в нирках, доказом чого було вірогідне зниження вмісту гему, активності аконітази (ензиму, який депонує залізо у вигляді ферумсірчаних кластерів) та зростання (р<0,05) активності в нирках гемоксигенази, що каталізує деградацію гемвмісних білків.

Безпосередні докази причетності іонів заліза в ініціюванні оксидативного стресу в нирках надали результати досліджень in vitro спроможністі катіонів заліза, присутніх в гомогенаті нирок, підтримувати аскорбат-залежну пероксидацію ліпідів. Отримані дані засвідчили, що гомогенати нирок тварин з цисплатиновим, бромбензоловим та особливо міоглобінуричним ураженням нирок мали більш високу здатність до пероксидації ліпідів, ніж гомогенати інтактних тварин. У щурів, що отримували цисплатин та бромбензол приріст утвореного в процесі пероксидації ліпідів малонового діальдегіду перевищував такий у інтактних щурів в 2,7 та 1,9 рази відповідно, а у щурів з міоглобінуричним ураженням нирок - в 3,6 рази.

Таблиця 2 Показники метаболізму заліза в нирках та сироватці крові щурів при різних типах ураження нирок щурів (М±m, n=8-9)

Примітка: * - р<0,05 відносно відповідного контролю.

Таким чином, проведені дослідження показали, що важливу роль в розвитку ксенобіотичних нефропатій відіграє ініційований вивільненям іонів заліза оксидативний стрес. Тому в якості препаратів коректорів функціонального стану нирок нами були обрані препарати з антиоксидантною дією - диметилтіосечовина, дисфериоксамін та триметазидин. Застосування антиоксидантів суттєво (р<0,05) обмежувало індуковане цисплатином, бромбензолом та гліцеролом пошкодження гломерулярного та тубулярного апарату нирок щурів. У щурів, яким вводили диметилтіосечовину, дисфериоксамін та триметазидин, застосування нефротоксикантів ініціювало достовірно менше падіння клубочкової фільтрації, наростання азотемії, глюкозурії та активності ГГТП порівняно з щурами, які не отримували антиоксиданти. Захисна дія виявилась найвищою у диметилтіосечовини та дисфериоксаміну, тоді як у триметазидину вона була меншою.

індуковані цисплатином (ЦИС), бромбензолом (БР) та гліцеролом (ГЛ).

Надалі ми дослідили вплив використаних коректорів на розвиток оксидативного стресу та процеси мобілізації заліза. Дослідження проведені на моделях цисплатинової та міоглобінуричної нефропатій, оскільки саме за цих уражень нирок показники функціонального стану нирок найбільш тісно корелювали з процесами пероксидації ліпідів, білків та порушенням метаболізму заліза. З антиоксидантних препаратів нами використані диметилтіосечовина та дисфериоксамін, які в дослідженнях in vivo виявляли найбільш виразну захисну дію щодо нирок. Так, введення диметилтіосечовини та дисфериоксаміну за цих умов зменшувало масштабність змін вмісту карбонільних груп білків, малонового діальдегіду, активностей NADPH-оксидази, ксантиноксидази, глутатіонпероксидази, глюкоза-6-фосфатази, рівнів глутатіону, тіольних груп та АТФ в нирках, порівняно з тваринами, які не отримували антиоксиданти.

Використання диметилтіосечовини та дисфериоксаміну також нормалізує метаболізм заліза в нирках. Виявилось, що призначення антиоксидантів за цисплатинової нефропатії зменшувало наростання вмісту сироваткового заліза (на 22-41%), негемового заліза в нирках (на 31-45%) та падіння латентної залізозв'язуючої здатності сироватки крові (в 2,4-3,4 рази), відносно тварин, які не отримували коректори. Подібна тенденція досліджуваних показників відмічалась і за умов призначення антиоксидантів за міоглобінуричного ураження нирок, причому більш ефективний вплив на вміст заліза та залізозв'язуючу здатність виявляв саме дисфериоксамін.

Застосування диметилтіосечовини та дисфериоксаміну ефективно попереджувало процеси деградації гемопротеїнів та вивільнення нехелатованих токсичних іонів заліза. Зокрема, у тварин з цисплатиновою нефропатією, яким попередньо вводили коректори, зниження рівня гему в нирках складало 16,6 та 16,6%, падіння активності аконітази - 17,0% та 18,8%, а зростання гемоксигенази відповідно 42,5 та 41,6%, тоді як у нелікованих щурів зміни цих показників складали відповідно 46,7, 45,4 та 185%, відповідно. Призначення коректорів при міоглобінуричному пошкодженні нирок викликало аналогічну направленість змін досліджуваних показників, хоча за цих умов найбільш ефективним коректором метаболізму заліза в нирках виявився дисфериоксамін.

