Методи дослідження: загальногістологічні - для вивчення структурних перетворень мезонефросу і метанефросу; імуногістохімічний - для вивчення локалізації і кількості клітин в стані проліферації й апоптозу, клітин з рецепторами естрогенів і прогестерону та чотирьох типів колагенових волокон у стромі закладок первинної і кінцевої нирок; лектиногістохімічний - для вивчення кількісного вмісту і гістотопографії глікополімерів-рецепторів лектинів у закладках первинної і кінцевої нирок; морфометричні - для підрахунку кількості колагенових волокон чотирьох типів, клітин у стані проліферації та апоптозу і клітин з рецепторами естрогенів і прогестерону; статистичні - для встановлення індексу проліферації, апоптозу, порівняння вибірки лектиногістохімічного дослідження.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше в роботі використано порівняльний комплексний підхід до проблеми ембріонального гістогенезу первинної і кінцевої нирок із застосуванням сучасних методів гісто-морфологічних, лектино- і імуногістохімічних досліджень з різними видами статистичного аналізу, що дозволило порівняти особливості раннього ЕГ провізорного органу - МЗН і дефінітивного органу - МТН.

Вперше представлено порівняльну характеристику процесів апоптозу й проліферації клітин МЗН і МТН на ранніх термінах пренатального розвитку. Оцінено можливість редукції МЗН і перших двох генерацій нефронів МТН за допомогою процесу апоптозу його клітин.

На обширному ембріологічному матеріалі вперше вивчено терміни появи і локалізацію колагенових волокон I, II, III і IV типів у волокнистій стромі первинної і кінцевої нирок та перерозподіл даних волокон при редукції МЗН.

Вперше у ембріонів людини перших 12-ти тижнів розвитку виявлено локалізацію клітин, що мають рецептори гормонів естрогенів і прогестерона, в складі епітеліальних і мезенхімних закладок МЗН і МТН та зміни їх кількості в різні вікові періоди.

Вперше на значному ембріологічному матеріалі описано розподіл і доведено ефект послідовного перерозподілу глікополімерів з різною вуглеводною специфічністю - рецепторів щойно отриманих лектинів в клітинах, на їх поверхні та на неклітинних тканинних структурах у процесі органоспецифічного диференціювання епітеліальних і мезенхімних закладок первинної і кінцевої нирок. Виявлено лектини, що є маркерами КВ першого і третього типів.

Практичне значення одержаних результатів. У дисертаційній роботі вивчено нормальний ембріональний гістогенез провізорного органу первинної нирки і дефінітивного органу кінцевої нирки зародків і передплодів людини, що розвинулись у матці за відсутності пошкоджуючих чинників зовнішнього середовища. Тому одержані результати можуть стати практичною основою для розробки параметрів контролю нормальності розвитку цих органів in vivo і при клонуванні із стовбурових клітин, попередження аномалій внутрішньоутробного розвитку та можливості їх корекції при впливові несприятливих екологічних чинників і пренатального стресу.

Виявлення клітин, що містять рецептори гормонів Е і П, в закладках первинної і кінцевої нирок розширює уявлення щодо впливу статевих гормонів, в тому числі і матері, на нормальний ембріогенез органів видільної системи та свідчить про необхідність додання жіночих статевих гормонів у культуральне середовище при точковому клонуванні кінцевої нирки.

Виявлення послідовності і термінів синтезу КВ різного типу в стромі МЗН і МТН важливо для створення необхідної пористої структури для міграції клітин епітелію при клонуванні кінцевої нирки із стовбурових клітин.

Картування локалізації глікополімерів, які є рецепторами щойно виділених Л, на оболонках клітин, в їх цитоплазмі і на неклітинних тканинних структурах первинної і кінцевої нирок в нормальному пренатальному розвитку людини необхідно для ранньої діагностики потенційно злоякісних пухлинних клітин, що дозволить створити доступні лектиногістохімічні тест-системи для онкології і патологічної анатомії.

Проведений порівняльний аналіз закономірностей раннього ЕГ провізорного і дефінітивного органу вносить новий вклад у розуміння теорії ембріогенезу.

Одержані результати можуть бути враховані в практиці акушерів-гінекологів, неонатологів, патанатомів і трансплантологів. Дані можуть бути використані в навчальному процесі на кафедрах гістології, цитології й ембріології, акушерства та гінекології, анатомії і патологічної анатомії.

