22

Размещено на http://www.allbest.ru/

КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ІМЕНІ ТАРАСА ШЕВЧЕНКА

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

03.00.04 - біохімія

Вплив стрептокінази на тромбоцитарну ланку системи гемостазу

Бурлова-Васильєва Наталія Костянтинівна

Київ 2010

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана на кафедрі біохімії біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка.

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор Волков Георгій Леонідович, Київський національний університет імені Тараса Шевченка, професор кафедри біохімії біологічного факультету.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Хижняк Світлана Володимирівна, Київський національний університет імені Тараса Шевченка, провідний науковий співробітник науково-дослідної лабораторії “Фізико-хімічної біології” біологічного факультету; кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник Кастрикіна Таїсія Федорівна, Інститут фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України, старший науковий співробітник відділу нейрохімії.

Захист відбудеться “22” березня 2010 року о 1600 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.001.24 Київського національного університету імені Тараса Шевченка за адресою: м. Київ, просп. академіка Глушкова, 2, корпус 12, біологічний факультет, ауд. 434.

Поштова адреса: 01601, м. Київ, вул. Володимирська, 64, Київський національний університет імені Тараса Шевченка, біологічний факультет, спеціалізована вчена рада Д 26.001.24.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Київського національного університету імені Тараса Шевченка за адресою: м. Київ, вул. Володимирська, 58.

Автореферат розісланий “16” лютого 2010 р.

Вчений секретар Т. Р. Андрійчук спеціалізованої вченої ради

1. Загальна характеристика роботи

стрептокіназа гемостаз інфаркт гепарин

Актуальність теми. Система гемостазу є складною біологічною системою, яка відповідає за попередження чи зупинку кровотечі, а також підтримання крові у рідкому стані. Процес згортання крові постійно перебуває у рівновазі між активацією та інгібуванням. Зміщення рівноваги у бік надлишкової коагуляційної активності або порушення механізмів дії антикоагулянтів призводить до патологічного тромбоутворення та геморагій [Веремеенко К. Н., 1988; Kalafatis M., 1997; Зубаиров Д. М., 2000; Добровольский А. Б., 2002]. Тромботичні ускладнення є головною причиною розвитку таких захворювань як інфаркт міокарда, атеросклероз, гіпертонії та порушення мозкового кровообігу. Для розщеплення тромбу та відновлення кровотоку проводиться тромболітична терапія. Антикоагулянтні препарати були вперше використані у клінічній практиці завдяки роботам В. Тіллета та С. Шеррі ще у 1949 р., але доцільність застосування тромболітиків отримала загальне визнання лише на початку 1990-х рр. [Бокарев И. Н., 1998]. Широкомасштабні дослідження розвитку патологій функціонування системи гемостазу сприяли тому, що тромболітична терапія стала обовґязковою при лікуванні гострого інфаркту міокарда [Бокарев И. Н., 1998; Дикун Я. В., 1998].

Сучасні тромболітичні засоби включають як рекомбінантні препарати фізіологічних активаторів плазміногена - тканинний активатор і урокіназу, так і білки, які здатні перетворювати плазміноген на плазмін неферментативним шляхом. Одним з найбільш доступних та поширених у наш час тромболітичним препаратом є стрептокіназа. Вона являє собою білок бактеріального походження, який продукується різними видами в-гемолітичних стрептококів. В кровотоці цей ефектор утворює комплекси з плазміногеном, що приводить до конформаційних змін проферменту та подальшої експозиції активного центру. Утворений плазмін розщеплює фібрин, який разом із тромбоцитами та іншими гемостатичними елементами є основою тромбу. Незважаючи на багаторічний досвід застосування тромболітичних препаратів, у тому числі стрептокінази, висока частота побічних ефектів спонукає до пошуку засобів покращення традиційної тромболітичної терапії [Vaughan D., 1988; Courval M., 2004; Perler B., 2005]. На сьогоднішній день відомо, що застосування стрептокінази призводить до посилення ризику геморагічних ускладнень. Введення препарату у кровоток у деяких випадках викликає повторне тромбоутворення. Така дія тромболітичного агента може бути пов'язана з активацією тромбоцитів та вивільненням з клітин інгібітора активаторів плазміногена типу 1 (ПАІ-1). Висока локальна концентрація ПАІ-1 сприяє інгібуванню фібринолізу і закріпленню фібринової бляшки, що призводить до небажаних наслідків під час проведення тромболітичної терапії [John J., 1988; Redmond M., 2000]. Окрім того, стрептокіназа є імуногенним фактором, її надходження до кровотоку спричиняє появу специфічних антитіл, які зумовлюють резистентність до повторного введення препарату, а також алергічні реакції [Добровольский А. Б., 2002].

Важливою проблемою сучасної клінічної практики є питання можливості використання низьких доз стрептокінази для проведення тромболітичної терапії. Цей підхід може дозволити зменшити ризик виникнення геморагічних ускладнень, а також знизити його вартість. Таким чином, досвід сучасної клінічної практики вказує на необхідність ефективної тромболітичної терапії з низьким профілем побічних реакцій. Вдосконалення системи лабораторної діагностики патологій згортання крові та фібринолізу потребує поглибленого вивчення механізмів взаємодії компонентів системи гемостазу та регуляції їх активності. У зв'язку з цим, дослідження взаємодії стрептокінази з компонентами системи гемостазу є актуальною проблемою сьогодення.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана у рамках науково-дослідної теми ”Визначення біохімічних, генетичних, імунологічних та цитологічних маркерів розвитку патологічних станів організму з метою розробки засобів направленої корекції“ (№ д/р 0106U005750) кафедри біохімії біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка.

