Моноклональные антитела

Размещено на http://www.allbest.ru/

Введение

Практически 30 лет тому назад в иммунологии произошло событие, которое было отмечено Нобелевской премией (Kuhler and Milstein, 1984), и которое положило начало новой эры в создании диагностических и лечебных препаратов. Это событие - разработка технологии получения моноклональных антител. Чем же моноклональные антитела отличаются от обычных, поликлональных, антител, которые продуцируются в организме млекопитающего (например, кролик, мышь, лошадь и др.) при введении антигена. Во-первых, известно, что в сыворотке крови иммунизированного животного будет содержаться, прежде всего, 2% антител, специфически реагирующих с антигеном, использованным для иммунизации. Остальные антитела будут направлены против других антигенов, с которыми организм животного встречался ранее; такие антитела представляют собой общий антительный иммунный репертуар (то, что мы называем «естественные антитела»). моноклональный антиген иммунизация селекция

Во-вторых, известно, что подавляющее большинство естественно встречающихся антигенов являются сложными структурами и могут содержать в своем составе множество эпитопов (антигенных детерминант), которые иммунная система распознает и ответит выработкой конкретного специфического антитела. Таким образом, термин - поликлональные антитела - обозначает то обстоятельство, что в сыворотке иммунизированного животного содержатся антитела не против одной антигенной детерминанты (эпитопа), а против множества антигенных детерминант (эпитопов) конкретного антигена. Более того, эти антитела будут принадлежать не одному классу (или даже подклассу), а будут совокупностью антител разных классов.

Моноклональные антитела тем и отличаются от поликлональных, что они принадлежат к одному классу иммуноглобулинов (как правило, IgG) и что по специфичности своей они направлены против одной единственной детерминанты конкретного сложного антигена. Образно говоря, если организм представить стогом сена, а чужеродный микроб с характерной для него антигенной детерминантой - иголкой, то обнаружить эту иголку с помощью моноклонального антитела не составляет трудностей.

В последующем такие моноклональные антитела подвергаются очистке различными методами и используются либо как диагностический инструмент, либо в виде фармпрепарата.

Нет сомнений, что в будущем диагностика и лечение огромного числа состояний и заболеваний будет связана с развитием гибридомной и рекомбинантной технологии. Например, к 2005 году в США разрешены к использованию в клинике 36 фармпрепаратов на основе моноклональ-ных антител. Еще большее их количество проходит клинические испытания.



1. Основная часть

1.1 Получения моноклональных антител методом гибридомной технологии

Основные этапы:

Смысл гибридомной технологии заключается в создании гибридной клетки (получившей название «гибридома»), получаемой путем слияния антитело- продуцирующего В-лимфоцита и опухолевой клетки миеломного или плазмацитомного ряда. Такая гибридома обладает свойством секретировать антитела, взятой у В-лимфоцита, и способностью к бесконечному делению, взятой у опухолевой клетки.

Источником В-лимфоцитов для получения гибридомы служат лимфоидные органы животного, гипериммунизированного тем антигеном, против которого хотят получить моноклональные АТ. Гипериммунизация сильно повышает процентное содержание В-лимфоцитов, продуцирующих антитела желаемой специфичности, в общей популяции клеток лимфоидного органа. Лимфоциты, выделенные из тканей селезенки,лимфоузлов, периферической крови, не способны к самостоятельному делению и живут в культуре всего 10-14 дней. Миеломные клетки, напротив, могут жить и делиться в культуре сколь угодно долго, но не продуцируют антитела нужной специфичности (чаще используют линии миелом или плазмацитом, вообще не продуцирующие никаких антител).

В результате процедуры гибридизации (слияния) образуется гетерогенная популяция клеток, состоящая, во-первых, из неслившихсяклеток лимфоидного органа; во-вторых, из неслившихся клеток миеломы; в-третьих, из гибридов лимфоцит+лимфоцит и миелома+миелома; в четвертых, из гибридов лимфоцит+миелома, из которых лишь часть (часто весьма небольшая) стабильно продуцирует антитела нужной специфичности. Понятно, что необходимо отделить интересующие клетки от всех остальных. От неслившихся лимфоцитов и гибридовлимфоцит+лимфоцит избавляться не нужно: через несколько дней они умрут сами; от неслившихся опухолевых клеток и гибридов миелома+миелома избавляются с помощью селективных сред (подробности ниже); среди оставшихся клеток (гибридов лимфоцит+миелома) отбирают нужные путем клонирования, когда из одной клетки выращивают популяцию клеток (клеточный клон) и отбирают среди таких клонов лишь те, которые стабильно продуцируют антитела требуемой специфичности.

