Актуальність теми. В сучасних умовах, як свідчать багаточисленні дані літератури (Ардатська М.Д. і співавт., 2001; Широбоков В.П., 2002; Бондаренко В.М. і співавт., 2003, 2004, 2007; Коршунов В.М. і співавт., 2001; Лобзін Ю.В. і співавт., 2006; Парфенов А.І. і співавт., 2002; Янковський Д.С., 2005), внаслідок дії на організм людини неблагоприємних екологічних, економічних, соціально-психологічних, техногенних і інших чинників великі прошарки населення різних країн мають порушення нормальної мікрофлори, шлунково-кишкового тракту, які часто призводять до розвитку дисбактеріозу.

В даний час дисбактеріоз розглядається як клініко-лабораторний синдром, що характеризується змінами якісного або кількісного складу нормальної мікрофлори організму людини, а також метаболічними, імунологічними і іншими порушеннями, які у частини осіб супроводжуються клінічними проявами (Бережний В.В. і співавт., 2002, 2004; Білько І.П., 2008; Бондаренко В.М. і співавт., 2007). За даними літератури в Україні дисбактеріозами страждає більше 60% населення різних вікових груп.

Для корекції порушень нормальної мікрофлори організму людини, лікування багатьох інфекційних і інших хвороб людини на сьогодні вельми ефективними є пробіотики (Венцковський А.А. і співавт., 2001; Гончар Н.В. і співавт., 2009; Димент Г.С., 2001; Каширська Н.Ю., 2008; Смирнов В.В. і співавт., 2003; Печінка А.М. і співавт., 2007), які вже на протязі десятиріччя розглядаються в якості альтернативи антибіотикам.

Пробіотики - це бактерійні препарати, які містять живі бактеріальні клітини мікроорганізмів, представників нормальної мікрофлори організму людини, призначені для підтримки нормобіоценозу організму людини на фізіологічному рівні.

На фармакологічному ринку України постійно здійснюється інтенсивна реклама препаратів пробіотиків. Але, на жаль, не всі, як свідчить медична практика, бактерійні препарати ефективні. Зокрема, часто реальна кількість життєздатних клітин пробіотичного мікроба, який рекламується в препараті, не відповідає заявленій в інструкції. За даними ряду дослідників (Смирнов В.В. і співавт., 2003; Янковський Д.С., 2005 і ін.) 20 % і більше клітин лактобактерій при ліофільній сушці гине, при цьому у значної їх частини суттєво знижується життєздатність і мікробіологічна активність.

Враховуючи, що кількість життєздатних клітин в пробіотику є його діючим початком, який визначає ефективність бактерійного препарата, зниження кількості живих бактеріальних клітин у ньому ставить під сумнів ефективність його використання у медичній практиці. Для реалізації лікувально-профілактичної дії на організм людини мікробу, який входить до складу пробіотика, необхідно, перш за все, закріпитись (адгезуватись) на клітинах організму людини, подолати його неспецифічні фактори захисту (в першу чергу дію лізоциму, секреторного IgA і інших факторів), здійснити колонізацію і в подальшому проявити притаманну їм антагоністичну активність.

Разом з тим, адгезивна, лізоцимна/антилізоцимна активність пробіотиків, які найчастіше використовуються, ще недостатньо вивчені, особливо в порівняльному аспекті.

Крім того, в інструкціях по використанню пробіотиків відмічається, що вони проявляють антагоністичну активність по відношенню до широкого кола патогенних і умовно патогенних бактерій та грибів, але не вказуються конкретні види цих мікроорганізмів. Тому виникає питання-які з широко рекламуємих і вживаних пробіотиків мають найбільшу антагоністичну активність до відповідних видів мікроорганізмів, тобто які з них є найбільш ефективними?

Як правило, ефективність пробіотика оцінюється лише на основі визначеної in vitro антагоністичної активності клітин мікробів, які входять до складу пробіотика, що, на наш погляд, є недостатнім. Визначення кількості живих клітин мікроорганізма в одній дозі пробіотика, їх адгезивної активності до клітин організма людини, лізоцимної /антилізоцимної і антагоністичної активності є актуальною задачею сучасних досліджень пробіотиків в плані обгрунтування додаткових критеріїв оцінки їх мікробіологічної активності, а також підбору штамів мікроорганізмів для створення нових пробіотиків.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота є фрагментом науково-дослідної роботи Національної медичної академії післядипломної освіти ім.П.Л. Шупика "Порівняльне вивчення антагоністичної, адгезивної, інтерфероногенної й лізоцимної активності пробіотиків вітчизняного і закордонного виробництва (номер державної реєстрації 015U011814). Дисертант є співвиконавцем фрагменту цієї наукової роботи, ним проведено дослідження по вивченню антагоністичної і лізоцимної активності взятих для дослідження пробіотиків.

Тему дисертаційної роботи затверджено на засіданні вченої ради НМАПО ім.П.Л. Шупика (прот. № 7 від 16.06.2007 р.)

Мета і завдання дослідження. Мета - в порівняльному аспекті експериментально вивчити основні біологічні властивості клітин мікроорганізмів (життєздатність, адгезивна, лізоцимна, антилізоцимна і антагоністична активність), які входять до складу найбільш широко розповсюджених пробіотиків; на основі отриманих даних науково обгрунтувати показання для розширення критеріїв оцінки мікробіологічної активності, а відповідно, і оцінки ефективності пробіотиків як бактерійних препаратів.

Для досягнення мети сформульовано наступні завдання:

1. Визначити спектр мікробних складових комерційних препаратів пробіотиків, які найбільш широко використовуються у медичній практиці.