Отже нефропротекторна дія дисфериоксаміну та диметилтіосечовини обумовлена їх здатністю стримувати розвиток оксидативного стресу, обмежувати виснаження ниркових антиоксидантів, запобігати порушенню активності про- та антиоксидантних ензимів, а також зменшувати масштабність змін метаболізму заліза в нирках щурів за цисплатинової, гліцеролової та бромбензолової нефропатії.

За даними літератури, в механізмах токсичного ураження нирок важливу роль відіграють реакції метаболічної активації, які є джерелом реакційноздатних метаболітів. Останні ковалентно модифікують тіольні групи цистеїну, аміногрупи лізину та гістидину, гідроксигрупи серину та треоніну в білках, а в нуклеїнових кислотах - атоми нітрогену і оксигену пуринових та піримідинових основ, що веде до порушення залежних від біомолекул функцій клітин нирок і може стати причиною загибелі клітин, мутацій, утворення неоантингенів та інших несприятливих змін [A.V. Stachulski, 2007; C. Skonberg et al., 2008, J. Perrone et al., 2008]. Тому досить важливим є вивчення ролі процесів метаболічної активації в реалізації нефротоксичного потенціалу цисплатину, гліцеролу та бромбензолу.

Спершу нами досліджено внесок реакцій токсифікації ксенобіотиків, асоційованих з І фазою біотрансформації, в механізми ураження нирок модельними нефротоксикантами (табл. 3). Оскільки важливу роль в утворенні реакційноздатних метаболітів відіграють реакції, каталізовані цитохромом Р4502Е1 ми використали інгібітор цього цитохрому - діетилдітіокарбамат та його індуктор - ацетон [С.О. Качула, О.О. Пентюк, 2004]. Виявлено, що ацетон погіршував перебіг цисплатинової та бромбензольної нефропатії та практично не впливав на міоглобінуричне пошкодження нирок.

Таблиця 3 Показники функціонального стану нирок щурів при різних типах ураження нирок щурів (М±m, n=8-9)

Примітки: 1. * - р<0,05 відносно відповідного контролю;

2. # - р<0,05 відносно відповідної групи тварин з нелікованою нефропатією.

Попереднє введення діетилдітіокарбамату справляло виразний захистний вплив на нирки лише за умов цисплатинової та бромбензолової нефропатій: застосування цього інгібітору статистично вірогідно (р<0,05) зменшувало токсичний вплив саме цисплатину та бромбензолу на фільтраційну функцій нирок та канальцевий апарат.

Ще одним доказом вагомої ролі процесів метаболічної активації в патогенезі токсичних нефропатій є виявлені нами зміни активності ензимів, залучених до токсифікації ксенобіотиків. Так, за умов цисплатинового та бромбензолового ураження нирок посилюються Р4502E1-залежні етапи біотрансформації (в 1,4 та 2,2 рази), знижується амідопірин-N-деметилазна активність цитохрому Р450 (на 30-50%), падає активність флавінмонооксигенази (на 20-30%), а також сповільнюються глутатіон-залежні реакції (на 24,1 та 53,8 % і більше).

В наступній частині нашої роботи ми оцінили в якій мірі нефротоксичний потенціал цисплатину, бромбензолу та гліцеролу опосередковується через метаболічну активацію в реакціях кон'югації. Нині відомо, що важливу роль в утворенні реакційноздатних метаболітів на ІІ етапі біотрансформації ксенобіотиків відіграють ензими глутатіонового та меркаптуратного шляхів метаболізму ксенобіотиків [S. Chakravarthi et al., 2006]. Тому в подальшому ми вивчили вплив інгібіторів та індукторів цих шляхів на нефротоксичність бромбензолу, цисплатину та гліцеролу. З цією метою ми використали етакринову кислоту (ЕК) - блокатор глутатіон-S-трансферази [S. Awasthi et al., 1993], амінооксиоцтову кислоту (АООК) - інгібітор бета-ліазного шляху метаболізму цистеїнових кон'югатів [T.A. McGoldrick et al., 2003], метімазол - субстрат та водночас інгібітор флавінвмісної монооксигенази [M. Ban et al., 1995; S.K. Krueger, D.E. Williams, 2005], а також б-кетоглутарат - активатор ензимів трансамінування [M.W. Anders, 2008].

