Фолат-залежні процеси у плаценті людини: роль фолієвої кислоти, гомоцистеїну та поліморфізму гена MTHFR
Поліморфізм гена MTHFR у зразках зрілої плаценти за умов фізіологічного та ускладненого прееклампсією перебігу вагітності. Фолати та низькомолекулярні амінотіоли. Вплив гомоцистеїну та фолієвої кислоти на процеси проліферації та апоптозу в плаценті.
| Рубрика | Медицина |
| Вид | автореферат |
| Язык | украинский |
| Дата добавления | 27.07.2015 |
| Размер файла | 137,3 K |
Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже
Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.
Размещено на http://www.allbest.ru/
НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ
ІНСТИТУТ БІОХІМІЇ ІМ. О. В. ПАЛЛАДІНА
УДК 618.56 + 547.436 + 543.544.5
АВТОРЕФЕРАТ
дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук
ФОЛАТ-ЗАЛЕЖНІ ПРОЦЕСИ У ПЛАЦЕНТІ ЛЮДИНИ: РОЛЬ ФОЛІЄВОЇ КИСЛОТИ, ГОМОЦИСТЕЇНУ ТА ПОЛІМОРФІЗМУ ГЕНА МЕТИЛЕНТЕТРАГІДРОФОЛАТРЕДУКТАЗИ
03.00.04 - біохімія
МАРЦЕНЮК Ольга Петрівна
КИЇВ - 2010
Дисертацією є рукопис.
Роботу виконано в Інституті молекулярної біології і генетики НАН України та Київському національному університеті імені Тараса Шевченка.
Науковий керівник - доктор біологічних наук, старший науковий співробітник
Оболенська Марія Юріївна,
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, завідувач лабораторії системної біології
відділу механізмів трансляції генетичної інформації.
Офіційні опоненти: - доктор біологічних наук, старший науковий співробітник
Пархоменко Юлія Михайлівна,
Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України,
провідний науковий співробітник відділу біохімії коферментів;
доктор медичних наук, професор
Тимченко Ольга Іванівна,
Державна установа «Інститут гігієни та медичної екології ім. О. М. Марзєєва АМН України», завідувач лабораторії генетичної епідеміології.
Захист відбудеться 22 березня 2010 р. о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.240.01 в Інституті біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України (01601, Київ-30, вул. Леонтовича, 9).
З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Інституту біохімії
ім. О. В. Палладіна НАН України (Київ, вул. Леонтовича, 9).
Автореферат розіслано «22» лютого 2010 р.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради
кандидат біологічних наукО. В. Кірсенко
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
фолієвий гомоцистеїн плацента вагітність
Актуальність теми. Фолат-залежні процеси є предметом інтенсивних досліджень біохіміків та медиків. Їх порушення часто асоціюються з гіпергомоцистеїнемією, яка вважається патогенетичним фактором у розвитку різних захворювань, зокрема серцево-судинних, деяких форм раку, хвороби Дауна, ускладнень вагітності та вад розвитку плода [van der Put et al., 2001]. Однією із причин виникнення цих патологій вважають поліморфізм гена метилентетрагідрофолатредуктази (MTHFR). Найчастіше генетичний дефект виявляється як точкова мутація внаслідок заміни цитозину на тимін у нуклеотиді 677 (677C>Т). MTHFR приймає активну участь у обміні фолатів, який безпосередньо чи опосередковано пов'язаний з метіоніновим циклом та обміном гомоцистеїну, з синтезом попередників нуклеїнових кислот, перетворенням серингліцин, синтезом поліамінів, цистеїну та глутатіону, а відтак із процесами проліферації та експресії генів, із процесами метилування, синтезу протеїнів, підтримання окисно-відновного статусу, дезинтоксикаційної активності тощо.
Серед акушерської патології чинне місце посідає прееклампсія, яка складає близько 15-22 % та є однією з причин захворювань і смерті матері та плода [Білоусов, 2006; Іщенко, 2008]. Всебічні дослідження цієї акушерської патології показали, що гіпергомоцистеїнемія та патологія плаценти відіграють суттєву роль у її розвитку. Гіперплацентоз, пузирний занесок (гестаційна пухлина трофобласту), двійні є факторами ризику розвитку прееклампсії, симптоми якої зникають після народження плаценти [Roberts and Cooper, 2001]. Однак достеменні зміни у плацентарному метаболізмі, які можуть сприяти виникненню прееклампсії, залишаються поки невідомими.
З огляду на це роботу присвячено вивченню за умов фізіологічного перебігу вагітності та прееклампсії вмісту в плаценті фолатів та амінотіолів, пов'язаних з обміном гомоцистеїну; розглядається питання чи є наявність у плаценті мутованих форм гена MTHFR фактором ризику виникнення прееклампсії, адже від активності цього ензиму суттєво залежить обмін гомоцистеїну; досліджуються вплив гомоцистеїну та фолієвої кислоти на процеси проліферації та апоптозу в плаценті, а також здатність плаценти компенсувати шкідливу дію гіпергомоцистеїнемії, а відтак захистити від неї плід.
Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дослідження проводили в рамках бюджетного тематичного плану відділу механізмів трансляції генетичної інформації Інституту молекулярної біології і генетики НАН України «Геном людини» (шифр теми № 2.2.4.9) за темою «Особливості функціонування та множинність форм фактора елонгації трансляції 1 вищих еукаріотів» (№ державної реєстрації 0105V005340, 2006-2010 рр.) і за підтримки грантів Президента України для обдарованої молоді «Біомаркери для попередження ускладнень вагітностей в Україні» (2006 р.), Міністерства освіти та науки МОН №152-2006 «Забруднене довкілля та генотоксичне ураження плаценти людини» (№ державної реєстрації 0107U012015, 2006-2007 рр.) та МОН № 28-2008 «Фолати та детоксикаційна активність у плаценті людини в умовах забрудненого довкілля» (№ державної реєстрації 0108U007249, 2008-2009 рр.), INTAS YSF № 06-1000014-5961 «Folate-related one-carbone unit metabolism in human placenta from environmental exposed pregnancies» (2007-2009 рp.)
Мета і завдання дослідження. Мета роботи - охарактеризувати фолат-залежний метаболізм гомоцистеїну у плаценті людини за умов поліморфізму гена MTHFR та ускладненого прееклампсією перебігу вагітності. Визначити вплив гомоцистеїну і фолієвої кислоти на співвідношення процесів проліферації та апоптозу в плаценті людини.
Для досягнення мети необхідно було вирішити такі завдання:
1. Охарактеризувати поліморфізм гена MTHFR у зразках зрілої плаценти за умов фізіологічного та ускладненого прееклампсією перебігу вагітності.
2. Визначити загальний вміст фолатів та низькомолекулярних амінотіолів у зразках плаценти у залежності від алельних варіантів гена MTHFR і характеру перебігу вагітності.
3. Проаналізувати вплив гомоцистеїну та фолієвої кислоти на процеси проліферації та апоптозу в експлантах плаценти першого та третього триместрів вагітності.
4. Дослідити експресію цистатіонін в-синтази (CBS) та активність шляху транссульфування гомоцистеїну у плаценті людини.
5. Визначити вплив гомоцистеїну на експресію CBS та активність шляху транссульфування гомоцистеїну у плаценті людини першого і третього триместрів вагітності.