Мета і завдання дослідження. З'ясувати вплив стрептокінази на активацію та агрегацію тромбоцитів та спряжених з ними процесів секреції ПАІ-1за умов внутрішньовенного введення тромболітичного агента.

Для досягнення мети було поставлено такі завдання:

1. Дослідити вплив стрептокінази на АДФ-залежну агрегацію тромбоцитів за гострого інфаркту міокарда.

2. Простежити динаміку активності інгібітора активаторів плазміногена типу 1 під дією стрептокінази та гепарину в плазмі крові за гострого інфаркту міокарда.

3. Дослідити активність та вміст інгібітора активаторів плазміногена типу 1 за використання модельних систем активації плазміногена.

4. З'ясувати роль стрептокінази та антистрептокіназних антитіл у процесах активації та агрегації тромбоцитів in vitro та in vivo.

5. Вивчити вплив стрептокінази на АДФ-залежну агрегацію тромбоцитів за умов внутрішньовенного введення тромболітичного агента.

Об'єкт дослідження: біохімічні механізми впливу стрептокінази на активацію тромбоцитарної ланки системи гемостазу.

Предмет дослідження: активація та агрегація тромбоцитів, активність та концентрація ПАІ-1 у плазмі крові, активність стрептокінази у плазмі крові.

Методи дослідження: Виділення білкових препаратів з плазми та сироватки крові ссавців проводили з використанням хроматографічних методів. Для визначення активності ферментів і кількісного аналізу компонентів фібринолітичної системи у плазмі крові було застосовано метод імуноферментного аналізу у модифікації ELISA. Якісний склад компонентів системи гемостазу вивчали методами електрофорезу у поліакриламідному гелі та вестерн-блотингу. Аналіз активації та агрегації тромбоцитів проводили на протоковому цитофлуориметрі та агрегометрі.

Наукова новизна одержаних результатів. У роботі показано, що введення гепарину після проведення тромболітичної терапії стрептокіназою сприяє нормалізації АДФ-залежної агрегації тромбоцитів хворих на гострий інфаркт міокарда (ГІМ) та зниженню активності інгібітора активаторів плазміногена типу 1. Виявлено активність стрептокінази у зразках плазми крові пацієнтів через 1 годину після внутрішньовенного введення тромболітичного агента. Дослідження динаміки вмісту інгібітора активаторів плазміногена типу 1 (ПАІ-1) у плазмі крові кролів та свиней показало, що застосування стрептокінази призводить до зростання концентрації ПАІ-1 на фоні зниження активності інгібітора. Вперше встановлено, що стрептокіназа дозозалежно впливає на секрецію інгібітора з тромбоцитів. Показано вивільнення ПАІ-1 у вільній та у комплексних формах. Встановлено, що стрептокіназа у плазмі крові, яка позбавлена плазміногена, не спричиняє активацію тромбоцитів, проте утворення комплексу стрептокіназа-антитіло активує клітини без участі плазміну. Виявлено, що поліклональні антитіла до стрептокінази безпосередньо не мають активуючого впливу на тромбоцити кроля в умовах in vitro.

У роботі вперше показано, що стрептокіназа дозозалежно впливає на АДФ-індуковану агрегацію тромбоцитів. На модельних системах in vitro виявлено, що інгібуючий ефект стрептокінази на АДФ-залежну агрегацію тромбоцитів є тимчасовим і його дія припиняється через 7 тижнів після введення тромболітичного агента. Вперше показано, що зростання рівня антистрептокіназних антитіл у плазмі крові є причиною зростання ступеня АДФ-залежної агрегації клітин при повторному введенні стрептокінази.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані в роботі результати мають фундаментальне значення для розуміння біохімічних шляхів впливу стрептокінази на тромбоцитарну ланку системи гемостазу та характеризують множинність проявів цього тромболітичного препарату. Проведені дослідження сприяють виявленню біохімічних процесів взаємодії білків системи гемостазу, які мають місце при застосуванні стрептокінази. Представлені у роботі дані є основою розробки методичних рекомендацій для удосконалення якості лікування хворих на ГІМ та створення більш коректних програм лікування з передбаченням можливих побічних дій, викликаних введенням стрептокінази у кровоток. Розробка удосконаленої програми тромболітичної терапії надасть можливість знизити ризик геморагічних ускладнень у хворих, які проходять лікування стрептокіназою, та запобігти повторному тромбоутворенню.

Особистий внесок здобувача. Здобувачем особисто проаналізовано наукову літературу за темою роботи, самостійно виконано експериментальні дослідження та підготовку матеріалів до публікації. За участі співавторів публікацій проведено інтерпретацію отриманих результатів. Планування експериментальних робіт, аналіз та обговорення отриманих результатів проведено спільно з науковим керівником.

Апробація результатів дисертації. Результати дисертації були повідомлені та обговорені на вітчизняних та міжнародних конференціях: конференція-конкурс робіт молодих учених «Актуальні проблеми біохімії та біотехнології» (Київ, 2006 та 2008); ІХ Український біохімічний з'їзд (Харків, 2006); XXII Congress of International Society on Thrombosis and Haemostasis (Boston, USA, 2009).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 7 наукових праць, з яких - 3 статті у фахових періодичних виданнях, затверджених переліком ВАК України та 4 тези доповідей у матеріалах наукових конференцій та з'їздів.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається з вступу, огляду літератури, матеріалів і методів досліджень, результатів власних досліджень та їх обговорення, заключення, висновків та списку літературних джерел (231 найменування). Роботу викладено на 136 сторінках, проілюстровано 28 рисунками та 1 таблицею.