2. Дослідити життєздатність клітин мікроорганізмів, які входять до складу відібраних для дослідження пробіотиків.

пробіотик мікрофлора мікроорганізм корекція

3. Вивчити адгезивну, лізоцимну та протилізоцимну активність клітин мікроорганізмів, які входять до складу взятих для дослідження пробіотиків до клітин організма людини.

4. Вивчити антагоністичну активність мікробних складових комерційних пробіотиків по відношенню до основних представників патогенних і умовно патогенних бактерій, а також грибів роду Candida.

5. Розробити практичні рекомендації щодо критеріїв оцінки мікробіологічної активності пробіотиків та підбору штамів мікроорганізмів для створення нових бактерійних препаратів.

Об`єкт дослідження. Комерційні препарати - пробіотики, патогенні, умовно патогенні грампозитивні і грамнегативні бактерії, гриби роду Candida, еритроцити організму людини.

Предмет дослідження. Біологічні властивості клітин пробіотичних мікроорганізмів, які входять до складу пробіотиків.

Методи дослідження: мікробіологічні, біологічні, статистичні.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше в порівняльному аспекті вивчено основні біологічні властивості пробіотичних мікроорганізмів (життєздатність, адгезивна, лізоцимна, антилізоцимна і антагоністична активність), які входять до складу найбільш широко розповсюджених у медичній практиці пробіотиків і на основі одержаних результатів обгрунтовано показання для розширення критеріїв оцінки мікробіологічної ефективності пробіотиків як бактерійних препаратів і підбору нових штамів пробіотичних мікроорганізмів. Розроблено нові та удосконалено існуючі методики визначення адгезивної, лізоцимної, антилізоцимної і антагоністичної активності мікроорганізмів. Вперше встановлено наявність антагонізму окремих пробіотиків (біфідумбактерин, біоспорін і біфікол) по відношенню до токсигенних коринебактерій дифтерії, що відкриває перспективи використання їх для лікування дифтерії і санації дифтерійного носійства. В період означення пробіотичного напрямку в якості пріоритетного в гуманній та ветеринарній медицині, коли різко інтенсифікується розробка нових пробіотиків та розширюється їх впровадження в практику, вельми важливим є удосконалення методологічних та методичних підступів щодо оцінки їх якості, стандартизації за більш чіткими критеріями, розширення показань до раціонального застосування, що і реалізовано в даній роботі.

Практичне значення одержаних результатів. Проведено доскональне вивчення та поглиблено оцінено 10 комерційних препаратів пробіотиків, що на протязі десятиліть широко використовуються в медичній та ветеринарній практиці, з позицій відповідності основним вимогам нормативно-технічної документації, коректності показань та протипоказань до застосування, клінічної ефективності. Означено високу мікробіологічну активність пробіотичних мікроорганізмів - складових біфідумбактерину, біоспорину, біфіколу, колі - та лактобактеринів. Достатньо висока їх ефективність при корекції дисбіозів в різних екологічних нішах, доведена майже 40 - 50 років тому, зберігається і донині. Однак, розробникам нових серій пробіотиків та виробникам необхідно впроваджувати в практику додаткові критерії оцінки пробіотичних штамів, обов'язково вивчати ступінь їх антагонізму щодо патогенів, враховувати адгезивну, лізоцимну та антилізоцимну активність окремих асоціантів біологічного препарату, про що і свідчать отримані нами результати досліджень. Виробникам пробіотиків рекомендовано на стадії вихідного контролю якості пробіотику враховувати і кількісні показники життєздатності мікробів в офіцінальній формі, що особливо торкається бактерій, що зазнають ліофілізації. Спосіб визначення адгезивної активності мікроорганізмів доведено до практичних мікробіологів та виробників пробіотичних препаратів інформаційними листами № 265-2009 та № 266-2009 МОЗ України.

Матеріали дисертаційної роботи використовуються в навчальному процесі кафедри мікробіології та епідеміології Національної медичної академії післядипломної освіти ім. П.Л. Шупика, кафедри клінічної імунології та мікробіології Харківської медичної академії післядипломної освіти, кафедр мікробіології, вірусології та імунології Національного фармацевтичного університету, Вінницького національного медичного університету ім. М.І. Пирогова та Дніпропетровської медичної академії.

Особистий внесок здобувача. Автор самостійно здійснив інформаційно-патентний пошук, проаналізував наукову літературу та науково-технічну і нормативну документацію щодо випуску пробіотиків, означив мету і завдання дисертаційної роботи, оволодів методами дослідження і виконав в повному об'ємі всі експерименти.

Дисертантом сумісно з науковим керівником означено ідею та критерії додаткового контролю мікробіологічної активності пробіотичних штамів бактерій з використанням методів дослідження антагоністичної активності, ступеню адгезії корисних мікробів в умовах екологічної ніші з порушеною мікроекологією, а також лізоцимної/антилізоцимної їх дії. При дослідженні якісних та кількісних показників життєздатності пробіотичних культур бактерій в офіцінальній формі, готовій до застосування, перш за все після ліофілізації, автором особисто удосконалено мікробіологічні підступи та методики, сумісно з науковим керівником запатентовано оригінальний спосіб визначення антилізоцимної активності мікроорганізмів. Аналіз масиву фактичного матеріалу, висновки і практичні рекомендації сформульовано сумісно з науковим керівником.

