Основы биотехнологии

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ АВТОНОМНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ

БЕЛГОРОДСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НАЦИОНАЛЬНЫЙ

ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ

(НИУ «БелГУ»)

МЕДИЦИНСКИЙ ИНСТИТУТ

ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

КАФЕДРА ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОЙ ТЕХНОЛОГИИ

Контрольная работа

по дисциплине «Биотехнология»

Выполнил: студентка 6 курса

группы 03030955

заочной формы обучения

Богатырева Татьяна Николаевна

БЕЛГОРОД 2014

Задание 1. Получил большое распространение препарат, являющийся смесью синтетического пенициллина - амоксициллина с клавулановой кислотой - «Аугментин». Какова роль указанных компонентов в преодолении резистентности к ЛС

таргетный скрининг антибиотик стерилизация

Фармакологическая группа препарата «Аугментин» - это антибиотик, пенициллин полусинтетический + бета-лактамаз ингибитор.

Амоксициллин - полусинтетический антибиотик широкого спектра действия, обладающий активностью против многих грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов. Амоксициллин обладает бактерицидным действием - подавляет синтез пептидогликана клеточной стенки во время фазы роста микроорганизма путем конкурентного ингибирования транспептидаз. В то же время амоксициллин подвержен разрушению бета-лактамазами, и поэтому спектр активности амоксициллина не распространяется на микроорганизмы, которые продуцируют эти ферменты.

Клавулановая кислота - ингибитор бета-лактамаз, структурно родственный пенициллинам, обладает способностью инактивировать широкий спектр бета-лактамаз, обнаруженных у микроорганизмов, устойчивых к пенициллинам и цефалоспоринам. Клавулановая кислота обладает достаточной эффективностью в отношении плазмидных бета-лактамаз, которые чаще всего обуславливают резистентность бактерий, и менее эффективна в отношении хромосомных бета-лактамаз 1 типа. Название клавулановой кислоты происходит от названия вида Streptomyces clavuligerus, который ее производит. Клавулановая кислота генерируется в ходе биосинтеза из аминокислоты аргинина и сахара глицеральдегид-3-фосфата.

Клавулановая кислота обладает незначительной внутренней антимикробной активностью, несмотря на наличие ?-лактамного кольца, что характерно для ?-лактамных антибиотиков. Однако сходство в химическом строении молекулы позволяет молекуле взаимодействовать с ферментом ?-лактамазы, секретируемым определенными бактериями для придания резистентности к ?-лактамным антибиотикам. Клавулановая кислота является суицидным ингибитором, ковалентно связывающимся с остатком серина в активном центре ?-лактамазы. Это перестраивает молекулу клавулановой кислоты, создавая гораздо более активные формы, которые подвергаются нападению других аминокислот на активном участке, постоянно инактивируя его, и таким образом, инактивируя фермент. Это ингибирование восстанавливает антимикробную активность ?-лактамных антибиотиков против секретирующих лактамазу резистентных бактерий.

Бактерицидное действие сочетания амоксициллина и клавулановой кислоты охватывает широкий спектр грам-положительных и грам-отрицательных, аэробных и анаэробных возбудителей, в том числе и те их штаммы, у которых сформировалась устойчивость к бета-лактамным антибиотикам (ампициллину и амоксициллину) вследствие продукции бета-лактамаз:

Грам-положительные:

Streptococcus Group A,B,C,G (Strep. pneumoniae, viridans, milleri, faecalis, pyogenes, anthracis, agalactiae, bovis); Staphylococcus aureus, epidermidis (пенициллин-чувствительные и пенициллин-резистентные, кроме метициллин-резистентных штаммов MRSA, MRSE); Enterococcus faecalis, faecium; Corynebacterium spp.; Listeria monocytogenes; Nocardia asteroides;

Грам-отрицательные:

Aeromonas spp.; Bordetella pertussis; Brucella spp.; Campylobacter jejuni, coli; Citrobacter spp. (умеренно чувствительны); Escherichia coli; Gardnerella vaginalis; Haemophilus ducreyi, influenzae; Helicobacter pylori; Klebsiella spp., K. pneumoniae; Moraxella catarrhalis; Morganella spp. (умеренно чувствительны); Neisseria gonorrhoeae, meningitidis; Pasteurela multocida; Proteus mirabilis, vulgaris; Salmonella spp.; Shigella spp.; Vibrio cholerae; Yersinia enterocolitica (умеренно чувствительна); Branhamella catarrhalis.