Основні положення дисертаційної роботи впроваджені в навчальну і наукову роботу кафедр гістології, цитології та ембріології: ДЗ "Луганський державний медичний університет", Одеського державного медичного університету, Запорізького державного медичного університету, ДВНЗ "Тернопільський державний медичний університет імені І.Я Горбачевського", Харківського національного медичного університету, Вінницького національного медичного університету ім. М.І. Пирогова, Дніпропетровської державної медичної академії, Львівського національного медичного університету ім. Данила Галицького, ДВНЗ "Івано-Франківський державний медичний університет"; кафедри анатомії людини Запорізького державного медичного університету.

Особистий внесок здобувача. Дисертація є особистою роботою автора, в якій дисертант самостійно зібрала і проаналізувала наукову літературу і патентну інформацію, сформулювала мету і завдання дослідження. Здобувач особисто провела збір і ретельний відбір ембріологічного матеріалу, його фіксацію з наступними ущільненням і виготовленням гістологічних зрізів, їх забарвлення гістологічними, імуногістохімічними і лектиногістохімічними методами. Самостійно виконанні біометричні дослідження, статистична обробка цифрових даних, а також аналіз та узагальнення результатів. Автор апробувала результати дослідження і підготувала праці до друку. В наукових публікаціях результатів дослідження за участю співавторів дисертанту належить основна частина внеску.

Апробація результатів дисертації. Результати дисертаційного дослідження, включені в дисертацію, були повідомлені на: VI міжнародному конгресі з інтегративної антропології (Вінниця, 2007); науково-практичній конференції "Прикладні аспекти морфології експериментальних і клінічних досліджень" (Тернопіль, 2008); науково-практичній конференції "Теоретические и практические аспекты современной медицины" (Алушта, 2008); міжнародній науково-практичній конференції "Вопросы морфологии XXI века" (С.-Петербург, 2008); науково-практичній конференції "Морфологічний стан тканин і органів систем організму в нормі та патології" (Тернопіль, 2009); науково-практичній конференції "Актуальні проблеми функціональної морфології", присвяченій 100-річчю з дня народження професора Е.Д. Бромберг (Полтава, 2009); Всеукраїнській науково-практичній конференції "Актуальні проблеми ембріологічних досліджень", присвяченій памяті професора В.А. Козлова (Дніпропетровськ, 2009); науковому конгресі "ІV міжнародні Пироговські читання", присвяченому 200-річчю М. І. Пирогова та V з`їзді АГЕТ України - (Вінниця, 2010); науково-практичній конференції, присвяченій памяті проф. Б.В. Шутки "Прикладні аспекти морфології" (Івано-Франківськ, 2010); III науковому симпозіумі "Морфогенез органів і тканин під впливом екзогенних факторів" (Алушта, 2010); Всеросійській науковій школі-конференції "Стволовые клетки и регенеративная медицина" (Москва, 2010).

Публікації. Основні матеріали дисертації викладені в 18 наукових публікаціях, 9 із яких - надруковані в ліцензованих ВАК України виданнях (2 - моно, 7 - у співавторстві), 6 - в матеріалах наукових конференцій. Отримано 2 деклараційних патенти України на корисну модель.

Обсяг і структура дисертації. Основний текст дисертації викладений на 265 сторінках компьютерного тексту і складається зі вступу, огляду літератури, розділів: матеріал і методи досліджень, результати власних досліджень, аналіз і узагальнення результатів досліджень, висновків і практичні рекомендації. Робота ілюстована 86 мікрофотографіями, 28 таблицями і 5 графіками (займають 81 сторінку). Список літератури включає 359 джерел, із них 90 праць учених СНД і 269 праць іноземних авторів.

Основний зміст роботи

Матеріал і методи дослідження. Вивчені 119 зародків людини, що розвинулись у матці за відсутності явно виражених пошкоджуючих чинників зовнішнього і внутрішнього середовища, отриманих при медичних абортах в 1-му і 2-му пологових будинках м. Сімферополя та в гінекологічному відділенні Луговської ЦРЛ Сімферопольского району. Одночасно були використані серійні зрізи із колекції "Крим" ДУ "Кримский державний медичний університет імені С.І. Георгієвского". Зародки фіксували 10% нейтральним формаліом. Оглядові препарати забарвлювали гематоксиліном і еозином (В.В. Семченко та співавт., 2006). Амфотерні сполуки в клітинах з переважанням основних властивостей забарвлювали методом AB&HxE за А.І. Брусиловським (2006), коли першим забарвлюють еозином, а потім гематоксиліном.

Імуногістохімічний метод дослідження. Імуногістохімічні дослідження проводили на серійних парафінових зрізах товщиною 5 мкм, поміщених на адгезивні скельця, покриті полілізином ("Menzel-Glaser", Німеччина). Для вивільнення антигенів після фіксації формаліном використовували теплове демаскування антигенів у мікрохвильовій печі "Sumsung" при потужності 800 Вт упродовж 10 хвилин у цитратному буфері при рН 6,0 (Д.Э. Коржевский, 2005).