Об'єкт дослідження: фолат-залежний обмін гомоцистеїну у плаценті людини.
Предмет дослідження: поліморфізм гена MTHFR, показники фолат-залежного обміну гомоцистеїну у плаценті людини за умов ускладненого прееклампсією перебігу вагітності, механізм дії фолієвої кислоти та гомоцистеїну на функціонування плаценти.
Методи дослідження: полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР), ПЛР із зворотною транскрипцією (ЗТ-ПЛР), напівкількісний іммуноблотинг, бісульфітна модифікація ДНК, культивування експлантів плаценти, хроматографія високого тиску (HPLC) з електрохімічною детекцією амінотіолів, імуногістохімічний аналіз, мікробіологічний метод визначення вмісту фолатів, афінна хроматографія, визначення ензиматичної активності.
Наукова новизна отриманих результатів. Із використанням методів біохімії та молекулярної біології проведені комплексні дослідження фолат-залежних процесів у плаценті людини у нормі та при патології.
Виявлено вплив носійства мутантних алелей гена MTHFR на баланс амінотіолів у плаценті. При перебігу вагітності з прееклампсією, носійстві С677Т алелів гена MTHFR та низькому рівні фолатів у плаценті людини спостерігали зниження вмісту метіоніну і підвищення рівня гомоцистеїну.
На експлантах плаценти людини першого і третього триместрів створено модель гіпергомоцистеїнемії. Встановлено, що інкубація експлантів плаценти з додаванням гомоцистеїну у межах клінічно обґрунтованих концентрацій призводить до зниження індексу проліферації, посилення процесів апоптозу і деструкції тканини ворсинки хоріону. Додавання фолієвої кислоти не зменшує цитотоксичний вплив гомоцистеїну.
Вперше показано, що у плаценті людини експресується і проявляє каталітичну активність CBS. Виявлено, що гомоцистеїн у концентраціях 20-40 мкМ активує експресію CBS та шлях транссульфування, а у концентрації 80 мкМ пригнічує.
Практичне значення отриманих результатів. Серед отриманих результатів можна виокремити декілька, які мають практичне значення. По-перше, виявлено тенденцію до вищої частоти мутованих форм гена MTHFR у плаценті за умов ускладненого прееклампсією перебігу вагітності. Ці результати свідчать про певну роль біохімічних процесів, які відбуваються у плаценті, у розвиткові захворювання. По-друге, за умов прееклампсії, носійства С677Т алелів гена MTHFR і низького рівня фолатів у плаценті супроводжується суттєвими змінами у профілі амінотіолів, зокрема підвищеним вмістом гомоцистеїну. Це, ймовірно, вказує на необхідність забезпечення організму вагітної достатньою кількістю фолатів. Однак, отримані нами результати вказують і на необхідність детальніших досліджень щодо впливу фолієвої кислоти на функціонування плаценти. Адже при культивуванні експлантів плаценти у присутності фолієвої кислоти спостерігали зниження проліферативного та підвищення апоптотичного індексів. Отримані дані можуть бути використані в акушерстві для розробки рекомендацій при плануванні вагітності та пренатальної діагностики для попередження ускладнень вагітності.
Особистий внесок здобувача. Основний обсяг експериментальної роботи, обробка та аналіз здобутих результатів виконані особисто здобувачем. Постановку наукових завдань та формулювання висновків дисертаційної роботи здійснено під керівництвом доктора біологічних наук, зав. лабораторії системної біології відділу механізмів трансляції генетичної інформації Інституту молекулярної біології і генетики НАН України М. Ю. Оболенської.
Автором особисто проведено дослідження алельних варіантів гена MTHFR, виділення ДНК та РНК, визначення кількості мРНК CBS методом ЗТ-ПЛР та вмісту відповідного білка методом імуноблотингу. Здобувачем також особисто виконано культивування експлантів плаценти людини, імуногістохімічний аналіз, дослідження індексів проліферації та апоптозу в Інституті клітинної біології, гістології, ембріології Медичного університету м. Грац, Австрія під керівництвом професора Б. Хуппертца. Здобувачем виконані аналіз літературних даних та обробка первинних результатів. Обговорення отриманих результатів проводили спільно з науковим керівником та зі співвиконавцями роботи.
Бісульфітна обробка ДНК та визначення метилування, підбір праймерів здійснено разом із А. М. Слончаком. Визначення вмісту загальних амінотіолів у зразках плаценти методом HPLC було здійснено у рамках спільного Україно-Словацького проекту на базі Наукової частини медичного університету м. Братислава разом із доктором Ш. Мішлановою.
Збір зразків плаценти для дослідження виконано у співробітництві з Державною установою «Інститут акушерства, педіатрії та гінекології АМН України», у пологовому будинку №3 м. Києва та лікарнею Landeskrankenhaus Graz, Австрія (University Clinics). Протокол отримання плаценти та дозвіл на дослідження був затверджений Комітетом з етики Медичного факультету Університету м. Грац (Австрія) та Комітетом з етики Інституту молекулярної біології і генетики НАН України.
Апробація результатів дисертації. Основні положення роботи доповідалися на Міжнародній конференції молодих вчених, аспірантів та студентів (м. Чернівці, Україна, 2006 р.), VII Міжнародній конференції молодих онкологів “Сучасні проблеми експериментальної і клінічної онкології” (Київ, Україна, 2006 р.), 40th Annual Meeting of the European Society for Clinical Investigation Prague (Czech Republic, 2006 р.), II Міжнародній науковій конференції студентів і аспірантів “Молодь та поступ біології” (м. Львів, 2006 р.,) ІХ Українському біохімічному з`їзді (Харків, Україна, 2006 р.), Научно-практической конференции «Фортификация пищевых продуктов витамином В9 с целью предупреждения врожденных дефектов невральной трубки» (Київ, Україна 2006 р.), 10th Anniversary of Gliwice Scientific Meetings (Gliwice, Poland, 2006 р.), RECOOP meeting: Bridges in life science annual scientific review 2007 р., 2008 р., Конференції молодих вчених аспірантів та студентів з молекулярної біології, присвяченій 120-му ювілею М. І. Вавілова (Київ, Україна, 2007 р.), 14th IFPA conference 2008 (Seggau Castle, Austria, 2008 р.), Конференції молодих вчених до 35-ї річниці ІМБіГ НАН України (Київ, Україна, 2008 р.), Конференції молодих учених «Актуальні проблеми біохімії та біотехнології - 2008» (Київ, Україна, 2008 р.), Третій конференції молодих вчених Інституту молекулярної біології і генетики НАНУ, присвяченій 200-літтю від дня народження Чарльза Роберта Дарвіна та 150-літтю праці «Походження видів...» (Київ, Україна, 2009 р.), International conference for Students of Nature Sciences (Vilnus, Lithuania 2009 р.), Всеукраїнській науковій конференції студентів та молодих науковців (Київ, Україна, 2009 р.).
Публікації. За темою дисертації опубліковано 5 експериментальних статей у провідних фахових виданнях та тези 18-ти доповідей на вітчизняних та міжнародних конференціях.
Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається з переліку умовних позначень, вступу, огляду літератури, опису матеріалів та методів дослідження, отриманих результатів досліджень, узагальнення отриманих результатів, висновків та списку використаних літературних джерел. Текст дисертації проілюстровано 4 таблицями і 29 рисунками. Список використаних літературних джерел складається зі 165 найменувань. Дисертаційну роботу викладено на 120 сторінках машинописного тексту.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ
Огляд літератури. В огляді літератури висвітлено сучасні уявлення про фолат-залежні процеси, метаболізм гомоцистеїну. Особливу увагу приділено факторам ризику виникнення патологій вагітності, що пов'язані з порушенням фолатного метаболізму та поліморфізмом генів. Висвітлено сучасні дані стосовно ролі плаценти у забезпеченні нормального росту і розвитку плода та значення балансу процесів проліферації та апоптозу в плаценті людини на різних етапах гестації. Описано сучасні підходи для дослідження метаболізму плаценти людини.
Матеріали та методи дослідження. Об'єктом дослідження була зріла (38-42 тижні вагітності) плацента людини та експланти плаценти від першого та третього триместрів вагітності. Всі жінки давали письмову згоду на використання плаценти у дослідженнях. Дослідження проведено відповідно до вимог Гельсінської декларації.
Високомолекулярну ДНК виділяли із зразків плаценти за методом Міллер та інші [Miller et al., 1988]. Генотипування MTHFR проведено у 96 зразках плаценти за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) з наступним рестрикційним аналізом амплікону [Van Amerongen et al., 1998].
Метилування промотору GSTP1 визначали методом ПЛР після модифікації ДНК метабісульфітом натрію [Gonzalgo et al., 2004].
Сумарний вміст тетрагідрофолатів визначено мікробіологічним тестом з використанням молочнокислих бактерій Lactobacillus casei, інтенсивність росту яких залежить від концентрації фолатів у середовищі культивування [Grossowicz et al., 1981; Степанова и др., 1972; Wilson and Horne, 1982].
Профілі вмісту метіоніну, цистеїну, гомоцистеїну та глутатіону визначали у зразках методом рідинної хроматографії високого тиску (РХВТ) з електрохімічною детекцією без попередньої дериватизації на приладі HP1100 (Hewlett-Packard, Waldbronn, Німеччина) [Melnyk et al., 1999] з аналітичною колонкою Purospher STAR RP-18e (250x4,6 mm, I.D., 5 m, Merck) та предколонкою LiChrospher 60 RP-select B (4x4 mm, I.D., 5 m).
Експланти плаценти отримано та культивовано згідно з протоколом [Baczyk et al., 2006]. Під мікроскопом відрізали окремі ворсинки хоріону, які переносили у 48-лункові планшети з культуральним середовищем DMEM/Hem`s-F12 1 % пеніциліном, 1 % стрептоміцином, 1 % амфотерицином B та 2 % L-глутаміном (PAA Laboratories GmbH, Австрія) і культивували у інкубаторі з 6 % О2 та 5 % СО2 при
37 °С протягом 48 год. При моделюванні стану гіпергомоцистеїнемії до культурального середовища додавали гомоцистеїн до кінцевої концентрації 20, 40 та
80 мкМ. Вплив фолієвої кислоти визначали, додаючи її у культуральне середовище до кінцевої концентрації 20 нМ, яка відповідає середній концентрації фолієвої кислоти у крові людини [Cikot et al., 2001; Selhub et al., 1993]. За стандартні умови культивування прийнято культивування без додаткових гомоцистеїну та фолієвої кислоти.
Після культивування експланти використовували для імуногістохімічного аналізу, для визначення вмісту CBS - специфічної РНК за допомогою ЗТ-ПЛР та вмісту протеїну CBS вестерн-блот аналізом.
Імуногістохімічний та імунофлуоресцентний аналіз проводили за стандартною методикою з використанням UltraVision LP Detection System HRP Polymer & AEC Chromogen (Labvision corporation, США) та антитіл до Кі67 (DakoCytomatin, Данія), М30 CytoDEATH (Roche Diagnostics GmbH, США), СBS (Abnova Corporation, Тайвань), Сyt 7 (Labvision, США) та DAPI (Invitrogen, США).
Після специфічного забарвлення препаратів у кожному з них обирали під мікроскопом (Zeiss Axiophot, Німеччина) при збільшенні х100 п'ять випадкових полів зору, фотографували їх і в програмі NIS-Elements AR 2,3 (Nikon, США) проводили відповідні вимірювання: визначали площу зрізу ворсинок хоріону та площу, яку займає М30 CytoDEATH позитивна зафарбованість у кожній ворсинці; вимірювали окружність ворсинок і підраховували кількість Ki67-позитивних клітин у зрізі кожної ворсинки. Проліферативний індекс розраховували як кількість Ki67 позитивних клітин на 100 мкм окружності ворсинки хоріону. Апоптотичний індекс розраховували через відношення площі, яку займає М30 CytoDEATH позитивна зафарбованість у кожній ворсинці, до загальної площі зрізу відповідної ворсинки та виражали у відсотках.
Експресію CBS у експлантах плаценти оцінювали за вмістом специфічної мРНК у тотальній РНК та за вмістом відповідного білка у сумарному білку лізатів. CBS-специфічну ензиматичну активність цитозолю зрілої плаценти визначали радіологічним методом, який базується на реакції [14C] L-серин + L-гомоцистеїн [14C] L-цистатіонін + H2O, що її каталізує ензим CBS. Радіоактивність вимірювали на аналізаторі Perkin Elmer Tri-Carb 2800TR (США). Ензиматичну активність цитозолю виражали у міліОд/мг сумарного протеїну. За одну одиницю CBS-специфічної ензиматичної активності цитозолю прийнято активність тієї кількості сумарного білка цитозолю, яка за умов експерименту каталізує утворення 1 мкмоль цистатіоніну за одну хвилину при 37 °С.
Отримані результати оцінювали за характером їхнього розподілу за допомогою коефіцієнта Шапіро-Уілка. Непараметричні дані наводили у вигляді медіан та інтерквартильних діапазонів; параметричні дані наводили у вигляді середніх арифметичних зі стандартним відхиленням (M ± SD). Значущість відмінностей і кореляцію між показниками оцінювали за тестами Манна-Уітні, Вілкоксона, Стьюдента і Спірмена. Статистичний аналіз даних проводили у програмі Statistica 7,0 (Stat-Soft 2004, США).
Результати досліджень та обговорення
Соціальні, економічні, демографічні та клінічні показники вибірки. За результатом аналізу медичних карток 40 зразків були від породіль із фізіологічним перебігом вагітності, 28 - від породіль із діагнозом прееклампсії і 28 - з іншими ускладненнями вагітності. Серед останніх зустрічалися анемія, небезпека викидню, гіпоксія плода, слабкість родової діяльності, плацентарна недостатність.
Групи не відрізнялися за віком жінок, масою та довжиною новонароджених, але індекс Апгар, який відображає стан новонародженого у перші хвилини після народження і оцінюється за п'ятьма показниками, двома балами за кожний, був достовірно вищий у групі без ускладнень вагітності (t-test, p<0,001) (табл. 1).
Розподіл С677Т алельних варіантів гена MTHFR у плаценті за умов фізіологічного та ускладненого прееклампсією перебігу вагітності. Як відомо, С677Т та Т677Т алельні варіанти гена MTHFR у материнському організмі найчастіше асоціюються з ускладненнями вагітності [van der Put et al., 2001; Микитенко і Тимченко, 2009]. Роль поліморфізму плацентарного гена MTHFR у виникненні захворювань досліджено у поодиноких працях [Gebhardt et al., 2001] і єдиної думки з цього приводу не існує.