Секрецию антител определяют различными методами скрининга супернатантов гибридом, другими словами, проводят анализ тойкультуральной среды, в которой рос конкретный клон. При наличии в супернатанте желаемых антител проводят еще одно или несколькоклонирований, затем клетки нарабатывают для получения большего количества антител либо в культуре, либо в перитонеальной полости мышей (крыс). Далее антитела выделяют из культуральной или асцитной жидкости и проводят более детальные исследования на предмет их пригодности для использования в тех целях, для которых моноклональные АТ были получены. Клетки-продуценты можно заморозить и хранить в жидком азоте долгое время.



Рассмотрим теперь подробнее каждый из этапов получения моноклональных АТ:

1 этап. Иммунизация

Иммунизация- самый «творческий» этап в процессе получения моноклональных антител, именно эффективностью иммунизации определяется в наибольшей степени конечный успех всего предприятия. Тут невозможно дать какой-то единый рецепт, поскольку выбор схемы иммунизации и использование различных приемов, повышающих эффективность иммунизации, целиком зависят от свойств конкретного антигена.

1.2 Выбор объекта иммунизации

В первую очередь необходимо выбрать объект иммунизации. На сегодняшний день известны три вида гибридомных систем: мышиная, крысиная и человеческая. Самой распространенной сегодня является мышиная гибридома, а самая редкая - человеческая, чему имеется ряд причин:

а) Мыши- наиболее хорошо изученный и доступный объект для работы в лаборатории, то же относится и к линиям мышиных миелом, используемых для слияния.

б) Все линии крысиных миелом, адаптированные для гибридомных работ, запатентованы, поэтому коммерческое использование крысиных гибридом регламентируется соответствующими патентами. Все мышиные линии миелом свободны от патентных ограничений.

в) Гипериммунизацию грызунов провести проще, чем иммунизацию человека. В большинстве случаев гипериммунизация человека вообще невозможна по этическим соображениям.

г) Источником иммунных В-лимфоцитов грызунов могут служить ткани любых лимфоидных органов, тогда как у человека возможно лишь взять периферическую кровь, где общее содержание В-лимфоцитов не превышает 20% от всех клеток. В редких случаях можно использовать удаленные миндалины пациентов, где содержание В-лимфоцитов может достигать 60%, но они, как правило, инфицированы и секретируют антитела именно против этого инфекционного агента.

д) При получении человеческой гибридомы существует проблема гистосовместимости клеток миеломы и В-лимфоцитов: у грызунов для слияния берутся В-лимфоциты и клетки миеломы, полученные от одной линии животных, и поэтому имеющих сходный репертуар антигенов гистосовместимости на клеточных поверхностях. Для человека это условие недостижимо, что в конечном итоге выражается очень низкой эффективностью слияния и крайне нестабильной антителопродукцией человеческих гибридом.

е) Мышиные и крысиные антитела достаточно просто нарабатывать в асцитных жидкостях; для человеческих гибридом возможна наработка лишь в культуре, либо с применением генноинженерных методов.

Для иммунизации мышей чаще всего используют линию BALB/c, все линии мышиных миелом происходят от этой линии. В случае низкоиммуногенных антигенов можно попытаться иммунизировать мышей другой линии, к некоторым антигенам они дают более сильный иммунный ответ по сравнению с BALB/c. Наработку таких гибридом в асцитных жидкостях производят на потомках первого поколения, полученных от скрещивания BALB/c и линии, использованной для иммунизации.

Для иммунизации крыс литература настойчиво рекомендует линию LOU/C, но вполне удовлетворительные результаты получаются с более доступными в нашей стране крысами линии WISTAR.

1.3 Схемы иммунизации мышей

1.3.1 Короткая схема иммунизации

При такой схеме иммунизации, антиген вводят дважды с двухнедельным интервалом в подушечки задних лап. Количество вводимого антигена берут в пределах от 5 до 200мкг на мышь в зависимости от его доступности и иммуногенности, для токсичных антигенов доза может быть понижена до 0,1мкг. Для первого введения антигена (раунда иммунизации) раствор антигена объемом 50-200 мкл смешивают с полным адъювантом Фрейнда (ПАФ), представляющего собой минеральное масло совзвесью убитых микобактерий. При активном перемешивании раствора антигена с ПАФ получается мелкодисперсная эмульсия, призванная замедлить и пролонгировать поступление антигена в ткани. Считается, что убитые микобактерии усиливают иммунный ответ, что, однако, у многих исследователей вызывает сомнение. Второй раунд иммунизации проводят так же, как и первый, но с использованием неполного адъюванта Фрейнда (НАФ), в котором отсутствуют микобактерии.

В случае проблемных антигенов полезно иммунизировать группу животных разными дозами антигена и с использованием разных схем иммунизации. На третий или четвертый день после второго раунда иммунизации нужно взять пробы крови и проанализировать их на содержание антител против требуемого антигена. Для дальнейшей работы выбирают животное с максимальным титром, исключение составляют антигены- белковые токсины, где иногда высокий титр специфических антител сочетается с большим процентом убитых токсином В-лимфоцитов. В таких случаях нужно брать животное, имеющее не самый высокий титр и/или обращать внимание на жизнеспособность клеток, берущихся для слияния.