2. Основний зміст роботи

Матеріали та методи досліджень

Для проведення досліджень використовували дві модельні системи активації плазміногена - систему гемостазу кроля та систему гемостазу свині. Цільну кров людини з додаванням лимоннокислого натрію надано Інститутом хірургії і трансплантології АМН України. В процесі виконання роботи було передбачено заходи по дотриманню морально-етичних норм у відповідності до конвенції Ради Європи про права людини і біомедицини. Для біохімічних досліджень використовували стрептокіназу виробництва “Белфарм”, Білорусь. Дослідження активації та агрегації тромбоцитів проводили на базі Інституту біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України на протоковому цитофлуориметрі COULTER® EPICSTM XLTM Flow Cytometer.

Плазму, яка збагачена тромбоцитами, отримували за методом диференційного центрифугування при 150 g цільної крові з додаванням лимоннокислого натрію (38 г/л) у кінцевому співвідношенні 9:1. Процедуру проводили при +20° С. АДФ-залежну агрегацію тромбоцитів досліджували на агрегометрі АР2110 фірми „Солар”, Білорусь. Як індуктор агрегації використовували розчин АДФ до кінцевої концентрації 2,5 мкМ. Реєстрували такі параметри агрегаційної кривої як ступінь агрегації (%) - максимальний рівень світлопропускання плазми крові після внесення індуктора агрегації. Вміст тромбоцитів стандартизували за показниками приладу.

Визначення активності інгібітора активаторів плазміногена типу 1 (ПАІ-1) під впливом стрептокінази проводили за модифікованим методом Eriksson E., Ranby M., 1988. Плазмін одержували з Глу-плазміногена, виділеного методом афінної хроматографії на лізин-сефарозі з наступною активацією на урокіназ-сефарозі у співвідношенні 2500 МО урокінази на 2 мг плазміногена [Wiman B., Wallen P., 1973]. Реакцію проводили у буфері (0,05 М трис-НСl, рН 7.4), що містив 25 % гліцерину за об'ємом. Активність плазміну складала 14 к.о./мг. Фермент зберігали при 4оС у буфері (0,05 М трис-НСl, рН 7.4), що містив 50 % гліцерину за об'ємом.

Протеолітичну активність плазміну визначали за здатністю гідролізувати казеїн [Robbins V., Summaria L., 1976]. Амідолітичну активність плазміну вимірювали за допомогою хромогенного субстрату S2251, відповідно до методики Castellino F., 1976.

Поліклональні антитіла одержували з сироватки крові імунізованих тварин з використанням протеїн А сефарози за стандартною методикою [Harlow E., Lane D., 1988; Affinity Chromatography. Principles and Methods. Amersham Pharmacia Biotech AB, 2001].

Імуноферментний аналіз у модифікації ELISA проводили у мікропланшетах за стандартною методикою для розчинних білків [Selected methods for antibody and nucleic acid probes. Cold Spring Harbor Laboratory Press, USA, 1993].

Диск-електрофорез у поліакриламідному гелі за присутності додецил- сульфату натрію проводили за стандартною процедурою [Laemli U. K., 1970] на приладі для вертикального гель-електрофорезу (Bio-Rad, США). Як маркери використовували LMW Calibration Kit (Amersham Biosciences, США), а також білкові маркери (Ферментас, Литва).

Метод вестерн-блотингу проводили відповідно до методу, описаного Harlow E., Lane D., 1988. Для проявлення ділянок, які відповідають ПАІ-1, використовувались моноклональні антитіла до інгібітора.

Математичну обробку даних проводили з використанням комп'ютерних програм Origin 6.1. та TotalLab 2. 04. Достовірність різниці показників оцінювали за допомогою t-критерію Стьюдента.

Результати досліджень та їх обговорення

В ході дослідження АДФ-індукованої агрегації тромбоцитів хворих на гострий інфаркт міокарда було виявлено значне підвищення ступеня агрегації тромбоцитів хворих відносно практично здорових донорів. Агрегація тромбоцитів у плазмі крові донорів становила 42±3,1 %, у той час як у хворих людей перевищувала 61 %. Після проведення тромболітичної терапії стрептокіназою пацієнти отримували препарат гепарину, який вводився внутрішньовенно протягом шести наступних діб. Через 1 годину після введення стрептокінази та гепарину відмічалось зменшення здатності до агрегації тромбоцитів у хворих. Як показали проведені дослідження, гепаринова терапія за ГІМ призводить до зниження ступеня агрегації тромбоцитів до безпечного показника лише на третю добу після початку внутрішньовенного введення препарату. Нормалізуючий ефект гепарину на АДФ-залежну агрегацію тромбоцитів є недовготривалим, вже на наступну добу після припинення введення антикоагулянту ступінь агрегації тромбоцитів хворих повертається до вихідного високого показника, що сигналізує про ризик реоклюзії, тобто повторного тромбоутворення.

Зменшення здатності до агрегації тромбоцитів у відповідь на АДФ вже через 1 годину після введення препаратів може бути викликане гепарином і його впливом на вміст фібриногену у плазмі крові пацієнтів, але не можна виключати і впливу самої стрептокінази на тромбоцити. Зважаючи на це, на наступному етапі роботи нами було проведено дослідження присутності стрептокінази у кровотоці хворих на гострий інфаркт міокарда після її внутрішньовенного введення. Наявність тромболітичного агента визначали за його активністю в зразках плазми крові у пацієнтів, хворих на ГІМ. Отримані дані показали присутність стрептокінази у кровотоці через 1 годину після проведення тромболітичної терапії. У хворих спостерігались досить значні коливання залишкового рівня активності стрептокінази - від 2,1 МО/мл до 34 МО/мл. Середня активність тромболітичного агента складала 15,9±3,6 МО/мл. Дослідження, проведені через 1 добу після введення стрептокінази, показали повну відсутність її активності. Це може свідчити як про виведення тромболітичного агента з організму, так і про те, що він циркулює в кровотоці, але знаходиться в неактивній комплексній формі.