Введення інгібіторів глутатіонового та меркаптуратного шляху метаболізму ксенобіотиків попереджувало ураження нирок цисплатином та бромбензолом, проте не впливало на ступінь міоглобінуричного пошкодження нирок (табл. 4).

Таблиця 4 Показники функціонального стану нирок щурів при різних типах ураження (М±m, n=8-9)

Примітки: 1. * - р<0,05 відносно відповідного контролю;

2. # - р<0,05 відносно відповідної групи тварин з нелікованою нефропатією.

У тварин, що отримували цисплатин та бромбензол на тлі введення цих інгібіторів, зростання рівня сечовини в сироватці крові, протеїнурії, ензимурії, глюкозурії та падіння клубочкової фільтрації було достовірно (р<0,05) меншим, ніж у тварин, які отримували лише нефротоксиканти. Найбільш потужна нефропротекторна дія була зафіксована у амінооксиоцтової кислоти, дещо менша - у метімазолу і найменша - у етакринової кислоти. В той же час використання активатору ензимів трансамінування б-кетоглутарової кислоти посилювало нефротоксичність цисплатину та бромбензолу, про що свідчило більш виразне (р<0,05) падіння клубочкової фільтрації та пошкодження тубулярного апарату, порівняно з тваринами, які не отримували корекцію.

Таким чином проведені дослідження показали, що реакції метаболічної активації за участі цитохрому Р4502Е1 та ензимів глутатіонового і меркаптуратного шляхів метаболізму ксенобіотиків інтегровані в патогенез уражень нирок цисплатином та бромбензолом, але не мають важливого значення в механізмах формування міоглобінуричного пошкодження нирок.

Очевидно, нефропротекторна дія інгібіторів ксенобіотик-метаболізуючих ензимів переважно обумовлена їх здатністю стримувати процеси метаболічної активації. З метою підтвердження цього припущення ми дослідили вплив інгібіторів цитохрому Р450 та ензимів глутатіонового і меркаптуратного шляхів метаболізму ксенобіотиків на показники метаболізму заліза та процесів пероксидації ліпідів та білків в нирках щурів. Для досліджень ми обрали лише два інгібітори - діетилдітіокарбамат та амінооксиоцтову кислоту, оскільки саме вони виявляли найбільшу протекторну дію на цисплатиновій та бромбензоловій моделях ураження нирок.

Застосування діетилдітіокарбамату та амінооксиоцтової кислоти попереджувало надмірну активацію процесів пероксидації ліпідів і білків, викликану досліджуваними нефротоксикантами. В групі тварин, яким вводили інгібітори, виявлялись достовірно (р<0,05) менші рівні малонового діальдегіду (на 24-32%) та карбонільних груп білків (на 20-33%) в нирках, порівняно з щурами, що отримували лише нефротоксиканти.

Введення інгібіторів ксенобіотик-метаболізуючих ензимів зменшувало дисбаланс в про- та антиоксидантних ензимах, а також запобігало формуванню дефіциту ниркових антиоксидантів. Зокрема, призначення цисплатину та бромбензолу на фоні діетилдітіокарбамату та амінооксиоцтової кислоти супроводжувалось меншим (р<0,05) наростанням активності ксантиноксидази і NADPH-оксидази, падінням вмісту білкових тіолів, глутатіону в нирках та активності глутатіонпероксидази відносно нелікованих тварин.

Насичення щурів діетилдітіокарбаматом та амінооксиоцтовою кислотою супроводжувалось зменшенням вивільнення каталітично активних іонів заліза в нирках. Ці речовини суттєво стримували викликане нефротоксикантами зростання вмісту нехелатованого заліза в сироватці крові, падіння латентної залізозв'язуючої здатності сироватки крові та підвищення вмісту негемового заліза в нирках. У тварин, що отримували лише цисплатин, рівень сироваткового заліза підвищувався на 139%, вміст негемового заліза в нирках зростав на 123%, а зменшення латентної залізозв'язуючої здатності складало 79,0%, тоді як у щурів, яким вводили цисплатин на фоні діетилдітіокарбамату чи амінооксиоцтової кислоти зміни цих показників були менш масштабними і становили в середньому 95,0, 77,0 та 60,0% відповідно. Подібні зміни реєструвались і за умов призначення вказаних коректорів за бромбензолової нефропатії, причому дія діетилдітіокарбамату була вищою, ніж амінооксиоцтової кислоти.

