Особливості перебігу ішемічно-реперфузійного пошкодження структур головного мозку при експериментальному цукровому діабеті в самців-щурів

Размещено на http://www.allbest.ru

Размещено на http://www.allbest.ru

Вступ

Актуальність теми. Цереброваскулярна патологія є однією з найбільш актуальних проблем сучасної медицини, що зумовлено зростанням розповсюдженості судинних захворювань. У 2004 році Всесвітньою Організацією Охорони Здоров'я констатовано, що інсульт є глобальною епідемією, яка загрожує здоров'ю і життю населення всього світу. На сьогоднішній день в усьому світі гострі порушення мозкового кровообігу є другою за частотою причиною смертності, поступаючись лише ішемічній хворобі серця та передуючи онкологічним захворюванням.

Особливу увагу привертають ішемічні пошкодження головного мозку, які складають більшу частку цереброваскулярної патології, що зумовлює медико-соціальне значення ішемії мозку. Поширеність ішемічних станів та оборотність патологічних змін при своєчасно розпочатих терапевтичних заходах підкреслює важливість глибокого знання патогенезу ішемічно-реперфузійного пошкодження різних структур головного мозку. Небезпечним є й те, що іноді ішемія головного мозку може перебігати малопомітно або безсимптомно, що утруднює її своєчасну діагностику.

Особливості перебігу інсульту визначаються доінсультним (фоновим) станом мозкового метаболізму, його енергетичними потребами та статусом і реактивністю нейроімуноендокринної системи організму. Серед фонових захворювань, на тлі яких розвивається ішемія головного мозку, цукровий діабет є одним із найбільш поширених (C.R. Kahn et al, 2005). Встановлено, що цукровий діабет підвищує ризик розвитку ішемічних уражень головного мозку в декілька разів, а сам ішемічний інсульт за таких умов перебігає тяжче. Особливого значення набувають такі ускладнення цукрового діабету, як кетоацидотичні, гіперосмолярні, лактатацидотичні та гіпоглікемічні коми, що призводять до розвитку неповної глобальної ішемії головного мозку з подальшою реперфузією і посилюють порушенння енергетики нейронів та глії, притаманні діабету.

Мета дослідження. З'ясувати особливості реакції філогенетично різних кіркових утворень головного мозку на неповну глобальну ішемію та наступну реперфузію в самців-щурів з експериментальним цукровим діабетом за окремими геномними, патобіохімічними та патоморфологічними показниками.

Задачі дослідження:

1. Вивчити особливості експресії білків Hif-1б, p53 та Bcl-2 при двобічній каротидній ішемії-реперфузії в корі лобової частки та гіпокампі самців-щурів за умов стрептозотоцин-індукованого цукрового діабету.

2. Дослідити вплив двобічної каротидної ішемії-реперфузії на показники пероксидного окиснення ліпідів, активність антиоксидантних ферментів, вміст продуктів окиснювальної модифікації білків у корі лобової частки та окремих полях гіпокампа самців-щурів з експериментальним цукровим діабетом.

3. З'ясувати вплив неповної глобальної ішемії-реперфузії на показники тканинної протеолітичної та фібринолітичної активності в корі лобової частки та гіпокампі самців-щурів зі стрептозотоцин-індукованим цукровим діабетом.

4. Вивчити патоморфологічні зміни в корі лобової частки та окремих полях гіпокампа самців-щурів при поєднаному впливі неповної глобальної ішемії-реперфузії та стрептозотоцин-індукованого цукрового діабету.

1. Матеріал і методи дослідження

Дослідження проведені на 244 нелінійних білих самцях щурів. Усіх тварин поділено на чотири групи: контрольні тварини; щури, яким виконано двобічну каротидну ішемію-реперфузію (ДКІР); щури зі стрептозотоцин-індукованим цукровим діабетом (ЦД) тривалістю три місяці; щури з експериментальним тримісячним ЦД, яким виконано ДКІР.

ЦД моделювали одноразовим внутрішньоочеревинним уведенням стрептозотоцину (Sigma, Aldrich, США) двомісячним тваринам у дозі 60 мг/кг маси тіла (M.Bassirat, Z.Khalil, 2008). Тривалість діабету склала три місяці. ДКІР моделювали під каліпсоловим наркозом (75 мг/кг) у щурів віком 5 місяців двадцятихвилинним перетисканням обох загальних сонних артерій з одногодинною реперфузією (Г.Г.Скибо, 2004).

