Актуальність проблеми. За даними ВООЗ, сьогодні у світі 180 млн. осіб мають зорові розлади, серед яких 45 млн - сліпих. За останні 20 років чисельність незрячих збільшилася на 12 млн чоловік. Кожні 5 секунд у світі стає сліпою 1 людина, тоді, як майже двом третинам випадків сліпоти можна запобігти [Т.В. Крижанівська, 2003]. Водночас, однією з головних причин невиліковної сліпоти у світі залишається ангіогенна патологія сітківки та зорового нерва (ЗН) [Риков С.О. 2003; Нагорна А.М. та ін., 2003].

Серед метаболічних чинників ураження судин, в останні роки велике значення надають гіпергомоцистеїнемії (ГГЦ), яка розглядається як незалежний фактор ризику чисельної групи офтальмологічних захворювань: оклюзивних процесів в сітківці - тромбозів центральної артерії та вени сітківки [Chua B., 2005; Kesler et al, 2008], глаукоматозної оптиконейропатії [Puustjarvi T., 2004; Tongabay Cumurcu, 2006; Roedl J. B., 2007], передньої ішемічної нейропатії [Pianka P., 2000; Stanger et al., 2005; Martin et al., 2007], вікових макулодистрофій [Seddon et al., 2006; Martin et al., 2007] та ретинопатій при цукровому діабеті [Brazionis L., 2008; Kenneth S., 2009] і при серцево-судинних захворюваннях [Hu R., 2005; Cheung N., 2008].

Доведено [Furie K. L., 2006], що підвищення рівня гомоцистеїну (ГЦ) на 5 мкмоль/л призводить до зростання ризику венозних тромбозів на 27% [Hoюoleanu C., 2007], а ризик тромбозу центральної вени сітківки підвищується на 7% при збільшенні рівня ГЦ на кожний 1 мкмоль/л, незалежно від інших факторів ризику [Chua B., 2005].

Експериментальні моделі ГГЦ для вивчення механізмів патогенетичної дії дають можливість не лише проаналізувати значення різних етіологічних чинників, тривалості та наслідків їх впливу на сітківку та ЗН, але й виявити можливі механізми нормалізації їх структури [Салдан Й.Р. та співавт., 2003; Пентюк О.О. та співавт., 2004; Ossani G. et al., 2004; Sipahioglu M. H., et al., 2005]. В останні роки активно вивчається можливість застосування вітамінів групи В при судинних і нейродегенеративних захворюваннях через зниження рівня ГЦ [Андрушко І.I., 2003; Wald N. J., Law M. R., 2003; Постовітенко К.П. та ін., 2006; Пентюк О.О. та ін., 2007; Артемчук М.А., 2008]. За даними Yagisawa M. [2004], гіпогомоцистеїнемічний вплив при експериментальній метіонін-індукованій ГГЦ здійснює бетаїн.

Повідомляються чисельні клінічні випадки ГГЦ серед офтальмологічних пацієнтів, але роботи, присвячені дослідженню морфологічних змін в сітківці та ЗН, - поодинокі [Салдан Й.Р. та співавт., 2003]. Відсутність чіткого розуміння морфологічного підґрунтя впливу високого рівня ГЦ на орган зору ускладнює розробку дієвих заходів з профілактики та лікування офтальмологічних захворювань, асоційованих з порушеннями обміну ГЦ. Вивченням структури та функції органа зору в нормі та при різних патологічних станах займається фундаментальна дисципліна - морфологія [Автандилов Г.Г., 2002; Віт В.В., 2003; Головацький А.С. та ін., 2009], яка складає анатомічну основу офтальмології. Тому, актуальність даного дослідження визначають саме вивчення впливу ГГЦ на морфофункціональний стан сітківки та ЗН і пошук раціонального підходу до його корекції.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Тема дисертації затверджена вченою радою лікувального факультету Вінницького національного медичного університету ім. М.І. Пирогова МОЗ України (протокол № 4 від 9 лютого 2006 р.) та проблемною комісією МОЗ і АМН України "Морфологія людини" (протокол № 80 від 9 жовтня 2007 р.). Робота є фрагментом планової наукової тематики кафедри очних хвороб ВНМУ ім. М.І. Пирогова під назвою "Стан місцевого імунітету та мікроциркуляції при патології органа зору та їх корекція” (№ державної реєстрації: 0104U002881) та наукової роботи кафедри біохімії (тема: "Використання модуляторів активності метаболізуючих ферментів та сорбентів в якості засобів корекції фармакологічної активності та токсичності лікарських засобів" (УДК: 615.22: 262 № державної реєстрації: 0101 U 002832), а також договорів про наукову співпрацю з Інститутом Хімії Поверхні НАН України, з Інститутом фармакології та токсикології АМН України "Створення нового лікарського засобу антиатеросклеротичної дії на основі комплексу вітамінів В₆, В₉, В₁₂ та мікроелементів” від 01.11.2001 року. Автор при виконанні роботи вивчив структуру сітківки та зорового нерва щурів в нормі, при модельованій гіпергомоцистеїнемії, а також при її корекції вітамінно-мікроелементним комплексом та бетаїном.

