Цитоморфологічна характеристика клітин лімфоми NK/ly і їх поверхневих вуглеводних детермінант у дослідженні ефективності потенційних протипухлинних препаратів

Размещено на http://www.allbest.ru/

МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ'Я УКРАЇНИ

ДЕРЖАВНИЙ ВИЩИЙ НАВЧАЛЬНИЙ ЗАКЛАД

ІВАНО-ФРАНКІВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

УДК: 611-018.1 :616-006.441-085.277.3

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук

ЦИТОМОРФОЛОГІЧНА ХАРАКТЕРИСТИКА КЛІТИН ЛІМФОМИ NK/Ly І ЇХ ПОВЕРХНЕВИХ ВУГЛЕВОДНИХ ДЕТЕРМІНАНТ У ДОСЛІДЖЕННІ ЕФЕКТИВНОСТІ ПОТЕНЦІЙНИХ ПРОТИПУХЛИННИХ ПРЕПАРАТІВ

14.03.09-гістологія, цитологія, ембріологія

ЛУЦИК МАКСИМ МАКСИМОВИЧ

Івано-Франківськ - 2011

Дисертацією є рукопис

Робота виконана у Львівському національному медичному університеті

імені Данила Галицького МОЗ України.

Науковий керівник: доктор медичних наук, професор

Ященко Антоніна Михайлівна,

Львівський національний медичний університет

імені Данила Галицького МОЗ України, кафедра

гістології, цитології та ембріології, професор кафедри

Офіційні опоненти:доктор медичних наук, професор

Мотуляк Андрій Памфілович,

ВДНЗ “Івано-Франківський національний

медичний університет”, кафедра гістології,

цитології та ембріології, професор кафедри;

доктор біологічних наук, старший науковий

співробітник Кіт Юрій Ярославович,

Інститут біології клітини НАН України,

лабораторія відділу регуляції клітинної проліферації

і апоптозу, завідувач лабораторії.

Захист відбудеться « 30 » вересня 2011 року об 11 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 20.601.02 при ДВНЗ “Івано-Франківський національний медичний університет” МОЗ України (76018, м.Івано-Франківськ, вул. Галицька, 2).

Із дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці ДВНЗ “Івано-Франківський національний медичний університет” МОЗ України (76018, м. Івано-Франківськ, вул. Галицька, 7).

Автореферат розісланий « 26 » серпня 2011 року

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради Д 20.601.02

кандидат медичних наук, доцент О.Г.Попадинець

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

лімфома імуноцитохімічний вінбластин

Актуальність теми. Дослідження ефективності потенційних протипухлинних речовин на експериментальних пухлинах in vivo є принципово важливим етапом у пошуку нових протипухлинних препаратів. Для оцінки впливу різних чинників на пухлину морфологічні методи є обов'язковим елементом такого дослідження. Цитологічні методи мають, крім того, особливо важливе значення в діагностиці онкогематологічних захворювань (Глузман Д.Ф. та ін., 2003). На сучасному етапі вони включають як традиційні методи забарвлення, так і методи ензимоцитохімії, імуноцитохімії, електронної мікроскопії. Важливе значення при цьому має кількісна оцінка результатів. Сучасні технічні досягнення і застосування комп'ютерних технологій суттєво розширили можливості кількісного цитологічного аналізу. У зв'язку з цим значна частина дисертаційної роботи присвячена вибору оптимальних методів забарвлення цитологічних препаратів для визначення ступеня пошкодження пухлинних клітин і кількісній оцінці результатів.

Поряд із традиційними цитологічними методами застосовано новий підхід - дослідження вуглеводів клітинної поверхні, які, за даними літератури, відіграють суттєву роль у процесах пухлинного росту і мають важливе діагностичне та прогностичне значення (Brooks S. et al., 1996; Чехун В.Ф. та ін., 2002; Пащенко С.М., 2005). Для характеристики вуглеводів клітинної поверхні застосовують моноклональні антитіла і лектини, останні є більш доступними і популярними. Переважна більшість робіт у цьому напрямі присвячена діагностичним і прогностичним аспектам (Глузман Д.Ф. та ін., 1993, 2003; Логінський В.Є. та ін., 2004, 2005). Зміни вуглеводних детермінант клітинної поверхні під впливом хіміопрепаратів досліджені менше. Описано зміни біосинтезу глікокон'югатів за включенням мічених моносахаридів у глікополімери під впливом хіміотерапії (De Graaf T.W. et al., 1993). При індукції апоптозу хіміопрепаратами виявлено посилення експонування вуглеводних детермінант із термінальними залишками D-манози і D-галактози (Bilyy R.O. et al., 2003). Разом з тим, зміни вуглеводних детермінант клітинної поверхні в процесі росту експериментальних пухлин, зокрема лімфоми NK/Ly, вивчені недостатньо.

Останнім часом сапонінам і сапогенінам приділяється значна увага як речовинам із протипухлинною активністю. Нагромаджено значний матеріал про перспективність їх дослідження в якості потенційних лікарських засобів, деякі з них вже знайшли клінічне підтвердження (Patocka J., 2003; Ovesna Z. et al., 2004; Paduch R.et al., 2007). У зв'язку з цим, значна частина дисертації присвячена дослідженню нових речовин із властивостями сапогенінів, отриманих із чистотілу (Chelidonium majus L.) і вовчника (Daphne mezereum L.),і їх впливу на клітини NK/Ly і лейкозу L1210 у порівнянні із вінбластином, взятим в якості позитивного контролю.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана в рамках планових наукових тем кафедри гістології, цитології та ембріології Львівського національного медичного університету імені Данила Галицького “Лектинові маркери та цитоплазматичні сигнальні молекули у процесі клітинної диференціації і проліферації” (№ державної реєстрації 0700U00106), “Пошук нових препаратів лектинів із сировини Карпатського регіону та можливості їх застосування у біології та медицині” (№ державної реєстрації 0107U001048). Автор є співвиконавцем цих робіт.

Мета і задачі дослідження. Встановити на цитологічному рівні зміни загальної морфології і вуглеводних детермінант поверхні пухлинних клітин під впливом протипухлинних хіміопрепаратів in vivo на експериментальній лімфомі NK/Ly мишей із визначенням діагностичної цінності цих змін для оцінки ефективності нових потенційних протипухлинних препаратів.

Завдання дослідження:

1. Визначити оптимальний набір методів забарвлення цитологічних препаратів для кількісної оцінки пошкодження пухлинних клітин під впливом хіміопрепаратів із застосуванням комп'ютерного морфометричного аналізу.