Отже, механізми реалізації нефропротекторних ефектів діетилдітіокарбамату та амінооксиоцтової кислоти не обмежуються лише депримуючим впливом на активність ксенобіотик-метаболізуючих ензимів, але й пов'язані з їх антиоксидантною дією. Остання базується на здатності інгібіторів цитохрому Р4502Е1 та бета-ліази цистеїнових кон'югатів нормалізувати активність про- та антиоксидантних ензимів, поповнювати запаси ендогенних антиоксидантів та попереджувати накопичення каталітично активних нехелатованих іонів заліза.

міоглобінуричний щур триметазидин нефропатія

Висновки

У дисертації наведені експериментальні дані, які свідчать про провідну роль процесів метаболічної активації та оксидативного стресу у реалізації пошкоджуючої дії модельних нефротоксинів - цисплатину, бромбензолу та гліцеролу, а також розроблено патогенетично обґрунтовані шляхи профілактики їх нефротоксичності шляхом застосування інгібіторів ксенобіотик-метаболізуючих ферментів, антиоксидантів і хелатору іонів заліза дисферіоксаміну.

1. Встановлено, що введенння цисплатину, бромбензолу та гліцеролу щурам викликає гостру ниркову недостатність, про що свідчать порушення фільтраційної здатності нирок (азотемія, підвищення рівня молекул середньої маси в сироватці крові, зниження виділення креатиніну з сечею, зменшення клубочкової фільтрації) та ураження канальцевого апарату нирок (підвищення активності гама-глутамілтрансферази в сечі, протеїнурія та глюкозурія). Так, за умов цисплатинового, бромбензолового та міоглобінуричного ураження рівень сечовини зростав в 5,9, 3,5 та 4 рази, відповідно, швикість клубочкової фільтрації зменшилась до 0,09, 0,010 та 0,04 мл/хв (в контролі - 0,27 мл/хв) та спостерігалось зростання активності гамаглутамілтрансферази в 3,5, 3,2 та 2,3 рази, відповідно.

2. Цисплатин, бромбензол та гліцерол ініціюють розвиток оксидативного стресу, що супроводжується активацією прооксидантних ферментів, виснаженням антиоксидантних систем, накопиченням продуктів пероксидації ліпідів і білків, вивільненням та накопичення нехелатованих іонів заліза в крові та нирках, ураженням клітинних мембран та порушенням процесів енергопродукції в нирках. Дія вказаних нефротоксикантів супроводжується порушеннями обміну заліза - значним зростанням вмісту негемового заліза в сироватці крові та нирках (в 2,2, 1,9 та 4,4 рази) та зменшенням залізозв'язуючої здатності сироватки крові (на 27,7, 15,1 та 27,7%, відповідно). В нирках за цих умов знижується рівень відновленого глутатіону, білкових тіолів, АТФ, активність глутатіонпероксидази, глюкоза-6-фосфатаза, активуються прооксидантні ферменти ксантиноксидаза та NADPH-оксидаза, особливо за міоглобінуричного ураження нирок.

3. Під впливом нефротоксикантів (цисплатину, бромбензол та гліцерол) виникають різноспрямовані зміни активності ферментів першої та другої фаз метаболізму ксенобіотиків, а саме, посилення Р4502E1-залежних етапів біотрансформації (паранітрофенолгідроксилазна активність цитохрому Р4502Е1 зростала в 1,9, 2,2 та 1,4 рази, відповідно) при помітному гальмуванні амідопірин-N-деметилазної активності цитохрому Р450 (на 37,2%, 50% та 29,2%, відповідно) та помірному - флавінмонооксигенази, а також пригнічення глутатіон-залежних реакцій (активність глутатіон-S-трансферази зменшується на 38,4%, 53,8 % та 24,1%, відповідно), що може бути причиною розвитку прооксидативних процесів та нефротоксичної активації ксенобіотиків.

4. Введення антиоксидантів - триметазидину та особливо диметилтіосечовини і хелатору іонів заліза - дисфериоксаміну, обмежує нефротоксичність цисплатину, бромбензолу та гліцеролу, що проявляється прискоренням клубочкової фільтрації (в 2 рази і більше), зменшенням ензимурії, глюкозурії, протеїнурії. Вказані речовини зменшують процеси пероксидації білків та ліпідів в нирках, знижують рівень малонового діальдегіду, активність прооксидантних ферментів, глюкоза-6-фосфатази та збільшують активність антиоксидантних ферментів, вміст тіолових груп білків, відновленого глутатіону та АТФ.