Дані ряду досліджень [Hamsten A., 1987; Jansson J., 1991; Добровольский А. Б., 2002] свідчать, що підвищений вміст інгібітора активаторів плазміногена типу 1 є сигналом розвитку атеротромбозу та може спричинити повторний інфаркт. Різка зміна в кровотоці концентрації інгібітора свідчить про активацію тромбоцитів під впливом певного чинника. Тому, для більш детального аналізу стану тромбоцитарної ланки системи гемостазу нами було досліджено динаміку зміни активності ПАІ-1 у зразках плазми крові хворих на ГІМ після прохотження тромболітичної терапії стрептокіназою та внутрішньовенного введення гепарину.

Встановлено, що активність інгібітора у плазмі крові хворих на ГІМ набагато перевищує показник практично здорових донорів. При надходженні хворих до стаціонару активність ПАІ-1 у плазмі крові складала 63,4±4,4 МО ТАП/мл, що перевищує норму у 4 рази. Через 1 годину після внутрішньовенного введення стрептокінази та початку лікування гепарином відмічалось значне зменшення активності інгібітора з поступовою її нормалізацією.

Основною метою проведення тромболітичної терапії є лізис фібринового тромбу у місці його формування. Проте, під впливом стрептокінази у плазмі крові утворюється значна кількість плазміну, що призводить також і до інших ефектів, в тому числі сприяє активації тромбоцитів і може бути причиною геморагічних ускладнень після застосування стрептокінази [Quinton T., 2004]. Тому необхідно розмежувати ефекти, викликані утвореним плазміном та самою стрептокіназою. Для цього було проведено дослідження впливу тромболітичного препарату на активність та вміст ПАІ-1 на 2-х модельних системах - системі гемостазу кроля та системі гемостазу свині. Показано, що стрептокіназа активує плазміноген кроля, внаслідок чого під час моделювання тромболітичної терапії утворюється плазмін. Відносно плазміногена свині препарат інертний.

Виявлено значне зниження активності ПАІ-1 у обох досліджених групах вже через 1 годину після введення тромболітичного препарату. Активність інгібітора у плазмі крові кролів складала 6,45±0,67 МО ТАП/мл, у той час як норма (до введення тромболітичного препарату) становила 12,15±0,95 МО ТАП/мл. Активність ПАІ-1 у зразках плазми крові, отриманих від контрольних свиней, дорівнювала 41,2±7,5 МО ТАП/мл, а після введення стрептокінази складала 17,1±5,3 МО ТАП/мл. Через 3 доби після ін'єкції тромболітичного препарату спостерігалось значне підвищення активності ПАІ-1 у плазмі крові кролей порівняно з контрольним показником. Отримані дані вказують на те, що стрептокіназа може спричинювати певне інгібування системи фібринолізу за рахунок пригнічення утворення плазміну його ендогенними активаторами. При дослідженні активності ПАІ-1 у кровотоці свині було виявлено, що рівень інгібітора на 3-ю добу після моделювання тромболітичної терапії залишається у 2 рази нижчим за норму.

З метою встановлення причини зниження активності інгібітора після внутрішньовенного введення стрептокінази було проведено дослідження вмісту ПАІ-1 у кровотоці кролів та свиней. Аналіз показав, що стрептокіназа викликає зростання концентрації інгібітора у кролів до 16,5 ±1,3 нг/мл через 1 годину після введення тромболітичного препарату, в той час як до введення вміст ПАІ-1 складав 8,4±2,3 нг/мл. У свиней спостерігалась аналогічна ситуація - вміст ПАІ-1 зростав до 46,5±5,3 нг/мл при нормі 28,7±2,3 нг/мл. На 3-ю добу після тромболітичної терапії концентрація інгібітора нормалізувалась у обох групах тварин - вміст ПАІ-1 становив 6,4±1,3 нг/мл та 28,9 ±2,5 нг/мл у кролів та у свиней відповідно.

Таким чином, пік активації тромбоцитів припадає на початок тромболітичної терапії стрептокіназою. Через 3 доби після введення препарату інгібітор активаторів плазміногена типу 1 вже не секретується клітинами. Зниження активності ПАІ-1 на фоні зростання концентрації інгібітора може свідчити про те, що ПАІ-1 знаходиться у неактивній формі або відбувається процес його комплексоутворення з тканинним активатором плазміногена.

Виходячи з вище згаданого, паралельно з дослідженням активності і концентрації інгібітора за умов впливу стрептокінази було вивчено вміст плазміногена у зразках плазми крові пацієнтів, хворих на ГІМ, а також у зразках плазми крові кролів та свиней. Показано, що тромболітична терапія хворих на гострий інфаркт міокарда призводить до значного зниження вмісту плазміногена вже через 1 годину після введення стрептокінази. При надходженні хворих до стаціонару рівень плазміногена складав 97,3±4,2 %, у той час як після застосування препарату знижувався до 30,2±3,4 %. У кролів тромболітичний засіб викликав очікуване зниження вмісту плазміногена з 100 % до 66,6±3,5 %. Цей показник є вищим, ніж у дослідженій групі хворих на ГІМ, що пояснюється меншою здатністю стрептокінази активувати плазміноген кроля відносно плазміногена людини. У свиней не спостерігалось зниження вмісту проферменту, що пояснюється неможливістю взаємодії стрептокінази з плазміногеном цього виду. Таким чином, отримані результати вказують на те, що стрептокіназа здатна активувати тромбоцити та викликати зміни вмісту та активності ПАІ-1 без участі плазміну. Необхідно зазначити, що порушення функціонування клітин у людини та кроля пов'язане не лише з впливом на тромбоцити самої молекули стрептокінази, а й з присутністю в кровотоці значних кількостей плазміну, який утворюється під дією цього препарату.