Апробація результатів дисертації. Основні наукові положення дисертації оприлюднено на міжнародних науково-практичних конференціях "Актуальні питання стратегії і тактики застосування та дослідження антибіотиків, антисептиків, дезінфектантів" (Вінниця, 2006), "Моніторинг, прогнозування діагностика та профілактика інфекційних хвороб з використанням сучасних методів епізоотології, молекулярної біології та біотехнології" (Феодосія, 2009), ХІІ з`їзді товариства мікробіологів України ім. С.М. Виноградського (Ужгород, 2009 р.), на науково-практичних конференціях молодих вчених Національної медичної академії післядипломної освіти ім. П.Л. Шупика (Київ, 2007), "Актуальні питання гігієни, екології, епідеміології та держсанепіднагляду на сучасному етапі" (Полтава, 2008), "Пошук та розробка нових імунобіологічних препаратів, профілактичних та лікувальних протимікробних засобів, антисептиків, дезінфектантів та пробіотиків" (Харків, 2006), "Шпитальні інфекції: сучасний стан проблеми" (Харків, 2006).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 14 наукових праць (8 одноосібно), в тому числі 5 статей у наукових фахових виданнях, затверджених ВАК України, два патенти України, 2 інформаційні листи, 5 тез у матеріалах конференцій і з`їздів.

Обсяг та структура дисертації. Робота викладена на 153 сторінках і складається із вступу, 8 розділів, в тому числі: огляд літератури, матеріали та методи дослідження, результати власних досліджень, їх аналіз та узагальнення, висновки, практичні рекомендації, містить 11 таблиць і 48 рисунків. Список використаної літератури складається із 210 джерел.

Основний зміст роботи

Матеріали та методи досліджень. В якості основних представників патогенних і умовно патогенних грампозитивних та грамнегативних бактерій і грибів роду Candida для досліджень використано токсигенні штами C. diphtheriae № 4, C. diphtheriae № 9, нетоксигенний штам C. diphtheriae № 1; еталонні штами S. aureus 209 P, M. lysodeikticus, S. sonnei, S. typhimurium, K. pneumoniae (m 28 № 57589), E. coli O111, P. aeruginosa, P. mirabilis і P. vulgaris, C. albicans, C. tropicalis, Candida spp. № 1. Для дослідження взято найбільш широко вживані пробіотики - біоспорин, біфідумбактерин, біфідумбактерин форте, біфікол, колібактерин, лактобактерин, лінекс, наріне, пробіфор, субалін. Надаємо більш детально методичні підступи, використані в роботі, поскільки фактично кожна із методик у відповідній мірі модифікована нами з урахуванням необхідності чіткого означення якісної і кількісної характеристик окремих мікробів та їх асоціацій в складі пробіотику.

Визначення життєздатності клітин пробіотичних мікроорганізмів, які входять до складу взятих для дослідження комерційних препаратів пробіотиків. Кількість життєздатних клітин в одній дозі комерційних препаратів пробіотиків, які в своєму складі містять біфідобактерії (біфідумбактерин, біфідумбактерин форте, біфікол, лінекс, пробіфор) визначали за своєї модифікації наступним чином: із кожної серії відповідного пробіотику досліджували три зразки. Для цього вміст флакона (ампули, пакета) розводили стерильним 0,9% водним розчином натрію хлориду із розрахунку 1 мл розчину на 1 дозу пробіотика. Одержані мікробні суспензії по 1 мл окремими стерильними піпетками переносили в пробірки з 9 мл модифікованого печінкового живильного середовища Блаурокка або живильного середовища на гідролізаті крові і перемішували шляхом піпетування стерильною піпеткою не менше 12-15 разів, отримуючи при цьому 1 дозу біфідобактерій в об`ємі 10 мл живильного середовища. Із цих пробірок окремими стерильними піпетками здійснювали послідовні десятикратні розведення від 10^-1 до 10^-9 мікробних клітин. Пробірки з розведеннями зразків у живильному середовищі вміщували в термостат при температурі 38 ⁰С і інкубували протягом 3-4 діб. Після інкубації відмічали розведення, в яких проявились колонії біфідобактерій у вигляді "зерен" або "гвіздків". Кількість життєздатних клітин біфідобактерій в 1 дозі пробіотику визначали шляхом множення кількості вирослих колоній біфідобактерій на величину розведення мікробної суспензії в даній пробірці. Одержані дані трьох пробірок складали, ділили на 3 і отримували середню кількість життєздатних клітин біфідобактерій в 1 дозі пробіотику.

Паралельно з пробірочним використовувався також чашечний метод. Для цього із одержаних в пробірках серійних послідовних розведень пробіотику (від розведення 10^-1 до розведення 10^-9) окремими стерильними піпетками для кожного розведення, починаючи з найбільшого (10^-9) по 1 мл переносили на поверхню середовища Блаурокка або Мюллера-Хінтона, приготовлених в чашках Петрі, і ретельно розподіляли суміш по поверхні середовища за допомогою стерильного скляного шпателя. Чашки Петрі з посівами вміщували в спеціальний герметичний контейнер, в який попередньо вміщували спеціальний газпакет для створення анаеробних умов для росту біфідобактерій. Контейнер з чашками Петрі і газпакетом вміщували в термостат при 38 ⁰С, інкубували протягом 72 годин, а потім враховували результати. Для цього підраховували кількість вирослих колоній на чашці Петрі з посівом відповідного розведення пробіотика. Кількість вирослих на трьох чашках Петрі колоній при посіві відповідного розведення складали, ділили на 3 і множили на розведення пробіотику. Отримана середня кількість вирослих колоній біфідобактерій приймалась за кількість життєздатних клітин біфідобактерій в 1 дозі пробіотику.

