Размещено на http://www.allbest.ru/

ОДЕСЬКИЙ ДЕРЖАВНИЙ АГРАРНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

УДК 619:616:98:579.873.21:636.2

ОЦІНКА БАКТЕРІОЛОГІЧНИХ МЕТОДІВ ДІАГНОСТИКИ ТУБЕРКУЛЬОЗУ

16.00.03 - ветеринарна мікробіологія, епізоотологія,

інфекційні хвороби та імунологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата ветеринарних наук

КУЛІШЕНКО ОЛЕГ МИКОЛАЙОВИЧ

Одеса - 2010

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Дніпропетровському державному аграрному університеті Міністерства аграрної політики України.

Науковий керівник: доктор ветеринарних наук, професор,

Ткаченко Олексій Андрійович,

Дніпропетровський державний аграрний університет,

завідувач кафедри епізоотології та інфекційних хвороб

Офіційні опоненти: доктор ветеринарних наук,

Кочмарський Віктор Андрійович,

Харківська державна зооветеринарна академія,

професор кафедри епізоотології та ветеринарного менеджменту

доктор ветеринарних наук,

член Нью-Йоркської академії наук,

Рухляда Валентин Васильович,

Білоцерківський національний аграрний університет,

завідувач кафедри мікробіології і вірусології

Захист відбудеться «__» ________ 2010 р. о __ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради К 41.372.01 в Одеському державному аграрному університеті за адресою: 65012, м. Одеса, вул. Пантелеймонівська, 13, навчальний корпус №3, ауд 306.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Одеського державного аграрного університету за адресою: 65039, м. Одеса, пер. Матросова, 6.

Авотреферат розісланий «__» _________ 2010 р.

Вчений секретар спеціалізовоної вченої ради,

кандидат ветеринарних наук, доцент С.І. Масленікова

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Основними причинами довготривалого неблагопо-луччя окремих регіонів та господарств України з туберкульозу є не тільки незадовільне виконання спеціальних організаційно-господарських й ветери-нарно-санітарних протитуберкульозних заходів, а й відсутність достеменних знань щодо біології збудника, зокрема його можливостей конверсії й реверсії L-форми та значення цих форм в інфекційному та епізоотичному процесах (Кассіч Ю., Завгородній А., 2002; Ситник В., 2003; Ткаченко О.А., 2004, 2005, 2007).

У зв'язку з цим, якість лабораторної діагностики суттєво впливає на ефективність заходів з профілактики та оздоровлення тваринництва від тубер-кульозу. Бактеріологічні методи, які нині використовуються для діагностики цієї хвороби (бактеріоскопічний, культуральний, біологічний) як у ветери-нарній так і у гуманній медицині, мають низку недоліків (Буряк Є.І., 2006; Дяченко Г., 2006). Результати бактеріологічного дослідження на туберкульоз багато у чому залежать від обраного методу передпосівної обробки біологіч-ного матеріалу, від збалансованості живильного середовища за поживними речовинами (Кочмарський В.А., 1997, 2003; Ткаченко О.А., 1998; Боганец Н.С., 2006). Живильних середовищ нараховується велика кількість, що обґрунтовує необхідність оцінки та удосконалення окремих з них.

Останнім часом з'явилися повідомлення про можливість використання речовин гумінового походження для покращення методів бактеріологічної діагностики туберкульозу (Нуратинов Р.А., 2004; Павлов Н.Г., 2006), так як про вплив гумінових речовин на інтенсивність розмноження мікобактерій та зміну їх ліпідного складу під дією цієї речовини, у вітчизняних публікаціях прак-тично не повідомляється.

Тому обрана тема дослідження потребує поглибленого вивчення та ана-лізу.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисер-тація є розділом теми науково-дослідної роботи кафедри епізоотології та інфек-ційних хвороб Дніпропетровського державного аграрного університету „Вив-чення епізоотології та інфекційного процесу туберкульозу, мікобактеріозної інфекції великої рогатої худоби та вдосконалення методів діагностики” та „Роз-робка системи профілактики та боротьби з туберкульозом тварин, викликаного епізоотичним швидкорослим штамом M. bovis”, № державної реєстрації 0106 V 009573.

Мета та завдання роботи.

Метою досліджень було удосконалення бактеріологічного методу діаг-ностики туберкульозу.

Для досягнення мети, поставлені завдання, до яких входило:

* вивчення епізоотичної ситуації щодо туберкульозу великої рогатої худоби у Дніпропетровській області (2000-2007 рр.) та вивчення ефективності тради-ційного бактеріологічного методу діагностики туберкульозу;

* виділення епізоотичних штамів мікобактерій та атипових мікобактерій з біологічного матеріалу від великої рогатої худоби з неблагополучних та бла-гополучних щодо туберкульозу господарств та вивчення їх біологічних влас-тивостей;

* порівняння ефективності методів передпосівної обробки біологічного матеріалу та живильного середовища для культивування мікобактерій;

* виготовлення та апробація експериментальних варіантів удосконаленого щільного живильного середовища з додаванням гідрогумату для культиву-вання мікобактерій;

* дослідження ефективності застосуваня удосконаленого живильного сере-довища у комплексі лабораторних досліджень;

* вивчення впливу гідрогумату на ліпідний склад штамів мікобактерій.

Об'єкти дослідження: епізоотичні та музейні штами M. bovis та атипові мікобактерії.

Предмети дослідження: збудники туберкульозу та атипові мікобактерії, визначення культуральних, біохімічних, вірулентних, сенсибілізуючих власти-востей мікобактерій; гідрогумат та ліпіди мікобактерій.