Анаэробные:

Actinomyces israeli; Bacteroides spp. (в том числе B. fragilis); Prevotella melaninogenica; Clostridium spp. (кроме Cl. difficile); Peptostreptococcus spp.; Eikenella corrodens; Fusobacterium spp.; Propionibacterium spp.; Peptococcus spp.

Другие:

Mycobacterium tuberculosis, fortuitum, bovis, kanasaii - умеренно чувствительны, (M. chelonei - устойчива); Treponema pallidum; Nocardiae spp., Leptospirae spp.

Следующие микроорганизмы резистентны или частично резистентны:

Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter spp., Serratia spp., Proteus rettgeri, morganii, Providencia spp., Mycoplasmae spp., Chlamidiae spp., Rickettsiae spp.

Клавулановую кислоту комбинируют с амоксициллином, так как фармакокинетические параметры обоих компонентов сходны и в комбинации они не влияют на фармакокинетику друг друга.

Задание 2. Антибиотики цефепим и цефпиром относятся к цефалоспоринам 4 поколения, обеспечивая высокую фармакологическую активность данных препаратов. Каковы особенности данных лекарственных средств по отношению к цефалоспоринам 1, 2 и 3-го поколений, и что обеспечивает направления в поиске и создании новых антибиотических лекарственных средств? Прокомментируйте, какие свойства молекулы этого соединения обеспечивают максимальную эффективность данного антибиотика в аспекте дальнейших направлений в поиске новых эффективных и безопасных лекарственных средств

Цефалоспорины относятся к ?-лактамам и представляют один из наиболее обширных классов антимикробных препаратов. Цефалоспорины оказывают бактерицидное действие, которое связано с нарушением образования клеточной стенки бактерий. В ряду от I к III поколению для цефалоспоринов характерна тенденция к расширению спектра действия и повышению уровня антимикробной активности в отношении грамотрицательных бактерий при некотором понижении активности в отношении грамположительных микроорганизмов.

Общим для всех цефалоспоринов является отсутствие значимой активности в отношении энтерококков, MRSA и L.monocytogenes. КНС, менее чувствительны к цефалоспоринам, чем S.aureus.

Цефалоспорины I поколения (цефазоин) активны в отношении Streptococcus spp. (S.pyogenes, S.pneumoniae) и метициллиночувствительных Staphylococcus spp. По уровню антипневмококковой активности цефалоспорины I поколения уступают большинству более поздних цефалоспоринов. Клинически важной особенностью является отсутствие активности в отношении энтерококков и листерий. Несмотря на то, что цефалоспорины I поколения устойчивы к действию стафилококковых ?-лактамаз, отдельные штаммы, являющиеся гиперпродуцентами этих ферментов, могут проявлять к ним умеренную устойчивость. Цефалоспорины I поколения обладают узким спектром действия и невысоким уровнем активности в отношении грамотрицательных бактерий. Природная активность в отношении M.сatarrhalis достаточно высока, однако они чувствительны к гидролизу ?-лактамазами, которые продуцируют практически 100% штаммов. Из представителей семейства Enterobacteriaceae чувствительны E.coli,Shigella spp., Salmonella spp. и P.mirabilis, при этом активность в отношении сальмонелл и шигелл не имеет клинического значения. Среди штаммов E.coli и P.mirabilis, вызывающих внебольничные и особенно нозокомиальные инфекции, широко распространена приобретенная устойчивость, обусловленная продукцией ?-лактамаз широкого и расширенного спектров действия.

Спектр действия цефалоспоринов II (цефуроксим,цефаклор) поколения в отношении грамотрицательных микроорганизмов шире, чем у представителей I поколения. Оба препарата активны в отношении Neisseria spp. Из семейства Enterobacteriaceae чувствительны не только E.coli, Shigella spp., Salmonella spp., P.mirabilis, но и Klebsiella spp., P.vulgaris, C.diversus. При продукции перечисленными микроорганизмами ?-лактамаз широкого спектра они сохраняют чувствительность к цефуроксиму. Цефуроксим и цефаклор разрушаются БЛРС (?-лактамазами расширенного спектра действия). Псевдомонады, другие неферментирующие микроорганизмы, анаэробы группы B.fragilis устойчивы к цефалоспоринам II поколения.