На четвертый день после второго раунда иммунизации животное забивают, и клетки подколенных лимфоузлов сливают с клетками миеломы.

1.3.2 Длинные схемы иммунизации

В случае неэффективности короткой схемы иммунизации пробуют различные виды длинных схем. При этом обычно животных иммунизируют с интервалом 2-4 недели либо внутрибрюшинно, либо подкожно (реже внутривенно или орально), используя для первого раунда иммунизации ПАФ, а для последующих- НАФ.

На 10-14 день после каждого раунда иммунизации (начиная со второго) кровь иммунизируемых животных проверяют на содержание специфических антител. Если титр антител достиг желаемого уровня, проводят последний раунд иммунизации (называемый бустированием), вводя раствор антигена внутривенно без адъювантов, в количестве 1/10 от предыдущих доз. В результате бустирования избирательно стимулируются клоны, продуцирующие антитела высокой аффинности к антигену.

1.4 Предварительная обработка антигенов перед иммунизацией

а) Токсичные антигены часто подвергают денатурации нагреванием или добавлением денатурирующих агентов (мочевины, гуанидилхлорида и др.). Токсичность при этом снижается (не всегда), но утрачиваются многие антигенные детерминанты, присущие неденатурированному (нативному) антигену. В результате получаемые моноклональные АТ узнают лучше денатурированный антиген.

б) Иногда молекулы антигена сшивают друг с другом (полимеризуют) с целью увеличения молекулярного веса и/или уменьшения токсичности.

в) Вирусы и бактерии перед иммунизацией, как правило, инактивируют нагреванием, либо обработкой фенолом, формальдегидом, глутаральдегидом и др. для уменьшения их токсичности и эпидемиологической опасности. Грамотрицательные бактерии, кроме того, иногда обрабатывают лизоцимом, чтобы убрать ЛПС с их поверхности и обеспечить иммунный ответ против бактериальных белков.



2. Гибридизация В-лимфоцита с клеткой миеломы

Отцы гибридомной технологии Келер и Мильштейн добивались слияния клеток при помощи вируса Сендай. Сейчас для этой цели все используют полиэтиленгликоль (ПЭГ), как более удобное, эффективное и безопасное средство. Молекулярный вес ПЭГ, пригодного для слияния, от 20 до 20000, но чаще используют ПЭГ массой 600-6 000.

Полиэтиленгликоль токсичен для клеток, и его токсичность возрастает с уменьшением молекулярного веса. Слияние клеток происходит во время инкубации их в 35-50% ПЭГ, время инкубации зависит от концентрации ПЭГ и от его молекулярного веса (для 50% ПЭГ мол. веса 1 500 это приблизительно 1 минута). Недостаточное время инкубации приведут к очень низкому проценту слившихся клеток, а избыточное- к большому проценту погибших клеток вследствие токсичности ПЭГ. Хорошо работает такой компромиссный вариант, когда клетки сначала инкубируются при мягком перемешивании в 50% ПЭГ в течение 1 мин, затем процент ПЭГ снижается до 35% медленным добавлением бессывороточной среды, и клетки инкубируются еще 5-7 минут. Затем медленно, но с нарастающим темпом и при аккуратном перемешивании суспензия клеток далее разбавляется средой, потом центрифугируется и высевается на культуральные планшеты.

Точный механизм гибридизации клеток еще недостаточно изучен. Вначале, по-видимому, происходит агглютинация (склеивание) клеток, затем слияние клеточных мембран и, наконец, слияние ядер и перестройки хромосомного материала. Имеются данные, что сливаются, в основном, клетки, находящиеся в стадии интенсивного деления. По этой причине клетки миеломы за 12-24 часа до гибридизации переводят в условия, способствующие максимальной скорости роста клеток (повышение содержания фетальной сыворотки, витаминов и ростовых факторов в культуральной среде). Иммунизация в свою очередь стимулирует рост клонов В-лимфоцитов- продуцентов специфических к антигену антител.



3. Культивирование клеток

Обычные условия культивирования миеломных и гибридомных клеток- 37°С и 5% СО2. Основа культуральной среды- это разные варианты предлагаемых на рынке сред DMEM или RPMI 1640, представляющих собой раствор солей, аминокислот, витаминов, углеводов и питательных добавок в разных концентрациях и цветового индикатора кислотности (как правило, феноловый красный). Кроме этого к среде добавляют эмбриональную телячью сыворотку или ее синтетические или полусинтетические заменители до концентрации 3-20% как источник белка и ростовых факторов. Качество сыворотки в наибольшей степени влияет на скорость роста клеток, особенно гибридомных, как более капризных по сравнению с миеломными. Помимо сыворотки в среду добавляют пируват натрия, антибиотики, глутамин (если он не содержался в исходной среде), реже- оксалоацетат, бета-меркаптоэтанол, инсулин и др.