Методи дослідження: бактеріологічний, патологоанатомічний, алергіч-ний, біохімічний, біологічний; тонкошарова та газорідинна хроматографія (для вивчення ліпідного складу мікобактерій); статистичний (для обчислення та ста-тистичної обробки одержаних результатів досліджень за допомогою Microsoft Office Excel 2003) та методикою Плохинского Н.А., 1970.

Наукова новизна одержаних результатів.

Встановлено, що найбільш ефективним методом є метод ферментативного збагачення біологічного матеріалу при підготовки суспензії до посіву.

Впровадження запропонованого живильного середовища для культиву-вання мікобактерій, яке містить у своєму складі 0,125 % розчин гідрогумату, сприятиме підвищенню ефективності бактеріологічної діагностики туберку-льозу.

Вперше в Україні проведено дослідження ліпідного складу штамів міко-бактерій, вирощених на щільному середовищі з додаванням 0,125% розчину гідрогумату. Встановлено, що гідрогумат у складі живильного середовища для культивування мікобактерій діє як адаптоген і сприяє росту на щільному яєчному середовищі за рахунок зменшення вмісту ненасичених жирних кислот та збільшення вмісту насичених жирних кислот.

Новизна розробки підтверджена патентом України № 28293 на корисну модель «Живильне середовище для культивування мікобактерій».

Практичне значення одержаних результатів. Запропоноване живильне середовище може бути використано в практиці бактеріологічної діагностики туберкульозу. Методика виготовлення та застосування удосконаленого живиль-ного середовища з гідрогуматом увійшла до посібника з лабораторної діагнос-тики туберкульозу тварин, який затверджений та прийнятий до впровадження у практику ветеринарної медицини Державним комітетом ветеринарної меди-цини України (протокол №1 від 23-24.12.2009 року) та затверджений науково-методичною радою факультету ветеринарної медицини Дніпропетровського державного аграрного університету.

Матеріали дисертації використовуються в навчальному процесі, зокрема науково-педагогічним складом кафедри епізоотології та інфекційних хвороб ДДАУ на лекційних курсах та на лабораторно-практичних заняттях з мікро-біології та епізоотології.

Особистий внесок здобувача. Автор дисертації самостійно вивчив усі доступні наукові літературні джерела за темою науково-дослідної роботи, провів аналіз даних офіційної звітності частоти виявлення мікобактерій з проб біологічного матеріалу бактеріологічним методом, зробив математичну обробку отриманих даних та оформив дисертацію. Експериментальну частину досліджень, автор виконав, за участі співробітників кафедри епізоотології та інфекційних хвороб Дніпропетровського державного аграрного університету та НДІ біології Дніпропетровського національного університету. Виділення штамів мікобактерій з проб біологічного матеріалу та їх дослідження проводили за безпосередньої участі доктора ветеринарних наук, професора О.А. Ткаченка, аспіранта кафедри епізоотології та інфекційних хвороб В.В. Глебенюка, вивчення ліпідного складу штамів мікобактерій під керівництвом кандидата біологічних наук, доцента І.О. Філоник за що автор роботи вислов-лює їм щиру подяку.

Окрема подяка висловлюється кандидату біологічних наук, професору ДДАУ Л.М. Степченко за люб'язно наданий для дослідження гідрогумат.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації обговорювалися на засіданнях кафедри епізоотології та інфекційних хвороб ДДАУ під час звіту аспірантів про виконану роботу, а також доповідалися на науково-практичних конференціях: “Перспективи розвитку ветеринарної медицини України”, присвяченої 10-річчю заснування факультету ветеринарної медицини Лугансь-кого НАУ (26 - 28 вересня 2007 року, м. Луганськ); “Проблеми зооінженерії та ветеринарної медицини”, присвяченої 100-річному ювілею кафедри мікробіо-логії та біотехнології Харківської державної зооветеринарної академії (27 - 29 листопада 2007 року м. Харків).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 5 наукових праць у фахових виданнях, затверджених ВАК України, та отримано патент України на корисну модель живильне середовище для культивування мікобактерій.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота включає вступ, огляд літератури, матеріали та методи виконання роботи, результати власних досліджень, обговорення результатів досліджень, додатки та список вико-ристаних джерел. Робота викладена на 158 сторінках комп'ютерного набору, проілюстрована 24 таблицями та 22 рисунками. Список використаних джерел включає 265 найменування, у тому числі 46 іноземних.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ

Роботу виконували у навчально-дослідній лабораторії кафедри епізоото-логії та інфекційних хвороб Дніпропетровського державного аграрного уні-верситету у період з 2004 по 2008 рр.

З метою аналізу епізоотичної ситуації щодо туберкульозу великої рогатої худоби у Дніпропетровській області у період з 2000 по 2007 рр. вивчали та аналізували річні звіти офіційної статистики про кількість неблагополучних пунктів щодо туберкульозу та реагуючих на ППД-туберкулін для ссавців тварин. У деяких випадках, для більшої точності і оцінки ситуації, безпосе-редньо у господарстві проводили алергічні дослідження великої рогатої ху-доби з використанням ППД-туберкуліну для ссавців.

Для вивчення бактеріологічної ефективності традиційних методів діаг-ностики використовували офіційні статистичні дані по Дніпропетровській області. З цією метою проаналізували річні звіти державної служби ветери-нарної медицини з 2000 по 2007 рр.

Передпосівну обробку біологічного матеріалу від великої рогатої худоби (лімфатичні вузли), реагуючої на ППД- туберкулін для ссавців, здійснювали за методиками В.М. Матузенка зі співавт., А.П. Алікаєвої, Гона-Левенштейна-Суміоші, флотації та комбінації методів В.М. Матузенка, А.П. Алікаєвої, Гона-Левенштейна-Суміоші з флотацією та методом флотації.