Цефалоспорины III поколения (цефотаксим, цефтиаксон) характеризуются высоким уровнем активности в отношении Streptococcus spp., при этом значительная часть пневмококков, устойчивых к пенициллину, сохраняет чувствительность к этим антибиотикам. Эта же закономерность характерна и для зеленящих стрептококков. Цефотаксим и цефтриаксон активны в отношении S.aureus, кроме MRSA, в несколько меньшей степени - в отношении КНС (Коагулазонегативный стафилококк ). Коринебактерии (кроме C.jeikeium), как правило чувствительны.

Энтерококки, MRSA, L.monocytogenes, B.antracis и B.сereus - устойчивы. Цефотаксим и цефтриаксон высокоактивны в отношении менингококков, гонококков, H.influenzae и M.catarrhalis, в том числе и в отношении штаммов с пониженной чувствительностью к пенициллину, независимо от механизма устойчивости.

Цефотаксим и цефтриаксон обладают высокой природной активностью в отношении практически всех представителей семейства Enterobacteriaceae, включая микроорганизмы, продуцирующие ?-лактамазы широкого спектра. Цефалоспорины Ш поколения не расщепляются ?-лактамазами, но они являются индукторами выработки ?-лактамаз, Устойчивость E.coli и Klebsiella spp. чаще всего обусловлена продукцией БЛРС. УстойчивостьEnterobacter spp., C.freundii, Serratia spp., M.morganii, P.stuartii, P.rettgeri обычно связана с гиперпродукцией хромосомных ?-лактамаз класса С.

Цефалоспорины IV поколения (цефепим, цефпиром) по многим параметрам близки к цефалоспоринам III поколения. Однако благодаря некоторым особенностям химической структуры обладают повышенной способностью проникать через внешнюю мембрану грамотрицательных бактерий и относительной устойчивостью к гидролизу хромосомными ?-лактамазами класса С. Поэтому, наряду со свойствами, характерными для базовых цефалоспоринов III поколения (цефотаксим, цефтриаксон), цефепим и цефпиром проявляют следующие особенности:

а) высокую активность в отношении P.aeruginosa и неферментирующих микроорганизмов;

б) активность в отношении микроорганизмов - гиперпродуцентов хромосомных ?-лактамаз класса С, таких как: Enterobacter spp., C.freundii, Serratia spp., M.morganii, P.stuartii, P.rettgeri;

в) цефалоспорины IV поколения (цефепим, цефпиром) не являются индукторами ?-лактамаз.

Большой эффект в поисках и создании новых антибиотиков может дать технология рекомбинантных ДНК. Во-первых, с ее помощью можно создавать новые антибиотики с уникальной структурой, оказывающие более мощное воздействие на определенные микроорганизмы и обладающие минимальными побочными эффектами. Во-вторых, генноинженерные подходы могут использоваться для увеличения выхода уже известных антибиотиков и соответственно для снижения стоимости их производства.

Новые антибиотики с уникальными свойствами и специфичностью можно получить, проводя генноинженерные манипуляции с генами, участвующими в биосинтезе уже известных антибиотиков.

Один из наиболее распространенных путей изыскания новых лекарственных средств - химическая модификация соединений с известной биологической активностью. Главная задача таких исследований заключается в создании новых препаратов (более активных, менее токсичных), выгодно отличающихся от уже известных.

Молекулы природных антибиотиков не всегда обладают удовлетворительными химиотерапевтическими и фармакологическими свойствами. Кроме того, широкое распространение получили резистентные формы микроорганизмов, обладающие способностью разрушать антибиотики, главным образом путем воздействия на них своими ферментами. Поэтому основное направление создания новых антибиотики - химическая и микробиологическая модификации природных антибиотиков и получение так называемых полусинтетических антибиотиков.

В структурной формуле цефепима присутствует метоксигруппа, что делает его эффективным в отношении граммотрицательных бактерий, определяя высокую скорость прохождения через пористые каналы мембраны клетки.