Для культивирования клеток при низкой клеточной плотности (особенно при клонировании, когда из одной- единственной клетки в лунке необходимо вырастить целый клон) используют так называемый фидерный слой клеток (или просто фидер), облегчающий эту задачу. Клетки фидера не должны самостоятельно делиться, они призваны обеспечивать гибридомные клетки необходимыми для роста цитокинами и создавать клеточные контакты. В качестве фидера можно использовать клетки тимуса, селезенки, лимфоузлов, перитонеальной полости животных того вида, который использовался для получения иммунных В-лимфоцитов. Фидер от животных другого вида тоже может быть использован, но с меньшей эффективностью.

Культивирование клеток необходимо проводить в условиях, максимально приближенных к стерильным. Попавшие в культуру клеток бактерии и грибы, опережая гибридомы в скорости роста, очень быстро исчерпают питательные вещества ростовой среды и насытят ее своими токсинами. Это приведет к неизбежной гибели гибридомных клеток. Во избежание инфицирования пользуются стерильными ростовыми средами и стерильной культуральной посудой, применяют антибиотики, а все манипуляции с клетками проводят в условиях минимальной осемененности микробами (в ламинарном боксе с принудительной подачей стерильного воздуха).

Особую проблему представляет заражение клеток внутриклеточными паразитами- вирусами и микоплазмой. Детектировать их достаточно сложно, они, как правило, не убивают всю культуру гибридомных клеток и с легкостью переносятся от одной культуры к другой. Вирусы и микоплазма фильтруются сквозь бактериальные фильтры, поэтому фильтрование ростовых сред и воздуха в ламинарном боксе становятся неэффективными при борьбе с ними. Заражение клеток вирусами или микоплазмой приводит к резкому замедлению роста клеток, особенно в малой их плотности, а также к усиленной потере гибридомами их способности секретировать антитела. Против микоплазмы существуют специальные антибиотики, а против вирусов- интерфероны, но они помогают лишь снизить степень инфицированности клеток, не избавляя их от инфекции полностью. Более действенным является сочетание антибиотиков с неоднократным проведением зараженной культуры через организм животного, где клетки могут расти в виде асцитной жидкости и использовать иммунную систему животного против инфекции.



4. Методы селекции слившихся клеток

4.1 Использование селективных сред

Считается неплохим результатом гибридизации, когда сливается одна пара клеток из 10 000. Для удаления неслившихся миеломных клеток (неслившиеся В-лимфоциты отмирают сами через несколько дней) чаще всего используют негативную селекцию на селективных средах, смысл которой заключается в следующем: В клетках млекопитающих имеется два пути синтеза пуринов (предшественников нуклеотидов)- основной и запасной. Для осуществления запасного пути требуется фермент гипоксантинфосфорибозилтрансфераза (ГФРТ), который отсутствует у миеломных клеток. Линии миеломных клеток, пригодные для гибридомной технологии, имеют мутацию, в результате которой клетки не способны синтезировать ГФРТ и осуществлять запасной путь синтеза пуринов. Отбор мутантов и удаление спонтанно возникающих нормальных миеломных клеток производят с помощью 8-азагуанина или 6-тиогуанина. В-лимфоциты, как изначально нормальные, способны использовать оба пути синтеза пуринов.

После процедуры гибридизации клетки высевают в среде, содержащей аминоптерин, который блокирует основной путь синтеза пуринов. В результате неслившиеся клетки миеломы (и гибриды миелома+миелома) погибают, так как оказываются лишенными и основного (блокированного аминоптерином) и запасного (потерянного в результате мутации) путей синтеза пуринов. Способными к росту оказываются лишь гибриды миелома+лимфоцит, взявшие у исходных лимфоцитов способность к осуществлению запасного пути синтеза пуринов.

После отмирания основной массы неслившихся клеток ростовую среду постепенно заменяют на свежую, не содержащую аминоптерин, так как он мешает нормальному функционированию клеток.

4.2 Использование проточного цитофлуориметра

Проточный цитофлуориметр позволяет отсортировывать клетки, которые несут на своей поверхности флуоресцентную метку.Использование проточного цитофлуориметра для отбора гибридных клеток состоит в следующем: Смесь иммунных лимфоцитов и клеток миеломы подвергают стандартной процедуре слияния; затем полученную суспензию клеток инкубируют с раствором антигена, против которого хотят получить моноклональные АТ, предварительно конъюгированного с флуоресцентной меткой (например, ФИТЦ- флуоресцеинизотиоцианат). В-лимфоциты и гибриды лимфоцит+миелома имеют на своей поверхности молекулы иммуноглобулинов. В том случае, когда эти иммуноглобулины направлены против требуемого антигена, происходит связывание несущих их клеток с антигеном, а через него с флуоресцентной меткой. Затем с помощью прибора отсортировывают меченые клетки от всех остальных и получают популяцию клеток, состоящую в основном из гибридом, секретирующих антитела против желаемого антигена, и неслившихся В-лимфоцитов, не способных к делению.