Мета дослідження: дослідити в експерименті морфофункціональний стан сітківки та зорового нерва в нормі, його зміни при гіпергомоцистеїнемії різної етіології, ступеня важкості й тривалості - для визначення елементів загальних закономірностей в їх пошкодженнях і патогенетичного підходу до корекції.

Задачі дослідження:

Матеріал і методи дослідження. Експерименти проведені на білих нелінійних щурах-самцях на базі науково-експериментальної клініки Вінницького національного медичного університету ім. М.І. Пирогова. Утримання, догляд за тваринами, маркування та всі маніпуляції проводили із дотриманням положень "Європейської конвенції про захист хребетних тварин, які використовуються для експериментальних та інших наукових цілей" [Страсбург, 1985], "Загальних етичних принципів експериментів на тваринах”, ухвалених Першим Національним конгресом з біоетики [Київ, 2001], а також у відповідності до положень ARVO (The Association for research in vision and ophthalmology) щодо використання тварин в офтальмологічних дослідженнях. Комісією з біоетики ім. М.І. Пирогова встановлено, що проведені наукові дослідження відповідають етичним вимогам згідно наказу МОЗ України №231 від 01.11.2000 року (протокол № 12 від 24 червня 2009 року).

Для контролю за харчуванням тварин щурів утримували на напівсинтетичному раціоні, що був розроблений на основі крохмально-казеїнової дієти з додаванням оптимальних кількостей всіх макро - і мікронутрієнтів [Пентюк О.О. та співавт., 2007].

Стан ГГЦ в експерименті моделювали з використанням підходів, викладених в офіційних рекомендаціях Фармцентру України "Доклінічні дослідження гіпогомоцистеїнемічної дії фармакологічних засобів" [2007]. Були відтворені гостра метіонінова та гіповітамінозно-метіонінова моделі ГГЦ.

сітківка зоровий нерв гіпергомоцистеїнемія

З метою корекції морфологічних зрушень, індукованих гіповітамінозно-метіоніновою ГГЦ, нами застосовані 2 засоби: ВМК та бетаїн. Лікування мало наступні особливості: відрізнялися препарати (ВМК та бетаїн), шляхи ведення (інтрагастрально чи в складі харчового раціону) і різною була тривалість спостереження (4, 10 та 20 діб). Бетаїн вносили в дієту з розрахунку 300 мг бетаїну на 1 кг маси щурів, а ВМК - в кількості, що забезпечувала надходження в організм тварин компонентів: піридоксину (В₆) - 714 мкг, фолієвої кислоти (В₉) - 143 мкг, кобаламіну (В₁₂) - 14,3 мкг, іонів цинку, хрому та ванадію - 1 мг, 7,5 і 0,93 мкг відповідно.

Морфологічні методи дослідження. Щурів декапітували під глибоким ефірним наркозом. Очні яблука та ЗН занурювали в 10 % розчин буферизованого формаліну з рН 7,4. Через тиждень очні яблука та ЗН за стандартною методикою зневоднювали у етанолі зростаючих концентрацій та ущільнювали в парафіні. Гістологічні зрізи товщиною 5-7 мкм забарвлювали гематоксиліном та еозином, азур ІІ-еозином, фосфорно-вольфрамовим гематоксиліном, толуїдиновим синім. Отримані препарати переглядали та фотографували за допомогою світлового мікроскопа МБІ-6 під оптичними збільшеннями (окуляр х7, х10; об`єктив х100, х200, х400, х1000). Для виявлення в судинах фібрину та встановлення його "віку” застосовано гістохімічну методику [Слінченко Н.З., 1964].