Задание 3. Сравните кривые роста микроорганизмов при получении первичных и вторичных метаболитов в биотехнологическом производстве

Первичные метаболиты необходимы для жизнедеятельности организма и кривая их роста возрастает в фазе роста биомассы. Вторичные метаболиты, вещества не являющиеся обязательными для роста или функционирования клетки, но синтезирующиеся в стационарной фазе и участвующие в защите клеток от различных воздействий, причем они могут образовываться или при протекании разветвленных реакций, или из первичных метаболитов, при достаточном их количестве, что отражается на кривой их роста. На рис.1 представлена S - образная кривая роста микроорганизмов в простых периодических условиях.

Рис. 1. S - образная кривая роста микроорганизмов

1 и 2 (лаг-фаза и фаза ускорения роста) - побор условий культивирования и состава питательной среды; 3 (лог-фаза) - синтез первичных метаболитов, образование биомассы; 4 и 5 (фаза торможения и стационарная) - синтез вторичных метаболитов, «урожай биомассы»; 6 (фаза отмирания) - процессы стерилизации внутриклеточные метаболиты.

На рис.1 видно, что синтез первичных метаболитов происходит на всех стадиях, а уровень их синтеза определяется, в основном, количеством клеток и наличием питательных веществ.

Более сложный характер имеет синтез так называемых вторичных метаболитов.

Синтез вторичных метаболитов фазоспецифичен и происходит не всегда, а лишь в определенных условиях, обычно неблагоприятных для клеток. Если взглянуть приведенную выше кривую роста, то можно предположить, что синтез таких соединений возможен начиная с конца Log-фазы и до конца фазы отмирания. Именно в это время происходит исчерпание основных компонентов питательной среды и одновременно происходит накопление в среде избыточных количеств продуктов первичного метаболизма, обычно весьма токсичных в больших концентрациях для клеток. Данную ситуацию для клеток можно охарактеризовать как стрессовую. Это приводит к дезорганизации нормального метаболизма и как следствие к прекращению размножения клеток. Предполагается, что в этих условиях некоторые продукты первичного метаболизма могут выступать в качестве индукторов или дерепрессоров генов, кодирующих синтез ферментов вторичного метаболизма. Согласно другому предположению гены вторичного метаболизма подвержены катаболитической репрессии продуктами разложения глюкозы, исчерпание которой снимает репрессию. Такой этап несбалансированного роста, сопровождающийся синтезом вторичных метаболитов называется идиофазой, а продукты - идиолитами. Среди вторичных метаболитов ведущее место по объему производства занимают антибиотики, стероиды и алкалоиды. Такие соединения как аминокислоты, кислоты цикла Кребса, глицерин, формально являются первичными метаболитами, однако их избыточное образование и накопление возможно, только в условиях нарушения нормального метаболизма клеток. Поэтому фактически, в этом случае, они тоже являются идиолитами.

Процесс промышленного биосинтеза идиолитов проходит две фазы или стадии (двустепенчатое культивирование), резко различающиеся по условиям проведения. Во время первой фазы (трофофазы) основной задачей является накопление максимально возможного количества биомассы, которая выращивается на среде оптимальной для роста данного микроорганизма (ростовая среда). Из экономических и технологических соображений эта фаза должна быть максимально быстрой, а питательная среда дешевой и содержать легко усваиваемые субстраты (глюкоза, фруктоза). На второй фазе создаются условия обеспечивающие запуск и активный синтез вторичного метаболита. На этой фазе ферментацию обычно ведут на так называемой продуктивной среде, которая по своему составу значительно отличается от ростовой, т.к. содержит, в основном, трудноусваиваемые углеводы. Переключение клеток с легко усваиваемых субстратов (глюкоза) на более сложные (лактоза, сахароза) требует синтеза большого количества новых индуцибельных ферментов, что является для клеток “встряской”, аналогичной той, которую может испытать человек при резком торможении или маневре на автомобиле, который двигался с большой скоростью. Наработанная на первом этапе (в трофофазе) клеточная культура может быть перенесена (пересеяна) на продуктивную среду в другом аппарате или культивирование может осуществляться на сложных питательных средах, содержащих как легкоусваиваемые, так и трудноусваиваемые компоненты. Поскольку в структуру молекул многих вторичных метаболитов кроме углерода, водорода и кислорода входит значительное количество азота, серы, фосфора, то в состав продуктивных сред обязательно нужно добавлять в необходимых количествах нитраты, соли аммония и фосфорной кислоты и другие микроэлементы. Существует целый ряд физических (температура, рН, освещение светом определенной длины волны и интенсивности) и химических (добавление веществ-предшественников, поддержание определенной, обычно высокой концентрации кислорода) факторов благоприятствующих синтезу вторичных метаболитов.