Для вивчення біологічних властивостей мікобактерій використовували епізоотичні M. bovis та швидкорослі атипові мікобактерії, виділені з лімфа-тичних вузлів великої рогатої худоби, реагуючої на ППД-туберкулін для ссав-ців.

У дослідженнях було використано 17 штамів мікобактерій 12 виділених під час дослідження проб біологічного матеріалу (дев'ять M. bovis та три ати-пові мікобактерії), а також п'ять музейних штамів M. bovis - «Шахтар», № 1034, 41 та атипові мікобактерії № 41, 21.

У виділених культур мікобактерій вивчали такі властивості: час появи перших колоній та їх середню кількість на щільних яєчних живильних сере-довищах; морфологічні властивості колоній (розмір, форму, краї колоній, колір); каталазну та пероксидазну активність за методикою Г.Н. Першина, Зикової Т.Н. (1958); ріст на середовищі з додаванням 0,5-1,0 мг/см3 натрію саліцилату згідно з настановою по лабораторній діагностиці туберкульозу (Матузенко В.М., Троценко З.Р. та ін., 1994). Тинкторіальні властивості ви-ділених мікобактерій досліджували шляхом фарбування мазків за методом Ціль-Нільсена з подальшою мікроскопією за допомогою мікроскопів Біолам Л-211 та Sunny.

Вивчення патогенних властивостей проводили на морських свинках, а у деяких випадках, для уточнення виду мікобактерій, - на кролях та курях. Ви-раженість патологоанатомічних змін та їх ступінь визначали за методикою Триус М.С. (1973). Усього для біологічних досліджень було використано 76 морських свинок, шість кролів та шість курей.

Для встановлення впливу гідрогумату на розмноження видів мікобактерій попередньо досліджували вплив його в різних концентраціях. Дослідження впливу гідрогумату в оптимальній концентрації здійснювали шляхом різно-варіантних досліджень з культурами мікобактерій та пробами біологічного матеріалу. Як контрольні використовували середовища Мордовського та ДП «Ветеринарна медицина», м. Харків.

Накопичення біологічної маси M. bovis та атипових мікобактерій, для вив-чення їх ліпідного складу здійснювали на базі навчально-дослідної лабораторії кафедри епізоотології та інфекційних хвороб Дніпропетровського державного аграрного університету. Дослідження ліпідного складу мікобактерій проводили у НДІ біології Дніпропетровського національного університету під безпосеред-нім керівництвом кандидата біологічних наук Філоник І.О., за що висловлюємо їй щиру вдячність.

Для накопичення біомаси мікобактерій використали живильне середо-вище для культивування мікобактерій (з 0,125%-вим розчином гідрогумату) та середовище Мордовського.

Виділення загальних ліпідів із зразків біомаси мікобактерій проводили за методикою Фолча в модифікації Блайя-Дайєра для мікробіологічних проб (Кейтс М., 1975).

Фракційний склад ліпідів вивчали за методом тонкошарової хромато-графії (ТШК) на селікагелевих пластинках Silufol (Чехія), попередньо зне-жирених перегоненим ацетоном та інактивованих за температури 100 °С про-тягом години, у системі розчинників - гексан:діетиловий ефір: метанол: льо-дяна оцтова кислота у співвідношенні 9:2:0,2:0,3 (Кейтс М., 1975).

Компонентний склад фракцій вільних жирних кислот (ВЖК) у зразках біомаси мікобактерій, культивованих на різних середовищах, проводили, за методом газорідинної хроматографії (ГРХ) на газовому хроматографі Chrom-5 („Laboratorni Pristroje“, Чехія) після попереднього метилювання. Аналіз зразків метилових ефірів жирних кислот проводили за таких умов: колонка L=1 м Ч4 мм, на сорбенті Хроматон N-Super з 5 % SP 2100 (0,16 - 0,20 мм). Температуру колонки програмували від 180 до 270 °С зі швидкістю нагрі-вання 5 °С/хв; температура випаровування становила 200 °С, детектора - 230 °С, газ-носій - азот (осч), полуменево-іонізаційний детектор (Кейтс М., 1975). Розрахунки та статистичну обробку результатів досліджень здійсню-вали за допомогою персонального комп'ютера в електронних таблицях Excel Microsoft Office 2003.

РЕЗУЛЬТАТИ ВЛАСНИХ ДОСЛІДЖЕНЬ

Епізоотична ситуація щодо туберкульозу великої рогатої худоби у Дніпропетровській області у період з 2000 по 2007 рр. Аналізуючи матеріали звітності за досліджуваний період, встановлено, що епізоотична ситуація щодо туберкульозу великої рогатої худоби у Дніпропетровській області була досить напруженою. За звітний період в області зареєстровано 18 неблагополучних пунктів, з цього захворювання. Середня кількість реагуючого на ППД-тубер-кулін для ссавців поголів'я серед усіх досліджених тварин становила 2,28-13,96 %, у тому числі реагуючих корів - 1,00 -17,08 %.

Різну кількість реагуючих тварин можна обумовити складністю прояву інфекційного та напруженістю епізоотичного процесів, патогенними та віру-лентними властивостями збудника туберкульозу, а також тривалістю небла-гополуччя господарства. Наприклад, у господарствах, де неблагополуччя тривало до двох років, реагуючих на ППД-туберкулін тварин було 0,98-37,00 %, у тому числі корів 1,06-49,60 %, а у господарствах, де туберкульоз тварин реєструвався шість років, кількість реагуючих склала 1,28-16,50 % від дос-ліджених тварин, у тому числі корів 1,04-7,39 %. Досліджуючи алергічно поголів'я великої рогатої худоби благополучного щодо туберкульозу НДГ „Самарський” Дніпропетровського державного аграрного університету, було встановлено, що велика рогата худоба цього господарства реагувала на ППД-туберкулін для ссавців, але у значно меншій кількості (0,47-5,02 %). На діаг-ностичному забої усіх реагуючих тварин цього господарства характерних для туберкульозу патологоанатомічних ознак невиявнено, а за культурального дос-лідження виділено три культури атипових мікобактерій.