Для вивчення різних типів колагену первинними антитілами були моноклональні антитіла до колагену I типу (Isotype Ig G1, Chemicon International), колагену II типу (клон COLL-II, Isotype Ms Ig G1-kappa, Chemicon International), колагену III типу (Isotype Ig G1, Chemicon International) і колагену IV типу (клон CIV 22, Dako Cytomation). В якості розчинника антитіл використовували розчин Antibody Diluent (Dako Cytomation). Результат розцінювали як позитивний при випадінні солей хромогену на колагенових волокнах МЗН і МТН.

Проліферативну активність вивчали за допомогою моноклональних антитіл Ki-67 (MIB-1), які ідентифікують ядерний антиген, присутній у більшості проліферативних клітин. Для оцінки готовності клітин обох нирок до рецепторного апоптозу та обчислення індексу готовності до апоптозу використовували моноклональні антитіла до Fas-рецепторів (CD 95 / Apo 1). Для виявлення клітин в стані апоптозу застосовували моноклональні антитіла до протеїну p53, який кодується геном - онкосупресором wt p53 (L.P. Fesus, J.A. Davis, M. Piacentini, 1991). Антиапоптотичний білок Bcl-2 пролонгує життя клітин, блокуючи апоптоз. Присутність білка Bcl-2 визначали за допомогою моноклональних антитіл до білка Bcl-2. Продукти позитивної реакції накопичувались в ядрах клітин, а для Bcl-2 також у їх цитоплазмі.

Для виявлення клітин, що мають рецептори Е і П, в МЗН і МТН імуногістохімічні реакції проводили з використанням відповідних первинних антитіл до рецепторів естрогенів (клон PdR636 фірми DAKO) і прогестерона (клон 1D5 фірми DAKO). Продукти позитивної реакції накопичувались в ядрах клітин.

Продукти позитивної реакції візуалізувались за допомогою системи візуалізації En vision (DAKO) упродовж 10 хвилин з кожним реактивом з біотинильованими антитілами і стрептавідин-пероксидазним комплексом. Потім проводили реакцію з хромогеном DAB (Dako Cytomation). Для адекватного уявлення структури тканини зрізи додатково забарвлювались гематоксиліном Майєра впродовж 3 хвилин. З метою контролю методу була проведена серія досліджень з використанням позитивних і негативних зразків, які служили еталонами.

Лектиногістохімічний метод дослідження. Серійні зрізи після депарафінізації занурювали в 96? етанол, а потім для інактивації ендогенної пероксидази інкубували 20 хвилин в метанолі, що містить 0,3% перекису водню. Препарати оброблювали із застосуванням стандартних наборів НПК "Лектинотест" (м. Львів) у розведенні лектинів 1:50 за рекомендуємою методикою (А.Д. Луцик, Е.С. Детюк, М.Д. Луцик, 1989). Візуалізацію місць звязування Л проводили в системі діамінобензидин-перекис водню. Контроль специфічності реакції здійснювали шляхом виключення зі схеми обробки препаратів діамінобензидину. Використовували: Л бузини червоної (SRA), специфічний до кінцевих нередукованих залишків N-ацетилнейрамінової (сіалової) кислоти глікополімерів; Л щириці (АСA), специфічний до бета-D-галактози; лектин гороху (PSL), специфічний до альфа-D-маннози; Л омели білої (VAA), специфічний до N-ацетил-D-галактозаміну; Л кореневища кропиви (UDA), специфічний до N-ацетил-D-глюкозаміну; і Л ікри окуня (PFA), специфічний до альфа-L-фукози. Інтенсивність забарвлення зрізів різними Л оцінювалась в балах методом напівкількісної оцінки.

Способи отримання та обробки статистичної інформації. Індекс проліферації, готовності до апоптозу та апоптозу, антиапоптотичний індекс визначали шляхом підрахунку кількості Ki-67, CD 95 / Apo 1, p53 і Bcl-2-позитивних клітин на 100 клітин кожної закладки первинної і кінцевої нирок при збільшенні х 1350 з наступним обчисленням показника в процентах в середньому за результатами всіх вивчених зародків кожного віку. Аналогічно в 100 клітинах кожної закладки підраховувалась кількість клітин з рецепторами Е і П.

Волокна позитивні по відношенню експресії маркерів КВ I, II, III і IV типів вивчали як мінімум на 5-ти зрізах. В кожному із них визначали кількість забарвлених у коричневий колір КВ в 10 полях зору на площі 502,08 мкм 2 (збільш. х 400 мікроскопу "Olympus CX-41") за допомогою окулярної сітки за Г.Г. Автандилова (1991).