2. Охарактеризувати вуглеводні детермінанти поверхні клітин лімфоми NK/Ly і лейкозу L1210 (для порівняння) з допомогою лектинів в якості вуглеводспецифічних зондів із наступним виявленням їх локалізації непрямим імуноцитохімічним методом.

3. Дослідити зміни морфології клітин лімфоми NK/Ly і вуглеводних детермінант їх поверхні в процесі росту пухлини і під впливом протипухлинного препарату вінбластину в якості позитивного контролю.

4. Вивчити вплив очищеної із чистотілу (Chelidonium majus L.) речовини із властивостями сапогеніну на ріст лімфоми NK/Ly, морфологію пухлинних клітин і вуглеводні детермінанти їх поверхні.

5. Дослідити вплив речовини із властивостями сапогеніну, отриманої із вовчника (Daphne mezereum L.), на ріст лімфоми NK/Ly і лейкозу L1210 (для порівняння), морфологію пухлинних клітин і вуглеводні детермінанти їх поверхні.

Об'єкт дослідження: процес пухлинного росту і зміни пухлинних клітин під дією хіміопрепаратів.

Предмет дослідження: морфологічні зміни клітин лімфоми NK/Ly і лейкозу L1210 під впливом відомого протипухлинного препарату вінбластину і нових досліджуваних речовин.

Методи дослідження: експериментально-біологічні, цитологічні, імуноцитохімічні, морфометричний аналіз цитологічних препаратів із застосуванням комп'ютерної технології, метод статистичного аналізу.

Наукова новизна одержаних результатів. Запропонована система цитологічних методів для оцінки цитотоксичної дії хіміопрепаратів на пухлинні клітини. Вона включає: аналіз розподілу клітин за розмірами і визначення відсотка клітин збільшених розмірів (макроцитів); морфометричний аналіз цитологічних препаратів, забарвлених азур-еозином, бромфеноловим синім на вміст білка (оригінальний метод), гематоксиліном і нейтральним червоним (оригінальна модифікація) - на структуру хроматину. Визначено показники, за якими проводиться класифікація клітин і визначається ступінь пошкодження клітинної популяції.

Опрацьовано непрямий імуноцитохімічний метод виявлення місць зв'язування лектинів із поверхнею клітин (технологія IGSS - immunogold silver staining); із цією метою отримано антитіла, специфічні до лектинів сочевиці, арахісу, зародків пшениці, мічені колоїдним золотом.

Встановлено, що речовина із властивостями сапогеніну із чистотілу малотоксична, однак, проявляє цитотоксичність у дозі 100 мг/кг щодо клітин NK/Ly. Клінічно терапевтичний ефект незначний. Речовина із властивостями сапогеніну із вовчника високотоксична, проявляє виражену пошкоджуючу дію щодо клітин NK/Ly, однак, в якості терапевтичного препарату неперспективна внаслідок високої неселективної токсичності.

Вперше виявлено і кількісно охарактеризовано гетерогенність популяції клітин лімфоми NK/Ly за зв'язуванням лектинів - конканаваліну А, сочевиці, арахісу, зародків пшениці. Виявлено достовірне зменшення зв'язування лектину арахісу субпопуляцією макроцитів, утворення яких індуковано вінбластином. Сапогеніноподібні речовини чистотілу зумовлюють достовірне збільшення відсотка клітин NK/Ly, які зв'язують лектини сочевиці і арахісу.

Практичне значення одержаних результатів. Запропонована система цитологічних тестів може бути застосована при скринінгу протипухлинних препаратів. Показано, що сапогеніноподібні речовини чистотілу і вовчника проявляють цитотоксичну дію щодо пухлинних клітин NK/Ly, однак, застосування їх як самостійних препаратів у хіміотерапії пухлин малоефективне.

Виявлена гетерогенність популяції пухлинних клітин за профілем зв'язування лектинів вказує на перспективність фракціонування клітинних популяцій із допомогою лектинів і дослідження біологічних властивостей окремих субпопуляцій.

Впровадження результатів дослідження. Матеріали дисертації впроваджені і застосовуються у навчальному процесі на кафедрах гістології, цитології та ембріології Тернопільського державного медичного університету імені І.Я. Горбачевського і Вінницького національного медичного університету імені М.І. Пирогова; у науковій роботі відділу сигнальних механізмів клітини Інституту біології клітини НАН України, у роботі відділення цитології Бюро судово-медичної експертизи Головного управління охорони здоров'я Львівської ОДА.

Особистий внесок здобувача. Автором самостійно проведено патентно-інформаційний пошук, сформульовано мету і завдання дослідження, виконано експериментальну частину роботи, яка включала перещеплення пухлини і дренаж асцитної рідини, підрахунок кількості пухлинних клітин в асцитній рідині, приготування мазків асцитних клітин, забарвлення препаратів з допомогою різних цитологічних методик і кількісна морфометрична оцінка результатів, отримання напівтонких зрізів пухлинних клітин, залитих в епоксидні смоли або унікрил, із наступним їх забарвленням для морфометричного аналізу з допомогою світлової мікроскопії, лектиногістохімії та електронної мікроскопії. Проведено статистичну обробку отриманих морфометричних даних. Обговорення і узагальнення результатів та висновків проведено спільно з науковим керівником.

Апробація результатів дисертації. Основні положення та результати роботи були представлені на науково-практичних конференціях: “ІХ Український біохімічний з'їзд” (Харків, 2006), “2-й з'їзд українського товариства клітинної біології” (Київ, 2007), “Прикладні аспекти морфології експериментальних і клінічних досліджень” (Тернопіль, 2008), “І Міжнародна наукова конференція молодих учених” (Донецьк, 2009), “Актуальні проблеми функціональної морфології та інтегративної антропології” (Вінниця, 2009).

Публікації. Результати дисертаційної роботи опубліковані в 10 наукових працях, із яких 4 статті - у фахових виданнях, рекомендованих ВАК України, 6 публікацій - у матеріалах науково-практичних конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація викладена українською мовою на 153 сторінках машинописного тексту (основний текст роботи становить 125 сторінок) і складається зі вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів дослідження, результатів дослідження, аналізу та узагальнення результатів, висновків. Список літератури включає 205 джерел, із них 59 праць вчених країн СНД і 146 праць іноземних авторів. Робота ілюстрована 55 рисунками і 10 таблицями.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи дослідження. Дослідження проводили на мишиній лімфомі NK/Ly, отриманій із колекції штамів Інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології НАН України. Пасажування асцитної форми пухлини проводили на мишах лінії С57Вl. Для підтримання штаму мишам інокулювали внутрішньочеревно 0,2-0,3 мл нативного асциту, отриманого на 6-8 день росту пухлини, кількість інокульованих клітин - 35-50 млн. При дослідженні впливу хіміопрепаратів інокулювали не більше 10 млн пухлинних клітин.