Частота виділення мікобактерій з біологічного матеріалу від великої рогатої худоби Дніпропетровської області. За даними відділу по боротьбі з туберкульозом Дніпропетровської державної обласної лабораторії ветеринарної медицини, середня ефективність виділення культур мікобактерій з проб біологічного матеріалу з 2000 по 2007 рр. склала 5,64 %. Культури мікобактерій виділяли без будь-яких закономірностей. Так з досліджених проб матеріалу виділено культур мікобактерій у 2000 році з 144 в 4,16 % випадків, тоді, як у 2007 році одержаний негативний результат. Причини негативного результату дослідження могла бути недосконалість методів бактеріологічного досліджен-ня, а саме передпосівної обробки біоматеріалу

Експерименти з дослідження бактеріологічної ефективності методів передпосівної підготовки суспензії біологічного матеріалу великої рогатої худоби неблагополучних і благополучних щодо туберкульозу господарств. Порівнюючи під час дослідження різні методи підготовки суспензії біоло-гічного матеріалу (метод ферментативного збагачення, А.П. Алікаєвої, Гона-Левенштейна-Суміоші, флотації та комбінації трьох методів, які перелічені вище з методом флотації), було встановлено що найбільш ефективним при культуральних дослідженнях є метод ферментативного збагачення - 65, 6 %, менш ефективним - метод ферментативного збагачення у поєднанні з флота-цією - 51,0 %; менш ефективними виявилися методи А.П. Алікаєвої та А.П. Алікаєвої у поєднанні з флотацією - відповідно по 43, 7 %; Гона-Левенштейна-Суміоші - 36, 4 %; Гона-Левенштейна-Суміоші у поєднанні з флотацією - 21, 8 %; методу флотації - 14, 5 %. При досліджені проб з благополучних госпо-дарств культури мікобактерій були виділені лише методами ферментативного збагачення та ферментативного збагачення у поєднанні з флотацією, ефектив-ність яких склала відповідно 30 та 20 %.

Найбільш ефективним за біологічного дослідження виявився метод фер-ментативного збагачення - 80,12 %, дещо менш ефективним метод фермен-тативного збагачення у поєднанні з флотацією - 58, 2 %. Ефективність методів А.П. Алікаєвої та методу А.П. Алікаєвої у поєднанні з флотацією склала відпо-відно по 43,73 %, ефективність методу Гона-Левенштейна-Суміоші - 36, 4 %, а ефективність методу Гона-Левенштейна-Суміоші у поєднанні флотацією - 21, 8 %, ефективність методу флотації - 14, 5 %.

Виділені на щільних живильних середовищах 12 культур мікобактерій за тинкторіальними, культуральними, морфологічними, біохімічними та біологіч-ними властивостями віднесені: три культури (№ 35, № 36/1 та 36/2) - до ати-пових мікобактерій, та дев'ять (з № 19 по 34) - до M. bovis. Виділені міко-бактерії формували колонії у проміжку від п'ятої до 44-ої доби у вигляді дріб-них та середніх, S- та R-форм кольору слонової кістки, жовтуватих, світло-коричневих. Бактеріоскопією мазків встановили дрібні, червоні, зернисті па-лички із заокругленими кінцями.

Вплив гідрогумату на інтенсивність росту мікобактерій. Досліджуючи вплив гідрогумату у різних розведеннях (від 0,25 до 0,001%) на інтенсивність росту M. bovis штаму «Шахтар», було встановлено, що на середовищі з концентрацією гідрогумату 0,125 % ріст колоній розпочався у 2,5 раза швидше, ніж на контролі (середовище Мордовського), а їх середня кількість, на десятий день від початку росту, у дослідному середовищі була у 2,83 раза більшою, ніж у контролі (P>0,95). Середовище з гідрогуматом у концентрації 0,125 % виявилося найбільш ефективним порівняно з іншими концентраціями та конт-ролем при культивуванні M. bovis штаму «Шахтар». Виявлено зворотній взає-мозв'язок середньої сили між початком росту колоній та концентрацією гід-рогумату у середовищі (r = -0,74; P> 0,95 ), а також прямий взаємозв'язок се-редньої сили між середньою кількістю колоній, на 10-й день від початку росту, та концентрацією гідрогумату у середовищі (r = 0,72; P> 0,95 ), що свідчить про стимулюючий вплив гідрогумату у складі щільного живильного середовища на інтенсивність росту мікобактерій.

Подібні дослідження були проведені на атипових мікобактеріях штамів 36/2 та № 35. У результаті досліджень встановлено, що початок росту культури атипових мікобактерій № 36/2 на середовищі з концентрацією гідрогумату 0,125 % почався у 1,4 раза швидше, ніж у контролі, а середня кількість колоній цих мікобактерій на першу та п'яту день від початку росту була відповідно у 3,5 та 1,56 раза більшою ніж на середовищі Мордовського (Р>0,95).