Незалежні варіаційні ряди інтенсивності забарвлення клітин епітеліальних і мезенхімних закладок первинної і кінцевої нирок різними лектинами, що оцінювалось у балах, піддані статистичному аналізу на предмет належності до однієї або різних генеральних сукупностей за допомогою непараметричного статистичного парного T-критерію Уілкоксона.

Результати роботи та їх аналіз. Теоретичні основи ЕГ у вигляді єдиної концепції були викладені А.Г. Кнорре (1971), який включив у трактування гістогенезу наступні поняття: збільшення числа клітин шляхом їх мітотичного розмноження, клітинний ріст, переміщення окремих клітин і клітинних комплексів, детермінацію клітин (закріплення шляхів їх подальшого розвитку), диференціацію клітин і їх неклітинних похідних, міжклітинні взаємодії, що призводять до інтеграції (обєднанню в єдине ціле - зачаток, тканинну систему, орган, організм), відмирання клітин. Нами досліджені і розкриті органні особливості деяких етапів ембріонального гістогенезу провізорного органа - МЗН і дефінітивного органа - МТН: проліферація і загибель клітин, диференціація, інтеграція і частково спеціалізація.

В ембріональному і початку плодного періодах пренатального онтогенезу в організмі зародка існує екскреторна система, представлена МЗН і МТН. До 7,5 тижнів екскреторна функція виконується МЗН, що забезпечують функціональний захист процесів закладки і розвитку, які відбуваються в МТН. З 8 до 9,5 тижнів екскреторна функція в організмі зародка виконується диференційованими нефронами МЗН і нефронами першої генерації постійної нирки. Третій період - після 10 тижнів характеризується змінами структурної організації екскреторної системи зapoдку, коли в МЗН переважають інволютивні процеси і головним екскреторним органом стає МТН або постійна нирка. До 12 тижнів (зародки 70 мм довжини) постійна нирка має сформовані нефрони чотирьох генерацій, чашечки і миски, петлі нефронів, диференційовані збірні трубочки і сосочкові протоки. Нефрони перших двох генерацій піддаються інволютивним змінам.

Особливості проліферації і загибелі клітин провізорного органу (МЗН) і дефінітивного органу (МТН) в перші 12 тижнів ембріогенезу мають загальні ознаки. В МЗН і МТН в різний час існують мезонефрони, що розвиваються, розвинуті і які редукуються. Клітини мезо- і метанефронів, що розвиваються, проявляють високу проліферацію та експресію антиапоптотичного гена Bcl-2 (рис. 1 і рис. 2). Процеси апоптозу і готовності до рецепторного апоптозу знижені.

Рис. 1. Індекси проліферації (Ki-67), апоптозу (p53), готовності до апоптозу (CD 95) і антиапоптотичний індекс (Bcl-2) клітин судинних клубочків тілець мезонефронів первинної нирки.

Клітини розвинутих мезо- і метанефронів однаково слабко діляться і гинуть шляхом апоптозу. Антиапоптотичний ген Bcl-2 експресується у невеликій кількості клітин. Клітини з рецепторами CD 95 одиничні. Мезо- і метанефрони, що редукуються, дегенерують за рахунок апоптозу складових їх клітин і знижених процесів проліферації. Індекс готовності до апоптозу теж порівняльно високий. Антиапоптотичний індекс малий. Клітини епітелію чашечно-мискової системи і ЕСТ мозкової речовини постійної нирки демонструють процеси проліферації й апоптозу, властиві розвинутим метанефронам, тобто клітинної популяції, що оновлюється. В постійній нирці під капсулою є мало диференційована тканина - метанефрогенна тканина, яка служить джерелом формування нових популяцій метанефронів. Клітини цієї тканини демонструють високу проліферативну здатність і експресію гена Bcl-2, який перешкоджає апоптозу цих клітин, що дозволяє їм диференціюватися.

Рис. 2. Індекси проліферації (Ki-67), апоптозу (p53), готовності до апоптозу (CD95) і антиапоптотичний індекс (Bcl-2) КЛ судинних клубочків тілець метанефронів першої генерації кінцевої нирки.