Морфометричні методи дослідження. Кількісний аналіз кожного гістологічного препарату проводили в 10 полях зору за допомогою сітки Автандилова (2002). Морфометричні дослідження здійснено в ділянках сітківки, за Glenna Currier, (1983), умовно названих центральною та периферичною ділянками сітківки. Морфометричний аналіз на світлооптичному рівні включав підрахунок кількості клітин в ЗЯШ, ВЯШ та ГШ сітківки, товщини та відносного об'єму ФСШ, ЗЯШ, ЗСШ, ВЯШ, ВСШ, ГШ разом із ШНВ, загальної товщини центральної та периферичної ділянок сітківки.

Ультрамікроскопічні методи дослідження. Фрагменти сітківки і ЗН фіксували 2,5 % глютаровим альдегідом на фосфатному буфері. Дофіксовували в 1 % розчині OsO4, заливали у епон, згідно загальноприйнятих електронно-мікроскопічних методик [Карупу В.Я., 1984]. Ультратонкі зрізи контрастували уранілацетатом та цитратом свинцю, вивчали та фотографували за допомогою електронного мікроскопа ЕМ-125. Електронно-мікроскопічне дослідження здійснено на базі Київського національного медичного університету ім.О. О. Богомольця.

Лектин-гістохімічні методи дослідження. Для визначення вуглеводної специфічності клітинних мембран структурних елементів сітківки та ЗН проводили гістохімічні дослідження методом лектин-пероксидазної техніки [Луцик О.Д. та співавт., 1989] за допомогою панелі із 8 лектинів різної вуглеводневої специфічності, кон`югованих з пероксидазою хрону, одержаних у лабораторії "Лектинотест" Львівського медичного університету ім. Данила Галицького д. фарм. н. Антонюком В.О. Матеріал, після фіксації нейтральним формаліном, заливали в парафін. На адгезивних скельцях, вкритих полілізином ("Mezel-Glaser”, Німеччина) готували парафінові зрізи сітківки та ЗН товщиною 5-7 мкм, депарафінізували і обробляли у спиртах. Контроль специфічності реакції здійснювали шляхом виключення діамінобензидину зі схеми обробки препаратів. Інтенсивність забарвлення зрізів різними лектинами оцінювали в балах порядкової шкали інтенсивності реакції.

Методи біохімічних досліджень. Біохімічні дослідження виконані в акредитованій науково-дослідній клініко-діагностичній лабораторії ВНМУ ім. М.І. Пирогова (під керівництвом професора Пентюка О. О.). Рівень загального ГЦ визначали методом ІФА з використанням набору "Homocysteine” Axis Shield, Англія. Вміст малонового діальдегіду визначали за реакцією з тіобарбітуровою кислотою [Владимиров Ю.А., Арчаков А.И., 1972], дієнових кон'югатів - за їх поглинанням в ультрафіолетовій ділянці спектра при 233 нм [Гаврилов В.Б., Мишкорудная М.И., 1983]. Вміст білкових карбонільних груп визначали за реакцією з 2,4-динітрофенілгідразином [Levine R. L. et al., 1994; Дубинина Е.Е. та ін., 2000]. Нітрити та нітрати в сироватці крові тварин визначали за реакцією з реактивом Грісса [Коренман И. М., 1975]. Активність глутатіонпероксидази (КФ 1.15.1.1) в постядерній фракції мозку визначали за падінням вмісту відновленого глутатіону (реакція Елмана) [Roy D. et al., 1989]. Вміст відновленого глутатiону визначали в глутатiонтрансферазнiй реакції у трихлороцтовому фільтраті мозку [Asaoka K., Takahashi K., 1981].