Досліджуючи атипові мікобактерії штаму № 35 встановлено що, початок росту колоній на середовищі з гідрогуматом в концентрації 0,125 % у 1,25 рази перевищував цей показник у контролі. Середня кількість колоній атипових мікобактерій № 35 на середовищі з гідрогуматом (0,125%) на 1-й та 5-й день від початку росту у 7,7 (Р > 0,999) та 2,37 (Р > 0,95) була відповідно більшою, ніж на середовищі Мордовського. В результаті досліджень встановлено, що опти-мальною концентрацією гідрогумату у середовищі є - 0,125 %. В подальшому провели дослідження проб біологічного матеріалу культуральним методом з використанням середовища з гідрогуматом у концентрації 0,125 %. В якості контролю було використано середовище Мордовського та сухе живильне сере-довище для культивування мікобактерій ДП «Ветеринарна медицина» м. Хар-ків. Результати досліджень засвідчили, що найбільша кількість мікобактерій ви-ділена на середовищі з гідрогуматом - дев'ять культур (34,6 %); на середовищі Мордовського - шість культур (23 %); на сухому живильному середовищі для культивування мікобактерій ДП «Ветеринарна медицина» - п'ять (19,2 %), що у 1,5 та 1,8 рази відповідно менше, ніж на дослідному середовищі. Найвища бактеріологічна ефективність виявлена у середовища для культивування міко-бактерій з додаванням 0,125 % розчину гідрогумату. При цьому на середовищі з гідрогуматом початок формування колоній мікобактеріями відмічено (у пробах з неблагополучних господарств) на 12,50± 0,64 день, та на 9,60±0,37 день ( в пробах з благополучних господарств). На середовищі Мордовського форму-валися колонії відповідно на - 15,70±0, 29 день (у пробах з неблагополучних господарств) та на 12,30± 0,61 день (у пробах з благополучних господарств). На сухому живильному середовищі для культивування мікобактерій ДП «Вете-ринарна медицина» м. Харків аналізовані показники становили відповідно - 18,00±0,44 днів та повна відсутність росту культур. Різниця показників початку росту склала відповідно для середовища з 0,125 % розчином гідрогумату та середовища Мордовського - 1,26 (P>0,999) та 1,28 рази (P>0,95). Для середо-вища ДП «Ветеринарна медицина» м. Харків та середовища з 0,125 % розчином гідрогумату різниця складає 1,44 рази (P>0,999). Середня кількість колоній на 10-й день після початку росту на середовищі для культивування мікобактерій з додаванням 0,125 % розчину гідрогумату склала для проб від тварин з не благо-получних господарств 24,50 ±2,23, а для проб від тварин з благополучних 32,2±1,26 колоній. На середовищі Мордовського середня кількість колоній на 10-й день після початку росту становила з проб від тварин з не благополучних господарств - 14,90±1,32, а з проб від тварин з благополучних господарств - 21,90±0,69 колоній. На сухому живильному середовищі для культивування мікобактерій ДП «Ветеринарна медицина» м. Харків ці показники становили відповідно 11,37±1,62 та повна відсутність росту колоній. Різниця середньої кількості колоній для середовища з 0,125 % розчином гідрогумату та сере-довища Мордовського склала відповідно у пробах з неблагополучних гос-подарств - 1,64 (P> 0,999), а у пробах з благополучних господарств - 1,47 рази (P>0, 99). Для середовища з 0,125 % розчином гідрогумату та середовища ДП «Ветеринарна медицина» м. Харків різниця показників середньої кількості ко-лоній у пробах з неблагополучних господарств складає 2,15 рази (P>0,999).

Середовище для культивування мікобактерій з додаванням 0,125 % роз-чину гідрогумату за дослідження біологічного матеріалу від великої рогатої худоби, у середньому, у 1,5-1,8 рази дає відповідно більше позитивних ре-зультатів, ніж середовище Мордовського та сухе живильне середовище для культивування мікобактерій ДП «Ветеринарна медицина» м. Харків.

За матеріалами дослідження оформлено патент на корисну модель (Пат. на кор. мод. 28293 Україна, МКІ C 12 N 1/00. Живильне середовище для культивування мікобактерій / Ткаченко О.А., Кулішенко О.М. - № u 2007033 06; заявл. 27.03.2007; опубл. 10.12.2007, Бюл. №20).

Результати комісійної кафедральної перевірки засвідчили, що середо-вище з додаванням гідрогумату у концентрації 0,125 % є більш ефективніше у порівнянні з контролем у 1,96-3,72 раза. У зв'язку з цим необхідно було з'ясу-вати, які метаболічні процеси (механізми) зумовлюють активізацію обміну ре-човин. Для цього були проведені наступні дослідження, зокрема ліпідів міко-бактерій.

Ліпідний склад видів мікобактерій культивованих на різних сере-довищах. Ліпідний склад видів мікобактерій культивованих на живильному середовищі з гідрогуматом та середовищі Мордовського. Досліджуючи ліпід-ний склад мікобактерій різних видів, які були культивовані на середовищі для культивування мікобактерій з 0,125 % розчином гідрогумату та середовищі Мордовського, з метою визначення механізму впливу гідрогумату на ростові властивості мікобактерій було встановлено, що гідрогумат у складі середовища для культивування мікобактерій зменшує загальну кількість ліпідів патогенних мікобактерій у 1,2 раза (Р>0,95); достовірно не змінює вміст фракцій загальних ліпідів (фосфоліпідів, диацилгліцеролів, стеринів, вільних жирних кислот, триацилгліцеролів, ефірів стеринів); впливає на зміну фракцій вільних жирних кислот. Так було встановлено, що вміст ненасичених вільних жирних кислот (C16:1; C18:1; C18:2,3) у дослідному зразку становив 35, 53±1,7 %, а у контрольному - 40, 54±1,76 %, що у 1,14 раза більше, ніж на середовищі з додаванням 0,125% розчину гідрогумату (Р>0,95). Вміст насичених кислот у досліді був вищий у 1,08 раза і становив 64,47±2,02 %, проти 59,46±1,67 % у контролі (Р>0,95). Коефіцієнт ненасиченості (відношення суми ненасичених жирних кислот до суми насичених) у досліді складав 0,55±0,027, а у контролі 0,68±0,057. Пові-домляється, що при дії несприятливих факторів на мікобактерії, культивованих на щільних живильних середовищах, включається механізм адаптації і збільшується вміст ненасичених жирних кислот. З огляду на дані наших досліджень, можна припустити, що гідрогумат у складі щільного живильного середовища сприяє метаболізму мікобактерій і створює більш благоприємні умови для їх розмноження.