На всіх етапах онтогенезу в тій або іншій мірі здійснюються всі елементарні процеси, і зокрема, безперервно продовжується диференціація. Нами вивчена диференціація клітин МЗН і МТН, що виражається в синтезі цими клітинами рецепторів статевих гормонів Е і П, які дозволяють їм реагувати на сигнали другої інтегруючої системи як організму матері, так і зародка. Ембріональний гістогенез МЗН на ранніх стадіях розвитку не контролюється статевими гормонами Е і П. Проогестерон важливий для розвинутих мезонефронів, а естрогени - для редукції первинної нирки. В кінцевій нирці Е-позитивні клітини постійно присутні в метанефрогенній тканині. Естрогени сприяють диференціюванню метанефронів із метанефрогенної тканини. У розвинутих метанефронах, так як і в розвинутих мезонефронах, є П-позитивні клітини. Тільки у розвинутих метанефронах є клітини з експресією рецепторів до естрогенів. Редукція метанефронів першої і другої генерації супроводжується зменшенням кількості клітин з рецепторами Е, що означає зниження чутливотсі структур до цього гормону. Кількість клітин з рецепторами П залишається незміненою.

Одним із аспектів диференціювання як одного із найважливійших компонентів ЕГ є становлення сполучнотканинної строми первинної і кінцевої нирок. ЕГ провізорного органу МЗН і дефінітивного органу МТН має схожі риси диференціювання сполучнотканинної строми, що заключається в першочерговому синтезі молодими фібробластами КВ III типу. КВ I типу починають синтезуватися пізніше і повторюють динаміку і гістотопографію КВ III типу, але їх значно менше. КВ IV типу входять до складу базальної мембрани ендотелію кровоносних судин строми і клубочків і базальної мембрани канальців і зовнішнього листка капсули ниркових тілець мезонефронів тільки найбільш каудальних відділів, а в метанефронах - у зародків починаючи з 10-ти тижнів (33-45 мм т-к довжини). КВ II типу виявляються в стромі кінцевої нирки з 11-го тижня (зародки 46-56 мм т-к довжини) розвитку і помітно не збільшуються кількісно і в товщину до кінця вивченого періоду ембріогенезу. В первинній нирці КВ II типу виявляються тільки в регресуючих ділянках.

За допомогою набору недавно виділених в НПК "Лектинотест" (м. Львів) лектинів з вуглеводною специфічністю до всіх можливих моносахаридних залишків, що присутні в глікополімерах людських тканин, нам удалось простежити послідовні етапи морфогенетичних перетворень епітеліальних і мезенхімних закладок МЗН і МТН. Виявлений ефект поступової зміни глікоконюгатів на поверхні і в цитоплазмі клітин в процес їх диференціювання та органної спеціалізації, що відображають послідовність включення різних механізмів диференціювання.

Відомо, що в ембріональному періоді маннозовмісткі глікоконюгати (рецептори Л гороху) відіграють роль у специфічному впізнаванні клітиною її мішенів і в підвищенні міжклітинної адгезії (C.E. Hart, J.G. Wood, 1985; A. Raedler, E. Raedler, 1985, M.M. Brysk, S. Rajaraman, 1986). Закладка мезонефронів первинної нирки не супроводжується експресією рецепторів Л гороху. Маннозоконюгати зявляються у великій кількості тільки під час розквіту мезонефронів. Найбільш богата PSA-позитивним матеріалом цитолема клітин судинних клубочків. Фібробласти періепітеліальної ЕСТ експресують глікополімери з кінцевим залишком альфа-D-маннози в значній кількості на цитолемі. Волокна строми мають місця звязувания Л гороху. Регрес мезонефронів не призводить до повного зникнення фукозоконюгатів в редукованих залишках нефронів. У кінцевій нирці закладка нефронів чотирьох генерацій у вивчений відрізок ембріогенезу супроводжується сильним накопиченням маннозовмістких біополімерів (рецептори Л гороху). КВ також мають термінальні залишки альфа-D-маннози.

Присутність на цитолемі клітин глікоконюгатів з кінцевими залишками N-ацетил-D-галактозаміну (рецептори Л омели білої) багато дослідників звязують з підвищенням агрегаційних характеристик клітин, як в ембріональному, так і в постембріональному періоді онтогенезу (И.В. Твердохлеб, И.С. Шпонька, 1998; А.Д. Луцик та співавт., 1989). Закладка і розквіт нефронів обох вивчених нирок супроводжується експресією рецепторів Л омели білої і карагани, що є N-ацетил-D-галактозаміноконюгатами. Повної відповідності гістотопографії і кількості цих лектинів не спостерігається. Рецепторів Л омели білої більше, ніж карагани. Біополімери з кінцевими нередукованими залишками N-ацетил-D-галактозаміну (рецептори Л карагани) приблизно рівно помірно заповнюють цитоплазму клітин судинних клубочків, зовнішнього листка капсули тілець і канальців. Рецепторів Л омели білої много в цитоплазмі клітин судинних клубочків і на апікальній і базальній поверхні епітелію канальців. КВ III типу мають вуглеводні детермінанти N-ацетил-D-галактозаміну, але є рецепторами тільки Л омели білої. В період розквіту нефронів зростає упорядкованість структур, що призводить до значної експресії N-ацетил-D-галактозаміноконюгатів, які забезпечують адгезію клітин. В процесі регрессії спостерігається розпад упорядкованої структури, можливо, за рахунок редукції рецепторів Л омели білої і карагани.