Усі втручання та забій тварин проводилися з дотриманням основних положень GLP (1981 р.), Конвенції Ради Європи про охорону хребетних тварин, що використовують в експериментах та інших наукових цілях, від 18.03.1986 р., Директиви ЄЕС № 609 від 24.11.1986 р. і наказу МОЗ України № 690 від 23.09.2009 р. Комісією з питань біоетики Буковинського державного медичного університету (протокол №5 від 17.06.2010 р.) порушень морально-етичних норм при проведенні науково-дослідної роботи не виявлено.

З експерименту тварин виводили декапітацією під каліпсоловим наркозом. Негайно на холоді виймали головний мозок і, залежно від подальших досліджень, одразу занурювали його у: розчин Буена - для імунофлуоресцентних визначень, рідкий азот - для біохімічного аналізу, 10 % розчин нейтрального формаліну - для світлооптичного вивчення, 2,5 % нейтральний розчин глютарового альдегіду - для електроннооптичної мікроскопії.

Для ідентифікації клітин, що експресують білки Hif-1б, Bcl-2 та p53 застосовували імунофлуоресцентні методи. Дослідженню підлягали випадково обрані зрізи кори лобової частки та полів СА1, СА2 і СА3 гіпокампа. Оброблені гістологічні зрізи вивчали у флуоресцентному мікроскопі Axioskop (Zeiss, Німеччина) за допомогою відеокамери COHU-4722 (COHU Inc., США). В отриманих зображеннях аналізували щільність розташування позитивних за відповідним фактором клітин у комп'ютерній системі цифрового аналізу VIDAS-386 (Kontron Elektronik, Німеччина).

У гомогенатах досліджуваних структур визначали вміст дієнових кон'югатів, малонового альдегіду, продуктів окиснювальної модифікації білків основного та нейтрального характеру, активність супероксиддисмутази, каталази, глутатіонпероксидази (В.М.Магаляс та ін., 2001).

Протеолітичну активність у гомогенатах структур головного мозку визначали за лізисом азоальбуміну, азоказеїну та азоколу, інтенсивність фібринолізу - за лізисом азофібрину (В.М.Магаляс та ін., 2001).

Гістологічні зрізи досліджуваних структур, пофарбованих толуїдиновим синім за методом Ніссля, вивчали морфоскопічним та фотографічним методами за допомогою світлооптичного мікроскопа Биолам Ломо С11 та цифрового фотоапарата Canon Ixus 50. Для електроннооптичних досліджень готували ультратонкі зрізи з контрастуванням свинцем і вивчали за допомогою електронного мікроскопа ПЕМ-125К.

Проведено статистичний аналіз числових даних у прикладних програмах “Statistica 6.0” та “SPSS 13” із використанням параметричного t-критерію Стьюдента. Критичний рівень значущості при перевірці статистичних гіпотез приймали рівним 0,05.

2. Результати досліджень та їх обговорення

У корі лобової частки ішемія-реперфузія, порівняно з контролем, спричиняє зростання експресії білків Hif-1б і Bcl-2 (таблиці 1, 3). Цукровий діабет у цій структурі призводить лише до зростання експресії Hif-1б. При поєднанні ішемії-реперфузії та діабету, порівняно з групою діабету, збільшується експресія факторів Hif-1б і Bcl-2, причому рівень Hif-1б є вищим за такий при ішемії-реперфузії без порушення вуглеводного обміну. Експресія білка р53 в корі лобової частки не зазнає змін у жодній експериментальній групі (табл. 2).

Таблиця 1. Експресія білка Hif-1б в корі лобової частки за умов поєднаної дії цукрового діабету та ішемії-реперфузії головного мозку (M±m)

Примітки: у даній та наступних таблицях: вірогідність різниці порівняно з: р1 - контролем, р2 - цукровим діабетом.