Для визначення кількості життєздатних клітин бацил в 1 дозі пробіотиків біоспорину і субаліну відбирали 3 зразки від кожної серії пробіотиків. Вміст флакона чи ампули розчиняли стерильним 0,9 % водним розчином натрію хлориду із розрахунку 1 мл розчину на 1 дозу пробіотика. Потім окремими стерильними піпетками в окремих стерильних пробірках готовили ряд послідовних десятикратних розведень висхідної суспензії клітин бацил (від 10^-1 до 10^-7) шляхом додавання 0,5 мл висхідної суспензії в 4,5 мл стерильного 0,9 % водного розчину натрію хлориду. Із розведень 10^-6 і 10^-7висівали по 0,1 мл мікробної суспензії на 2 чашки Петрі з м`ясопептонним агаром і ретельно розподіляли суспензію по поверхні агару стерильним шпателем. Чашки Петрі з посівами вміщували в термостат при 37 <sup>0</sup>С, інкубували протягом 24 годин і враховували результати. Для цього підраховували кількість вирослих колоній бацил на м`ясопептонному агарі у двох чашках Петрі з відповідним розведенням висхідної суспензії, складали їх, ділили на 2 і множили на показник розведення. При підрахунку враховували чашки Петрі, на яких виросло не менше 15 колоній.

Для визначення кількості життєздатних клітин E. coli M-17, які входять до складу пробіотиків колібактерину і біфіколу, від кожної серії пробіотику досліджували не менше 3 зразків. В якості живильного середовища використовували середовище Ендо. З метою отримання росту клітин E. coli M-17 у вигляді окремих колоній сухий пробіотик кожної серії розчиняли стерильним 0,9 % водним розчином натрію хлориду окремими стерильними піпетками із розрахунку 1 доза препарата пробіотика в 1 мл розчину. Із основного розведення (10^-1) готували послідовні десятикратні розведення в стерильному 0,9 % водному розчині натрію хлориду в окремих стерильних пробірках окремими стерильними піпетками. При цьому останнє розведення було на порядок більшим, ніж розведення, яке містить вказану в інструкції кількість клітин E. coli M-17 в 1 дозі пробіотика. Із одержаних серійних розведень окремими стерильними піпетками, починаючи з найбільшого розведення, по 0,1 мл наносили на дві чашки Петрі з середовищем Ендо і ретельно розподіляли суспензію клітин кишкової палички по поверхні середовища стерильним шпателем. Посіви вміщували в термостат при 37 ⁰С, інкубували протягом 18-20 годин і враховували результати. При підрахунку кількості вирослих колоній E. coli M-17 враховували чашки Петрі, на яких виросло не менше 15 колоній. Отриману кількість колоній на двох чашках Петрі складали, ділили на 2, множили на відповідне розведення і таким чином визначали кількість життєздатних клітин. Кількість вирослих у трьох зразках препарата пробіотику колоній E. coli M-17 складали і для отримання середнього арифметичного показника ділили на 3. Множення кількості вирослих колоній E. coli M-17 здійснювали на ступінь розведення і на 10, так як посів на чашку Петрі був здійснений в об`ємі 0,1 мл.

Для визначення кількості життєздатних клітин лактобацил, які входять до складу пробіотиків лактобактерину, наріне, лінексу в 1 дозі пробіотику від кожної серії препарату досліджували не менше трьох зразків. При цьому вміст флакона або ампули чи пакета розчиняли стерильним 0,9 % водним розчином натрію хлориду із розрахунку 1 мл розчину на 1 пробіотика. Із одержаної висхідної суспензії окремими стерильними піпетками в окремих стерильних пробірках готували ряд послідовних десятикратних розведень в стерильному 0,9 % водному розчині натрію хлориду від 10^-1 до 10^-7. Із розведень 10^-6 і 10^-7 по 0,1 мл мікробної суспензії окремими стерильними піпетками об`ємом 1 мл наносили на 2 чашки Петрі з агаризованим живильним середовищем МРС-4. Чашки Петрі з посівами вміщували в термостат при 37 <sup>0</sup> С, інкубували протягом 48 годин і враховували результати. При цьому підраховували кількість вирослих колоній лактобацил на двох чашках Петрі з відповідним розведенням мікробної суспензії і для отримання середнього арифметичного показника ділили її на 2, множили на ступінь розведення і на 10, тому що посів здійснювався в об`ємі 0,1 мл.

Визначення адгезивної активності клітин мікроорганізмів, які входять до складу взятих для дослідження пробіотиків. Зважаючи на недоліки існуючих методик визначення адгезивної активності мікроорганізмів до клітин організму людини, для визначення адгезивної активності клітин мікроорганізмів, які входять до складу взятих для дослідження пробіотиків, нами розроблений новий спосіб визначення адгезивної активності мікроорганізмів. У відповідності з ним визначення адгезивної активності клітин мікроорганізмів, які входять до складу взятих для дослідження пробіотиків, здійснювали наступним чином: із культури досліджуваного мікроорганізма, що виросла на щільному агаровому середовищі, готували суспензію клітин у стерильному 0,9 % водному розчині натрію хлориду з концентрацією 10⁹ клітин/мл розчину за оптичним стандартом каламутності.