Беручи до уваги отримані результати, проведено дослідження функціонування тромбоцитів в модельних системах in vitro для встановлення можливих шляхів активації та подальшої агрегації клітин в результаті потрапляння в кровоток стрептокінази під час проведення тромболітичної терапії або під час стрептококової інвазії.

При дослідженні вмісту ПАІ-1 у плазмі крові кроля, яка є збагаченою тромбоцитами, встановлено концентраційну залежність впливу срептокінази на вивільнення інгібітора з клітин. Максимальний ефект проявлявся за активності тромболітичного препарату 200 МО/мл зразка: концентрація ПАІ-1 перевищувала контрольний показник у 1,6 раза.

При цьому необхідно зауважити, що максимальний рівень інгібітора, який секретується цитоплазматичними гранулами тромбоцитів, відповідає загальноприйнятій терапевтичній дозі стрептокінази (в середньому 1,5 млн МО на 70 кг). Таким чином, отримані результати дають підстави для використання більш низьких доз тромболітичного агента, ніж застосовують у сучасній медичній практиці.

Для якісного аналізу білків, які секретуються тромбоцитами під дією стрептокінази, було проведено диск-електрофорез та вестерн-блотінг. Аналіз показав, що внаслідок активації тромбоцитів стрептокіназою помітно зростає вивільнення з б-гранул вільної форми інгібітора порівняно з контролем. Також стрептокіназа зумовлює появу комплексів ПAI-1 з молекулярною масою 72 кДа та 88 кДа. Помітно збільшується вивільнення фрагмента інгібітора з молекулярною масою 21 кДа.

Отримані дані свідчать на користь того, що фрагментація молекул ПАІ-1 відбувається під дією кислих гідролаз, які містяться у б-гранулах тромбоцитів. Тромболітичний препарат може спричиняти секрецію з клітин цих гідролітичних ферментів, які, в свою чергу, розщеплюють інгібітор до фрагментів, ідентифікованих на блотограмі

Дослідження впливу стрептокінази на процес активації тромбоцитів в умовах in vivo. Показано, що вміст ПАІ-1 у фракції тромбоцитів кроля до введення тромболітичного препарату складав 41±5 нг/мл, але на 7 добу після застосування стрептокінази концентрація інгібітора у фракції тромбоцитів зростала і досягала 95,8±7,4 нг/мл. Встановлений ефект можна пояснити значно більшою здатністю клітин до активації, що в свою чергу може вказувати на наявність порушень в мембрані тромбоцитів внаслідок дії тромболітичного засобу.

При проведенні досліджень впливу стрептокінази на активацію та агрегацію тромбоцитів використовували плазму крові, яку позбавляли плазміногена. Стрептокіназу використовували у концентрації 200 од/мл зразка. Також було проведено дослідження впливу поліклональних антитіл до стрептокінази та імунних комплексів на активацію та агрегацію тромбоцитів. Антитіла до стрептокінази, фібриногену, протромбіну та тканинного активатора плазміногена використовували у концентрації 0,4 мг/мл. Для кожного експерименту число повторів складало n=5, наведені графіки є типовими для кожної серії дослідів.

Показано, що внесення стрептокінази у плазму крові, яка збагачена тромбоцитами, контрольних кролів активує клітини, проте не викликає їх агрегації

Наступні дослідження проводились з використанням плазми крові кроля, яка збагачена тромбоцитами та позбавлена плазміногена. Ефективність видалення плазміногена перевіряли, використовуючи специфічний хромогенний субстрат для плазміну S2251. Встановлено, що внесення антистрептокіназних антитіл не викликає зміни форми клітин, а отже, і їх активації. Стрептокіназа також не спричинювала зміну форми тромбоцитів. Проте спільне внесення стрептокінази та поліклональних антитіл до неї, тобто комплексу стрептокіназа-антитіло, викликало зміну бічного світлорозсіювання, що вказує на активацію тромбоцитів

Агрегація тромбоцитів не спостерігалась у жодному з досліджених випадків. Слід зауважити, що дія комплексу вивчалась в умовах відсутності плазміногена в плазмі крові, тобто вплив плазміну як на активацію, так і на агрегацію тромбоцитів було виключено. Показано, що поліклональні антитіла до фібриногену, протромбіну та тканинного активатора плазміногена не викликають активацію чи агрегацію тромбоцитів.

Таким чином, отримані результати свідчать про те, що активація тромбоцитів здійснюється специфічно комплексом стрептокіназа-антитіло, інші імунні комплекси не викликають активацію клітин. Можливо в умовах in vivo при проведенні тромболітичної терапії має місце сукупна дія стрептокінази, антитіл та утвореного плазміну на тромбоцити, що призводить до гемморагічних ускладнень у пацієнтів.

При проведенні подальших досліджень моделювали утворення антитіл проти стрептокінази в кровотоці in vivo. Для цього кролям внутрішньовенно вводили стрептокіназу з урахуванням маси тварин (22000 МО/кг маси). Слід зауважити, що у інтактних кролів антитіла до стрептокінази у кровотоці не виявлялись. Плазму крові, яка збагачена тромбоцитами, позбавляли плазміногена афінною хроматографією на лізин-сефарозі за стандартною методикою. Титр антистрептокіназних антитіл визначали на 30 добу після введення тромболітичного препарату. За кривою титрування антистрептокіназних антитіл у сироватці крові кроля титр антитіл становив 1:1000. До плазми крові кроля з підвищеним титром антистрептокіназних антитіл вносили стрептокіназу у концентрації 200 од/мл. Плазма крові була попередньо позбавлена плазміногена, після чого до неї додавали фракцію чистих тромбоцитів кроля. Встановлено, що стрептокіназа викликає активацію тромбоцитів, агрегація клітин при проведенні даного досліду не спостерігалась.