Закладка мезонефронів МЗН і МТН супроводжується помірним накопиченням глікополімерів з кінцевими нередукованими залишками альфа-L-фукози (рецептори Л ікри окуня) в цитоплазмі клітин клубочків. Волокнистий компонент строми навколо розвитеутих мезонефронів яскраво забарвлюється Л ікри окуня. Регрес нефронів звязаний з редукцією фукозоконюгатів у типових місцях локалізації.

Закладка, розквіт і регрес первинної і кінцевої нирок корелюється з помірним накопиченянм, а потім зменшенням кількості глікополімерів з кінцевими нередукованими залишками N-ацетил-D-глюкозаміну, що є рецепторами Л кореневища кропиви. Клітини ЕСТ синтезують невелику кількість UDA-позитивного матеріалу на цитолемі і малу - в цитоплазмі. Редукція мезонефронів супроводжується зниженням біосинтезу N-ацетил-D-глюкозаміноконюгатів у вище описаних ділянках локалізації, за виключенням апікальної поверхні канальців.

Із літературних джерел відомо, що сіалірування залишків D-галактози поєднано з підвищенням міграційних характеристик клітин (Ю.Р. Якшибаева, 2006; N. Milos, H.C. Wilson, 1986). Разом з тим дозрівання клітин, які міцно контактують між собою, супроводжується зростанням вмісту на їх поверхні залишків D-галактози (M.K. Nemanic, J.S. Whitehead, 1983). Співвідношення D-галактоза / сіалова кислота на поверхні клітин може служити регулятором рівноважної системи адгезія-міграція в складі ранніх зародків (D.W. De Simone, M. Spiegel, 1986; N. Milos, H.C. Wilson, 1986).

Закладка нефронів МЗН і МТН повязана з відсутністю бета-D-галактоконюгатів, що виявляються Л щириці. Розквіт і регрес мезонефронів і формування метанефронів призводить до накопичення великої кількості таких сполук на цитолемі клітин судинних клубочків, базальній поверхні клітин зовнішнього листка капсули тілець і канальців. Клітини ЕСТ обох нирок містить помірну кількість, а цитоплазма - малу кількість місць звязування Л щириці. Дегенерація метанефронів першої і другої генерацій супроводжується зниженням щільності рецепторів лектинів в місцях типової локалізації.

Закладка і розквіт мезо- і метанефронів супроводжується синтезом великої кількості сіалізованих глікополімерів, які є рецепторами Л бузини червоної. Регрес мезонефронів веде до збільшення концентрації місць звязування Л бузини червоної в клітинах судинних клубочків і зниження - в клітинах зовнішнього листка капсули і молодих фібробластах ЕСТ.

Нами отримано, що послідовність експресії і редукції глікополімерів, які є рецепторами Л щириці, кореневища кропиви, ікри окуня і карагани та їх кількість по мірі розвитку зародків в пергі 12 тижнів ембріогенезу в закладках мезонефронів статистично достовірно не відрізняється від такових в закладках метанефронів, а для рецепторів Л гороху, бузини червоної та омели білої статистично достовірно такої закономірності немає.

Дегенерація нефронів перших двох генерацій МТН звязана з редукцією в епітеліальних і мезенхімних закладках сіалоконюгатів (рецептори Л бузини червоної), фукозоконюгатів (рецептори Л ікри окуня), N-ацетил-D-глюкозаміноконюгатів (рецептори Л кореневища кропиви) і N-ацетил-D-галактозаміноконюгатів (рецептори Л омели білої і карагани).

КВ первинної і кінцевої почек мають термінальні залишки альфа-D-маннози (рецептори Л гороху, але не рецептори Л сочевиці). КВ III типу мають вуглеводні детермінанти N-ацетил-D-галактозаміну, але є рецепторами тільки Л омели білої. КВ I типу, які забарвлюють Л ікри окуня, містять залишки альфа-L-фукози в своєму складі.

В МЗН оксифілія клітин, виявлена методом AB&HxE, звязана з наявністю біополімерів і вуглеводними детермінантами альфа-L-фукози (рецептори Л ікри окуня) і N-ацетил-D-глюкозаміну (рецептори Л кореневища кропиви). В кінцевій нирці оксифілія клітин звязана з наявністю біополімерів з вуглеводними детермінантами альфа-D-маннози (рецептори Л гороху), N-ацетил-D-галактозаміну (рецептори Л омели білої) і бета-D-галактози (рецептори Л щириці).