Частина роботи була проведена на штамі лейкозу L1210 для порівняння із лімфомою NK/Ly. Пасажування лейкемії L 1210 проводили на мишах лінії DBA/2, а також на гібридах DBA/2 х С57В1. Реципієнтам вводили внутрішньочеревно 1 млн. пухлинних клітин, отриманих із 5-6-денного асциту. За ростом асциту слідкували щоденним зважуванням тварин. Тривалість життя в середньому становила для лімфоми NK/Ly 25-30 днів, для лейкозу L 1210 - 8-10 днів.

Вивчали вплив трьох речовин на ріст пухлини і морфологію пухлинних клітин: протипухлинний препарат вінбластин, активний щодо лімфоми NK/Ly, (позитивний контроль), дві речовини із властивостями сапогенінів, отримані із насіння чистотілу (Chelidonium majus L.) та із насіння вовчника (Daphne mezereum L.). Очистка речовин була проведена в Інституті біології клітини НАН України.

Властивості речовин. Сапогеніноподібна речовина (СПР) із насіння чистотілу - тверда речовина консистенції мила, розчинна у водно-етанольних сумішах, оцтовій кислоті, інтенсивно піниться при струшуванні розчинів, реакця Лібермана-Бурхарда позитивна, проявляє гемолітичну дію в мінімальній концентрації 31 мкг/мл, вуглеводи і фосфор відсутні. Отримано декілька фракцій, одна з них у кристалічному стані, її молекулярна маса за даними мас-спектрометрії 656 Da. Речовина не токсична, внутрішньочеревне введення в дозі 300 мг/кг не викликало загибелі мишей. Дослідження проводили саме з цією фракцією.

Для приготування ін'єкційного розчину 2 мг речовини вносили в стерильну пробірку (5х50 мм), додавали 10 мкл етанолу, 5 мкл 1% спиртового розчину

левоміцетину (Богуш Т.А., 1986), розмішували скляною паличкою до однорідної маси і вносили 0,4 мл води для ін'єкцій. Речовина повністю розчинялася, вводили 0,2 мл розчину внутрішньочеревно, що відповідало 1 мг сапогеніну.

Зразок СПР із насіння вовчника, фракція F IV, представляє собою в'язку олію жовтого кольору, розчинну в етанолі, оцтовій кислоті, пропіленгліколі, реакція Лібермана-Бурхарда позитивна, виявляє гемолітичну активність у мінімальній концентрації 125 мкг/мл, вуглеводів і фосфору не виявлено. Молекулярна маса основного компонента за даними мас-спектрометрії 483,1 Da. Речовина високотоксична (LD₁₀₀ 6 мг/кг). Ін'єкційний розчин готували ex tempore внесенням 5 мкл 0,1% спиртового розчину речовини у 0,2 мл розчинника, який представляв собою cтерильний 0,1 М тріс, рН 8,5, із додатком 0,5% твін 20 і 50 мкг левоміцетину. В залежності від кількості дослідних мишей, об'єми ін'єкційних розчинів обох речовин пропорційно збільшували в n+1 раз, де n - кількість мишей.

За описаними властивостями одержані речовини найбільш відповідають сапогенінам (Гринкевич Н.И. и др.,1983; Bruneton J.,1999; Ковальов В.М. та ін.,2000)

Цитоморфологічний аналіз проводили за наступною схемою: дослідження розподілу популяції асцитних клітин за розмірами (вимірювання в програмі Axiovision, Karl Zeiss, обробка даних і побудова кривої розподілу в програмі Microsoft Excel); забарвлення цитологічних мазків за Романовським-Гімза (загальна структура клітин), бромфеноловим синім - на вміст білка в клітинах (оригінальна розробка), гематоксиліном Делафільда, нейтральним червоним (оригінальна модифікація) - на структуру хроматину. Кількісну оцінку препаратів проводили шляхом підрахунку на фотопринтах клітин, класифікованих за ознаками структурних порушень. Без кількісної інтерпретації проводили виявлення ліпідних включень суданом чорним В по Ackerman (цит. за Глузман Д.Ф. та ін., 2005), забарвлення ДНК і РНК сумішшю Унна (метиловий зелений-піронін, Ліллі Р., 1969), акридиновим оранжевим (Rigler R., 1966). Препарати фотографували цифровою камерою Canon А590, обробку зображень і підрахунок клітин здійснювали із допомогою комп'ютера.

Окремий розділ роботи стосувався розробки методу виявлення вуглеводних детермінант клітинної поверхні шляхом обробки нативними лектинами і виявлення місць їх зв'язування з клітинною поверхнею непрямим імунохімічним методом із допомогою антитіл, мічених колоїдним золотом, і наступною візуалізацією колоїдного золота імпрегнацією сріблом. Із цією метою із сироватки крові імунізованих кролів були отримані очищені антитіла, специфічні до лектинів сочевиці, арахісу, зародків пшениці. Після приєднання до частинок колоїдного золота (Geoghean W. et al., 1977) їх застосовували в якості других антитіл, візуалізацію частинок колоїдного золота для світлової мікроскопії проводили фізичним проявленням ацетатом срібла (Hacker G. et al., 1994).

Статистичну обробку результатів здійснювали у програмі пакету аналізу Microsoft Excel, визначали середнє значення морфометричних даних, стандартну похибку середнього значення та достовірність різниці між двома альтернативними сукупностями даних за коефіцієнтом Стьюдента. Достовірною вважали різницю при відповідних значеннях t згідно t-розподілу Стьюдента (рівень достовірності Р<0,05).

Результати дослідження та їх обговорення.

Цитоморфологічна характеристика клітин NK/Ly і вуглевдних детермінант їх поверхні в процесі росту пухлини.