Отримані дані вказують на те, що повторне введення стрептокінази у організм може викликати активацію тромбоцитів, що пов'язано з наявністю в кровотоці антитіл до данного тромболітичного агента. У свою чергу, дослідження АДФ-індукованої агрегації тромбоцитів хворих на гострий інфаркт міокарда показало, що ступінь агрегації клітин після припинення гепаринової терапії має тенденцію до зростання і повертається до вихідного високого показника, який був встановлений при надходженні хворого до стаціонару. Після проведення тромболітичної терапії стрептокіназою у пацієнтів з'являється додатковий фактор ризику - утворення у плазмі крові антитіл до тромболітичного агента. У зв'язку з цим постала необхідність дослідити вплив стрептокінази на АДФ-залежну агрегацію тромбоцитів з використанням модельних систем in vivo.

Для моделювання впливу тромболітичної терапії на тромбоцитарну ланку системи гемостазу, кролям внутрішньовенно вводили стрептокіназу. Дозу стрептокінази для ін'єкції розраховували, беручи до уваги масу тварини. Для досліджень відбирали зразки крові на 7-у добу та на 7-ий тиждень після введення тромболітичного препарату. Наявність антитіл до стрептокінази визначали методом імуноферментного аналізу у модифікації ELISA. Дані строки було обрано згідно з таких міркувань: через 7 діб після застосування стрептокінази антитіла не виявлялись у плазмі крові тварин, таким чином цей фактор ризику було виключено з дослідження впливу тромболітичного агента на агрегацію тромбоцитів. На 7-ий тиждень після моделювання терапії стрептокіназою очікувалась поява у кровотоці антитіл, які у свою чергу впливають на функціонування тромбоцитарної ланки системи гемостазу. Визначений за кривою титрування титр антистрептокіназних антитіл у сироватці крові кроля становив 1:1000.

В ході досліджень було показано, що АДФ-залежна агрегація клітин у плазмі крові тварин має тенденцію до інгібування стрептокіназою. Ефект інгібування є дозозалежним, найбільшу ступінь інгібування АДФ-залежної агрегації тромбоцитів у плазмі крові кролів, отриманої через 7 діб після введення препарату стрептокінази, має доза у 16 мкг тромболітичного агента на 1 мл проби. Нижчі концентрації стрептокінази проявляли значно меншу інгібуючу дію на агрегацію тромбоцитів, індуковану АДФ.

На 7-му добу після введення тромболітичного агента не спостерігалось агрегації тромбоцитів при внесенні до плазми стрептокінази. При проведенні даного експерименту ступінь агрегації клітин у плазмі крові кроля складав 3±2 %.

Дослідження АДФ-залежної агрегації тромбоцитів через 7 тижнів після внутрішньовенного введення тромболітичного агента дозволило оцінити вплив антистрептокіназних антитіл на агрегацію тромбоцитів. В ході експериментів було встановлено, що ступінь агрегації тромбоцитів у відповідь на АДФ значно підвищився відносно вихідного. У контрольних кролів (тваринам не вводили тромболітичний агент) ступінь АДФ-залежної агрегації тромбоцитів складав 46±7 %, а через 7 тижнів після моделювання тромболітичної терапії досяг 81±5 %, що майже у 2 рази перевищує нормальний показник.

Через 7 тижнів після внутрішньовенного введення стрептокінази у кролів не спостерігалось ефекту інгібування стрептокіназою АДФ-залежної агрегації тромбоцитів. Дози стрептокінази 16 мкг/мл та 32 мкг/мл спричинювали посилення ступеня агрегації на 4 % та 15 % відповідно.

Ці дані корелюють з отриманими при дослідженні АДФ-залежної агрегації тромбоцитів у хворих на гострий інфаркт міокарда. При надходженні до стаціонару ступінь АДФ-залежної агрегації тромбоцитів складав 61±8,2 %, що майже у 2 рази перевищує нормальний показник. Введення хворим гепарину після проведення тромболітичної терапії стрептокіназою сприяло нормалізації чутливості тромбоцитів, проте одразу після припинення гепаринової терапії ступінь агрегації тромбоцитів збільшувався і на 30 добу лікування складав 66±10,8 %.

Таким чином, результати проведених досліджень свідчать, що стрептокіназа має здатність впливати на мембрану тромбоцитів. Додавання цього тромболітичного агента у плазму крові з невисоким титром антитіл до стрептокінази викликає інгібування АДФ-залежної агрегації тромбоцитів. При цьому не можна виключати можливість конкурентного зв'язування стрептокінази з рецепторами до АДФ. Встановлено, що на 7-й тиждень після внутрішньовенного введення препарату кролям ступінь АДФ-залежної агрегації тромбоцитів значно перевищує нормальний показник.

Такі дані можуть вказувати на глибокі порушення у тромбоцитарній мембрані, зростання її нестабільності та збільшення здатності тромбоцитів до активації. Активація і агрегація тромбоцитів, викликані АДФ, відіграють основну роль у розвитку та патогенезі артеріальних тромбозів. Дія стрептокінази на тромбоцити призводить до підвищення чутливості останніх до АДФ, що в подальшому може спричинювати агрегацію клітин у відповідь на повторне введення тромболітичного агента.

Висновки

1. Досліджено вплив стрептокінази на активацію та агрегацію тромбоцитів, а також спряжені з ними процеси секреції ПАІ-1. На різних модельних системах активації плазміногена показано, що стрептокіназа має безпосередній, не опосередкований плазміном, вплив на тромбоцитарну ланку системи гемостазу.