Висновки

У дисертаційній роботі в результаті комплексного дослідження одержані дані щодо закономірностей раннього ембріонального гістогенезу провізорного органу первинної нирки і дефінітивного органу кінцевої нирки людини. На основі морфологічних, імуногістохімічних і лектиногістохімічних методів вперше отримана інформація, яка дозволяє порівняти особливості раннього ембріонального гістогенезу провізирних і дефінітивних органів людини.

1. Вивчення закономірностей органогенезу первинної і кінцевої нирок на морфологічному рівні виявило, що до 7,5 тижнів екскреторна функція виконується мезонефросом. З 8 до 9,5 тижнів найбільшего розвитку досягає МЗН, який забезпечує функцію виділення разом з нефронами першої генерації постійної нирки. Третій період - після 10 тижнів в мезонефросі переважають інволютивні процеси і головним екскреторним органом стає кінцева нирка. До 12 тижнів (зародки 70 мм довжини) постійна нирка має сформовані нефрони чотирьох генерацій, чашечки і миски, петлі нефронів, диференційовані збірні трубочки і сосочкові протоки. Нефрони перших двох генерацій піддаються інволютивним змінам.

2. Особливості проліферації і загибелі клітин провізорного органу (мезонефросу) і дефінітивного органу (метанефросу) в перші 12 тижнів ембріогенезу мають загальні ознаки. Клітини мезо- і метанефронів, що розвиваються, проявляють високу проліферацію та експресію антиапоптотичного гена Bcl-2. Процеси апоптозу і готовності до рецепторного апоптозу знижені. Клітини розвинутих мезо- і метанефронів однаково слабко діляться і гинуть шляхом апоптозу. Антиапоптотичний ген Bcl-2 експресується в невеликій кількості клітин. Клітини з рецепторами CD 95 одиничні. Редуковані мезо- і метанефрони дегенерують за рахунок апоптозу складових їх клітин і знижених процесів проліферації. Індекс готовності до апоптозу теж порівняно високий. Антиапоптотичний індекс малий. Клітини епітелію чашечно-мискової системи та ембріонально сполучної тканини мозкової речовини постійної нирки демонструють процеси проліферації й апоптозу, властиві розвинутим метанефронам.

3. У постійній нирці під капсулою є мало диференційована тканина - метанефрогенна тканина, яка служить джерелом формування нових популяцій метанефронів. Клітини цієї тканини демонструють високу проліферативну здатність і експресію гена Bcl-2.

4. Ембріональний гістогенез мезонефросу на ранніх стадіях розвитку не контролюється статевими гормонами естрогенами і прогестероном. Клітини з рецепторами прогестерону присутні в розвинутих мезонефронах, а клітини з рецепторами естрогенів - в редукованих ділянках первинної нирки. В кінцевій нирці естроген-позитивні клітини постійно присутні в метанефрогенній тканині. У розвинутих метанефронах, так же як і в розвинутих мезонефронах, є прогестерон-позитивні клітини. Тільки у розвинутих метанефронах є клітини з експресією рецепторів до естрогенів. Редукція метанефронів першої і другої генерації супроводжується зменшенням кількості клітин з рецепторами естрогенів. Кількість клітин з рецепторами прогестерону залишається незміненими.

5. Ембріональний гістогенез провізорного органу мезонефросу і дефінітивного органу метанефрону має схожі риси диференціювання сполучнотканинноої строми, що заключається в першочерговому синтезі молодими фібробластами колагенових волокон III типу. Колагенові волокна I типу починають синтезуватися пізніше і повторюють динаміку і гістотопографію колагенових волокон III типу, але їх значно менше. Колагенові волокна IV типу входять до складу базальної мембрани ендотелію кровоносних судин строми і клубочків і базальної мембрани канальців і зовнішнього листка капсули ниркових тілець мезонефронів тільки найбільш каудальних відділів, а в метанефронах - у зародків починаючи з 10-ти тижнів (33-45 мм т-к довжини). Колагенові волокна II типу виявляються в стромі кінцевої нирки з 11-го тижня (зародки 46-56 мм довжини) розвитку і помітно не збільшуються кількісно і в толщину до кінця вивченого періоду ембріогенезу. У первинній нирці колагенові волокна II типу виявляються тільки в регресуючих ділянках.