Проведене нами визначення розподілу алельних варіантів гена MTHFR є одним із перших в Україні. У 96 зразках зрілої плаценти від породіль із центральної України визначено, що частота С677С генотипу складала 45,8 % (44/96), С677Т - 43,8 % (42/96) та Т677Т - 10,4 % (10/96).
Таблиця 1. Характеристики матері та новонароджених (M ± SD)
|
Показники |
Вагітність без ускладнень (n = 40) |
Прееклампсія (n = 28) |
|
|
Вік матері, роки |
25,9 ± 4,9 |
27,6 ± 5,7 |
|
|
Маса новонародженого, г |
3331,0 ± 324,3 |
3225,9 ± 507,8 |
|
|
Довжина новонародженого, см |
52,6 ± 2,2 |
51,3 ± 2,7 |
|
|
Коефіцієнт Апгар |
8,7 ± 1,4 |
7,6 ± 0,9* |
Примітка. *-різниця з групою «Вагітність без ускладнень» статистично вірогідна, t-test, p<0,001.
Ці результати суттєво не відрізнялися від розподілу генотипів у європейській популяції. Однак, зразки з С677Т та Т677Т алельними варіантами гена MTHFR частіше зустрічаються у групі з прееклампсією (рис. 1, а), ніж за умов фізіологічного перебігу вагітності (рис.1, б).
а)
б)
Рис. 1. Частота алельних варіантів гена MTHFR у зразках плаценти за умов ускладненого прееклампсією (а) та фізіологічного (б) перебігу вагітності
Відомо, що каталітична активність ензимів цих алельних варіантів складає відповідно 65 та 30 % каталітичної активності ензиму з С677С генотипом.
Вміст фолатів і амінотіолів у зразках плаценти та результати кореляційного аналізу даних. Загальний вміст фолатів у зразках плаценти коливався у межах 0,12 - 0,79 мкг/мг сумарного протеїну або 2 - 32 мкг/г тканини і був найнижчим за носійства С677Т алелів MTHFR та ускладнення вагітності прееклампсією (табл. 2). Зниження рівня фолатів у плаценті може бути наслідком дефіциту надходження фолатів з їжею або порушенням їх адсорбції на фоні прееклампсії.
До профілю амінотіолів, який визначали, входили метіонін, цистеїн, гомоцистеїн і глутатіон. Вміст останніх трьох амінотіолів визначали як тотальний вміст кожного з них у сумі їхньої відновленої, окисленої та протеїнзв'язаної форми.
Результати наводили у нмоль/мг сумарного протеїну. Вміст кожного із тіолів коливався у межах 0,07 - 0,14 для гомоцистеїну, 1,93 - 11,18 для метіоніну, 17,72 - 28,38 для цистеїну та 3,04 - 27,21 для глутатіону (табл. 2).
Таблиця 2. Вміст фолатів (мкг/мг білка) та амінотіолів (нмоль/мг білка) у зразках плаценти
|
Категорії |
Медіана (інтерквартильний діапазон) |
||||||
|
Фолати |
Гомоцистеїн |
Метіонін |
Цистеїн |
Глутатіон |
|||
|
Неускладнені вагітності |
C677C |
0,4 (0,2 - 0,6) |
0,09 (0,05 - 0,19) |
5,5 (3,1 - 10,6) |
17,7 (15,7 - 21,5) |
4,2 (2,4- 12,3) |
|
|
C677T |
0,3 (0,1 - 0,7) |
0,12 (0,09 - 0,17) |
9,7 (6,4 -12,4) |
21,6 (13,9 - 31,4) |
6,8 (4,0 - 13,4) |
||
|
T677T |
0,4 (0,2 - 0,6) |
0,07 (0,04 - 0,10) |
11,2 (0,4 - 22,0) |
26,0 (14,1 - 38,0) |
27,2 (7,5 - 47,0) |
||
|
Прееклампсія |
C677C |
0,5* (0,2 - 0,8) |
0,09*¦ (0,06 - 0,17) |
7,9* (5,7 -9,1) |
20,1 (12,5 - 23,2) |
7,8 (1,8 - 12,2) |
|
|
C677T |
0,2*¦ (0,1 - 0,4) |
0,14*# (0,06 - 0,16) |
3,7* (0,4 - 5,0) |
19,0 (13,2 - 29,1) |
9,3 (4,7 - 31,9) |
||
|
T677T |
0,7¦ (0,6 - 0,8) |
0,03¦# (0,03 - 0,06) |
3,3 (0,3 - 7,1) |
14,1 (8,7 - 22,5) |
14,5 (2,5 - 30,6) |
Примітка. Величини з однаковими позначками у межах однієї колонки статистично відмінні із достовірністю р 0,05 за тестом Манна-Уітні.
Серед усіх аміонотіолів цистеїн складав близько 63 %, глутатіон - 19,7 %, метіонін - 17 % та гомоцистеїн - 0,4 %. У зрілій плаценті людини вміст цистеїну втричі перевищує вміст глутатіону, що за характером співвідношення цистеїн/глутатіон подібно до співвідношення у печінці плода (15 / 1) та новонародженого (1,5 / 1). В інших органах плода на 13-ому тижні гестації співвідношення цистеїн/глутатіон мало протилежний характер [Raijmakers et al., 2001].
Аналіз рівня амінотіолів у плаценті за носійства різних алельних варіантів гена MTHFR та перебігу вагітності без ускладнень та з прееклампсією показав певні відмінності між групами. Найнижчий рівень метіоніну виявлено у зразках з С677Т алельними варіантами MTHFR у групі з прееклампсією, який із статистичною достовірністю відрізняється від значень у зразках з С677С носійством у тій же групі та у зразках з С677Т носійством у групі вагітностей без ускладнень (тест Манна - Уітні, р=0,016 у кожному із порівнянь). Вміст гомоцистеїну серед всіх категорій є найвищим у групі з С677T алельними варіантами MTHFR, низьким вмістом фолатів на фоні ускладненої прееклампсією вагітності.
Попарний кореляційний аналіз вмісту амінотіолів та фолатів показав, що при комбінації прееклампсія - С677Т носійство - низький рівень фолатів виникає досить сильна кореляція між цими показниками: негативна між фолатами і гомоцистеїном, фолатами і цистеїном, цистеїном і глутатіоном, гомоцистеїном і глутатіоном; позитивна між гомоцистеїном та цистеїном, гомоцистеїном і метіоніном, фолатами і глутатіоном (рис. 2).
Фолати і гомоцистеїн є двома субстратами у реакції реметилування, і дисбаланс між ними призводить до накопичення однієї із речовин, що і пояснює негативну кореляцію між ними. Два амінотіоли, цистеїн і глутатіон, тісно пов'язані між собою, оскільки цистеїн є водночас лімітуючим фактором у синтезі г-глутамілцистеїну, першого продукту у синтезі глутатіону, а також продуктом розщеплення глутатіону через цистеїнілгліцин [Meister, 1988]. Однак природу негативної кореляції між ними (rs = - 0,69, p = 0,012) за даними умовами важко пояснити тільки наведеними їхніми метаболічними зв'язками.