Достоинства этого метода селекции по сравнению с методом селективных сред состоят в следующем:

а) отбираются не все гибриды лимфоцит+миелома, а только те, которые секретируют антитела к нужному антигену;

б) партнеры для гибридизации могут не быть мутантами (ГФРТ негативными), поэтому этот метод селекции особенно полезен при получении биспецифических антител, когда для слияния берут две гибридомы, секретирующие антитела разной специфичности.

Недостатки метода:

а) далеко не все лаборатории имеют в своем распоряжении этот весьма дорогостоящий прибор, требующий к тому же квалифицированного оператора;

б) процедура гибридизации довольно травматична для клеток, а дополнительные манипуляции с ними после гибридизации неизбежно приведут к большей их гибели.



5. Скрининг супернатантов гибридом

Через несколько дней после процедуры слияния заметен рост гибридомных клонов на фоне отмерших неслившихся миеломных клеток и меньших по размеру неделящихся В-лимфоцитов. На 6-14 после слияния день, когда размер клонов обычно достигает нескольких сотен клеток, необходимо протестировать супернатанты гибридом на содержание антител к требуемому антигену (иначе говоря, провести скрининг). Необходимость в раннем скрининге диктуется следующими причинами:

а) после отмирания неслившейся миеломы популяция делящихся клеток может содержать в себе гибридомы, секретирующие антитела к постороннему антигену либо антитела к требуемому антигену, но неудовлетворительной аффинности;

б) небольшая часть миеломных клеток может выжить на селективной среде вследствие обращения мутантного гена в нормальный, свободные от секреции такие ревертанты быстро перерастут гибридомы- продуценты антител;

в) после гибридизации клетки приобретают дополнительный хромосомный набор, что делает клетку генетически неустойчивой. Это приводит к активным геномным перестройкам и выбросу лишних хромосом в первые дни и недели после гибридизации. Клетка, лишившаяся таким образом обременительной для себя секреции антител, опередит в росте секретирующие клетки.

5.1 Иммуноферментный анализ

Наиболее распространенным сегодня методом скрининга является твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА). Общая схема имунноферментного анализа:

1) прикрепление молекул антигена на дне лунок 96-луночного планшета;

2) отмывка несвязавшегося антигена;

3) блокировка мест связывания на планшете, свободных от молекул антигена;

4) отмывка блокирующего раствора;

5) инкубация с исследуемыми образцами (например, супернатантами гибридом); в процессе инкубации должно происходить связывание молекул антигена с молекулами антител (если они имеются в исследуемом образце);

6) отмывка от несвязавшихся с антигеном компонентов исследуемых образцов;

7) инкубация с раствором конъюгированных с ферментом антител, направленных против предполагаемых антител образца;

8) отмывка от несвязавшихся конъюгированных с ферментом антител;

9) инкубация с раствором неокрашенного субстрата фермента до развития окраски вследствие ферментативной реакции;

10) остановка ферментативной реакции;

11) оценка интенсивности окраски.

Приведенная схема отражает лишь один, самый распространенный вариант иммуноферментного анализа. Рассмотрим подробнее вышеперечисленные этапы ИФА:

5.2 Радиоиммунный анализ

Почти все сказанное выше в отношении иммуноферментного анализа можно отнести и к радиоиммуному анализу. Принципиальным отличием здесь является то, что вместо ферментной метки используют метку радиоактивную, главным образом ¹²⁵I. Наличие сигнала регистрируют, прикладывая к лункам планшета или нитроцеллюлозному листу пленку с чувствительным к излучению слоем, либо вырезают дно лунок планшета (используют специальные гибкие планшеты) или кусочки нитроцеллюлозы и фиксируют наличие излучения при помощи сцинтилляционного счетчика. Радиоиммунный анализ более чувствителен, чем иммуноферментный, однако сейчас он почти не используется по причине своей дороговизны и вредного воздействия изотопов на человека и окружающую среду.

5.3 Латекс-агглютинация и метод фиксации комплемента

Эти методы целесообразно применять для скрининга в том случае, если получаемые моноклональные АТ предполагается использовать в подобных тест- системах. Моноклональные АТ, отобранные иммуноферментным анализом могут плохо работать в гомогенных системах, таких как латекс- агглютинация или метод фиксации комплемента.