Ріст асцитної форми лімфоми NK/Ly умовно розділили на 3 стадії: початкова стадія (адаптація, 6-8 днів), стадія інтенсивного росту і проліферації пухлинних клітин (10-25 день), термінальна стадія (26-30 день). Вказані терміни дійсні при умові дренування асциту, без дренування тривалість життя скорочується до 16-18 днів. Достовірні цитоморфологічні зміни показників при застосованій нами схемі аналізу спостерігаються між початковою і термінальною стадіями. Вони проявляються збільшенням розмірів клітин і зростаннням відсотка клітин із порушеною морфологією - за даними застосованих методів забарвлення мазків (табл. 1).

Таблиця 1. Цитоморфологічні зміни асцитних клітин лімфоми NK/Ly в процесі росту пухлини і при введенні вінбластину

№ п/п	Цитологічні показники	n	Початкова стадія росту (7-8 днів) (M±m)	Термінальна стадія росту (25-30 днів) (M±m)	Введення вінбластину (M±m)
1	Середнє значення діаметру клітин (мкм)	10	13,6±0,3	15,1±0,2*	29,2±1,7*
2	Відсоток клітин діаметром 18 мкм і більше	10	6,3±0,5	12,5±3,1*	78,4±9,4*
3	Відсоток аномальних (пошкоджених) клітин за даними забарвлення:
3а	Азур-еозином	8	26,8±3,9	41,0±5,0*	88,2±3,2*
3б	Бромфеноловим синім	8	18,5±1,5	30,7±4,3*	51,9±4,5*
3в	Гематоксиліном Делафільда	8	13,2±1,2	48,0±5,1*	81,3±4,3*
3г	Нейтральним червоним	8	15,8±1,8	44,1±4,9*	79,8±4,7*
4	Відсоток лектин-позитивних клітин
4а	Con A+	4	67,0±6,05	70,6±6,3	69,8±6,8
4б	LCA+	4	13,6±1,1	9,2±0,8	8,7±1,0
4в	PNA+	4	29,8±2,8	24,5±2,2	27,3±2,5
4г	WGA+	4	81,8±3,6	78,4±3,4	75,4±4,1

Примітка. Вінбластин вводили внутрішньочеревно в дозі 2,5 мг/кг два або три рази з інтервалом 48 годин. * - достовірна відмінність у порівнянні з початковою стадією (Р<0,05).

Достовірних змін у профілі зв'язування лектинів із клітинами на ранній і термінальній стадіях розвитку пухлини не виявлено.

Вплив вінбластину на ріст лімфоми NK/Ly, морфологію пухлинних клітин і вуглеводні детермінанти їх поверхні.

Нами встановлено, що двох- або трьохразове введення вінбластину в дозі 2,5 мг/кг, починаючи із 24 годин після інокуляції пухлинних клітин, викликає стійку ремісію і продовження життя до 60 і більше днів (контроль ? до35 днів). В окремих випадках спостерігали повну ремісію із розвитком резистентності до повторного прищеплення клітин NK/Ly, спостереження над реконвалесцентами проводилося впродовж 340 днів. При пізньому введенні вінбластину клінічно спостерігали пригнічення росту асциту і продовження життя тварин до 70-90 днів. Причиною загибелі було виснаження внаслідок росту солідних вузлів лімфоми або ерозія судин і кровотеча.

При цитологічному дослідженні відмічено характерну особливість дії вінбластину ? утворення великої кількості клітин збільшених розмірів (макроцитів), діаметром до 50-60 мкм, кількість яких в окремих випадках становила до 86%. Збільшення розмірів пухлинних клітин із утворенням гігантських форм спостерігається при дії багатьох протипухлинних препаратів (Шеллеи К. и др., 1975; Erenpreisa J. еt al., 2001; Wheatley D., 2006). Найвищу кількість гігантських клітин (макроцитів) ми спостерігали при дії вінбластину на клітини лімфоми NK/Ly, яка досягала рівня 85-90 %, тобто практично чиста культура, яка може бути використана як модель для дослідження біологічних властивостей цих клітин. На нашу думку, кількість гігантських клітин (макроцитів), індукованих протипухлинним препаратом, може служити цінним показником його ефективності. Ряд авторів вважають можливим перетворення гігантських клітин до повноцінних пухлинних шляхом видалення надлишку генетичного матеріалу, процес позначають терміном «неозіс» (Wheatley D., 2006; Rajaraman R. et al., 2006). Механізм процесу неясний, однак, очевидно, що він повинен бути координованим і контрольованим, а не випадковим (Puig P.E.et al., 2008; Erenpreisa J.et al., 2010).

При забарвленні мазків виявлено високо достовірне збільшення пошкоджень пухлинних клітин, найбільш виражене у загальній морфології клітин і структурі ядер та хроматину (табл.1). Профіль зв'язування лектинів при аналізі всієї популяції асцитних клітин достовірно не відрізнявся від контролю. Однак, при вибірковому аналізі субпопуляції макроцитів відмічено достовірне зменшення зв'язування лектину арахісу макроцитами ((19,4±2,1)% проти (27,3±2,5)% для популяції в цілому, Р<0,05). Можливою причиною такого явища може бути зменшення густини розміщення рецепторів лектину арахісу на мембрані внаслідок різкого збільшення її поверхні, що зумовлює зменшення споріднення до лектину, відповідно, зменшення його зв'язування, а також своєрідне “розбавлення барвника”. Для лектину сочевиці виявленна тенденція до посилення зв'язування із макроцитами ((16,8±1,8)% проти (13,6±1,1)% для популяції в цілому, Р=0,1), для решти лектинів відмінності були дуже незначними.

Вплив СПР чистотілу на ріст лімфоми NK/Ly, морфологію пухлинних клітин і вуглеводні детермінанти їх поверхні.

Щоденне введення СПР чистотілу в дозі 50 мг/кг, починаючи із 24 годин після інокуляції пухлинних клітин (всього 10 ін'єкцій), на початковій стадії затримувало ріст асциту, кількість клітин в асцитній рідині була в 2,5 рази менша, ніж у контролі. У подальшому, при збільшенні інтервалу між введеннями ріст асциту відновлювався і був близький до контрольних величин. Тривалість життя пухлиноносіїв не відрізнялася від контролю.

Цитоморфологічні зміни характеризувалися збільшенням розмірів клітин, що особливо помітно по збільшенню відсотка клітин діаметром 18 мкм і більше (табл. 2). Морфологічні зміни пухлинних клітин характеризувались інтенсивним утворенням пухирців на поверхні (блеббінг-феномен), порушеннями структури ядер і хроматину, що проявлялось як фрагментація ядер, конденсація хроматину і каріопікноз або, з іншої сторони, каріолізис із втратою нуклеопротеїнового комплексу і чітким контрастуванням ядерець. За характеристиками зв'язування лектинів відмічено достовірне збільшення відсотка клітин, які зв'язували лектини сочевиці і арахісу (табл. 2).