Негативні кореляції між фолатами і цистеїном, гомоцистеїном і глутатіоном віддзеркалюють хоча і сильну, але опосередковану асоціацію між цими речовинами.
Позитивна кореляція між гомоцистеїном і метіоніном пояснюється зв'язком між цими сполуками типу субстрат - продукт. Ще одна сильна позитивна кореляція виявлена між фолатами та глутатіоном, які зв'язані між собою опосередковано, і, можливо, частково реалізується через ланцюг фолати - гомоцистеїн - глутатіон (рис. 2). Ця кореляція свідчить про важливість фолатів для підтримки окисно-відновного статусу клітини.
Тісну позитивну кореляцію ми встановили також між гомоцистеїном і цистеїном з коефіцієнтом Спірмена rs = 0,73, p = 0,006. Гомоцистеїн і цистеїн можуть бути пов'язані між собою шляхом транссульфування, існування якого у плаценті людини раніше не було доведено. Частину роботи ми присвятили з'ясуванню цього питання.
Отже, встановлено, що вміст амінотіолів та фолатів у зразках зрілої плаценти змінюється у залежності від алельних варіантів гена MTHFR та наявності/відсутності прееклампсії. Тісна кореляція між величинами показників виникає за умов носійства С677Т генотипу MTHFR і низького рівня фолатів на фоні прееклампсії. Відомо, що прееклампсія спричиняє оксидативний стрес у тканині плаценти [Lachmeijer et al., 2002], а такі ензими, як CBS та метіонінсинтаза, є редокс чутливими [Taoka et al., 1998]. Ми припускаємо, що носійство С677Т алелів гена MTHFR, низький рівень фолатів та інші, ще не повністю розшифровані зміни у метаболізмі плаценти, спричинені прееклампсією, мають аддитивний ефект і сприяють тіснішій кореляції між вмістом фолат-залежних амінотіолів.
Експресія і каталітична активність цистатіонін-в-синтази у плаценті людини. Для перевірки вищезазначеної гіпотези щодо існування активного шляху транссульфування у плаценті людини ми дослідили експресію ензиму CBS на рівні мРНК і протеїну та локалізацію CBS у плаценті людини першого та третього триместрів гестації. В експлантах плаценти з обох термінів гестації виявлено CBS-специфічну мРНК (рис. 3, а) і CBS-специфічний протеїн (рис. 3, б).
Позитивну реакцію антитіл з антигеном СBS спостерігали у синцитіотрофобласті і цитотрофобласті та у клітинах строми ворсинок хоріону першого та третього триместрів гестації (рис. 4, а, б). Реакцію більшої інтенсивності виявили у синцитіо- та цитотрофобласті у зразках першого триместру вагітності порівняно з третім триместром.
CBS специфічну ензиматичну активність цитозолю визначали радіологічним методом у зразках зрілої плаценті від породіль із фізіологічним перебігом вагітності. З'ясували, що внаслідок реакції [14C] L-серин + L-гомоцистеїн [14C] L-цистатіонін + H2O, яка каталізується ензимом CBS, радіоактивно мічений -вуглець серину виявляється у фракції цистатіоніну. За інтенсивністю включення мітки CBS специфічна ензиматична активність цитозолю складала 46 міліОд/мг загального протеїну. Нагрівання гомогенату плаценти до 65С унеможливлювало реакцію, а за неспецифічним включенням активність оцінювалася як 1,9 міліОд/мг загального протеїну.
Таким чином, вперше доведено, що у плаценті людини експресується ензим CBS, який має специфічну каталітичну активність.
Вплив гомоцистеїну та фолієвої кислоти на проліферативний та апоптотичний індекси у експлантах плаценти першого триместру вагітності. Для того, щоб з'ясувати як впливає гомоцистеїн та фолієва кислота на функції плаценти, визначали проліферативний та апоптотичний індекси у експлантах плаценти, культивованих у відповідних умовах. Процеси проліферації, диференціації та апоптозу чітко збалансовані у плаценті, і порушення цього балансу є критичним для нормального функціонування плаценти і розвитку плода. Моноклональні антитіла до антигену Ki-67 (Mib1) розпізнають ядерний антиген, який є маркером клітинної проліферації, оскільки присутній у G1, S, G2 та M фазах клітинного циклу і відсутній у G0 фазі. У препаратах експлантів першого триместру вагітності Кі67-позитивні клітини визначалися серед клітин цитотрофоблату, а відповідне значення медіани проліферативного індексу становило 4,2 (інтерквартильний діапазон, 3,1 - 5,1). Культивування експлантів у присутності 20 і 40 мкМ гомоцистеїну призводило до зниження проліферативного індексу (2,2 (1,0 - 3,2) та 1,5 (1,1 - 2,3) відповідно), який залишався незмінним при 80 Нсу (1,5 (1,2 - 2,2) (тест Вілкоксона, р < 0,05) (рис. 5, а). Культивування у присутності 20 нМ фолієвої кислоти також призводило до зниження проліферативного індексу до 2,7 (1,8 - 3,7) (тест Вілкоксона, p=0,011). Додавання фолієвої кислоти до зростаючої концентрації гомоцистеїну у інкубаційному середовищі суттєво не змінювало токсичний вплив Нсу.
За допомогою моноклональних антитіл М30 CytoDEATH у експлантах першого триместру специфічно виявлено нео-епітоп цитокератину 18, який утворюється на ранніх стадіях апоптозу при розщепленні цитокератину каспазою 3 [MacFarlane et al., 2000]. Апоптотичний індекс, який визначали як співвідношення площі, яку займає М30 позитивна зафарбованість у кожній ворсинці, до загальної площі зрізу відповідної ворсинки, у експлантах, культивованих за стандартних умов, дорівнював 0,8 % (0,1 - 1,1).
а)
б)
Рис. 5. Проліферативний (а) та апоптотичний індекси (б) в експлантах плаценти першого триместру вагітності: 1-культивування без фолієвої кислоти; 2-з фолієвою кислотою
*-значення індексів зі статистичною вірогідністю відрізняються від відповідних значень за стандартних умов культивування) (тест Вілкоксона, p < 0,05)
Він зростав залежно від концентрації гомоцистеїну у 2,5, 5 та 6,8 разів відповідно при додаванні 20, 40 та 80 мкМ гомоцистеїну у культуральне середовище (тест Вілкоксона, 0,0002 < p < 0,0015) (рис. 5, б).
Культивування при додаванні 20 нМ фолієвої кислоти підвищувало апоптотичний індекс до 1,5 % (0,6 - 2,8 %) у порівнянні зі стандартними умовами культивування (тест Вілкоксона, p = 0,0002). Додавання фолієвої кислоти до середовища з 20 - 80 мкМ гомоцистеїном виявляло тенденцію до підвищення апоптотичного індексу (тест Вілкоксона, 0,07 < p <0,14). Наростання апоптотичного індексу з підвищенням концентрації гомоцистеїну як у присутності, так і у відсутності фолієвої кислоти, суттєво перевищувало темпи зниження проліферативного індексу.
Таким чином, інкубація з гомоцистеїном призводила до порушення рівноваги між проліферацією та апоптозом. Фолієва кислота не послаблювала проапоптичний ефект гомоцистеїну у експлантах першого триместру вагітності.