Подібні дослідження з вивчення ліпідів були проведені на атипових мі-кобактеріях. В результаті досліджень було встановлено, що гідрогумат дос-товірно не змінює вміст загальної кількості ліпідів в атипових мікобактерій; із фракцій ліпідів достовірно змінює вміст фракції стеринів (Р>0,99); змінює вміст вільних жирних кислот. Дослідження засвідчили, що у дослідному та конт-рольному зразках біомаси атипових мікобактерій вміст ненасичених вільних жирних кислот склав відповідно 41,54± 0,69 % та 50,50±1,25 %. Різниця цих показників становить 1,2 рази (Р>0,999). Вміст насичених жирних кислот у досліді становив у 58,46±1,02 %, а у контролі 49,50±1,03 %, що у 1,18 рази менше, ніж на середовищі з додаванням гідрогумату (Р>0,999). Коефіцієнт ненасиченості (відношення ненасичених жирних кислот до насичених) у досліді складав 0,71±0,13, а у контролі 1,02±0,1.

Окрім зазначеного вище, збільшення вмісту насичених жирних кислот у дослідному зразку біомаси мікобактерій у порівнянні з контролем, відмічена також тенденція до збільшення у дослідному зразку вмісту насичених довго-ланцюгових жирних кислот (генейкозанової, бегенової, тетракозанової, гекса-козанової) поряд з тенденцією зменшення вмісту насичених коротколанцю-гових жирних кислот (пальмітинова, маргаринова, стеаринова, нонадеканова), що теж вказує на високу адаптивну здатність атипових мікобактерій штаму № 36/2 під впливом гідрогумату. Все вищезазначене дозволяє припустити, що підвищення фракції насичених жирних кислот та збільшення вмісту її окремих представників, а також тенденція до зростання вмісту довголанцюгових насичених жирних кислот, говорить про те, що середовище з гідрогуматом є більш благоприєним для культивування атипових мікобактерій штаму № 36/2 і гідрогумат у складі живильного середовища сприяє метаболізму мікобакте-ріальних клітин і виконує роль адаптогену.

Разом з цим, за впливу гідрогумату на жирнокислотний склад мікобак-терій відмічена тенденція до збільшення довголанцюгових насичених жирних кислот, як у епізоотичних штамів мікобактерій так і у атипових мікобактерій. Зокрема збільшився вміст пентакозанової кислоти у штаму атипових міко-бактерій штаму № 36/2 та у штаму M. bovis № 24. Відмічена тенденція до зрос-тання вмісту насичених довголанцюгових жирних кислот (генейкозанової, тет-ракозанової, гексакозанової) поряд з тенденцією до зменшення вмісту наси-чених коротколанцюгових жирних кислот (пальмітинової, маргаринової, стеа-ринової, нонадеканової) у атипових мікобактерій штаму № 36/2.

Досліджуючи масу знятої культури мікобактерій з середовища з гідрогу-матом та середовища Мордовського, було встановлено, що маса культури видів мікобактерій на контрольному середовищі виявилася у 4,05 раза нижчою, ніж на дослідному (Р>0,99). В той же час, як свідчать результати досліду, не всі штами мікобактерій розмножуються на середовищі з гідрогуматом з однаковою інтенсивністю. Це визначає різну кількість накопиченої бак-терійної маси: від 1,8-1,9 раза (штами № 36/2, «Шахтар», № 41, № 21) до 18,6 разів (штам №101).

ВИСНОВКИ

1. У дисертації визначений вплив гідрогумату на життєздатність міко-бактерій та вивчена ефективність впливу різних способів передпосівної об-робки біологічного матеріалу на результати бактеріологічного дослідження, проведене порівняльне випробування живильних середовищ, у тому числі удосконаленого середовища з гідрогуматом, вивчена ефективність застосу-вання різних середовищ шляхом визначення строків та інтенсивності росту колоній на різних живильних середовищах та обґрунтована доцільність ви-користання запропонованого удосконаленого середовища для культивування мікобактерій різних видів, визначений ліпідний склад мікобактерій та його зміни в процесі адаптації збудників мікобактеріальних інфекцій.

2. В господарствах Дніпропетровської області на поголів'ї великої рогатої худоби циркулюють збудники туберкульозу і атипові мікобактерії - у 18 неблагополучних пунктах, виявлених впродовж останніх семи років, кількість реагуючого на внутрішньошкірну туберкулінову пробу поголів'я коливалась - у межах 2,28-13,96 %, а в благополучних господарствах у межах 0,47-5,02 %; з 12 виділених культур дев'ять віднесені M. bovis і три - до атипових міко-бактерій.

3. Ефективність бактеріологічного дослідження біоматеріалу від великої рогатої худоби, забитої з діагностичною метою впродовж 2000-2007 рр., за даними державної діагностичної установи ветеринарної медицини, коливається в межах від 1,12 до 9,65 %.

4. З методів передпосівної підготовки біологічного матеріалу, у т.ч. за А.П. Алікаєвою, Гоном-Левенштейном-Суміоші, ферментативного збагачен-ням біологічного матеріалу, флотацією та комбінацією перших трьох методів з флотацією, найбільш результативним виявився метод ферментативного збага-чення біологічного матеріалу, ефективність застосування якого коливається у межах 65,6% та 80,12 %.