Із еритроцитарної маси еритроцитів людини 0 (1) групи Rh + готували суспензію еритроцитів у стерильному 0,9% водному розчині натрію хлориду і тричі відмивали її в цьому розчині шляхом центрифугування при 1000 обертів на 1 хвилину протягом 10-15 хвилин. Потім із відмитих еритроцитів готували суспензію в стерильному 0,9 % водному розчині натрію хлориду концентрацією 10⁸ еритроцитів на 1 мл розчину. В стерильну пробірку вносили по 1 мл суспензії клітин досліджуваного мікроорганізма і відмитих еритроцитів людини. Отриману суміш струшували протягом 5-10 хвилин і вміщували в термостат при 37 ⁰С на 60 хвилин. В стерильну чашку Петрі наливали 8-10 мл розплавленого на водяній бані 1-1,5% агарового гелю, приготовленого на 0,9 % водному розчині натрію хлориду, і давали йому застигнути при кімнатній температурі. Потім із застиглого агарового гелю стерильним пінцетом вирізали блок площиною 1-1,5 см², який стерильним пінцетом переносили на стерильне предметне скло в його центр. На блок агарового гелю наносили каплю суміші клітин мікроорганізма і еритроцитів людини, попередньо витриманої при 37 ⁰С, накривали суміш стерильним накривним склом і здійснювали її фазовоконтрастну мікроскопію. При цьому підраховували кількість клітин мікроорганізма, адгезованих на 50 еритроцитах, а потім визначали кількість клітин мікроорганізма, адгезованих на одному еритроциті (індекс адгезії мікроорганізма). Модифікація описаної методики захищена патентом України за № 92976. - 2009.

Визначення лізоцимної активності клітин мікроорганізмів, які входять до складу взятих для дослідження пробіотиків. Зважаючи на те, що існуючі методики визначення лізоцимної активності мікроорганізмів мають ряд недоліків, нами для визначення лізоцимної активності мікроорганізмів, які входять до складу взятих для дослідження пробіотиків, розроблений новий спосіб. Згідно з цим способом визначення лізоцимної активності мікроорганізмів здійснювалось наступним чином: розтоплене на водяній бані агарове живильне середовище, відповідно до ростових особливостей мікроорганізму, по 15-18 мл наливали в стерильну чашку Петрі діаметром 9 см і давали йому застигнути і підсохнути при кімнатній температурі протягом 20-30 хвилин. Після цього на поверхню агаризованого живильного середовища, в його центр, бактеріальною петлею засівали у вигляді диска діаметром 0,8-1,0 см культуру мікроорганізма. Потім, відступивши від краю диска на 1-2 мм, бактеріальною петлею радіальним штрихом підсівали суспезію живих клітин M. lysodeikticus густиною 10⁶ клітин на 1 мл за оптичним стандартом каламутності. Після посіву мікрококів чашку Петрі вміщували в термостат при температурі 37 ⁰С, інкубували протягом 24-36 годин і враховували результати. При цьому наявність зони лізису M. lysodeikticus більше 5-6 мм свідчило про наявність у мікроорганізма лізоцимної активності, а відсутність зони лізису M. lysodeikticus - про її відсутність.

Для визначення лізоцимної активності біфідобактерій, які входять до складу біфідумбактерина, біфідумбактерина форте, біфікола, лінекса і пробіфора чашки Петрі після посіву мікробів у вигляді диска вміщували в герметичний котейнер, в який клали газпакет для створення анаеробних умов, інкубували контейнер в термостаті при 38 ⁰С протягом 48 годин, потім підсівали суспезію M. lysodeikticus, інкубували чашку при 37 ⁰С в аеробних умовах протягом 18-20 годин і враховували результати.

Визначення антилізоцимної активності мікроорганізмів, які входять до складу взятих для дослідження пробіотиків. Для визначення антилізоцимної активності мікроорганізмів, які входять до складу взятих для дослідження пробіотиків, нами розроблено новий спосіб визначення антилізоцимної активності мікроорганізмів, захищений патентом України на корисну модель № 45426. - 2009.

Згідно з цим способом антилізоцимна активність мікроорганізмів, визначалась наступним чином: на щільне живильне середовище, відповідно до ростових особливостей мікроорганізму, приготовленого в чашці Петрі, в центр, накладали стандартний паперовий диск діаметром 0,6 см, внурений у розчин лізоциму (5, 10, 15 мкг лізоцима в 1 мл стерильного 0,9% водного розчину натрію хлориду). Через 25-30 хвилин після накладання диска радіальними штрихами бактеріальною петлею засівали суспензію клітин мікроорганізма в стерильному 0,9 % водному розчині натрію хлориду (концентрація 10⁶ клітин на 1 мл розчину). В якості контроля до диска з лізоцимом підсівалась радіальним штрихом суспензія клітин M. lysodeikticus в концентрації 10⁶ клітин на 1 мл стерильного 0,9% водного розчину натрію хлориду за оптичним стандартом каламутності (негативний антилізоцимний тест) і суспензія клітин S. aureus в аналогічній концентрації (позитивний антилізоцимний тест). Чашку Петрі з посівами аеробних мікроорганізмів вміщували в термостат при температурі 37 ⁰С, інкубували протягом 18-20 годин і враховували результати. При цьому наявність росту мікроорганізма безпосередньо біля краю паперового диска з лізоцимом свідчила про наявність у мікроорганізма антилізоцимної активності, а відсутність росту мікроорганізму на відстані від краю паперового диска з лізоцимом більше 0,5 см - про її відсутність.

При дослідженні антилізоцимної активності анаеробних мікроорганізмів чашку Петрі з посівами вміщували в герметичний контейнер, в який розташовували спеціальний газпакет, який створював анаеробні умови. Контейнер вміщували в термостаті при температурі 38 ⁰С, інкубували протягом 2-3 діб, а потім враховували результати.

Кожний дослід по визначенню антилізоцимної активності мікроорганізмів здійснювався в трьох повторностях. З кожним пробіотичним мікроорганізмом проведено не менше 10 дослідів.