Таблиця 2. Вплив внутрішньочеревного введення СПР чистотілу на морфологічні характеристики клітин NK/Ly і вуглеводні детермінанти їх поверхні

№ п/п	Цитологічні показники, (M±m)	n	Початкова стадія росту (7 - 8 днів, контроль)	n	Раннє введення сапогеніну, 9 щоденно	n	Пізнє введення, (6-10 день після дренажу асциту)
1	Діаметр клітин, мкм	10	13,6±0,3	5	16,5±0,3*	10	14,6±0,2*
2	Відсоток клітин 18 мкм і більше	10	6,3±0,5	5	29,8±2,3*	10	13,2±2,8*
3	Відсоток пошкоджених клітин за даними забарвлення:
3а	Азур-еозином	10	26,8±2,8	5	80,2±4,8*	8	75,3±3,9*
3б	Бромфеноловим синім	10	18,5±1,5	5	27,3±2,3	8	54,4±2,2*
3в	Гематоксиліном Делафільда	10	13,2±1,2	5	63,0±5,1*	8	53,2±8,4*
3г	Нейтральним червоним	10	15,8±1,8	5	59,3±5,4*	8	59,0±5,1*
4	Відсоток клітин у популяції, які зв'язують лектини:
4а	Con A	4	67,0±6,1	4	75,1±5,5	4	71,6±6,7
4б	LCA	4	13,6±1,1	4	45,0±5,2*	4	40,0±5,0*
4в	PNA	4	29,8±2,8	4	51,0±4,9*	4	43,1±3,9*
4г	WGA	4	81,8±3,6	3	87,0±5,7	3	83,2±5,4

Пізнє введення СПР здійснювали на 7-8 день росту пухлини після дренування асциту і промивання черевної порожнини фізрозчином. У сукупній групі 20 тварин достовірного терапевтичного ефекту не спостерігалося, лише в окремих випадках тривалість життя продовжувалася до 45-49 днів, що може бути зумовлене індивідуальними особливостями тварини.

При цитологічному аналізі виявлено збільшення розмірів клітин, як і при ранньому введенні СПР. При забарвленні азур-еозином відмічалося значне пошкодження пухлинних клітин, яке проявлялося деструктивними змінами в цитоплазмі і ядрі, утворенням мікровезикул. Відсоток аномальних клітин більший, ніж при ранньому введенні СПР. Аналогічна тенденція спостерігалася при забарвленні на білок, вміст якого був зменшений у 50% клітин, що може бути зумовлено втратою білка через плазматичну мембрану або активацією внутрішньоклітинного протеолізу. При забарвленні гематоксиліном спостерігалося декілька типів порушень: фрагментація ядер і хроматину, хаотичне групування хромосом, конденсація хроматину і каріопікноз. Нейтральним червоним чітко виявлялися дезінтеграція хроматину з утворенням окремих його скупчень.

У профілі зв'язування лектинів, як і при ранньому введенні СПР чистотілу, виявлено достовірне збільшення відсотка клітин, що зв'язували лектини сочевиці і арахісу. Це може бути зумовлене неповним десіалюванням гліканів, що є необхідною умовою зв'язування лектину арахісу, і одночасно підвищення споріднення десіальованих фрагментів гліканів до інших лектинів, в тому числі манозоспецифічних (сочевиці, конканаваліну А) (Cкляренко Л.М., 1997; Bilyy R.O. et al., 2003).

Таким чином, СПР чистотілу проявляє цитотоксичну дію щодо клітин NK/Ly, однак терапевтичний ефект її незначний. Аналогічний результат отримано із немодифікованим сапогеніном діосгеніном (Yan L. L. et al., 2009). Зважаючи на низьку токсичність зразка СПР чистотілу і характерну для сапогенінів різноспрямованість дії на клітини (Bruneton J., 1999; Ovesna Z. et al., 2004; Paduch R. et al., 2007), перспективним є дослідження його як ад'юванта в комплексі з активними, однак токсичними, протипухлинними препаратами.

Вплив СПР із насіння вовчника на ріст лімфоми NK/Ly i лейкозу L1210, морфологію пухлинних клітин і вуглеводні детермінанти їх поверхні.

При введенні субтоксичних доз 0,25-0,75 мг/кг очищеної речовини вовчника мишам із лімфомою NK/Ly спостерігали пригнічення проліферації пухлинних клітин на початковій стадії, однак тривалість життя тварин була менша, ніж у контролі внаслідок інтоксикації з ураженням переважно органів травної системи (кишечник, печінка).

При цитологічному дослідженні спостерігали достовірне збільшення розмірів пухлинних клітин, проте менш виражене, ніж під впливом вінбластину, а також інтенсивне пошкодження клітин NK/Ly при різних методах забарвлення. За результатами зв'язування лектинів відмічено тільки тенденцію до підвищення відсотка LСА+ клітин (табл. 3).

Лейкоз L1210 виявився більш чутливим до сапогеніну вовчника, тривалість життя дослідних тварин була в середньому на 80-100 % більша, ніж у контролі. Нами відмічено, що рівень зв'язування ConA+ клітинами L1210 був у 9,7 раза нижчий, ніж у клітин NK/Ly, при дещо вищому рівні зв'язування аглютиніну пшениці, який досягав майже 100% (табл. 4). Достовірних змін у зв'язуванні лектинів під впливом СПР вовчника не виявлено в обидвох типах клітин.

Таблиця 3. Вплив СПР вовчника на характеристики асциту і клітин лімфоми NK/Ly

№ п/п	Характеристики асциту і пухлинних клітин (M±m)	n	Контроль	n	Раннє введення сапогеніну вовчника
1	Кількість клітин, отримуваних при одному дренажі (млн)	12	1164±34	7	345±41*
2	Діаметр клітин NK/Ly (мкм)	10	13,7±0,2	7	14,5±0,2*
3	Відсоток клітин NK/Ly діаметром 17 мкм і більше	10	3,0±0,3	7	13,9±3,7*
4	Відсоток аномальних клітин за даними забарвлення:
4a	Азур-еозином	6	26,8±3,9	6	70,6±1,8*
4б	Бромфеноловим синім	6	18,5±3,0	6	50,3±3,5*
4в	Гематоксиліном Делафільда	6	13,4±0,9	6	56,5±3,2*
5	Відсоток клітин у популяції, які зв'язують лектини:
5а	Con А	3	67,0±6,1	4	68,5±4,8
5б	LCA	3	13,6±1,1	4	18,7±3,0
5в	PNA	3	29,8±2,8	4	32,1±2,5
5г	WGA	3	81,8±3,6	4	78,5±3,9

На цитологічному рівні відмічено значне пошкодження лейкемічних клітин при забарвленні різними методами (табл. 4).