2. Показано, що застосування стрептокінази та гепарину за гострого інфаркту міокарда сприяє нормалізації активності ПАІ-1, проте ступінь АДФ-залежної агрегації тромбоцитів у 1,5 раза перевищує контрольний показник.

3. Встановлено, що вплив стрептокінази на активацію тромбоцитів з наступним вивільненням ПАІ-1 є дозозалежним в плазмі крові кроля in vitro.

4. Показано, що ПАІ-1 вивільнюється з тромбоцитів як у вільній, так і в комплексних формах, що є причиною зниження його інгібіторного потенціалу.

5. Утворення у плазмі крові комплексу стрептокіназа-антитіло викликало активацію тромбоцитів, при цьому дія комплексу не опосередковувалась впливом плазміну.

6. Пізні терміни після внутрішньовенного введення стрептокінази (7-ий тиждень) характеризувались зростанням чутливості тромбоцитів до АДФ у 2 рази відносно контролю.

Список опублікованих праць за темою дисертації

1. Бурлова-Васильєва Н. К. Вплив стрептокінази на вміст інгібітора активаторів плазміногену 1 типу / Н. К. Бурлова-Васильєва, Є. М. Краснобрижа, О. М. Савчук, Г. Л. Волков // Укр. біохім. журн. - 2006. - Т. 78, № 3. - С. 113-117. (Здобувачем особисто досліджено вплив стрептокінази на вивільнення тромбоцитами інгібітора активаторів плазміногена типу 1під впливом стрептокінази та встановлено молекулярні форми інгібітора, який секретується клітинами.)

2. Бурлова-Васильєва Н. К. Процес активації тромбоцитів у присутності стрептокінази / Н. К. Бурлова-Васильєва, Є. М. Краснобрижа, О. М. Савчук, Г. Л. Волков // Укр. біохім. журн. - 2007. - Т. 79, № 6. - С. 60-64. (Здобувачем особисто досліджено вплив стрептокінази, антистрептокіназних антитіл та імунних комплексів на активацію і агрегацію тромбоцитів кроля).

3. Бурлова-Васильєва Н. К. Стрептокиназа - индуктор возникновения неспецифических белок-белковых взаимодействий в системе гемостаза / Н. К. Бурлова-Васильєва, С. П. Гаврилюк, Є. М. Краснобрижа, О. М. Савчук, Г. Л. Волков, Т. Н. Платонова // Експериментальна та клінічна фізіологія і біохімія. - 2009. - Т. 45, № 2. - С. 47-54. (Здобувачем особисто досліджено активність та вміст інгібітора активаторів плазміногена типу 1 у кровотоці кролей та свиней після внутрішньовенного введення стрептокінази).

4. Бурлова-Васильєва Н. К. Вплив стрептокінази на тромбоцитарну ланку системи гемостазу / Н. К. Бурлова-Васильєва // Актуальні проблеми біохімії та біотехнології-2006: конференція-конкурс робіт молодих учених, присвячена 100-річчю від дня наротження Володимира Олександровича Бєліцера, 6-7 черв. 2006 р. : тези доповідей. - К., 2006. - С. 4.

5. Бурлова-Васильєва Н. К. Активація тромбоцитів за присутності стрептокінази / Є. М. Краснобрижа, Н. К. Бурлова-Васильєва // IX Український біохімічний з'їзд, 24-27 жовт. 2006 р. : матеріали з'їзду. - Х., 2006. - С. 47.

6. Бурлова-Васильєва Н. К. Параметри інгібітора активаторів плазміногена 1 типу за умов дії стрептокінази / Н. К. Бурлова-Васильєва, Є. М. Краснобрижа, О. М. Савчук // IX Український біохімічний з'їзд, 24-27 жовт. 2006 р. : матеріали з'їзду. - Х., 2006. - С. 103.

7. Burlova-Vasilieva N. The influence of streptokinase on platelet link of haemostatic system / N. Burlova-Vasilieva, O. Savchuk, I. Krasnobrizha and G. Volkov // XXII Congress: The International Society on Thrombosis and Haemostasis, 11-16 of July 2009: abstracts. - Boston, 2009. - P. 1064.

Анотація

Бурлова-Васильєва Н. К. Вплив стрептокінази на тромбоцитарну ланку системи гемостазу. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 - біохімія. - Київський національний університет імені Тараса Шевченка, Київ, 2010.

Дисертація присвячена дослідженню особливостей взаємодії стрептокінази з тромбоцитарною ланкою системи гемостазу.

Дослідження проводились на різних системах активації плазміногена in vivo та in vitro. У роботі показано, що застосування стрептокінази та гепарину за гострого інфаркту міокарда сприяє нормалізації активності інгібітора активаторів плазміногена типу 1. Проте вже на наступну добу після припинення введення гепарину ступінь АДФ-залежної агрегації тромбоцитів хворих повертається до початкового високого показника. Було показано, що через 1 добу після проведення тромболітичної терапії активність стрептокінази у кровотоці хворих на ГІМ не виявляється. Дослідження впливу стрептокінази in vivo на тромбоцити кролів та свиней показало зростання концентрації ПАІ-1 на фоні падіння активності інгібітора. Доведено, що стрептокіназа викликає вивільнення ПАІ-1 з тромбоцитів як у вільній, так і в комплексних формах.

Через 7 діб після внутрішньовенного введення стрептокінази вміст інгібітора у фракції відмитих тромбоцитів кроля був значно підвищеним відносно норми. При дослідженні взаємодії імунних комплексів з тромбоцитами було встановлено, що комплекс стрептокіназа-антитіло специфічно активує клітини. Виявлено, що ступінь АДФ-залежної агрегації тромбоцитів через 7 тижнів після введення тромболітичного препарату у 2 рази перевищує нормальний показник, а повторне застосування стрептокінази супроводжується подальшим зростанням чутливості тромбоцитів до АДФ.