Таблиця 2. Експресія білка р53 в корі лобової частки за умов поєднаної дії цукрового діабету та ішемії-реперфузії головного мозку (M±m)

Таблиця 3. Експресія білка Bcl-2 в корі лобової частки за умов поєднаної дії цукрового діабету та ішемії-реперфузії головного мозку (M±m)

У гіпокампі у відповідь на ішемію-реперфузію зростає вміст протеїнів р53 (у полях СА1 і СА3 гіпокампа) та Bcl-2 (у полях СА2 і СА3) (табл. 4). Схожим чином змінюється експресія досліджуваних генів у цій структурі й при цукровому діабеті, при додатковому збільшенні показника Bcl-2 в полі СА3 гіпокампа.

При поєднанні обох патологій, порівняно з групою діабету, в полі СА1 підвищується вміст факторів р53 і Bcl-2, а в полі СА3 зростає експресія білка р53 при одночасному зниженні експресії білка Bcl-2. У гіпокампі в усіх експериментальних групах відсутні зміни експресії фактора Hif-1б.

Таблиця 4. Експресія білків Hif-1б, р53 і Bcl-2 в гіпокампі за умов поєднаної дії цукрового діабету та ішемії-реперфузії головного мозку (M±m)

Такі дані свідчать про більш суттєве ушкодження й активність апоптотичних процесів у гіпокампі та більш сприятливі умови для виживання клітин кори лобової частки за умов поєднання неповної глобальної ішемії-реперфузії головного мозку та цукрового діабету.

У корі лобової частки й гіпокампі ішемія-реперфузія, порівняно з контролем, призводить до паралельної активації процесів ліпопероксидації та антиоксидантного захисту, про що свідчить зростання вмісту ДК і МА, зростання активності КТ й ГПО. Проте постійною складовою цієї реакції є зниження активності СОД.

При діабеті, порівняно з контрольною групою, відбувається зниження вмісту продуктів пероксидного окиснення ліпідів й активності СОД в усіх структурах, активність КТ за цих умов зростає в корі лобової частки і полі СА2 гіпокампа. Ішемія-реперфузія на тлі ЦД, у цілому, характеризується зниженням антиоксидантного захисту на тлі незмінної інтенсивності ліпопероксидації. Крім того, показники пероксидного окиснення ліпідів й активності антиоксидантного захисту в останній групі є нижчими, ніж такі в групі тварин з ішемію-реперфузією без діабету.

Ще одним важливим критерієм вираженості оксидантного стресу є окиснювальна модифікація білків. За наших експериментальних умов двобічна каротидна ішемія-реперфузія, порівняно з групою контролю, спричинює достовірні зміни лише в корі лобової частки - у вигляді зростання вмісту продуктів окиснювальної модифікації нейтрального і основного характеру. Експериментальний цукровий діабет знижує вміст продуктів окиснювальної модифікації білків нейтрального характеру в полях СА1 і СА3 гіпокампа та основного характеру - в усіх досліжених структурах. Зміни вмісту продуктів окиснювальної модифікації білків у відповідь на двобічну каротидну ішемію-реперфузію на тлі тримісячного цукрового діабету полягають лише в зростанні вмісту продуктів окиснювальної модифікації білків основного характеру тільки в корі лобової частки головного мозку щурів.

Неодмінними компонентами реакції нервової тканини на ішемічно-репрфузійні пошкодження є зміни протео- та фібринолітичної активності.

Під впливом двобічної каротидної ішемії-реперфузії, стосовно контролю, зростає лізис високомолекулярних білків і колагену в усіх досліджених структурах головного мозку, за винятком поля СА1 гіпокампа, в якому має місце зниження лізису низькомолекулярних білків. Цукровий діабет, відносно контролю, знижує лізис низькомолекулярних білків у корі лобової частки та полі СА1 гіпокампа і збільшує лізис високомолекулярних білків і колагену в полях СА2 і СА3 гіпокампа. Характерною закономірністю змін тканинного протеолізу при поєднанні ішемії-реперфузії мозку та цукрового діабету є зниження лізису колагену в усіх досліджених нами структурах.

За нашими даними реакція тканинного фібринолізу на ішемію-реперфузію головного мозку полягає в зростанні всіх або окремих показників фібринолітичної активності в усіх досліджених структурах, за винятком поля гіпокампа СА3, де змін не виявлено (табл. 8). При цукровому діабеті також наявна закономірність - зростання практично всіх показників фібринолізу в усіх мозкових структурах. На противагу реакції у тварин без порушення вуглеводного обміну, при експериментальному цукровому діабеті двобічна каротидна ішемія-реперфузія, порівняно з показниками у тварин із діабетом, спричиняє зниження ферментативної фібринолітичної активності в полях СА2 та СА3 гіпокампа самців-щурів, не впливаючи на досліджені показники в інших ділянках головного мозку.