Задача 4. В поиске и создании наиболее безопасных и эффективных лекарственных средств большая роль отводится таргетному скринингу. Объясните, что такое таргетный скрининг и как он работает

После завершения предклинических испытаний, при благоприятных результатах, когда ставится вопрос о передаче препарата в клинику, обычно начинается углубленное изучение механизма его действия на субклеточном и молекулярном уровне, то есть ведется поиск его внутриклеточной мишени или, по недавно укоренившейся терминологии "таргета" (target-мишень), - макромолекулы или макромолекулярного комплекса. Затем выявляется ген, кодирующий образование этой макромолекулы или гены, которые кодируют образование макромолекул, входящих в макромолекулярный комплекс.

Новая технология скрининга, создается на основе знания полностью секвенированного (генома, в котором определена последовательность миллионов пар (А-Т, Г-Ц) нуклеотидов ) генома патогенна и «существенных» генов в геноме. В лабораториях, работающих в области создания новых антимикробных лекарств, предварительно выбирается ген, который будет использован для их испытания как таргет (точнее как таргет, будет использован продукт этого гена). Международные базы данных позволяют получить сведения о гене и его распространенности среди патогенов; о продукте, кодируемом этим геном; и об участии этого продукта (как правило, фермента) в том или ином метаболическом цикле; о катализировании им конкретной реакции в цикле. Иными словами, исходным тест-объектом для отбора антимикробных веществ, избирательных ингибиторов метаболизма, является не микробная культура, а ген, или точнее, кодируемый им продукт.

Таргетный скрининг позволяет в соответствии с выбором гена вести отбор биологически активных веществ, в частности, антимикробных препаратов с запланированным иным механизмом действия в отличие от традиционного метода (поиск, ведущийся методом от клетки к гену). Первый этап таргетного скрининга начинается с выделения этого гена (соответствующего фрагмента ДНК) из генома. Далее, используя полимеразную цепную реакцию (ПЦР), фрагмент ДНК амплифицируется. Количество копий гена умножается. Конструируются:

1) бесклеточная система, где наработанная матрица служит для получения информационной РНК, специфичной для гена;

2) бесклеточная рибосомная система, где эта информационная РНК служит для наработки белкового продукт, кодируемого данным геном.

Следует отметить, что методика ПЦР, а также методы получения бесклеточных систем транскрипции и трансляции в настоящее время достаточно хорошо отработаны и в значительной мере автоматизированы. Бесклеточная система, непосредственно используемая для испытания, первичного отбора и оценки активности потенциальных лекарственных веществ - ингибиторов фермента, (продукта изучаемого гена), содержит этот продукт и его субстрат (субстраты).

После того, когда наработан белок, устанавливается функцию этого белка, например, какую реакцию он катализирует как фермент, для того, чтобы по подавлению этой реакции отбирать ингибиторы. Если имеется близкое сходство белка с белком из "модельного" организма, подобрать бесклеточную систему - субстрат для нового белка, не является трудной задачей. Если сходство есть, но не очень близкое, прибегают к анализу "мотивов" - коротких участков аминокислотной последовательности, которые распределены по всей длине белковой цепи при выравнивании и могут оказаться сходными у двух белков. Когда такого сходства нет, или сходство обнаружено, но нет ясности в функции самого гомолога, то есть белка, взятого для сравнения, то прибегают еще к одному пути установления функций изучаемого белка. Устанавливают, с какими белками он контранскрибируется. Если транскрипт - часть полицистронной информационной РНК, необходимой для протекания в последующем определенного метаболического процесса с участием нескольких ферментов, тогда поиск функции изучаемого белка, включенного в группу этих ферментов, сужается.