Статистичні методи дослідження. Статистичний аналіз даних проводили в програмному пакеті Statistica 5.5 (належить ЦНІТ ВНМУ ім. М.І. Пирогова, ліцензійний номер АХХR910A374605FA) з використанням параметричних та непараметричних методів оцінки отриманих результатів. Достовірність різниці значень між незалежними кількісними величинами визначали за допомогою t - критерію Стьюдента, в інших випадках - оцінювали за допомогою критеріїв Манна-Уітні та Вілкоксона. Критерієм достовірності вважалася величина Р<0,05 (95 %). Для визначення зв'язків між показниками використовували кореляційний аналіз (з вираховуванням r) по Пірсону.

Результати дослідження та їх аналіз. Встановлено, що одноразове введення тваринам великої дози метіоніну (50 мг/кг) забезпечує розвиток ГГЦ середньої важкості (за класифікацією Jacobsen D. W. (1998)). Так, у щурів контрольної групи середній рівень ГЦ складав 10,8±0,35 мкмоль/л, а у щурів, котрі отримали 50 мг/кг метіоніну вміст ГЦ виявився в 4,6 рази більшим - 49,6±3,92 мкмоль/л.

Дослідженнями структурної організації сітківки при гострій метіоніновій ГГЦ виявлено дезорганізацію шарів сітківки, помірний набряк обох ядерних шарів та виражений набряк з переважною локалізацією в ФСШ, ГШ та ШНВ. Останній зазнає дегенеративних змін через плазматичне просякання стінок судин і периваскулярного простору, їх гомогенізації та пролябації в напрямку до склистого тіла.

Дані лектин-гістохімічного дослідження свідчать про найбільш виражені зміни представництва глікоконьюгатів в шарах сітківки з більш вираженим набряком. При гострій метіоніновій ГГЦ наявна повна редукція рецепторів до лектинів виноградного слимака (HPA) та насіння сої (SBA) в набряклих ядерних шарах та в ГШ, а також втрата експресії рецепторів лектину WGA в ФСШ. Ареактивними по відношенню до модельованого стану виявилися рецептори сітківки та ЗН до лектинів SNA та кори бузини чорної, що може свідчити про втрату сіалогліканів або їх маскування глікополімерами у вигляді NAcDGlc. Зростання афінності при метіоніновій ГГЦ зафіксована в окремих шарах до лектинів LABA, WGA і PNA. Зміни цитотопографії глікополімерів, що проявлялися підвищенням інтенсивності гістохімічної реакції найбільш характерні були для альфа-L-фукозних кон'югатів. Посилення експресії рецепторів лектину LABA у ФСШ, ядерних, ЗСШ та ГШ сітківки може вказувати на участь глікополімерів L-фукози у синтезі збуджуючих нейротрансмітерів при передачі нервового імпульсу.

Найбільш виражені зміни експресії глікокон'югатів при метіоніновій ГГЦ були в пограничних мембранах, ФСШ, ГШ і ШНВ, сітчасті шари демонстрували відносно незначну перебудову глікому структурних компонентів. ЗН при метініновій ГГЦ демонстрував зміни гістотопографії вуглеводних рецепторів з тенденцією до їх зменшення в пери - та ендоневрії (LABA - і WGA-позитивні рецептори).

Товщина сітківки дослідних груп щурів достовірно збільшувалася, статистично достовірно зростала питома вага ГШ та ШНВ. Спостерігалася втрата однорідності шарів, та їх диспропорція за рахунок набряку зовнішньої та внутрішньої ділянок сітківки, які знаходяться в безпосередній близькості до гемато-ретинального бар`єру. В середній частині сітківки (сітчасті шари та ВЯШ) були відносно незначні ознаки набряку, змін лектин-гістохімічної активності, товщини шарів та сталості клітинної популяції в них.

Виявлено, що найчастіше при метіоніновій ГГЦ вражаються фотосенсорні та мультиполярні гангліонарні нейрони. Зміни паличок та колбочок сітківки під впливом ГГЦ характеризуються деструкцією зовнішніх їх відділів. Стосовно гангліонарних нейронів, дія ГГЦ реалізується явищами вакуолізації їхньої цитоплазми, ущільнення ядер, тенденцією до гіпохромії, нейроцитолізу, достовірного зменшення їх кількості. Результати наших досліджень узгоджуються із результатами Ganapathy P., [2009] стосовно втрати чисельності гангліонарних клітин та набряку в сітчастих та ядерних шарах при ГГЦ.