Визначення антагоністичної активності клітин мікроорганізмів, які входять до складу взятих для дослідження пробіотиків. Для вирощування мікроорганізмів, які входять до складу взятих для дослідження пробіотиків, а також тест-штамів грампозитивних, грамнегативних патогенних і умовно патогенних бактерій і грибів роду Candida використовувались загальноприйняті у медичній мікробіології стандартні комерційні живильні середовища. При цьому для вирощування мікроорганізмів (кишкова паличка, лактобацили, ентерококи, аеробні спороутворюючі бацили) використовувався м`ясопептонний агар з додаванням 1% глюкози, а для вирощування біфідобактерій - середовище Блаурокка. Для визначення антагоністичної активності мікроорганізмів по відношенню до коринебактерій в живильні середовища додатково вносили 5 % еритроцитів крові людини або 10% нормальної конячої сироватки. Для вирощування тест-штамів грибів роду Candida використовували стандартне живильне середовище Сабуро.

Всі живильні середовища готували за загальноприйнятими у медичній мікробіології методиками. Суспензію відповідного мікроорганізма для посіву на живильне середовище отримували шляхом розведення сухого пробіотика стерильним 0,9 % водним розчином натрію хлориду у відповідності до інструкції по його використанню.

Вирощування аеробних і факультативноанаеробних мікроорганізмів здійснювали в термостатах при звичайних умовах, а вирощування анаеробних мікроорганізмів (біфідобактерій) - у мікроанаеростатах, в спеціальних герметичних контейнерах, в які вміщували газпакети для створення анаеробних умов, а також модифікованим нами методом Перетца (покриття посіву анаеробного мікроорганізма на щільному живильному середовищі дном або кришкою стерильної пластмасової чашки Петрі одноразового використання діаметром 4 см так, щоб між живильним середовищем і дном/кришкою чашки Петрі не було пухирьків повітря).

Посів суспензій мікроорганізмів на середовища здійснювали двома методами: - посів суспензії мікроорганізму на поверхню середовища в чашці Петрі бактеріальною петлею діаметром 3 мм частими густими штрихами від одного краю чашки Петрі до її протилежного краю, тобто по діаметру чашки Петрі ("полоскою"); - посів суспензії мікроорганізма частими густими штрихами в центр середовища у вигляді бляшки діаметром 3,0-3,5 см (посів "диском"). Посіви мікроорганізмів інкубували при 37 ⁰С протягом 72 годин, а потім, відступивши від краю росту мікроорганізма на 1-2 мм підсівали радіальними штрихами суспензії культур тест-штамів грампозитивних, грамнегативних патогенних умовно патогенних бактерій і грибів роду Candida, взятих для дослідження. Для цього із свіжевирослих на середовищах культур тест-штамів мікроорганізмів готовили суспензії їх клітин в стерильному 0,9% водному розчині натрію хлориду, які містили не менше 10⁶ клітин в 1 мл розчину за оптичним стандартом каламутності. Після посіву тест-штамів мікроорганізмів середовища з культурами вирослих мікроорганізмів і підсіяними до них суспензіями тест-штамів мікроорганізмів або грибів роду Candida інкубували в термостаті при звичайних умовах при 37 ⁰С протягом 24 годин, а потім враховували результати. Наявність чи відсутність антагоністичної активності у мікроорганізмів по відношенню до відповідного тест-штама мікроорганізма визначали шляхом виміру зони затримки росту відповідного тест-штама в мм. Кожний дослід по визначенню антагоністичної активності мікроорганізма ставився в трьох повторностях. З кожним мікроорганізмом проведено не менше 10 дослідів.

Проведені нами дослідження по визначенню антагоністичної активності мікроорганізмів методом відстрокового антагонізму показали, що суттєвим недоліком цього методу є те, що він не дозволяє визначати антагоністичну активність рухливих клітин мікроорганізмів (аеробних спороутворюючих бацил - B. subtilis і B. licheniformis) внаслідок того, що ці мікроорганізми при рості, рухаючись по поверхні живильного середовища, покривають всю або більшу частину його поверхні, що не дозволяє підсівати перпендикулярними штрихами культури тест-штамів мікроорганізмів і. тим самим, визначати зони затримки їх росту пробіотичним мікроорганізмом. З метою усунення цього недоліка нами розроблений модифікований спосіб визначення антагоністичної активності рухливих клітин мікроорганізмів шляхом попередньої їх імобілізації в агаризованому живильному середовищі. Розроблений спосіб здійснювався наступним чином: в розтоплене на водяній бані агаризоване живильне середовище, охолоджене до 45-50 ⁰С, вносили культуру клітин рухливого мікроорганізма і розмішували її в середовищі. Після цього одержану суспензію клітин мікроорганізма виливали в стерильну чашку Петрі і давали середовищу застигнути при кімнатній температурі. При цьому досягалась імобілізація рухливих клітин мікроорганізма в середовищі. Після цього із пластини середовища з імобілізованими в ньому рухливими клітинами мікроорганізма свердлом для пробок діаметром 3 см виштамповували диск, який виймали стерильним скальпелем і накладали його на середовище в чашці Петрі без мікроорганізмів, в його центр так, щоб між диском і середовищем не було пухирьків повітря. Потім чашку Петрі з середовищем і диском інкубували в термостаті при 37 ⁰С протягом 48-72 годин. При цьому ріст рухливих клітин мікроорганізма відмічався тільки в межах диску. Після цього перпендикулярно диску з вирослим пробіотичним мікроорганізмом, відступивши від краю диска 1-2 мм радіальними штрихами засівали тест-штами мікроорганізмів. Чашку Петрі після посіву тест-штамів мікроорганізмів інкубували в термостаті при 37 ⁰С протягом 24 годин і враховували результати шляхом виміру зони затримки росту тест-штама мікроорганізма в мм. Головною перевагою розробленого способу визначення антагоністичної активності мікроорганізмів, порівняно з існуючим методом відстрокового антагонізму, є те, що він дозволяє визначати антагоністичну активність рухливих клітин мікроорганізмів. На розроблений спосіб визначення антагоністичної активності мікроорганізмів отримано посвідчення на раціоналізаторську пропозицію № 3148.