5. Застосування інгібіторів ферментів першої та другої фаз метаболізму ксенобіотиків) гальмує розвиток цисплатинового та бромбензолового, але не міоглобінурічного ураження нирок. За ступенем нефропротекторної дії застосовані нами інгібітори розташовуються в порядку зменшення ефективності таким чином: діетилдітіокарбамат ? амінооксиоцтова кислота > метимазол > етакринова кислота. В той-же час, індуктор реакцій переамінування - альфакетоглутарова кистота та цитохрому Р450 - ацетон достовірно збільшували патогенетичний вплив нефротоксикантів.

6. Інгібітори ферментів першої та другої фаз метаболізму ксенобіотиків не лише стримують процеси метаболічної активації, але і частково попереджують порушення метаболізму заліза та розвиток оксидативного стресу. Показано, що введення щурам діетилдітіокарбамату чи амінооксиоцтової кислоти суттєво обмежує викликане цисплатином та бромбензолом зростання вмісту заліза в сироватці крові, падіння латентної залізозв'язуючої здатності сироватки крові та підвищення вмісту негемового заліза в нирках. Ці інгібітори зменшують викликане цисплатином падіння активності ферменту антиоксидантного захисту глутатіонпероксидази, а також протидіють активації прооксидантних процесів, а саме в 2,5 рази знижують активність ксантиноксидази.

Список праць, опублікованих за темою дисертації

1. Пентюк О.О. Нефротоксичність лікарських засобів: клінічні прояви, патофізіологічні механізми та підходи до лікування (огляд літератури) / О. О. Пентюк, Н. І. Волощук, О. В. Машевська // Раціональна фармакотерапія - 2009. - №1(10). - С. 21-28. (Здобувачем особисто проведено аналіз та узагальнення літературних даних і написання частини статті по молекулярним механізмам нефротоксичності).

2. Машевська О.В. Протективна дія інгібіторів глутатіон-S- трансферази, бета-ліази, флавінвмісної монооксигенази й антиоксидантів при ураженні нирок щурів цисплатином / О. В. Машевська, О. О. Пентюк // Одеський медичний журнал. - 2009. - №3. - С. 7-9. (Автором здійснено аналіз літератури, проведено експериментальні дослідження, проаналізовані результати, написана частина статті).

3. Машевська О.В. Оцінка протективної дії дисфериоксаміну, триметазидину, диметилтіосечовини та геністеїну при ураженні нирок щурів цисплатином / О. В. Машевська, О. О. Пентюк // Актуальні проблеми сучасної медицини: Вісник Української медичної стоматологічної академії. - 2009. - №4 - С. 94-98. (Здобувачем проведено аналіз та узагальнення даних літератури, розробка методів біохімічних досліджень, статистична обробка матеріалу, написання частини статті).

4. Машевська О.В. Вплив модуляторів цитохрому Р450 на перебіг цисплатинового, бромбензолового та міоглобінуричного ураження нирок щурів / О. В. Машевська // Фармакологія та лікарська токсикологія. - 2010. - №1-2. - С. 111-116.

5. Машевська О.В. Вплив антиоксидантів десферіоксаміну та диметилтіосечовини на показники обміну заліза та процеси оксидативного стресу у щурів з цисплатиновим та міоглобінуричним ураженням нирок / О. В. Машевська // Медична хімія. - 2010. - №4.- С. 58-60.

6. Машевська О.В. Прооксидантні механізми токсичного ураження нирок цисплатином. Протективна дія триметазидину, дисфериоксаміну, геністеїну та диметилтіосечовини / О. В. Машевська // Матеріали міжнародної конференції "Молодь та поступ біології", 12-15 травня 2009р., м. Львів - Т.2 - С. 55.

7. Машевська О.В. Вплив модуляторів глутатіонового та меркаптуратного шляхів метаболічної активації ксенобіотиків на перебіг цисплатинового, бромбензолового та міоглобінуричного ураження нирок щурів / О. В. Машевська // Матеріали Всеукраїнської науково-практичної конференції “Досягнення і перспективи експериментальної і клінічної біохімії”, 8-9 жовтня 2009 р., Тернопіль. - Медична хімія. - 2009. - Т.11, №3. - С. 161.

8. Машевська О.В. Вплив діетилдітіокарбамату та амінооксиоцтової кислоти на показники обміну заліза у щурів з цисплатиновим та бромбензоловим ураженням нирок / О. В. Машевська // Матеріали Х Українського біохімічного з'їзду, 13-17 вересня 2010 р., Одеса. - Український біохімічний журнал. - Т.82, №4 (додаток 2). - С. 128.

Размещено на Allbest.ru