Таблиця 4

Вплив СПР вовчника на характеристики асциту і клітин лейкозу L1210

№ п/п	Характеристики асциту і пухлинних клітин (M±m)	n	Контроль	n	Введення сапогеніну вовчника
1	Кількість клітин, отримуваних при одному дренажі (млн)	6	358±70,6	4	40,5±34,0*
2	Діаметр клітин L1210, мкм	6	10,6±0,1	4	11,6±0,12*
3	Відсоток клітин L1210 діаметром 13 мкм і більше	6	5,4±0,4	4	11,1±1,3*
4	Відсоток аномальних клітин у популяції за даними забарвлення:
4а	Азур-еозином	4	15,8±1,2	4	55,8±2,8*
4б	Бромфеноловим синім	4	11,8±0,8	4	36,8±3,6*
4в	Гематоксиліном Делафільда	4	17,1±3,1	4	53,3±4,7*
4г	Нейтральним червоним	4	15,3±2,8	4	49,2±2,0*
5	Відсоток клітин у популяції, які зв'язують лектини:
5а	Con А	3	7,2±1,4	4	6,7±1,1
5Б	LCA	3	8,5±1,7	4	9,2±1,5
5в	PNA	3	25,3±5,6	4	30,4±6,0
5г	WGA	3	95,7±3,3	4	94,2±4,1

Отримані дані дозволяють зробити висновок, що зразок СПР із насіння вовчника Daphne mezereum L., виявляє сильну токсичну дію як щодо пухлинних, так і нормальних клітин і тканин. Висока неселективна токсичність робить його непридатним в якості протипухлинного препарату резорбтивного типу дії.

Із цієї ж рослини був одержаний мезереїн, який проявляв антилейкемічну активність в дозі 50 мкг/кг щодо лейкозу L1210 i P388 (Kupchan S.M. et al., 1975). Продовження дослідженнь цієї речовини в якості протипухлинного лікарського препарату в літературі ми не знайшли. Можливо, що обмежена кількість робіт по мезереїну, як лікарському протипухлинному препарату, зумовлена його високою і неселективною токсичністю.

ВИСНОВКИ

У дисертаційній роботі наведено теоретичне узагальнення та нове вирішення актуального наукового завдання - встановити на цитологічному рівні зміни загальної морфології і вуглеводних детермінант поверхні пухлинних клітин під впливом протипухлинних хіміопрепаратів in vivo на експериментальній лімфомі NK/Ly мишей із визначенням діагностичної цінності цих змін для оцінки ефективності нових потенційних протипухлинних препаратів.

1. Визначено цитологічні критерії оцінки протипухлинної ефективності хіміопрепаратів в експерименті in vivo на пухлинах мишей - лімфомі NK/Ly і лейкемії L1210 (для порівняння), які включають аналіз розподілу клітин у популяції за розмірами і морфометрію цитологічних препаратів із застосуванням комп'ютерного аналізу. Із 9 апробованих цитологічних методів забарвлення оптимальні результати отримано при забарвленні азур-еозином, бромфеноловим синім, гематоксиліном Делафільда і нейтральним червоним. Найпростішим у виконанні і оцінці результату є розроблена нами модифікація методу забарвлення бромфеноловим синім, суть якого грунтується на зменшенні кількості білка у клітинах при їх пошкодженні. Найбільш інформативним є забарвлення азур-еозином за методом Романовського-Гімза.

2. Опрацьовано непрямий імуноцитохімічний метод характеристики вуглеводних детермінант поверхні клітин NK/Ly і L1210 із застосуванням нативних лектинів в якості вуглеводспецифічних зондів і виявлення місць їх зв'язування з допомогою антитіл, мічених колоїдним золотом. Показана гетерогенність і специфічність профілю зв'язування лектинів (Сon A, LСА, PNA, WGA) популяціями асцитних клітин.

3. Виявлено зміни вуглеводних детермінант поверхні клітин збільшених розмірів (макроцитів), які проявлялися у достовірному зменшенні відсотка PNA+ і тенденції до збільшення відсотка LСА+ клітин у цій субпопуляції. Зміни особливо чітко виражені при дії вінбластину, який індукував утворення значної кількості макроцитів.

4. Аналіз вуглеводних детермінант клітинної поверхні з метою характеристики протипухлинної активності препарату є менш інформативним і ефективним, ніж застосовані цитологічні методи забарвлення внаслідок значної розбіжності результатів, а також трудоємкості. Більш доцільним і перспективним слід вважати застосування лектинів для фракціонування гетерогенних популяцій пухлинних клітин із метою дослідження біологічних властивостей окремих клітинних субпопуляцій.

5. Одержано експериментальний зразок СПР із чистотілу, малотоксичної речовини (LD₅₀>300 мг/кг), при внутрішньочеревному введенні в дозі 100 мг/кг мишам із привитою лімфомою NK/Ly зумовлювала пошкодження пухлинних клітин, що проявлялося підвищенням відсотка макроцитів і аномальних форм клітин у популяції. За тривалістю життя мишей-пухлиноносіїв СПР чистотілу не забезпечувала достовірного терапевтичного ефекту. Незважаючи на це, отримана речовина є перспективною для подальшого дослідження в якості ад'юванта в комплексі з активними, однак токсичними, протипухлинними хіміопрепаратами.

6. Розроблено метод очистки СПР із насіння вовчника, високотоксичної речовини (смертельна доза 6 мг/кг при внутрішньочеревному введенні мишам) з ураженням переважно органів травної системи. Багаторазове введення субтоксичних доз (0,15-0,5 мг/кг) зумовлювало виражену цитотоксичну дію щодо пухлинних клітин NK/Ly i L1210. Суттєвого терапевтичного ефекту при введенні СПР вовчника, в тому числі ліпосомної форми, не виявлено внаслідок високої токсичності речовини.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Протипухлинні алкалоїдні препарати нового покоління / М. Д. Луцик, Н. М. Бойко, М. М. Луцик [та ін.] // Праці наукового товариства імені Т.Шевченка. Секція: Хемія і біохемія. - 2008. - Т. ХХІ. - С. 227 - 241. Дисертантом проведено літературний пошук, збір чистотілу, очистка ряду компонентів і дослідження їх дії на лімфому NK/Ly.