При использовании метода латекс- агглютинации частицы латекса нагружают молекулами антигена, инкубируя их в растворе антигена 30 минут при 56°С. Латекс отмывают от несвязавшегося антигена неоднократным центрифугированием в фосфатно-солевом буфере. Тестируемые пробы смешивают со взвесью латексных частиц в лунках круглодонного 96-луночного планшета, затем центрифугируют или ждут самостоятельного осаждения латексных частиц. Наличие антител против требуемого антигена оценивают по степени агглютинации латекса: при отсутствии антител и, следовательно, агглютинации, латексные частицы собираются на дне лунки в одну точку. При наличии агглютинации частицы оказываются «размазанными» по дну лунки. Диаметр пятна зависит от степени агглютинации и, соответственно, отражает уровень содержания специфических к антигену антител в исследуемой пробе. Для облегчения визуальной оценки реакции используютярко-окрашенные латексные частицы.

Явным недостатком метода является необходимость нагревать антиген, что может привести к изменению его антигенных свойств. Другим недостатком метода является необходимость тщательного подбора условий реакции для каждого конкретного антигена во избежание ложно-положительных реакций. К таким условиям относятся: количество сорбируемого антигена и разведение супернатантов и сывороток, поскольку избыток сывороточных неспецифических антител (особенно класса IgM) может вызвать неспецифическую агглютинацию. Кроме того метод c большей чувствительностью определяет антитела класса IgM по сравнению с более желаемыми IgG. К несомненным достоинствам метода можно отнести быстроту его исполнения и низкую стоимость.

Метод фиксации комплемента имеет много общего с латекс-агглютинацией; разница состоит в том, что антигеном нагружают не латексные частицы, а живые клетки (как правило, эритроциты барана). Взвесь клеток с молекулами антигена на поверхности смешивают с исследуемой пробой и раствором белков системы комплемента. При наличии в пробе антител к антигену, происходит активация комплемента и, как следствие, лизис клеток, наблюдаемый визуально. Достоинства и недостатки метода фиксации комплемента те же, что и у латекс-агглютинации.

5.4 Дополнительные методы скрининга

При получении моноклональных АТ полезно учитывать их предполагаемое использование и в связи с ним вводить дополнительные методы скрининга, позволяющие отобрать моноклональны е АТ, максимально пригодные для их применения. Примером здесь может быть скрининг моноклональных АТ, влияющих на активность фермента, либо обладающих самостоятельной ферментативной активностью. В этих случаях используют метод, позволяющий оценивать активность фермента в присутствии или в отсутствие тестируемого образца.



6. Клонирование гибридом

Сразу после обнаружения в лунке с растущим клоном (или несколькими клонами) желаемых антител, нужно возможно скорее провести клонирование. Причины, по которым нужно торопиться с клонированием, такие же, что и для раннего тестирования первичных клонов, и были перечислены выше.

6.1 Метод клонирования в мягком агаре

Отцы гибридомной технологии Келер и Мильштейн в своей пионерской работе использовали метод клонирования в мягком агаре. Сегодня этот метод имеет скорее историческое, нежели практическое значение, но из уважения к патриархам гибридомной технологии кратко рассмотрим и его. Гибридомы после процедуры слияния высевали в чашке Петри на стерильном 1%-ом агаре, приготовленном на селективной ростовой среде с аминоптерином. Белые бляшки растущих клонов тестировали на наличие специфических антител, используя метод фиксации комплемента. Те бляшки, вокруг которых наблюдали лизис эритроцитов барана, вырезали скальпелем, клетки суспендировали в ростовой среде и затем вновь высевали на агар. Процедуру повторяли до тех пор, пока не отбирали клоны, стабильно продуцирующие нужные антитела. Такие антитела являются моноклональными, поскольку секретируются клоном, выращенным из одной клетки.

6.2 Клонирование методом предельных разведений

Самым распространенным сегодня методом клонирования является метод предельных разведений. Смысл его состоит в том, чтобы суспензию клеток развести в ростовой среде до такой концентрации, чтобы при посеве клеток на планшет в каждой лунке оказалась бы одна гибридомная клетка. На практике такое недостижимо, даже при самом тщательном расчете в какие-то лунки попадет две или даже большее число клеток, в какие-то не попадет вовсе. Кроме того, не все клетки могут выжить в тяжелых для них условиях одиночества и дать начало жизнеспособному клону. Поэтому делают несколько разных разведений клеток (как правило, три), в первом из них концентрацию клеток берут приблизительно равной 10 клеток на лунку, во втором- одна клетка на лунку, и в третьем- 0,1 на лунку. Приведенные цифры в разных пособиях могут варьировать. Клетки высевают, используя фидерный слой клеток, поскольку у одинокой гибридомной клетки практически нет шансов выжить в лунке.