6. Послідовність експресії і редукції глікополімерів, які є рецепторами лектинів щириці, кореневища кропиви, ікри окуня і карагани та їх кількість по мірі розвитку зародків в перші 12 тижнів ембріогенезу в закладках мезонефронів статистично достовірно не відрізняється від такових в закладках метанефронів, а для рецепторів лектинів гороху, бузини червоної та омели білої статистично достовірно такої закономірності немає. Дегенерація нефронів перших двох генерацій метанефросу звязана з редукцією в епітеліальних і мезенхімних закладках сіалоконюгатів (рецептори Л бузини червоної), фукозоконюгатів (рецептори Л ікри окуня), N-ацетил-D-глюкозаміноконюгатів (рецептори Л кореневища кропиви) і N-ацетил-D-галактозаміноконюгатів (рецептори Л омели білої і карагани).

7. Колагенові волокна первинної і кінцевої нирок мають термінальні залишки альфа-D-маннози (рецептори Л гороху). В складі колагенових волокон III типу присутні вуглеводні детермінанти N-ацетил-D-галактозаміну, що робить їх рецепторами Л омели білої. Колагенові волокна I типу, які забарвлюються Л ікри окуня, містять залишки альфа-L-фукози в своєму складі.

8. У мезонефросі оксифілія клітин звязана з наявністю біополімерів з вуглеводними детермінантами альфа-L-фукози (рецептори Л ікри окуня) і N-ацетил-D-глюкозаміну (рецептори Л кореневища кропиви). В кінцевій нирці оксифілія клітин звязана з наявністю біополімерів з вуглеводними детермінантами альфа-D-маннози (рецептори Л гороху), N-ацетил-D-галактозаміну (рецептори Л омели білої) і бета-D-галактози (рецептори Л щириці).

9. Виходячи з порівняння процесів проліферації і загибелі клітин, диференціювання, спеціалізації та інтеграції клітин і формування колагенової строми, які складають структурні компоненти ембріонального гістогенезу, ембріональний гістогенез провізорного органу - мезонефросу і дефінітивного органу - метанефросу протікає по єдиними законами. Разом з тим присутні й органні особливості розвитку кожного із вивчених органів.

Практичні рекомендації

1. Картування локалізації глікополімерів, які є рецепторами Л, в первинній і кінцевій нирках в нормальному пренатальному розвитку людини може бути використано для ранньої діагностики потенційно злоякісних пухлинних клітин, що дозволить створити доступні лектиногістохімічні тест-системи для онкології і патологічної анатомії.

2. Картування чотирьох типів колагенів у стромі, проліферуючих клітин і клітин в стані апоптозу, клітин з рецепторами Е і П в процесі нормального ембріонального органогенезу МЗН і МТН людини може бути використано для розробки параметрів нормального пренатального органогенезу даних органів при точковому клонуванні.

3. При створенні колагенової пористої структури для вирощування кінцевої нирки із стовбурових клітин необхідно на початку використати колаген III типу, а потім додавати колаген I типу.

4. При вирощуванні кінцевої нирки із стовбурових клітин в культуральне середовище необхідно додавати гормони Е і П, які контролюють розвиток цього органу.

5. Одержані дані можуть бути рекомендовані для практики акушерів і гінекологів, неонатологів, патанатомів, нефрологів і урологів.

Список опублікованих праць за темою дисертації

1. Бойко Т.А. Маннозоконьюгаты в нормальном эмбриогенезе первичной и окончательной почки / Т.А. Бойко, С.В. Жарков, Е.Ю. Шаповалова, С.В. Харченко // Вісник морфології. 2007. Т. 13, № 2. С. 319-323. (Здобувач самостійно зібрана література, ембріони і плоди людини, приготовлені і забарвлені препарати, проведені узагальнення).

2. Бойко Т.А. Гликополимеры с углеводной детерминантой N-ацетил-D-галактозамина участвуют в становлении эпителио-мезенхимных взаимоотношений в раннем пренатальном онтогенезе окончательной почки у человека / Т.А. Бойко, Е.Ю. Шаповалова // Таврический медико-биологический вестник. 2008. Т.11, №3. С.151-154. (Здобувачем самостійно проведений аналіз літератури, зібрані ембріони і плоди людини, приготовлені і забарвлені препарати, зроблені висновки).

3. Бойко Т.А. Особенности биосинтеза полисахаридов и волокнистого каркаса поджелудочной железой и окончательной почкой в раннем эмбриогистогенезе у человека при маточной имплантации / Т.А. Бойко, Е.Ю. Шаповалова, Н.И. Майструк // Таврический медико-биологический вестник. 2008. Т. 11, № 2. С. 182-186. (Здобувачем самостійно зібрана література, ембріони і плоди людини, приготовлені і забарвлені препарати, проведені узагальнення).

4. Бойко Т.А. Особенности биосинтеза и гистотопографии коллагенов I, II, III и IV типов при формировании волокнистого каркаса первичной и окончательной почек у эмбрионов человека / Т.А. Бойко // Світ медицини та біології. 2009. № 3. С. 35-40.