2. Луцик М. М. Кількісний метод оцінки пошкодження пухлинних клітин при дії протипухлинних препаратів in vivo фарбуванням цитологічних препаратів на білок / М. М. Луцик, А. М. Ященко // Вісник морфології. - 2009. - Т.15. - №1. - С. 188 - 192. Дисертант розробив метод забарвлення цитологічних мазків бромфеноловим синім, підготував до друку статтю.

3. Луцик М. М. Характеристика вуглеводних детермінант поверхні клітин мишиної лімфоми NK/Ly по зв'язуванню нативних лектинів із наступним їх виявленням непрямим імуноцитохімічним методом / М. М. Луцик, А. М. Ященко // Біологія тварин. - 2010. - Т.12. - № 1. - С. 94 - 99. Дисертант брав участь в отриманні антитіл до лектинів, помітив їх колоїдним золотом, вивчив зв'язування лектинів клітинами лімфоми NK/Ly.

4. Гетерогенность популяции клеток лимфомы NK/Ly и лейкоза L-1210 по углеводной структуре клеточной поверхности: иммуноцитохимический анализ связывания лектинов / М. М.Луцик, А. М. Ященко, В. И. Ковалишин [и др.] // Цитология и генетика. - 2011. - № 2. - С.3 - 9. Дисертант дослідив зв'язування лектинів із клітинами NK/Ly i L1210 непрямим імуноцитохімічним методом, провів літературний пошук, брав участь у написанні статті.

5. Луцик М. Д. Дослідження терапевтичної дії сапоніну чистотілу на моделі мишиної лімфоми NK/Ly / М. Д. Луцик, Н. М. Бойко, М. М. Луцик // Біологія пухлинної клітини: 2-й з'їзд українського товариства клітинної біології, 23-26 жовтня 2007 р.: тези доп. - Київ, 2007. - С.103 - 104. Дисертант брав участь у процесі очистки сапогеніну чистотілу, провів дослідження його активності на мишах із привитою лімфомою NK/Ly.

6. Луцик М. М. Цитоморфологічні критері оцінки впливу хіміопрепаратів на пухлинні клітини в експерименті in vivo / М. М. Луцик, А. М. Ященко // Біологія пухлинної клітини: 2-й з'їзд українського товариства клітинної біології, 23-26 жовтня 2007 р.: тези доп. - Київ, 2007. - C. 123. Дисертант самостійно провів експерименти на тваринах, приготував мазки і дав їх кількісну інтерпретацію.

7. Луцик М. М. Простий метод оцінки пошкодження пухлинних клітин шляхом зафарбовування цитологічних препаратів на білок / М. М. Луцик, А. М. Ященко // Прикладні аспекти морфології експериментальних і клінічних досліджень: наук.-практ. конф., 29-30 травня 2008 р.: тези доп. - Тернопіль, 2008. - С.79 - 81. Дисертант самостійно провів експерименти на тваринах, приготував мазки і дав їх кількісну інтерпретацію .

8. Луцик М. М. Дослідження гетерогенності популяцій пухлинних клітин за вуглеводною структурою клітинної поверхні / М. М. Луцик, А. М. Ященко // Актуальні проблеми функціональної морфології та інтегративної антропології: наук.-практ. конф., 20-21 травня 2009 р.: тези доп. - Вінниця, 2009. - С. 190 - 191. Дисертант провів визначення зв'язування лектинів клітинами NK/Ly із допомогою непрямого імунохімічного методу.

9. Луцик М. М. Аналіз гетерогенності клітинних популяцій за вуглеводною структурою клітинної поверхні / М. М. Луцик // Фундаментальні та прикладні дослідження в біології: мат. І Міжн. наук. конф. мол. вч., 23-26 лютого 2009 р.: тези доп. - Донецьк, 2009. - С. 40 - 41.

10. Луцик М. М. Характеристика вуглеводних детермінант клітинної поверхні з допомогою детекторної системи лектини-антилектинові антитіла, мічені колоїдним золотом / М. М. Луцик, А. М. Ященко, М. Д. Луцик // Прикладні аспекти морфології експериментальних і клінічних досліджень: наук.-практ. конф., 10-11 червня 2009 р.: тези доп. - Тернопіль, 2009. - С.108 - 110. Дисертант провів визначення зв'язування лектинів клітинами NK/Ly із допомогою непрямого імунохімічного методу.

AНОТАЦІЯ

Луцик М.М. Цитоморфологічна характеристика клітин лімфоми NK/Ly і їх поверхневих вуглеводних детермінант у дослідженні ефективності потенційних протипухлинних препаратів. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 14.03.09 - гістологія, цитологія, ембріологія. ДВНЗ “Івано-Франківський національний медичний університет”, Івано-Франківськ, 2011.

Визначено цитологічні критерії оцінки впливу хіміопрепаратів на пухлинні клітини in vivo, які включають аналіз розподілу клітин за розмірами; морфометричний комп'ютерний аналіз мазків, забарвлених азур-еозином, бромфеноловим синім, гематоксиліном і нейтральним червоним. Охарактеризовано зв'язування лектинів (Con A, LСА, PNA, WGA) з клітинами лімфоми NK/Ly і лейкозу L1210 непрямим імунохімічним методом із застосуванням антилектинових антитіл, мічених колоїдним золотом. Виявлено достовірне зменшення відсотка PNA+ клітин у субпопуляції макроцитів, індуковане вінбластином, і підвищення відсотка LСА+ і PNA+ клітин під впливом СПР чистотілу. Зразки СПР чистотілу і вовчника виявляли цитотоксичний ефект на клітинах NK/Ly іn vivo, однак терапевтичний ефект був несуттєвим.

Ключові слова: лімфома NK/Lу, лейкоз L1210, вуглеводи клітинної поверхні, вінбластин, сапогеніни.

АННОТАЦИЯ

Луцик М.М. Цитоморфологическая характеристика клеток лимфомы NK/Ly и их поверхностных углеводных детерминант в изучении эффективности потенциальных противоопухолевых препаратов. ? Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук по специальности 14.03.09 - гистология, цитология, эмбриология. ГВУЗ “Ивано-Франковский национальный медицинский университет”, Ивано-Франковск, 2011.