Результати досліджень та їх обговорення. Результати по визначенню кількості життєздатних клітин пробіотичних мікроорганізмів, які входять до складу взятих для дослідження пробіотиків, вказують на те, що не всі серії пробіотиків містять в 1 дозі ту кількість живих клітин мікроорганізма, яка вказана в інструкції. Виходячи з того, що кількість живих клітин мікроорганізма в 1 дозі пробіотика визначає його якість як бактерійного препарата, встановлена розбіжність кількості живих клітин мікроорганізмів у різних серіях пробіотика і це слугує основою необхідності суворого контролю за кількістю живих клітин мікроорганізмів як у біомасі мікроорганізмів перед виготовленням серії пробіотика із неї, так і перед випуском кожної серії пробіотика для реалізації, а також в процесі транспортування і збереження пробіотика.

Проведені дослідження визначили також відсутність у складі пробіотика "пробіфор" необхідної кількості життєздатних клітин біфідобактерій, що робить цей пробіотик неефективним і тому він не може бути рекомендований для використання у медичній практиці.

Результати по визначенню індексів адгезії клітин пробіотичних мікроорганізмів, взятих для дослідження пробіотиків, до еритроцитів людини 1 групи (Rh +) приведені в табл.1.

Дані табл.1 оцінювались наступним чином: при індексі адгезії від 0 до 1,75 мікроорганізми вважались неадгезивними; від 1,76 до 2,5 - низкоадгезивними; від 2,51 до 4,0 - середньоадгезивними, а більше 4,0 - високоадгезивними.

Таким чином дані табл.1 свідчать, що пробіотики біфідумбактерин, біфікол і лактобактерин є високоадгезивними; пробіотики біоспорин, біфідумбактерин форте, лінекс і субалін - середньоадгезивними; пробіотики колібактерин, наріне, пробіфор - неадгезивними.

Таблиця 1. Індекси адгезії клітин пробіотичних мікроорганізмів, взятих для дослідження комерційних пробіотиків, до еритроцитів людини 1 групи (Rh+)

Отримані дані по вивченню адгезивної активності взятих для дослідження 10 пробіотиків дозволяють зробити висновок про те, що перед виготовленням пробіотика шляхом ліофілізації необхідно визначати адгезивну активність мікроорганізмів, які входять до складу пробіотика, і готувати пробіотик тільки із штамів мікроорганізмів, які мають високу або середню адгезивну активність.

Результати проведенного дослідження по визначенню лізоцимної активності клітин мікроорганізмів, які входять до складу взятих для дослідження пробіотиків, приведені в табл.2.

Із даних табл.2 видно, що клітини мікроорганізмів, які входять до складу пробіотиків біоспорину, колібактерину, лактобактерину і субаліну володіють лізоцимною активністю, а клітини мікроорганізмів, які входять до складу пробіотиків біфідумбактерину, біфідумбактерину форте, біфіколу, лінексу, наріне, пробіфору не мають лізоцимної активності.

Із результатів проведених досліджень по визначенню лізоцимної активності клітин мікроорганізмів взятих для дослідження пробіотиків можна зробити висновок про те, що при підборі нових штамів пробіотичних мікроорганізмів для створення нових пробіотиків перевагу слід надавати тим штамам мікроорганізмів, які мають лізоцимну активність, тому що наяність лізоцимної активності буде сприяти адгезії мікроорганізму на слизовій оболонці шлунково-кишкового тракту організму людини за рахунок подолання його неспецифічних факторів захисту.

Таблиця 2. Лізоцимна активність клітин пробіотичних мікоорганізмів, які входять до складу взятих для дослідження комерційних препаратів пробіотиків

Результати дослідження по визначенню антилізоцимної активності мікроорганізмів, які входять до складу взятих для дослідження пробіотиків, приведені в табл. 3.

Таблиця 3. Антилізоцимна активність пробіотичних мікроорганізмів, які входять до складу взятих для дослідження комерційних препаратів пробіотиків

Дані табл.3 вказують, що клітини мікроорганізмів, які входять до складу пробіотиків біоспорину, біфідумбактеріну, біфідумбактерину форте, біфіколу, субаліну мають антилізоцимну активність, а клітини мікроорганізмів, які входять до складу пробіотиків колібактерину, лактобактерину, лінексу, наріне, пробіфору не мають антилізоцимної активності.

Із одержаних результатів проведених досліджень по визначенню антилізоцимної активності мікроорганізмів, які входять до складу взятих для дослідження пробіотиків, можна зробити висновок про те, що при підборі нових штамів мікроорганізмів для створення нових пробіотиків слід визначати їх антилізоцимну активність, так як антилізоцимна активність є одним із критеріїв оцінки їх мікробіологічної активності (в плані приживлення в організмі людини) і віддавати перевагу тим штамам, які мають антилізоцимну активність.

Результати по визначенню антагоністичної активності клітин мікроорганізмів, які входять до складу взятих для дослідження пробіотиків по відношенню до тест-штамів основних представників патогенних і умовно патогенних грампозитивних бактерій, приведено в табл. 4.