Вплив гомоцистеїну та фолієвої кислоти на проліферативний та апоптотичний індекси у експлантах плаценти третього триместру вагітності. Проліферативний індекс у культивованих експлантах третього триместру вагітності приблизно у 6 разів нижчий за такий у першому триместрі. Інкубація експлантів зрілої плаценти у присутності як гомоцистеїну, так і гомоцистеїну разом з фолієвою кислотою, суттєво не впливала на первісно низький проліферативний індекс трофобласту і на характер змін, пов'язаних із підвищенням концентрації гомоцистеїну (рис. 6, а).
За стандартних умов культивування апоптотичний індекс у експлантах зрілої плаценти майже у два раза вищий, ніж у експлантах першого триместру, 1,5 і 0,8 % відповідно. Різниця між експлантами двох термінів гестації стає ще більш наочною при зростанні концентрації гомоцистеїну, оскільки за цих умов апоптотичний індекс «зрілих» експлантів зростає більш, ніж у 10 разів (14,65, 16,15 та 16,35 % при 20, 40 та 80 мкМ гомоцистеїну, відповідно ) (рис. 6, б). Культивування експлантів при додаванні 20 нМ фолієвої кислоти призводило до підвищення апоптотичного індексу, однак додавання фолієвої кислоти дещо послаблювало залежність апоптотичного індексу від концентрації гомоцистеїну, хоча достовірно не змінювало апоптотичний індекс за умов культивування з жодною із концентрацій гомоцистеїну. Ми припускаємо, що більша чутливість експлантів зрілої плаценти до підвищеного рівня гомоцистеїну пов'язана зі «старінням» плаценти та відповідними змінами у її метаболізмі.
а)
Б)
Рис. 6. Проліферативний (а) та апоптотичний індекси (б) в експлантах плаценти третього триместру вагітності: 1-культивування без фолієвої кислоти; 2-з фолієвою кислотою.
* -значення індексів зі статистичною вірогідністю відрізняються від відповідних значень за стандартних умов культивування (тест Вілкоксона, p < 0,05)
Експресія та цистатіонін-в-синтазна активність цитозолю у експлантах плаценти. Вміст протеїну CBS у експлантах першого триместру вагітності дослідили залежно від концентрації гомоцистеїну та фолієвої кислоти у культуральному середовищі (рис. 7, а). Блотограма та денситограма засвідчують, що внаслідок культивування експлантів з 20 мкМ гомоцистеїном у присутності фолієвої кислоти та без неї зростає вміст протеїну CBS майже втричі порівняно з культивуванням за стандартних умов. При культивуванні експлантів з 40 мкМ та 80 мкМ гомоцистеїном вміст протеїну CBS перевищує вихідний рівень тільки у 1,5 - 2 рази, а додавання у культуральне середовище 20 нМ фолієвої кислоти ще трохи знижує його (рис. 7, б).
а)
Размещено на http://www.allbest.ru/
б)
Рис. 7. Вміст СBS протеїну в тотальному протеїні плаценти людини. Блотограма (а) і денситограма (б) вестерн-блот аналізу експлантів плаценти з використанням специфічних антитіл проти CBS.
Експланти плаценти першого триместру вагітності культивували впродовж 48 год за стандартних умов (1); у присутності гомоцистеїну у концентраціях 20 мкM (2), 40 мкM (4), 80 мкM (6); у присутності 20 нM фолієвої кислоти і гомоцистеїну у концентраціях 20 мкM (3), 40 мкM (5), 80 мкM (7) і у присутності лише 20 нM фолієвої кислоти (8)
Щоб переконатися, чи супроводжується збільшення експресії гена CBS підвищенням ензиматичної активності, ми порівняли вміст цистеїну в експлантах першого та третього триместрів після їхнього культивування без додавання гомоцистеїну та з ним. З'ясували, що в експлантах першого триместру при додаванні 20 і 40 мкМ гомоцистеїну рівень цистеїну стрімко зростає до 0,95 та 3,55 мкмоль/г тканини, відповідно, порівняно з 0,12 мкмоль/г тканини при культивуванні за стандартних умов. У експлантах зрілої плаценти він зростає до 0,34 і 1,20 мкмоль/г тканини порівняно з 0,07 мкмоль/г тканини. Тобто активність синтезу цистеїну в експлантах першого триместру вища, ніж у третьому триместрі. Незважаючи на активацію шляху транссульфування у тканині плаценти у умовах використаних концентрацій Нсу, ця «захисна» спроможність плаценти виявляється недостатньою для підтримання на належному рівні ключових функцій плаценти.
Структурні зміни в експлантах після культивуваня з гомоцистеїном та фолієвою кислотою. Культивування у присутності 20 чи 40 мкM гомоцистеїну або 20 нM фолієвої кислоти не спричиняло суттєвих змін у структурі експлантів, хоча зміни у експресії гена CBS і у проліферативному й апоптотичному індексах за цих умов були суттєві. Однак культивування з 80 мкM гомоцистеїном супроводжувалось витонченням шару трофобласту і частковим відшаруванням цито- та синцитіотрофобласту від строми (рис. 8), тобто грубими порушеннями структури тканини.
Отже, у експлантах плаценти людини першого та третього триместрів гестації експресується каталітично активний ензим CBS і за умов високих концентрацій гомоцистеїну рівень протеїну CBS та рівень цистеїну зростає. Підвищений рівень гомоцистеїну призводить до зростання апоптотичного індексу та зниження проліферації, а додавання фолієвої кислоти не зменшує токсичний вплив гомоцистеїну.
Після культивування з 80 мкМ гомоцистеїном спостерігали порушення у структурі ворсинок хоріону, тоді як - з 20 і 40 мкМ гомоцистеїном суттєвих гістологічних змін не виявлено.
ВИСНОВКИ
У дисертаційній роботі вперше охарактеризовано фолат-залежний обмін амінотіолів у плаценті людини за умов поліморфізму гена метилентетрагідрофолатредуктази (MTHFR) при фізіологічному та ускладненому прееклампсією перебігу вагітності. Виявлено дисбаланс між рівнями амінотіолів у плаценті при прееклампсії та за носійства мутантних алелів гена MTHFR. Встановлено цитотоксичний вплив гомоцистеїну на структуру та функції трофобласта плаценти людини.
1. При прееклампсії, носійстві С677Т алелів гена MTHFR та низькому рівні фолатів у плаценті людини спостерігали зниження вмісту метіоніну, підвищення гомоцистеїну та високий рівень кореляції між вмістом фолатів і амінотіолів.
2. Виявлено, що інкубація експлантів плаценти першого і третього триместрів вагітності з гомоцистеїном призводить до зниження індексу проліферації, посилення процесів апоптозу і деструкції тканини ворсинки хоріону.
3. Інкубація експлантів плаценти з фолієвою кислотою у фізіологічній концентрації призводить до зниження індексу проліферації та посилення процесів апоптозу. Фолієва кислота не зменшує негативний вплив гомоцистеїну на апоптотичний та проліферативний індекси.
4. Вперше показано, що у плаценті людини експресується та виявляє каталітичну активність цистатіонін в-синтаза.
5. Вперше виявлено, що гомоцистеїн у межах концентрацій 20-40 мкМ активує експресію цистатіонін в-синтази та шлях транссульфування.
ПЕРЕЛІК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ
1. С677Т поліморфізм метилентетрагідрофолатредуктази як фактор ризику для новонароджених в Україні / О. П. Марценюк, А. М. Слончак, Н. М. Теплюк,
Л. Я. Сазонова, М. Ю. Оболенська // Науковий вісник Чернівецького університету: Збірник наукових праць. - 2006. - Вип. 297: Біологія. - С. 77-82.