Через несколько дней просматривают под микроскопом все лунки и фиксируют количество растущих в них клонов. Лунки с одним растущим клоном осматривают особенно тщательно на предмет отсутствия в них вторых мелких и малозаметных клонов. Затем, когда клоны достигнут достаточного для тестирования размера, проводят скрининг их супернатантов, используя тот же метод, что и для тестирования первичных клонов. Среди клонов, давших при тестировании положительный результат, отбирают самые продуктивные и здоровые на вид и повторяют процедуру клонирования. Если после второго клонирования все протестированные клоны дали положительный результат, самые лучшие из них отбирают для дальнейшей работы (наработки, заморозки и т.д.). В случае обнаружения несекретирующих клонов, что говорит о неустойчивой секреции антител, необходимо повторить клонирование, либо отказаться от дальнейшего использования этого клона.

6.3 Клонирование с помощью приборов

В последнее время все большую популярность приобретают микроманипуляторы- приборы, позволяющие под визуальным контролем стерильно перенести одну выбранную клетку из одного культурального планшета в другой. Этот метод особенно удобен, если в лунке с положительно протестированным супернатантом имеется несколько клонов. Прибор позволяет взять из всех, даже самых маленьких клонов по несколько клеток и рассадить их по одной в лунки. Налицо экономия культуральной посуды и ростовых сред.

Другим прибором, использующимся для клонирования, является упомянутый выше проточный цитофлуориметр. Он может предложенную ему суспензию клеток рассадить по одной клетке в лунки культурального планшета.



7. Наработка гибридомных клеток и секретируемых ими антител

Наиболее широко используются сейчас два способа наработки гибридомных клеток и моноклональных антител: наработка на культуральных средах в СО2 инкубаторе и в асцитных жидкостях мышей (или крыс). Каждый из них имеет свои достоинства и недостатки.

7.1 Наработка на культуральных средах в СО2 инкубаторе

После того, как отобраны стабильно продуцирующие клоны, переходят к наработке антител, чтобы получить достаточное их количество для более подробного изучения их свойств. Гибридомные клетки очень чувствительны к перемене условий их содержания, поэтому необходима плавность и постепенность при увеличении объема ростовой среды и культуральной посуды: из одной лунки 96-луночного планшета клетки рассевают на несколько лунок такого же планшета, затем, когда плотность клеток в них будет достаточно большой, клетки из нескольких лунок переносят в одну лунку большего размера и т.д. Когда количество клеток будет достаточным для производства требуемых количеств антител, содержание эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) в ростовой среде постепенно или резко снижают (до концентрации <1%). Рост и деление клеток при этом сильно замедляется, клетки переключаются на секрецию антител. Супернатанты клеток стерильно отбирают, проверяют на содержание специфичных антител и собирают для дальнейшей очистки.

Для наработки антител в промышленных масштабах используют различные приспособления (цитокультиваторы, ферментеры и т.д.), в которых соблюдаются необходимые условия культивации клеток (температура, уровень СО2 и влажности), а также частично или полностью автоматизированы подача питательных сред и отбор супернатантов.



7.2 Наработка антител в асцитных жидкостях

Наименее хлопотный способ наработать большое количество антител- это ввести гибридомные клетки в перитонеальную полость мыши (или крысы). Через 6-30 дней (чаще через 10-14) в зависимости от числа введенных клеток и скорости их деления в перитонеальной полости образуется асцитная жидкость, содержащая большое количество гибридомных клеток и моноклональных АТ (концентрация антител в асцитах может достигать 20мг/мл). Для лучшей приживаемости гибридомных клеток и во избежание развития солидных (твердых) опухолей мышам предварительно (за 7-20 дней до введения клеток) вводят минеральное масло- пристан. Если все-таки вместо асцитной жидкости образовалась солидная опухоль, ее извлекают, гомогенизируют, и в фосфатно- солевом буфере вводят другим мышам.

В процессе развития асцитной опухоли клетки гибридомы оздоравливаются, избавляются от бактериальной и вирусной инфекций.Скорость роста извлеченных из асцита клеток, как правило, значительно выше, чем до введения их в перитонеальную полость мышей.

Количество клеток, вводимых мышам, может быть любым: от нескольких десятков или сотен клеток до нескольких сотен миллионов. Однако следует учитывать, что при очень маленьком количестве вводимых клеток увеличивается время образования асцита, при очень большом- есть риск гибели мыши, если клетки заражены микоплазмой. В целом успех выращивания асцитной жидкости зависит, в основном, от качества мышей (их линейности - генетического соответствия требуемой линии).

Наработке антител в асцитных жидкостях во многих странах препятствует законодательство, считая эту процедуру негуманной по отношению к животным. В нашей стране пока такого запрета нет, но соответствующий законопроект уже обсуждается.

Наработка антител с использованием генноинженерных методов применяется только для наиболее ценных гибридом и будет подробно обсуждаться в следующей главе.