Реакція ЗН на різке підвищення рівня ГЦ проявляється метаболічною перебудовою, зростанням інтенсивності забарвлення неврилеми, збільшенням кількості нейролемоцитів, макрофагів та фібробластів. Спостерігається їх нерівномірне накопичення та порушення звичайної орієнтації між пучками нервових волокон (під кутом до осі нерва). На фоні відносної втрати структурованості нерва вибірково маркуються гліальні клітини при кон'югації з лектином LABA.

Встановлено, що в сітківці на різке зростання ГЦ в крові обов'язково реагує МЦР. Стінки ретинальних судин ГШ гомогенізуються та потовщуються внаслідок плазморагії, просвіт судин деформується, зменшується, а місцями взагалі облітерується. Вазотоксичність ГЦ, виявлену в гострому досліді, можна пояснити гіпоксією, яку спричиняє оксидативний стрес при ГГЦ та дією оксиду азоту.

Свідченням підвищеної проникності судин при метіоніновій ГГЦ можна вважати виявлені зміни активності вуглеводних рецепторів ендотеліоцитів судин сітківки, що проявлялися в достовірному підвищенні інтенсивності гістохімічної реакції з лектинами LABA та PNA.

Наявні гістологічні та біохімічні дані дозволяють зробити припущення, що в основі токсичної дії надлишку в крові ГЦ лежить ініціювання ним оксидативного стресу та порушення вазорегуляції. Підтвердженням ймовірності "оксидативної” гіпотези несприятливого впливу надлишку ГЦ на сітківку та ЗН можуть бути результати проведеного нами вимірювання вмісту продуктів пероксидації ліпідів та білків в сироватці крові та мозку тварин, глутатіону та активності антиоксидантного фермента глутатіонпероксидази в мозку. Наші дані свідчать, що у тварин з гострою ГГЦ рівень в сироватці крові карбонільних груп білків зростає в 2,3 рази, вміст малонового діальдегіду - в 2,14 рази, дієнових кон'югатів - в 2,56 рази. В мозку тварин з ГГЦ вміст карбонільніх груп зростає в 2,25 рази, малонового діальдегіду - в 2,56 рази. Натомість рівень відновленого глутатіону зменшується на 42%, а активність глутатіонпероксидази - на 36%. Тобто, при ГГЦ має місце значна активація процесів пероксидації ліпідів та білків, і зрив антиоксидантих можливостей, і ці зміни тісно корелюють з рівнем ГЦ в крові.

Важливим в патогенетичному відношенні є ще один виявлений факт - значне зменшення (на 43,6% при гострій ГГЦ) концентрації нітратів та нітритів в сироватці крові тварин з ГГЦ. Відомо, що нітрати та нітрити є стабільними метаболітами оксиду азоту - основної вазодилятаторної молекули. Тобто, цілком можливо, що одним з ранніх проявів токсичної дії надлишку ГЦ на судини є гальмування продукції вазодилятаторів. Такий хід подій логічно вивільняє механізм вазоконстрикції. Зафіксований нами факт зростання інтенсивності процесів пероксидації ліпідів та білків свідчить про посилення утворення активних форм кисню, які, як відомо, теж володіють потужною вазоконстрикторною дією.

Очевидно, що знайдені нами зміни як судинного апарату, так і нервових елементів в сітківці та ЗН є наслідком ішемічно-реперфузійних уражень даних морфологічних структур, а механізмом ініціювання таких пошкоджень є викликані надлишком ГЦ явища оксидативного стресу.

При поєднанні двох факторів - навантаження організму щурів метіоніном та дефіциту основних вітамінів, які беруть участь в обміні ГЦ, - рівень ГЦ в сироватці крові зростає до 119±8,5 мкмоль/л, що відповідає важкій ГГЦ [Jacobsen D. W., 1998].

На 15 добу експерименту в сітківці та ЗН при мікроскопічному дослідженні, в судинах МЦР сітківки діагностовано зменшення просвіту судин, потовщені стінки судин, пошкодження ендотеліальних клітин, підвищення проникності капілярів, діапедез формених елементів крові, стази та тромби в артеріях та венах. Просвіт судин сітківки як правило, розширений, заповнений кров'ю, в окремих судинах (переважно венах) відмічено явища стазу та тромбозу різної давнини (за даними гістохімічного дослідження). Стаз та повнокрів'я частіше мають місце в ретинальних капілярах ГШ та ШНВ. На межі ЗСШ та ВЯШ також збільшується питома вага повнокровних дилятованих судин.