2. Поліморфізм генів метилентетрагідрофолатредуктази, глутатіонтрансфераз та цитохрому Р450 1А1 та глутатіонтрансферазна активність у плаценті людини /
О. П. Марценюк, Н. М. Теплюк, Л. Я. Сазонова, М. Ю.Оболенська // Біополімери і клітина. -2006. - Т.22, №6. - С .452-457.
3. Деякі аспекти регуляції транскрипції гена глутатіон-S-трансферази Р1-1 у плаценті людини / А. М. Слончак, О. П. Марценюк, Й. Жешовська-Вольни,
П. Відлак, М. Ю. Оболенська // Укр. біох. журн. - 2007. - Т.79, №4. - С.67 - 75.
4. Рівень низькомолекулярних тіолів та фолатів у плаценті людини /
О. П. Марценюк, Ш. Мішланова, К. Л. Романець, Н. М. Теплюк, М. Ю.Оболенська. // Укр. біох. журн. - 2009. - Т. 81, №4. - С. 94-104.
5. Вплив гомоцистеїну на структуру та функції трофобласта плаценти людини /
О. П. Марценюк, К. Л. Романець, М. Ю. Оболенська, Б. Хупертц // Укр. біох. журн. - 2009. - Т. 81, №5. - P.40-49.
6. Асоціація поліморфізму генів метилентетрагідрофолатредуктази та глутатіонтрансферази з глутатіонтрансферазною активністю в плаценті людини / О. П. Марценюк, А. М. Слончак, Н. М. Теплюк, Л. Я. Сазонова,
М. Ю. Оболенська // Тези VII міжнародної конференції молодих онкологів “Сучасні проблеми експериментальної і клінічної онкології” Київ, Україна. - 2006. - С. 58.
7. Systemic analysis of genetic factors that predispose to DNA damage in human placenta / O. Martsenyuk, N. Teplyuk, M. Obolenskaya // European Journal of Clinical Investigation, March 2006. - Vol. 36, Suppl.1.- 2006, Р.76.
8. Поліморфізм метилентетрагідрофолат редуктази як фактор ризику для новонароджених в Україні / О. П. Марценюк, А. М. Слончак,
Л. Я. Сазонова,М. Ю. Оболенська // II Міжнародна наукова конференція студентів і аспірантів “Молодь та поступ біології”. Збірник тез. (21-24 березня 2006 р., м. Львів). - 2006. - С. 340 - 341.
9. Асоціація глутатіонтрансферазної активності з поліморфними генами метилентетрагідрофолатредуктази та глутатіон-S-трансферази в плаценті людини / О. П. Марценюк, Н. М. Теплюк, А. М. Слончак, Л. Я. Сазонова, М. Ю. Оболенська // Матеріали ІХ Українського біохімічного з`їзду, Харків, 2006 - Т.1.- С.54
10. Поліморфізм ключового ферменту фолатного циклу - метилентетрагідрофолатредуктази та глутатіонтрансферазна активність в плаценті людини / О. П. Марценюк, А. М. Слончак, Л. Я. Сазонова, М. Ю. Оболенська // Фортификация пищевых продуктов витамином В9 с целью предупреждения врожденных дефектов невральной трубки. Научно-практическая конференция. - Киев, 2006. - С.25.
11. Methylation and site-specific interaction of nuclear proteins with GSPT1 promoter in human placenta / A. Slonchak, O. Martsenyuk, J. Lanushewska, P. Widlak,
J. Rzeszowska-Wolny, M. Obolenskaya // The 10-th Anniversary of Gliwice Scientific Meetings, Poland. - November 2006. - Р. 62.
12. Investigation of glutathione S-transferase P1-1 transcription regulation in human placenta, the unique non-cancer model / A. Slonchak, O. Martsenyuk, P. Widlak,
J. Rzeszowska-Wolny, M. Obolenskaya // European Journal of Clinical Investigation. - May 2007. - Vol. 37, Suppl. 1- P. 50.
13. Determination of aminothiols in human placenta by HPLC with coulochemical detection / O. Martsenyuk, Cs. Miљѕanovб, M. Obolenskaya // Abstract book. Conference of young scientists, PhD students and students on molecular biology and genetics. - 20-22 September 2007. - Kyiv, Ukraine. - P. 176.
14. Identification of transcription factors acting on glutathione S-transferase P1 promoter in human placenta/ A. Slonchak, O. Martsenyuk, P. Widlak, J. Rzeszowska-Wolny,
M. Obolenskaya // Abstract book. Conference of young scientists, PhD students and students on molecular biology and genetics. - 20-22 September 2007. - Kyiv, Ukraine. - P. 188.
15. Determination of aminothiols in human placenta samples /
O. Martsenyuk, Cs. Miљѕanovб, M. Obolenskaya // Bridges in life science annual scientific review.-2007.-V1, №1.- p.77.
16. Cytotoxicity of homocysteine and its transsulfuration pathway in human placenta /
O. Martsenyuk, B. Huppertz, M. Siwetz, C. Mislanovб, M. Obolenskaya. // Біополімери та клітина. -2008. - Vol. 24, №5 - P. 358.
17. Negative effect of homocysteine on the turnover of villous trophoblast /
O. Martsenyuk, B. Huppertz, M. Obolenskaya. // IFPA Meeting 2008, Placenta. - 2008. -Vol.29, issue 8. - P. A 40.
18. Folates and folate-related metabolism in human placenta /
Cs. Miљѕanovб, O. Martsenyuk, M. Obolenskaya // IFPA Meeting 2008, Placenta. - 2008.-Vol.29, issue 8. - P. A. 62.
19. Cystathionine synthase and proliferation at hyperhomocysteinemia in human placenta / O. Martsenyuk, B. Huppertz, M. Siwetz, C. Mislanovб, M. Obolenskaya // Bridges in life science annual scientific review.-2008. - Vol. 2, №1. - P.66.
20. Цитотоксичний вплив гомоцистеїну на клітини трофобласта плаценти людини / О. П. Марценюк, Б. Хупертц, М. Сіветц, Ш. Мішланова, М. Ю. Оболенська // Укр. Біох. Журн. -2008. - Т.80, №4. - С. 166.
21. Detoxification function glutathione S-transferase P1 and role of methylenetetrahydrofolate reductase polymorphism in decrease its enzyme activity in human placenta / M. P. Kruvosheya, O. P. Martsenyuk, A. M. Slonchak,
M. Yu. Obolenskaya // The book of abstracts. VIII Ukrainian Conference of young scientists, PhD students and students. - September 2008. - Kyiv, Ukraine. - P. 39-40.
22. Cystathionine-в-synthase expression in human placenta / O. Martsenyuk, B. Huppertz, M. Obolenskaya // Materials of the Third Conference of Young Scientists, dedicated to Charles Darwin's 200th Birthday and the 150th Anniversary of the publication of his main book «On the Origin of Species ..» 10 June 2009 Kiev, Ukraine Biopolymers and cell. -2009. - Vol. 25, №5. - P. 358.