Таблиця 4. Антагоністична активність клітин пробіотичних мікроорганізмів, які входять до складу взятих для дослідження комерційних препаратів пробіотиків по відношенню до тест-штамів основних представників патогенних і умовно патогенних грампозитивних бактерій

Із даних табл.4 видно, що найбільшу антагоністичну активність по відношенню до взятих для дослідження тест-штамів коринебактерій мають клітини мікроорганізмів, які входять до складу пробіотиків біоспорину, біфідумбактерину, субаліну і біфіколу; слабку - біфідумбактерину форте, лінексу і пробіфору, а у пробіотиків колібактерин, лактобактерин і наріне антагоністична активність по відношенню до тест-штамів коринебактерій відсутня. При дослідженні антагоністичної активності було визначено, що по відношенню до S. aureus 209 P найбільшу антагоністичну активність мають клітини мікроорганізмів біоспорину, біфідумбактерину, біфіколу і колібактерину, а по відношенню до M. lysodeikticus - біоспорину, біфідумбактерину, біфіколу, колібактерину і субаліну; клітини мікроорганізмів біфідумбактерину форте, лінексу, пробіфору по відношенню до S. aureus 209 P і M. lysodeikticus виявляють слабку антагоністичну активність.

Дані по визначенню антагоністичної активності клітин мікроорганізмів, які входять до складу взятих для дослідження пробіотиків по відношенню до тест-штамів основних представників патогенних і умовно патогенних грамнегативних бактерій, приведено в табл. 5.

Таблиця 5. Антагоністична активність клітин пробіотичних мікроорганізмів, які входять до складу взятих для дослідження пробіотиків по відношенню до тест-штамів основних представників патогенних і умовно патогенних грамнегативних бактерій

Із даних табл.5 видно, що біоспорин проявляє слабку антагоністичну активність по відношенню до тест-штамів S. sonnei, S. flexneri, E. coli, K. pneumoniae, P. aeruginosa і не має антагоністичної активності по відношенню до тест-штамів S. typhimurium, P. vulgaris, P. mirabilis.

Біфідумбактерин має виражену антагоністичну активність по відношенню до тест-штамів S. typhimurium, E. coli, P. mirabilis і не виявляє антагоністичної активності по відношенню до тест-штамів S. sonnei, S. flexneri, K. pneumoniae, P. aeruginosa, P. vulgaris.

Біфідумбактерин форте проявив незначну антагоністичну активність по відношенню до тест-штамів S. sonnei, S. flexneri, S. typhimurium, K. pneumoniae і не мав антагоністичної активності по відношенню до тест-штамів E. coli, P. vulgaris, P. mirabilis, P. aeruginosa.

Біфікол проявив антагоністичну активність по відношенню до тест-штамів S. typhimurium, E. coli, P. vulgaris і не мав антагоністичної активності по відношенню до тест-штамів S. sonnei, S. flexneri, K. pneumoniae, P. mirabilis.

Колібактерин проявив антагоністичну активність по відношенню до тест-штамів S. typhimurium, E. coli, P. mirabilis, P. aeruginosa і не мав антагоністичної активності по відношенню до тест-штамів S. sonnei, S. flexneri, K. pneumoniae, P. vulgaris.

Лактобактерин проявив низьку антагоністичну активність по відношенню до тест-штамів S. typhimurium, E. coli і не мав антагоністичної активності по відношенню до тест-штамів S. sonnei, S. flexneri, K. pneumoniae, P. mirabilis, P. vulgaris, P. aeruginosa.

Лінекс практично не мав антагоністичної активності по відношенню до тест-штамів грамнегативних бактерій. Незначна антагоністична активність лінекса по відношенню до тест-штамів S. typhimurium, E. coli, P. aeruginosa не відповідає необхідній антагоністичній активності (не менше 5 мм).

Наріне проявив незначну антагоністичну активність по відношенню до тест-штамів S. sonnei, S. flexneri, E. coli, S. typhimurium і не мав антагоністичної активності по відношенню до тест-штамів K. pneumoniae, P. mirabilis, P. vulgaris, P. aeruginosa.

Пробіфор проявив значну антагоністичну активність по відношенню до тест-штамів S. sonnei, S. flexneri, K. pneumoniae, слабки до P. mirabilis, E. coli і не мав антагоністичної активності по відношенню до тест-штамів S. typhimurium, P. vulgaris, P. aeruginosa.

Субалін має високу антагоністичну активність по відношенню до тест-штамів S. flexneri, E. coli; незначну - до S. sonnei, K. pneumoniae, P. aeruginosa і не має антагоністичної активності по відношенню до тест-штамів S. typhimurium, P. vulgaris, P. mirabilis.

Проведені дослідження показали також, що ні один із взятих для дослідження пробіотиків не проявив антагоністичної активності по відношенню до тест-штамів грибів роду Candida.

Тобто, найбільшу антагоністичну активність по відношенню до тест-штамів основних представників патогенних і умовно патогенних грампозитивних бактерій мають клітини пробіотичних мікроорганізмів, які входять до складу комерційних пробіотиків біоспорину, біфідумбактерину, біфіколу, а по відношенню до тест-штамів основних представників патогенних і умовно патогенних грамнегативних бактерій - біфідумбактерину, біфіколу, колібактерину. Одночасну антагоніститчну активність по відношенню до тест-штамів основних представників патогенних і умовно патогенних як грампозитивних, так і грамнегативних бактерій мають клітини мікроорганізмів, які входять до складу пробіотиків біфідумбактерину і біфіколу. Клітини мікроорганізмів, які входять до складу всіх 10 взятих для дослідження комерційних препаратів пробіотиків, не мають належної антагоністичної активності по відношенню до тест-штамів грибів роду Candida.

Висновки