В ЗН вразливими до ГГЦ виявились судини м`якої оболонки, під якою на тлі набряку наявні вогнища діапедезу еритроцитів у оточуючу тканину, а також судини нерва. За анатомічною будовою і локалізацією вищезгадані судини відповідали центральній артерії сітківки та супроводжуючим її венам та венулам. В нашому дослідженні тромби мають місце, в основному, в венах, частіше - в дрібних судинах ГШ сітківки, водночас, в ЗН діагностовано тромби в крупних судинах диску зорового нерва та в центральній вені сітківки, до входження в товщу нерва.

Кожна гілка ЦАС, розпадаючись на капіляри, кровопостачає окремий квадрант, тому при припиненні кровоплину в ретинальних судинах при ГГЦ розвивався інфаркт відповідної обмеженої ділянки. В подальшому, в таких місцях відбувалося розростання сполучної тканини та глії з утворенням конгломератів або "залишкових вузликів", часто периваскулярної локалізації. Звертало на себе увагу, що при виявленні фактів тромбозу в судинах внутрішньої третини сітківки, її зовнішні відділи часто зберігали відносну інтактність, що може свідчити про різні механізми і неоднакові ступені порушення гісто-гематичного бар'єру внутрішніх та зовнішніх шарів сітківки. Виявлені набряк та втрата щільності ФСШ у одних тварин, та масивна вакуолізація та атрофія зовнішніх сегментів нейросенсорних клітин у інших тварин однієї групи може свідчити про індивідуальну чутливість паличок та колбочок до ГЦ. За результатами морфометричного дослідження шарів сітківки, найбільш резистентним до впливу ГГЦ є ЗЯШ. Відносна збереженість перикаріонів фотосенсорних нейронів здатна забезпечити регенерацію ФСШ, що й спостерігається при застосуванні ВМК.

Лектин-гістохімічним дослідженням сітківки тварин з гіповітамінозно-метіоніновою ГГЦ в її ФСШ виявляється мозаїчна перебудова рецепторів LABA, PNA та WGA, що свідчить про втрату його функціональної здатності та розвиток дистрофічних процесів.

Встановлено, що вразливими до ГЦ, крім фотосенсорних, є асоціативні та гангліонарні клітини. В популяції клітин ВЯШ відносно ареактивними залишаються горизонтальні нейрони, тоді як найбільш чутливими до ГГЦ є амакринові клітини, які розташовуються на межі ВЯШ та ВСШ. Аксони амакринових нейронів при гіповітамінозно-метіоніновій ГГЦ набувають гіперхромності. В нашому дослідженні кількість гіперхромних амакринових клітин достовірно зростає. Ми схильні вважати, що ГГЦ викликає збудження, а можливо і перезбудження нейронів, зважаючи на вже відомі ексайтотоксичні ефекти ГГЦ в мозку [Sachdev P. S., 2005; Blaise S. A., 2007] та сітківці [Вікторов 2006; Ying Dun, 2007; Ganapathy P., 2009].

У клітинах ГШ при ГГЦ спостерігались альтеративні поліморфні зміни окремих нейронів у вигляді як вакуолізації нейроплазми, наявності клітин-тіней, так і гіперхромії та пікнозу нейронів, що, напевно, обумовлено гіпоксією нейронів. Звертала на себе увагу однотипність деструктивних змін гангліонарних нейронів та астроцитів, що контактують один з одним в ГШ біля ретинальних судин. Статистично достовірно кількість гангліонарних нейронів була нижчою у тварин з ГГЦ. Проведений статистичний аналіз виявив тенденцію до збільшення кількості гіперхромних амакринових клітин при одночасному розрідженні гангліонарних нейронів.

В нашому дослідженні по мірі наростання чутливості до токсичного впливу ГЦ нейрони розміщуються в такій послідовності: гангліозні < амакринові < фотосенсорні.