23. Експресія цистатіонін-в-синтази та цистатіонін-г-ліази у зрілій плаценті людини / К. Л. Романець, О. П. Марценюк, М. Ю. Оболенська // Матеріали всеукраїнської наукової конференції студентів та молодих науковців 28-29 жовтня 2009. - Київ, Україна.- С. 119-120.
АНОТАЦІЯ
Марценюк О. П. Фолат-залежні процеси в плаценті людини: роль фолієвої кислоти, гомоцистеїну та поліморфізму гена метилентетрагідрофолатредуктази. - Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 - біохімія.- Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України, Київ, 2010.
Дисертацію присвячено дослідженню фолат-залежного метаболізму амінотіолів в плаценті людини при поліморфізмі гена метилентетрагідрофолатредуктази (MTHFR) та ускладненому прееклампсією перебігу вагітності. Встановлено цитотоксичний вплив гомоцистеїну на структуру та функції трофобласта плаценти людини. Нижчий рівень фолатів і метіоніну та вищий рівень гомоцистеїну виявлено в зразках плаценти після вагітності з прееклампсією та за носійства C677T алелів гена MTHFR. Дефіцит фолатів в комбінації з носійством мутованого гену MTHFR призводить до більш виразних змін в фолат-залежному метаболізмі амінотіолів, що проявляється тісною кореляцією між рівнем фолатів та амінотіолів.
Показано експресію цистатіонін в-синтази та доведено активність шляху транссульфування в плаценті людини першого та третього триместрів гестації. Вперше показано, що культивування експлантів плаценти в присутності 20 і 40 мкМ гомоцистеїну призводить до активації шляху транссульфування, пригнічення проліферації та підвищення апоптозу. Надвисокі концентрації гомоцистеїну (80 мкМ) викликають грубі порушення в структурі ворсинки. Додавання фолієвої кислоти в культуральне середовище з гомоцистеїном не зменшувало його цитотоксичний ефект.
Ключові слова: фолієва кислота, гомоцистеїн, метилентетрагідрофолатредуктаза, цистатіонін в-синтаза, прееклампсія, плацента.
АННОТАЦИЯ
Марценюк О. П. Фолат-зависимые процессы в плаценте человека: роль фолиевой кислоты, гомоцистеина и полиморфизма гена метилентетрагидрофолатредуктазы. - Рукопись.
Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.04 - биохимия. - Институт биохимии им. О.В. Палладина НАН Украины, Киев, 2010.
Диссертация посвящена изучению фолат-зависимого метаболизма аминотиолов в плаценте человека при полиморфизме гена метилентетрагидрофолатредуктазы (MTHFR) и осложненной преэклампсией беременности.
Основные задачи исследования состояли в том, чтобы определить содержание общих фолатов и низкомолекулярных аминотиолов в образцах плаценты в зависимости от аллельных вариантов гена MTHFR и характера протекания беременности; проанализировать влияние гомоцистеина и фолиевой кислоты на процессы пролиферации и апоптоза в эксплантах плаценты первого и третьего триместров беременности; исследовать экспрессию цистатионин в-синтазы (CBS) и активность пути транссульфирования гомоцистеина в плаценте человека.
С помощью полимеразной цепной реакции с последующим рестрикционным анализом изучено аллельные варианты гена MTHFR в 96 образцах зрелой плаценты из центральных регионов Украины. Выявлено, что распределение частот C677T и T677T аллелей гена MTHFR в данной выборке не отличается от распределения в европейской популяции.
При исследовании уровня общих фолатов в образцах плаценты микробиологическим методом с Lactobacillus casei выявлено снижение уровня фолатов при прееклампсии и носительстве С677Т аллелей гена MTHFR.
Методом жидкостной хроматографии высокого давления изучено уровни метионина, гомоцистеина, цистеина и глутатиона. Показано, что при преэклампсии, носительстве С677Т аллелей гена MTHFR и низком уровне фолатов в плаценте снижается содержание метионина и повышается уровень гомоцистеина. В этой группе уровень всех исследованных аминотиолов и фолатов с разным направлением коррелируют с уровнем гомоцистеина как типичного маркера фолат-зависимых процессов.
Положительная корреляция гомоцистеина с уровнем цистеина была основой для предположения о существовании пути транссульфирования гомоцистеина.
Подобные документы
Класифікація анемій, причини їх виникнення. Лікування аутоімунної гемолітичної анемії з тепловими антитілами, холодової аглютинінової хвороби. Встановлення причини абсолютного дефіциту заліза, фолієвої кислоти. Призначення медикаментозної терапії.
курсовая работа [56,2 K], добавлен 28.03.2016Оборотна зупинка метаболізму в клітинах за рахунок технологічних процесів з використанням низьких температур. Зберігання плаценти, її здатність бути "депо" різних біологічно активних речовин і впливати на патологічні процеси. Регрес атеросклерозу.
автореферат [77,0 K], добавлен 20.02.2009Макроскопічна і морфометрична характеристика та будова кровоносного русла пупкового канатика і плаценти людини. Структурний аналіз ворсинкового відділу плаценти. Особливості кровообігу між плодом і плацентою. Структурна організація плацентарного бар’єра.
автореферат [49,5 K], добавлен 20.02.2009Роль цитохромів Р450 в біотрансформації ліків, їх генетичний поліморфізм, лікарська взаємодія. Субстрати, інгібітори та індуктори окремих представників родини CYP450, методи діагностики активності ферментів біотрансформації в медикаментозному лікуванні.
реферат [38,4 K], добавлен 08.11.2010Общая характеристика гена eNOS. Анализ наследственной отягощенности у детей в группе риска по ожирению, по сахарному диабету тип 2 (СД2) и по сердечно-сосудистой патологии. Проведение ПЦР для 4a4b полиморфизма гена эндотелиальной NO-синтазы (eNOS).
курсовая работа [317,8 K], добавлен 06.07.2011Фактори ризику маткових кровотеч при оперативному розродженні. Стан імунної системи та інтерлейкінів у вагітних та породілей з прееклампсією, розроджених кесаревим розтином. Характер гістологічних та електронномікроскопічних змін міометрія та плаценти.
автореферат [51,9 K], добавлен 10.04.2009Біотехнологічні процеси заготівлі, консервування клітин, тканин ембріофетоплацентарного походження в умовах низьких температур. Вплив холоду на біологічні об'єкти. Функціональна повноцінність біологічного матеріалу. Вибір терапії від форми і стадії ЦХРД.
автореферат [44,3 K], добавлен 09.03.2009Роль окисно-відновних процесів у еякулятах бугаїв і фолікулах яєчників корів, їх вплив на капацитацію та дозрівання сперміїв і ооцитів поза організмом, способи корекції метаболізму статевих клітин, оцінювання їх фізіологічного, морфологічного стану.
автореферат [76,9 K], добавлен 04.04.2009Трансфіковані клітини культури клітин яєчників китайського хом’яка. Дослідження експресії трансгена. Рекомбінантні плазміди, які містять ген АРОА1 людини під контролем енхансеру чи промотору середньораннього гена цитомегаловірусу людини з інтроном.
автореферат [52,1 K], добавлен 12.03.2009Діагностика ранніх стадій діабетичної нефропатії на підставі визначення ліпідного спектра крові та вмісту плазмового гомоцистеїну і поліпшення результатів її лікування із розробкою коригуючої терапії. Вуглеводний обмін та функціональний стан нирок.
автореферат [29,4 K], добавлен 11.04.2009