5. Встановлена пряма залежність інтенсивності росту та зворотна - появи перших колоній штаму M.bovis “Шахтар”, від концентрації гідрогумату у жи-вильному середовищі. Оптимальною концентрацією гідрогумату у щільному живильному середовищі для культивування мікобактерій є - 0,125 %. Ефек-тивність використання вказаного середовища у порівнянні з середовищем Мордовського виявилася вищою у 2,5-2,8 рази при культивуванні штаму M.bovis “Шахтар” і у 1,96-5,6 рази - при культивуванні атипових мікобактерій штамів № 36/2 та № 35.

6. Застосування живильного середовища з гідрогуматом у порівнянні з середовищами Мордовського та ДП ”Ветеринарна медицина“ сприяє - зрос-танню кількості виділених культур мікобактерій відповідно у 1,5 та 1,8 рази; збільшенню кількості утворених колоній патогенних мікобактерій відповідно у 1,64-2,15 рази; скороченню первинного росту колоній відповідно у 1,25-1,44 рази. При культивуванні атипових мікобактерій на удосконаленому середовищі з гідрогуматом у порівнянні з середовищем Мордовського зростає швидкість формування колоній і збільшується їх кількість відповідно у 1,28-1,47 рази.

7. Склад ліпідів M. bovis “Шахтар”, при культивуванні на удосконале-ному середовищі з гідрогуматом у порівнянні з культивуванням на середовищі Мордовського характеризується достовірним зменшенням загальної кількості ліпідів і ненасичених вільних жирних кислот відповідно у 1,2 та у 1,14 рази за одночасного збільшення вмісту насичених вільних жирних кислот, зокрема маргаринової, пентакозанової у 2,56-2,81 рази.

8. Ліпідний склад атипових мікобактерії, при їх культивуванні на зап-ропонованому середовищі з гідрогуматом у порівнянні з культивуванням на середовищі Мордовського, достовірно не змінюється, за винятком фракції сте-ринів, а також характеризується достовірним зменшенням вмісту ненасичених вільних жирних кислот у 1,2 рази та достовірним зростанням вмісту насичених вільних жирних кислот у 1,55-2,93 рази і вмісту довголанцюгових жирних кис-лот (С21-С27) поряд із зменшенням вмісту коротколанцюгових вільних жирних кислот (С12-С19) у атипових мікобактерій штаму № 36/2.

9. Наявність лауринової і гексакозанової жирних кислот при культиву-ванні атипових мікобактерій і їх відсутність при культивуванні M. bovis на удосконаленому середовищі, може мати ідентифікаційне значення.

ПРОПОЗИЦІЇ ВИРОБНИЦТВУ

1. З метою покращення якості бактеріологічної діагностики туберкульозу доцільно використовувати живильне середовище для культивування мікобак-терій (Патент України № 28293 на корисну модель «Живильне середовище для культивування мікобактерій»).

2. Методика виготовлення та застосування удосконаленого живильного середовища з гідрогуматом увійшла до посібника з лабораторної діагностики туберкульозу тварин, який затверджений та прийнятий до впровадження у практику ветеринарної медицини Державним комітетом ветеринарної меди-цини України (протокол №1 від 23-24.12.2009 року) та затверджений науково-методичною радою факультету ветеринарної медицини Дніпропетровського державного аграрного університету.

СПИСОК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

туберкульоз худоба великий рогатий

1. Кулішенко О.М. Вплив гідрогумату на інтенсивність розмноження M. bovis / О.М. Кулішенко // Ветеринарні науки: зб. наук. праць Луганського НАУ. - Луганськ, 2007. -№ 78/101. - С. 332-338. (Дисертант провів культи-вування мікобактерій на середовищі з гідрогуматом у різній концентрації та вивчив вплив цієї речовини на ростові властивості M. bovis).

2. Кулішенко О.М. Практичне значення гідрогумату в бактеріологічній діагностиці туберкульозу / О.М. Кулішенко // Проблеми зооінженерії та вете-ринарної медицини: зб. наук. праць ХДЗВА, присвячений 100 - річному юві-лею кафедри мікробіології та біотехнології ХДЗВА. - Харків: РВВ ХДЗВА, 2007. - Вип. 15(40), ч.2, т.1 «Ветеринарні науки». - С. 72 - 79. (Дисертант дослідив вплив середовища з гідрогуматом на інтенсивність росту мікобак-терій при дослідження проб біологічного матеріалу).

3. Ткаченко О.А. Вплив гідрогумату на швидкість росту атипових мікобактерій / О.А. Ткаченко, О.М. Кулішенко // Вісник Дніпропетровського державного аграрного університету. - 2007. - №2. - С. 86 - 88. (Дисертант провів культивування атипових мікобактерій на середовищі з гідрогуматом в різній концентрації та вивчив вплив цієї речовини на їх ростові властивості).

4. Кулішенко О.М. Залежність адаптивної здатності M. bovis від впливу гідрогумату / О.М. Кулішенко, М.В. Зеленська, О.А. Ткаченко // Ветеринарна медицина України. - 2008. - № 7. - С. 30-33. (Дисертант дослідив вплив сере-довища з гідрогуматом на інтенсивність росту атипових мікобактерій та епізоотичних штамів M. bovis при пересівах та дослідженні проб біоло-гічного матеріалу).

5. Кулішенко О.М. Ліпідний склад М. bovis культивованого на різних середовищах / О.М. Кулішенко // Ветеринарна медицина України. - 2009. - № 2. - С. 30 - 33. (Дисертант провів накопичення бактеріальної маси міко-бактерій (М. bovis), дослідив ліпідний склад та узагальнив результати ро-боти).