8. Хранение клеток

Клетки годами можно хранить в жидком азоте без существенной потери их жизнеспособности. Заморозку клеток производят, когда они находятся в логарифмической фазе роста. Суспензию клеток, предназначенных для заморозки, помещают в раствор, содержащий 10-90% сыворотки, 5-10% ДМСО и в остальном- ростовую среду. Присутствие сыворотки смягчает процессы замораживания- оттаивания клеток, ДМСО препятствует при заморозке образованию крупных кристаллов воды, губительных для клеточной стенки.

Понижение температуры при заморозке производят постепенно, существуют даже специальные приборы, позволяющие снижать температуру с заданной скоростью. В основном же бывает достаточно предварительно поместить ампулу с клетками в морозильник на -70єС, а затем перенести в специальный сосуд с жидким азотом (сосуд Дьюара). Неудобство хранения клеток жидком азоте состоит в необходимости регулярно доливать азот в эти сосуды. Для менее продолжительного хранения клеток можно использовать морозильники с температурой от -70єС и ниже.

Наиболее ценные гибридомы можно хранить в виде векторов (плазмид или нитчатых фагов), куда вставлены гены, кодирующие иммуноглобулины этих гибридом. Этот метод хранения более надежен, но требует предварительной работы по изготовлению таких векторов.



9. Выделение моноклональных АТ из супернатантов гибридом и асцитных жидкостей

При выборе методов выделения нужно учитывать следующее:

а) желаемая степень очистки в соответствии с дальнейшим использованием выделенных антител;

б) источник антител (супернатанты клеток или асцитная жидкость)

в) класс и субкласс выделяемых антител;

г) индивидуальные особенности конкретных моноклональных АТ.

Основным белком, подлежащим удалению при очистке, является альбумин (бычий в супернатантах и мышиный в асцитах). Его количество в десятки раз превосходит количество выделяемых антител.

9.1 Методы предварительной очистки антител: высаливание сульфатом аммония (натрия), преципитация каприловой кислотой, диализ против дистиллированной воды при выделении IgM

Метод высаливания сульфатом аммония состоит в следующем: при смешивании образца антител с эквивалентным объемом насыщенного сульфата аммония происходит выпадение осадка, содержащего, главным образом, иммуноглобулины. Осадок растворяют в фосфатном буфере и диализуют. Процедуру повторяют при необходимости несколько раз. Степень очистки антител можно повысить, снижая концентрацию сульфата аммония, но при этом придется столкнуться с потерями антител. При повышении концентрации соли (до 60% от насыщения) выход антител увеличивается, но увеличивается и содержание загрязняющих компонентов, главным образом, альбумина. Недостатком метода является недостаточная степень очистки антител, поэтому часто его применяют в качестве предварительного метода, позволяющего увеличить концентрацию антител в образце.

Для очистки каприловой кислотой образец антител должен иметь рН 4, поэтому эго предварительно разбавляют 60 мМ ацетатом натрия. Каприловую кислоту добавляют по каплям при помешивании, получающийся при этом осадок содержит загрязняющие белки, IgG остается в растворе. После диализа раствор антител концентрируют и проверяют их активность.

При диализе образца против дистиллированной воды (или буфера с низкой ионной силой) большая часть IgM выпадает в осадок. Осадок растворяют в фосфатном буфере и проверяют активность антител.

9.2 Хроматографические методы выделения антител

1) Ионнообменная хроматография.

В качестве ионнообменника для выделения антител чаще всего используют DEAE (DiEthylAminoEthyl), прикрепленного к целлюлозе, сефарозе или акриламидным гранулам. При кислых значениях рН (6,5) раствора молекулы IgG не связываются с DEAE, тогда как большинство других сывороточных (асцитных) белков (особенно, альбумин) связываются с DEAE достаточно прочно.

2) Гель-фильтрация антител производится на колонках с агарозой, сефарозой или сефадексом, если речь идет о гельфильтрации при атмосферном давлении, и акриловыми гранулами при высоко эффективной жидкостной хроматографии высокого давления (HLPC). Разделение идет по молекулярным массам белков, поэтому IgG массой 150кДа достаточно хорошо отделяется от основного загрязнителя- альбумина (65кДа).

3) Хроматография на протеинах А или G.

Протеин А (из Stafilococcus aureus) связывает Fc-фрагмент антител с разной эффективностью в зависимости от видовой и классовой (субклассовой) принадлежности антитела. Поэтому, в зависимости от силы связывания протеина А с конкретным моноклональным АТ, подбирают условия хроматографии (рН буфера для связывания, ионная сила). Антитела, плохо связывающиеся с протеином А (например, мышиные IgG1), можно выделять на протеине G.

4) Аффинная хроматография.

При помощи аффинной хроматографии, где к носителю прикреплены молекулы антигена, получаются самые чистые образцы моноклональных АТ. Однако, если моноклональные АТ имеют очень высокую аффинность, их элюция в неденатурирующих условиях может представлять серьезную проблему.

Размещено на Allbest.ru