На модели экспериментальной опухоли NK/Ly изучали влияние винбластина (в качестве положительного контроля) и экспериментальных образцов сапогенинов из семян чистотела и волчника на цитоморфологию и углеводные детерминанты клеточной поверхности опухолевых клеток с целью определения эффективности действия противоопухолевого препарата. Предложена схема цитологического анализа и количественной оценки эффекта препарата, которая включает: а) анализ кривой распределения клеток по размеру, б) морфометрический компьютерный анализ фотопринтов мазков, окрашенных азур-эозином (общая цитоморфология), бромфеноловым синим (содержание клеточного белка, оригинальный метод), гематоксилином Делафильда и нейтральным красным на структуру ядра и хроматина. С целью характеристики углеводных детерминант клеточной поверхности разработан непрямой иммунохимический метод определения локализации связанных лектинов. Фиксированные клетки обрабатывали нативными лектинами чечевицы, арахиса, зародышей пшеницы, конканавалином А с последующим выявлением локализации связанных лектинов с помощью специфичных антител, меченых коллоидным золотом и последующим физическим проявленим ацетатом серебра (метод immunogold silver staining).

Установлено, что эффективные противоопухолевые препараты вызывают увеличение размеров опухолевых клеток, наиболее значительное увеличение размеров наблюдалось при введении винбластина. Под влиянием этого препарата количество макроцитарных форм клеток NK/Ly диаметром 18-50 мкм (средний диаметр интактных клеток 13,6±0,3 мкм) в клеточной популяции достигало 75-85%.

При количественной оценке нарушений морфологии опухолевых клеток под влиянием изучаемых веществ наиболее значительные изменения наблюдались под влиянием винбластина. Винбластин обеспечивал отчетливый терапевтический эффект на модели лимфомы NK/Ly с продолжительностью выживания до 70-90 суток (контроль до 35 суток). В некоторых случаях наблюдалось полное излечение с развитием резистентности к повторным прививкам опухолевых клеток.

Цитоморфологические изменения, вызываемые сапогенинами, были выражены в меньшей степени, но достоверно выше, чем в контроле; тем не менее, терапевтический эффект сапогенинов был несущественным.

Экспериментальный препарат сапогенина чистотела (Chelidonium majus L.) нетоксичен, внутрибрюшное введение дозы 300 мг/кг не вызывало гибели мышей. Введение его мышам с привитой лимфомой NK/Ly в течении 10 дней (доза 100 мг/кг) обуславливало угнетение пролиферации опухолевых клеток и образование аномальных форм, однако, время выживания мышей в опыте не отличалось от контроля. Учитывая слабую токсичность сапогенина чистотела и цитопатическое действие на опухолевые клетки, возможно применение его в качестве адьюванта в комбинации с активными, но более токсическими, противоопухолевыми препаратами.

Экспериментальный образец сапогенина волчника (Daphne mezereum L.) обладал высокой токсичностью (LD₁₀₀ 6 мг/кг). Повторное введение в субтоксических дозах обуславливало угнетение пролиферации клеток лимфомы NK/Ly, образование макроцитарных и аномальных форм. Время выживания мышей в опыте было меньше, чем в контроле, что обусловлено токсическим действием препарата с преимущественным поражением органов пищеварительной системы. В дополнительно проведенных опытах выявлено, что более чувствительным к сапогенину волчника является лейкоз L1210. При применении меньших доз (0,2-0,3 мг/кг) наряду с морфологическими нарушениями клеток время выживания мышей в опыте было на 80-100 % больше, чем в контроле.

Выявлена значительная гетерогенность клеточных популяций NK/Ly и L1210 по связыванию лектинов, а также значительные отличия профилей связывания лектинов клетками лимфомы NK/Ly и лейкоза L1210. Последние очень слабо связывали конканавалин А и несколько сильнее агглютинин пшеницы, чем клетки NK/Ly. При анализе изменений углеводов клеточной поверхности выявлено достоверное уменьшение связывания лектина арахиса макроцитарными формами клеток NK/Ly, индуцированными винбластином. Под влиянием сапогенинов чистотела наблюдали достоверное увеличение связывания лектинов чечевицы и арахиса с клетками лимфомы NK/Ly.

В сравнении с методом анализа окрашенных препаратов, анализ углеводов клеточной поверхности менее информативен при скрининге и определении эффективности противоопухолевых препаратов. Более целесообразно применение лектинов для фракционирования гетерогенных клеточных популяций с последующим исследованием биологических свойств отдельных субпопуляций.

Ключевые слова: лимфома NK/Ly, лейкоз L1210, углеводы клеточной поверхности, винбластин, сапогенины.

ANNOTATION

Lutsyk M.M. Cytomorphological characteristics of NK/Ly lymphoma cells and their surface carbohydrate determinants in the investigation of the efficiency of potential antitumor preparations. ? Manuscript.

Thesis for obtaining degree of Candidate of Medical Sciences. Speciality code - 14.03.09 - histology, cytology, embriology. Ivano-Frankivsk National Medical University, Ivano-Frankivsk, 2011.

Cytological criteria for evaluation of the effect of chemotherapeutics upon tumor cells in vivo are proposed which includes the analysis of cell dimension distribution within a population; morphometric computer-linked analysis of smears stained by azure-eosin, bromophenol blue, hematoxylin and neutral red. Indexes to quantify cell damage are defined. Binding of lectins (Con A, LcL, PNA, WGA) with NK/Ly and leukemia L1210 cells was characterized by indirect immunochemical method, using colloidal gold labeled antilectin antibodies as a second reagent. Significant decrease in PNA+ cells in the subpopulation of macrocytes induced by vinblastin was revealed, while sapogenin-like substance of Greater celandine significantly increased the number of LСА+ and PNA+ cells. Sapogenin-like substances of Greater celandine and Spurge olive exhibited cytotoxicity towards NK/Ly cells, yet therapeutic effect was not significant.

Key words: lymphoma NK/Ly, leukemia L1210, cell surface carbohydrates, vinblastin, sapogenins.

ПЕРЕЛІК УМОВНИХ СКОРОЧЕНЬ

СПР сапогеніноподібна речовина

Con A конканавалін А

LCA лектин сочевиці

PNA лектин арахісу

WGA лектин (аглютинін) зародків пшениці

* рівень достовірності різниці порівнювальних величин (Р<0,05)

Размещено на Allbest.ru