6. Пат. на кор. мод. 28293 Україна, МКІ C 12 N 1/00. Живильне сере-довище для культивування мікобактерій / Ткаченко О.А., Кулішенко О.М. - № u 200703306; заявл. 27.03.2007; опубл. 10.12.2007, Бюл. № 20. (Дисертант дослідив вплив середовища з гідрогуматом на інтенсивність росту міко-бактерій).

Кулішенко О.М. Оцінка бактеріологічних методів діагностики тубер-кульозу. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата ветеринарних наук за спеціальністю 16.00.03 - ветеринарна мікробіологія, епізоотологія, інфекційні хвороби та імунологія. - Одеський державний аграрний універ-ситет. - Одеса, 2010.

Дисертація стосується проблеми бактеріологічної діагностики тубер-кульозу. В роботі проведено аналіз епізоотичної ситуації щодо туберкульозу великої рогатої худоби у Дніпропетровській області з 2000 по 2007 рр. та про-ведений аналіз ефективності методів бактеріологічної діагностики туберкульоз-зу. Проведене порівняння ефективності застосування різних методів перед-посівної підготовки суспензії біологічного матеріалу.

Досліджено тинкторіальні, культуральні, морфологічні, біохімічні та біологічні властивості виділених 12 культур мікобактерій.

Досліджено вплив гідрогумату на інтенсивність розмноження різних видів мікобактерій та запропоновано удосконалене середовище для культиву-вання мікобактерій з 0,125 % розчином гідрогумату, на яке отримано патент на корисну модель № 28293.

Проведене вивчення ефективності застосування удосконаленого сере-довища з гідрогуматом, за дослідження проб біологічного матеріалу у порів-нянні з середовищем Мордовського та сухим живильним середовищем для культивування мікобактерій ДП «Ветеринарна медицина» м. Харків.

Проведено накопичення біомаси мікобактерій, які були культивовані на запропонованому середовищі з гідрогуматом та середовищі Мордовського з наступним дослідженням їх ліпідного складу для вивчення механізмів стиму-люючого впливу гідрогумату на мікобактерій.

Ключові слова: туберкульоз, епізоотичний процес, бактеріологічна діагностика, методи передпосівної обробки, гідрогумат, пришвидшення росту, штами мікобактерій, ліпідний склад мікобактерій, адаптивна здатність.

Кулишенко О.М. Оценка бактериологических методов диагностики туберкулёза. - Рукопись.

Диссертация на соискание учёной степени кандидата ветеринарных наук по специальности 16.00.03 - ветеринарная микробиология, эпизоо-тология, инфекцонные болезни и иммунология. - Одесский государствен-ный аграрный університет. - Одесса, 2010.

Диссертация касается проблемы бактериологической диагностики ту-беркулёза. В работе проведён анализ эпизоотической ситуации по туберкулёзу крупного рогатого скота в Днепропетровской области в период с 2000 по 2007 гг. и анализ эффективности методов бактериологической диагностики тубер-кулёза. Проведено сравнение эффективности применения различных методов подготовки суспензии биологического материала для бактериологического посева.

У выделенных 12 культур микобактерий исследовано тинкториальные, культуральные, морфологические, биохимические и биологические свойства.

Исследовано влияние гидрогумата на интенсивность размножения раз-ных видов микобактерий и предложено усовершенствованная питательная среда для культивирования микобактерий с 0,125 % раствором гидрогумата на которую получено патент на полезную модель № 28293.

Проведено сравнение эффективности применения предложенной среды для исследования проб биологического материала. В качестве контроля были использованы среда Мордовского и сухая питательная среда для культивиро-вания микобактерия ДП «Ветеринарная медицина» г. Харьков.

Проведено накопление биомассы микобактерий, которые были культи-вированные на предложенной среде и на среде Мордовского с последующим исследованием их липидного состава с целью изучения механизмов стимули-рующего влияния гидрогумата на микобактерии.

Ключевые слова: туберкулёз, эпизоотологический процесс, бактерио-логическая диагностика, методы обработки биологического материала, гид-рогумат, ускорение роста, штаммы микобактерий, липидный состав микобак-терий, адаптивная способность.

Kulishenko O.N. The Estimation of the bacteriological methods of the diagnostics tuberculosis. - Manuscript.

The Thesis on competition scientific degree candidate of the veterinary sciences on professions 16.00.03 - veterinary microbiology, epizootology, infec-tious disease and immunology. - Odessa state agrarian university. - Odessa, 2010.

The dissertation concerns researches of bacteriological diagnostics of a tuberculosis. In work it is analysed epizootological a situation on tuberculosis cattle in the Dnepropetrovsk area during the period with 2000 for 2007 years and it is carried out the analysis of efficiency of methods of bacteriological diagnostics of a tuberculosis. Comparison of efficiency of application of various methods of preparation of suspension of a biological material for bacteriological crops is spent.

At the allocated 12 cultures mycobacterium it is investigated cultural, morphological, biochemical and biological properties.

Influence hydrohumates on intensity of reproduction of times of kinds mycobacterium is investigated and it is offered an advanced nutrient medium for cultivated mycobacterium from 0,125 % solution hydrohumates on which is taken out the patent for useful model № 28293.

Comparison of efficiency of application of the offered environment for research of tests of a biological material is conducted. As the control have been used the nutrient medium Mordovian and a dry nutrient medium for cultivated mycobacterium «Veterinary medicine» Kharkov.

Biomass accumulation mycobacterium which were cultivated on the offered nutrient medium and on nutrient medium Mordovian with their subsequent research lipids structure for the purpose of studying of mechanisms of stimulating influence hydrohumates on mycobacterium spent.

The Keywords: tuberculosis, epizootological process, bacteriological diag-nostics, methods processing, hydrohumates, speedup of the growing, strain myco-bacterium, lipids composition mycobacterium, adaptive ability.

Размещено на Allbest.ru