Виявлена при ГГЦ відсутність груп гангліонарних клітин супроводжується примноженням гліальних сателітів. Збільшення щільності загальної та сателітної глії може свідчити про появу репаративних процесів, що також проявлялося активацією нейроглії в умовах високих рівнів ГЦ. Статистично достовірно зростала кількість гіперхромних гліальних клітин, відростки яких прямували від внутрішньої пограничної гліальної мембрани до ВЯШ.

За допомогою лектин-гістохімічного дослідження виявлено факт підвищеної експресії рецепторів до PNA в окремих гіпертрофованих гліальних клітинах, на противагу загальній гіпореактивності гліальних клітин в ЗН з іншими лектинами, що дозволяє зробити припущення, що лектин арахісу є маркером активованих ГЦ гліальних клітин в ЗН. На поперечних зрізах ЗН чітко прослідковуються гліально-фібробластичні реакції на фоні набряку епі - та ендоневрію.

На відміну від нейронів глія володіє проліферативною здатністю, що яскраво демонструється на наступних етапах досліду. При використанні ВМК більшість збережених нейронів на 4 та 10 добу лікування характеризувалися морфологічними ознаками компенсаторно-пристосувальних реакцій, що проявлялося в гіпертрофії гангліонарних нейронів та оточенні їх гліальними клітинами.

Дослідження препаратів ВМК та бетаїну продемонстрували, що обидва препарати забезпечують гіпогомоцистеїнемічний ефект. При лікуванні вже розвинутої ГГЦ (на гіповітамінозно-метіоніновій моделі), виявлено, що за силою лікувальної дії застосовані фактори по мірі наростання позитивного ефекту розміщуються в такій послідовності: повноцінна дієта < бетаїн < ВМК.

Лікування препаратами ВМК та бетаїном за 4 доби знижувало плазмові рівні ГЦ в 5,92 рази (на 83,11 %) та у 3,29 рази (на 69,58%) відповідно, - такі показники характерні для слабкої ГГЦ. На противагу, у нелікованих тварин, яких переводили на стандартну дієту із фізіологічним вмістом вітамінів, зниження концентрації ГЦ становило 54,97 % (в 2,21 рази), а синдром ГГЦ набував середньої ступені важкості. На 10 добу лікування у тварин, які отримували ВМК, вміст ГЦ знижувався до нормальних рівнів (статистично достовірно). Отож, 10-ти добового періоду лікування ВМК достатньо для ліквідації ГГЦ в крові. Встановлено, що застосування бетаїну забезпечує зниження рівня ГЦ до нормальних значень в період від 10 до 20 діб лікування. Результати дослідження свідчать, що показники оксидативного стресу минають повільніше, ніж знижується концентрація ГЦ, а біохімічні зрушення в мозку тварин минають повільніше, ніж в сироватці крові. Слід зауважити, що при застосуванні дієти із фізіологічними дозами вітамінів також спостерігалася, хоч і повільна, але позитивна динаміка зниження концентрації ГЦ в крові до 35 доби експерименту.

Позитивна динаміка біохімічних показників в сироватці крові та мозку щурів знаходила своє відображення і в морфологічній перебудові сітківки та ЗН. Однак, якщо вищезгадані біохімічні зрушення піддавалися повній корекції, то структурні зміни сітківки та ЗН - не в повній мірі. Аналіз морфологічних результатів застосування ВМК та бетаїну показав, що відновлювальні ефекти на мікроскопічному рівні проявлялися у зменшенні набряку нейронів, інтрацелюлярного матриксу сітківки, нервових волокон, що забезпечувало відновлення структурованості сітківки та впорядкованості волокон ЗН і зменшенні явищ демієлінізації. Поступово зменшувався набряк стінок судин, що живлять сітківку та ЗН, нормалізувалася будова та функціональна здатність ендотелію судин, які втрачали стовпчасте розташування. Покращення мікроциркуляції, ймовірно, призводило до покращення кровопостачання і усунення гіпоксії і наслідків оксидативного стресу. При застосуванні ВМК, набряк зменшувався у напрямку до ФСШ, тобто ретинальні судини внутрішньої третини сітківки були більш чутливими до гіпогомоцистеїнемічних ефектів ВМК та бетаїну, ніж хоріоретинальні судини.