Гістологічна картина кори лобової частки та гіпокампа тварин, яким виконано двобічну каротидну ішемію-реперфузію, та щурів із цукровим діабетом характеризується подібністю морфологічних змін. За обох експериментальних моделей на світлооптичному рівні встановлено поліморфізм нейроцитів у вигляді появи збільшених, із набряклими відростками гіпохромних нейроцитів у стані тигролізу, а також малих гіперхромних клітин. На електроннооптичному рівні для стану гіпохромії характерна прозорість нуклео- і цитоплазми. Гіперхромні клітини містять зменшені за площею ядра з нерівною каріолемою та осміофільною каріоплазмою. За обох типів морфологічних змін спостерігається зменшення вмісту клітинних органел та порушення будови останніх. Мітохондрії мають просвітлений матрикс та пошкоджені кристи, канальці гранулярного ендоплазматичного ретикулуму та комплексу Гольджі розширені, мало вільних рибосом і полісом. За обох експериментальних патологій наявний периваскулярний набряк.

Ці зміни набувають найбільшої вираженості при поєднанні двобічної каротидної ішемії-реперфузії та стрептозотоцин-індукованго цукрового діабету. Таке втручання спричиняє значні деструктивні зміни всіх структурних компонентів сірої речовини кори лобової частки та гіпокампа на світло- й електроннооптичному рівнях у вигляді порушень внутрішньої будови та форми нервових клітин і появи гіпохромних та різко гіпохромних, гіперхромних і навіть пікнотичних нейроцитів зі зменшенням кількості і змінами структури їх органел, набряком ендотеліоцитів та перикапілярних просторів. Узагальнюючи результати дослідження можна дійти висновку, що при ішемії-реперфузії мозку ступінь експресії генів Hif-1б, p53 та Bcl-2 вищий на тлі цукрового діабету, ніж у тварин із незміненою ендокринною функцією підшлункової залози. У той же час, інтенсивність процесів пероксидного окиснення ліпідів, окиснювальної модифікації білків, тканинного протеолізу та фібринолізу при неповній глобальній ішемії-реперфузії у всіх досліджуваних структурах мозку тварин із цукровим діабетом, порівняно з показниками у тварин без порушення вуглеводного обміну, як за кількістю змінених параметрів, так і за вираженістю змін менша, активність антиоксидантних ферментів, незважаючи на менші прояви оксидативного стресу, значно пригнічена, а морфологічний стан даних структур за умов поєднання двох патологічних станів характеризується більшим ступенем вираженості деструктивних змін.

Висновки

каротидний ішемія патоморфологічний

У дисертації наведено теоретичне узагальнення та експериментальні дані стосовно нового вирішення наукової задачі - особливостей ішемічно-реперфузійного пошкодження структур головного мозку на тлі цукрового діабету, що дозволяє поглибити розуміння перебігу такого патологічного стану з метою подальшої розробки ефективної стратегії попередження та лікування цереброваскулярних захворювань, що виникають за умов порушеного метаболізму.

1. Ішемія-реперфузія на тлі цукрового діабету достовірно посилює експресію білків Hif-1б та Bcl-2 у 2,9 і 1,4 раза відповідно в корі лобової частки, білка р53 - у полях гіпокампа СА1 та СА3 в 3 рази й 1,4 раза відповідно, білка Bcl-2 - у полі гіпокампа СА1 у 2 рази та знижує експресію останнього - у полі СА3 в 1,5 раза, що свідчить про більш суттєве ушкодження й активність апоптотичних процесів у гіпокампі та більш сприятливі умови для виживання клітин кори лобової частки за даних експериментальних умов.

2. Двобічна каротидна ішемія-реперфузія на тлі тримісячного цукрового діабету спричиняє достовірне пригнічення активності каталази в корі лобової частки, полях гіпокампа СА1, СА2 та СА3 у 2,5, 1,8, 2,0 і 1,6 раза відповідно, пригнічення активності глутатіонпероксидази в корі лобової частки і полі СА3 гіпокампа в 1,5 та 1,2 раза відповідно, без суттєвих змін вмісту продуктів ліпопероксидації, що свідчить про виснаження антиоксидантного захисту.