В целом подходы к установлению функций продуктов изучаемых генов многочисленны и их разнообразие неуклонно растет. Таким образом, можно, в конечном счете, проводить серийные испытания потенциальных ингибиторов функций почти любого из тысяч генов, составляющих геном патогена и обнаруживать все возможные "уязвимые точки" микробной клетки. Подобный путь достижения цели породил в литературе термин "обратная генетика" - исследование ведется не от клетки и ее фенотипа к гену и геному, а, наоборот, от гена к клетке, и к ее фенотипу. Что касается скрининга лекарственных веществ, осуществляемого таким путем, то он получил название "таргетного скрининга" или «скрининга по мишени». Таргетный скрининг и его технология имеют неоспоримое достоинство в том, что любой ген становится доступен для ингибиторов его функций.

Однако, в отношении таргетного скрининга высказываются и критические замечания, которые не носят принципиального характера. В них отмечается, что обнаружение ингибитора таргета - это только начало пути создания антимикробного агента, пригодного для клиники. Требуется, например, чтобы это вещество проникало через оболочку микробной клетки, не подвергалось ферментативной инактивации и т.п. Тем не менее, таргетный скрининг с некоторыми его модификациями и дополнительными тестами, начинает занимать важное место в создании антимикробных лекарств.

Задача 5. Каким образом в подготовительной стадии ферментационного процесса обеспечивается асептика производства

Подготовительные стадии служат для приготовления и подготовки необходимых видов сырья биотехнологической стадии. На стадии подготовки могут быть использованы следующие процессы:

Приготовление среды, обычно жидкой, включающей необходимые компоненты питания для биотехнологической стадии. Стерилизация среды для асептических биотехнологических процессов, где нежелательно попадание посторонней микрофлоры. Под стерилизацией сред обычно понимают любой метод воздействия, обеспечивающий удаление из них микробов - контаминантов или разрушение (гибель) последних. Наиболее распространенным и универсальным среди возможных методов, вызывающих деструкцию микроорганизмов, является метод, основанный в использовании высоких температур. При периодическом способе стерилизации процессы: нагрев, выдержка и охлаждение среды протекают последовательно во времени в одном аппарате. Это может быть ферментер, посевной аппарат или специальный стерилизатор. Весь объем среды нагревают в аппарате до заранее выбранной температуры, выдерживают при этой температуре строго определенное время и охлаждают водой, подаваемой в рубашку аппарата или змеевик. Сам процесс нагрева осуществляют либо путем прямого введения (инжекции) струи перегретого пара с температурой до 1300С в питательную среду, либо подачей пара в тепловую рубашку аппарата. Непрерывное нагревание среды может быть осуществлено без прямого контакта с теплоносителем в трубчатом, пластинчатом или спиральном теплообменнике, который встроен в стерилизатор или стоит перед ним. Но чаще всего среда нагревается до нужной температуры в течение нескольких секунд прямым введением (инжектированием) перегретого пара (100-1400С), полученного в паровых контактных нагревателях. Твердые сыпучие среды, используемые для поверхностного способа культивирования, стерилизуют паром, иногда инфракрасными и ?-лучами. Если в состав питательных сред входят вещества, разрушающиеся при автоклавировании, их следует стерилизовать путем фильтрации через бактериальный фильтр. Затем стерильные профильтрованные компоненты добавляют в проавтоклавированную среду, охлажденную до t 40 ?С.

Подготовка и стерилизация газов (обычно воздуха), необходимых для протекания биотехнологического процесса. Чаще всего подготовка воздуха заключается в очистке его от пыли и влаги, обеспечении требуемой температуры и очистке от присутствующих в воздухе микроорганизмов, включая споры. Одним из самых эффективных способов стерилизации воздуха, является облучение ультрафиолетовыми лучами. Этот метод используется для обеззараживания воздуха в боксах и технологических помещениях . Технически и экономически оправданным в промышленности является способ очистки больших количеств воздуха на фильтрах с помощью волокнистых и пористых материалов. Таким путем удается получить воздух со степе чистоты 99,9999%. Взвешенные в воздухе частицы задерживаются волокнистым материалом благодаря инерционному и диффузионному механизмам осаждения. Если очищенный воздух используют в процессе поверхностного культивирования то он должен быть дополнительно кондиционирован до необходимой температуры и влажности.