Ключові слова: система гемостазу, стрептокіназа, інгібітор активаторів плазміногена типу 1, тромбоцити, АДФ-залежна агрегація тромбоцитів.

Аннотация

Бурлова-Васильєва Н. К. Влияние стрептокиназы на тромбоцитарное звено системы гемостаза. - Рукопись.

Диссертация на получение научной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.04 - биохимия. - Киевский национальный университет шимени Тараса Шевченко, Киев, 2010.

Диссертация посвящена исследованию особенностей взаимодействия стрептокиназы с тромбоцитарным звеном системы гемостаза. Исследования проводились на разных системах активации плазминогена in vivo и in vitro. В работе показано, что введение стрептокиназы и гепарина при остром инфаркте миокарда способствует нормализации активности ингибитора активаторов плазминогена типа 1. Тем не менее уже на следующие сутки после прекращения введения гепарина степень АДФ-зависимой агрегации тромбоцитов больных возвращается к исходному высокому показателю. Показано, что через 1 сутки после проведения тромболитической терапии активность стрептокиназы в кровотоке больных ОИМ не обнаруживается. Исследование влияния стрептокиназы in vivo на тромбоциты кроликов и свиней показало возрастание концентрации ПАИ-1 на фоне падения активности ингибитора. Доказано, что стрептокиназа вызывает секрецию ПАІ-1 из тромбоцитов как в сободной, так и в комплексных формах. Через 7 суток после внутривенного введения стрептокиназы содержание ингибитора во фракции отмытых тромбоцитов кролика значительно превышало норму. При исследовании взаимодействия иммунных комплексов с тромбоцитами было установлено, что комплекс стрептокиназа-антитело специфично активирует клетки. Обнаружено, что степень АДФ-зависимой агрегации тромбоцитов через 7 недель после введения тромболитического препарата в 2 раза превышает нормальный показатель, а повторное использование стрептокиназы сопровождается дальнейшим возростанием чувствительности тромбоцитов к АДФ.

Ключевые слова: система гемостаза, стрептокиназа, ингибитор активаторов плазминогена І типа, тромбоциты, АДФ-зависимая агрегация тромбоцитов.

Summary

Burlova-Vasilieva N. K. Influence of streptokinase on the platelet link of the haemostatic system. - Manuscript.

Dissertation for the candidate of biological sciences degree in specialty 03.00.04 - Biochemistry. - Kyiv National Taras Shevchenko University, Kyiv, 2010.

The present study is dedicated to the investigation of streptokinase interactions features with platelet link of the haemostatic system. Researches were conducted on the different plasminogen activation systems in vivo and in vitro. It was shown that treatment of AMI patients with streptokinase and heparin inhibit АDP-dependent aggregation of platelets. On the next day after heparin therapy was canceled, the platelet aggregation degree returned to the high level. The activity of streptokinase was detected in 1 hour after thrombolytic therapy which testifies in behalf of the direct influence of streptokinase on platelets. As increased PAI-1 level attends vessels thrombosis development and promotes cardiovascular diseases, the dynamics of PAI-1 activity in blood plasma of AMI patients was investigated. Inhibitor activity in blood plasma of AMI patients exceeded the index of relatively healthy donors. Streptokinase and heparin treatment led to inhibitor activity reduction.

On the next stage of work influence of streptokinase on rabbits and porcine platelets was investigated in vivo. It was established that growth of PAI-1 concentration was accompanied with its activity falling after streptokinase usage. As porcine plasminogen was not activated by streptokinase, obtained results proved that streptokinase is able to activate platelets and cause PAI-1 release without participation of plasminogen.

For the next experiments we obtained rabbit platelet rich plasma and studied influence of streptokinase on PAI-1 secretion. In vitro investigation showed, that streptokinase had dose-depending influence on PAI-1 release from platelets, which testifies to the streptokinase low-dose treatment. It was also shown that streptokinase caused PAI-1 release from platelets б-granules not only in a free form but also in a complex with certain proteins. Taking into account obtained results, the influence of streptokinase on rabbit platelets in 7 days after intravenous streptokinase treatment was investigated. PAI-1 level in cleaned platelets fraction was considerably increased in comparison with a norm. This result can be explained with diminishing stability of platelet membrane and considerably increment of platelet activation ability which specifies deep damages in platelet membrane as a result of streptokinase action.

As streptokinase has immunogenic properties, on the next stage of work the action of antistreptikinase antibodies on rabbit platelets in vitro was investigated. It was shown that streptokinase did not cause platelet activation in plasminogen depleted plasma but streptokinase-antistreptokinase complex formation caused activation of platelets without plasmin participation. Fibrinogen-antibody, prothrombin-antibody and tissue type plasminogen activator-antibody complexes did not cause activation of platelets. It was established that anti-streptokinase antibodies did not cause platelet activation in the absence of streptokinase.

During the investigation process of streptokinase influence on ADP-dependent platelet aggregation the tendency towards inhibition of ADP-dependent aggregation was revealed. Inhibition effect was dosedependent, the most significant inhibition of ADP-dependent platelet aggregation displayed 16 mkg/ml of thrombolytic agent. Also the influence of antistreptokinase antibodies on ADP-dependent platelet aggregation was studied. It was shown that platelet aggregation degree in response to ADP significantly increased when compared to initial after 7 weeks intravenous injection in rabbits blood flow. Inhibition effect of streptokinase on ADP-dependent platelet aggregation was absent.

Keywords: haemostatic system, streptokinase, plasminogen activators inhibitor type-1, platelets, ADP-dependent platelet aggregation.

Размещено на Allbest.ru