3. Зміни вмісту продуктів окиснювальної модифікації білків у відповідь на двобічну каротидну ішемію-реперфузію на тлі тримісячного цукрового діабету полягають лише в зростанні вмісту продуктів окиснювальної модифікації білків основного характеру тільки в корі лобової частки головного мозку щурів в 1,3 раза (р<0,05).

4. Двобічна каротидна ішемія-реперфузія на тлі цукрового діабету спричиняє достовірне зниження лізису колагену в корі лобової частки та полях гіпокампа СА1, СА2 і СА3 в 1,6, 1,6, 1,4 1,5 раза відповідно й ферментативної фібринолітичної активності - у полях гіпокампа СА2 та СА3 в 1,4 та 1,2 раза.

5. Морфологічні зміни тканини кори лобової частки і гіпокампа під впливом двобічної каротидної ішемії-реперфузії на тлі тримісячного цукрового діабету проявляються зменшенням щільності розташування клітин, появою гіпохромних, гіперхромних і різко гіперхромних нейроцитів, зміною форми і вмісту нервових клітин, зменшенням кількості і порушенням структури їх органел, набряком ендотеліоцитів та перикапілярних просторів, що свідчить про зниження функціональної активності нейроцитів та гемокапілярів, а також про пригнічення перебігу внутрішньоклітинної регенерації в нервових клітинах.

6. При двобічній каротидній ішемії-реперфузії головного мозку в самців-щурів на тлі тримісячного цукрового діабету зміни показників пероксидного окиснення ліпідів, окиснювальної модифікації білків, тканинного протеолізу та фібринолізу є менш вираженими, ніж такі при ішемії-реперфузії без порушення вуглеводного обміну, що є прямим свідченням ослаблення цих біохімічних процесів унаслідок особливостей метаболізму за умов діабету. У той же час отримані дані щодо експресії генів Hif-1б, p53 та Bcl-2 свідчать про більшу активність геномної реакції і суттєвіше пошкодження нервової тканини при ішемії-реперфузії саме на тлі цукрового діабету.

Література

1. Лєньков О.М. Перекисне окиснення ліпідів та антиоксидантний захист у корі головного мозку і гіпокампі за умов двобічної каротидної ішемії-реперфузії при експериментальному цукровому діабеті в самців-щурів / О.М. Лєньков // Клінічна та експериментальна патологія.-2009.-Т.III,№2.-С.44-46.

2. Лєньков О.М. Стан тканинного протеолізу та фібринолізу в корі головного мозку і гіпокампі за умов двобічної каротидної ішемії-реперфузії при експериментальному цукровому діабеті в самців-щурів / О.М. Лєньков // Буковинський медичний вісник. - 2009. - №3. - С.115-118.

3. Лєньков О.М. Вплив двобічної каротидної ішемії-реперфузії на вміст продуктів окиснювальної модифікації білків у корі головного мозку і гіпокампі при експериментальному цукровому діабеті в самців-щурів / О.М. Лєньков, С.С. Ткачук // Клінічна та експериментальна патологія. - 2009. -Т.VIII, № 3(29). - С.37-39.

4. Лєньков О.М. Морфологічні зміни тканини гіпокампа за умов двобічної каротидної ішемії-реперфузії при експериментальному цукровому діабеті в самців-щурів / О.М. Лєньков // Клінічна та експериментальна патологія. - 2009. - Т.VIII, № 4(30). - С.39-42.

5. Ткачук С.С. Ультраструктурні зміни тканини гіпокампа за умов двобічної каротидної ішемії-реперфузії при експериментальному цукровому діабеті в самців-щурів / С.С. Ткачук, К.С. Волков, О.М. Лєньков // Здобутки клінічної і експериментальної медицини. - 2009. - №2. - С.73-77.

6. Ткачук С.С. Мофологічні зміни кори лобової частки головного мозку за умов двобічної каротидної ішемії-реперфузії при експериментальному цукровому діабеті / С.С. Ткачук, О.М. Лєньков // Клінічна анатомія та оперативна хірургія. - 2010. - Т.9, №2(32). - С.102-107.

Размещено на Allbest.ru