На моделі гіповітамінозно-метіонінової ГГЦ було виявлено стази та тромби в ретинальних артеріях та венах, які в подальшому діагностували в сітківці тварин нелікованої групи. У щурів, які отримували ВМК та бетаїн, навколо тромбованих судин утворювалися гліально-фібробластичні конгломерати або "залишкові вузлики", які виявлялися на усіх термінах лікування. На 4 добу застосування ВМК залишалося повнокрів'я, а при лікуванні бетаїном розширеними та повнокровними судини залишалися і по закінченню 10-денного періоду.

Результати наших досліджень, свідчать, що розростання гліальних елементів в період лікування - один із характерних морфологічних проявів замісної регенерації в сітківці та ЗН. Саме гліальні елементи (астроцити, олігедендроцити та мікроглія) забезпечували замісну регенерацію. Розмноженням і подальшою диференціацією та синтезом волокнистого компоненту можна пояснити утворення гліальних рубців в сітківці. Гіпертрофія і розмноження гліальних клітин були більш виражені в сітківці тварин, яких лікували ВМК. В ГШ в місцях випадіння гангліонарних клітин відбувалося заміщення патологічно змінених нейронів гліальними клітинами, які розташовувалися в кілька рядів. Результати спостереження за відновлювальним періодом в ЗН також свідчать про розростання в ньому гліальних елементів. При лікуванні ВМК спостерігається помірне осередкове збільшення гліальних клітин в ЗН, при застосуванні бетаїну - угрупування гліальних і сполучно-тканинних клітин деформують малюнок ЗН, а у нелікованих тварин - гліоз завершувався частковим фіброзом ЗН.

Пристосувально-компенсаторні процеси в сітківці також проявлялися гіпертрофією уцілілих гангліонарних нейронів. Водночас, навіть після лікування, збільшення чисельності клітин в ГШ відбувається не за рахунок гангліонарних клітин, а за рахунок гліальних клітин.

Лікування бетаїном демонструвало дещо повільнішу ліквідацію набряку, який не минав в ФСШ та ГШ та ЗН. В останньому навіть на 10 добу лікування у частини тварин помітні були явища відшарування епіневрію. В сітківці - виражений дефіцит нейронів, особливо гангліонарних. При цьому, проліферація гліальних елементів була практично відсутньою як в сітківці, так і в ЗН. Незначна активація проліферативної глії в ЗН спостерігалася лише на 20-ту добу застосування бетаїну.

Таким чином, хоч і лише частково, морфологічна картина в сітківці та ЗН під впливом лікування зазнавала позитивних змін, які були краще вираженими при застосуванні ВМК.

У нелікованих тварин, не зважаючи на те, що на 35 добу експерименту, після 20-ти добового утримання на основній дієті, рівень ГЦ знизився до 14,9±1,85 мкмоль/л, морфологічна картина характеризувалася ознаками набряку, особливо в ГШ, ЗСШ та ФСШ, достовірним зменшенням чисельності нейронів, питомої ваги ФСШ та ЗЯШ. У частини тварин ФСШ зазнавав повної атрофії разом із тотальним зменшенням ЗЯШ. Звертав на себе той факт, що ретинальні судини або мали значно розширені просвіти та гомогенізовані товсті стінки, або у них взагалі були відсутні просвіти за рахунок потовщення стінок в дрібних судинах. Навколо окремих судин з потовщеними стінками виявляли клітинну інфільтрацію, схожу на периваскуліт. В судинах сітківки були наявні тромби. Результати морфометричних досліджень свідчать, що у нелікованих тварин наявне достовірне зменшення загальної товщини сітківки. В ЗН тварин, які не отримували гіпогомоцистеїнемічних препаратів, розвивалося відшарування периневрію, втрата лінійності та контрастності нервових волокон, що свідчить про атрофічні процеси. Встановлено, що масовим явищем при нелікованій ГГЦ були дегенерація мієлінових оболонок та дистрофія осьових циліндрів нервових волокон ЗН. Таким чином, встановлено, що якщо ГГЦ не лікувати, відбувається тромбування судин сітківки, атрофія фотосенсорних та гангліонарних нейронів і порушення мієлінізації ЗН, що свідчить про незворотню втрату зору.

Висновки