Подготовка посевного материала. Подготовку биообъектов проводят согласно прилагаемым к регламентам инструкциям. В этих целях исходный штамм микроорганизма или споровый материал (для грибов или актиномицетов), сохраняемый в условиях, близких к анабиозу или анабиоза (высушенным в стерильной почве, песке, на пшене, путем лиофилизации, или сублимационной сушки), оживляют после добавления стерильной жидкой питательной среды с последующим высевом на уплотненную питательную среду (агар). Убедившись в подлинности и чистоте культуры (культура называется чистой, если родительские и дочерние клетки в ней практически неразличимы и между ними нельзя установить родственные связи), операции по пересеву штамма на богатую питательными веществами среду возрастающих объемов (или площади) повторяют несколько раз в асептических условиях, переходя от пробирок к колбам различного объема, помещаемым на качалочные устройства (шюттель-аппараты). Окончательную наработку биообъекта осуществляют в цехе, используя небольшие ферментаторы-инокуляторы (1-2 стадии), в которых наращивают посевной материал для промышленных ферментаций в количестве 5-20% от объема питательной среды в основном аппарате.

Подготовка биокатализатора. Стадия ферментации осуществляется в биотехнологическом реакторе (ферментере) и может быть организована различными способами в зависимости от особенностей используемого продуцента и требований к типу и качеству конечного продукта. Ферментер - это реакционная емкость, в которой обеспечивается питательное и физиологическое окружение культуры, необходимое для ее роста или получения нужных продуктов метаболизма.

Принципы оснащения биопроизводств:

1. Конструкционное совершенство и относительная универсальность биоректоров.

2. Инертность и коррозионная стойкость материалов биореакторов, другого технологического оборудования, влияющих на биообъект или контактирующих с ним или продуктами его метаболизма.

3. Эксплуатационная надежность технологического оборудования.

4. Доступность, эстетичность и легкость обслуживания, замены, очистки, обработки антисептиками и дезинфектантами узлов и соответствующих частей оборудования.

Согласно первому принципу, желательно конструировать биореакторы, которые можно использовать для реализации биотехнологических процессов, основанных на использовании разных биообъектов (бактерий, грибов, клеток растений и животных).

Учитывая инертность материалов биореакторов, при выборе конструкционных материалов биореакторов используют нержавеющую сталь, стекло, керамику, титан, чугун и т.п. Хром, никель, молибден как лигирующие элементы повышают жаростойкость и химическую стойкость чугуна. Полиэтилен и другие полимерные материалы также широко используют в биотехнологическом процессе.

Эксплуатационная надежность технологического оборудования обеспечивается соответствием аппаратов, приборов и другого оборудования целевому назначению, в частности по конструкционному совершенству, полностью обеспечивающему оптимальные условия для протекания технологического процесса и контроля за ним с учетом требований по технике безопасности.

Любой прибор и аппарат, легко доступной для сборки и разборки, загрузки материалами, питательными средами и выгрузки для чистки, мойки, смазки, ремонта и пр., оценивается выше, чем оборудование с усложненным доступом к его частям.

Оборудование, используемое для работы в асептических условиях, должно иметь регистрирующие устройства для контроля параметров процесса. Необходимо снабжение оборудования устройствами сигнализации, извещающими о неисправности.

Важнейшим условием успешного протекания любого биотехнологи- ческого процесса является поддержание стерильности среды в ферментере и во всей ферментационной установке в целом.

Всю совокупность операций по подготовке оборудования и коммуникаций с целью создания в них асептических условий можно разделить на два важнейших процесса: стерилизация внутренних полостей и герметизация всех элементов и узлов. Первый процесс проводится в подготовительный период перед запуском оборудования (в ходе процесса ферментации осуществляются лишь профилактические мероприятия по стерилизации отдельных узлов вспомогательного оборудования). Второй процесс осуществляется и при подготовке, и при эксплуатации оборудования.

Наиболее распространенный метод стерилизации аппаратов и трубо- проводов - тепловая обработка перегретым выше 1000?С насыщенным водяным паром. Этот метод надежнее, экономичнее и удобнее в производственных условиях, чем обработка химическими средствами.

При стерилизации важнейшим условием ее эффективности является возможность создания во всех точках внутренних полостей необходимой температуры и поддержания ее в течение заданного времени. В производственных условиях выполнение этого требования связано со значительными трудностями ввиду наличия в ферментере многочисленных тупиковых полостей, областей и зон в которые затруднен доступ пара (“слабые точки”). Наиболее трудно стерилизуемыми местами в аппаратах являются участки расположения теплообменников, барботеров, штуцера (места ввода трубопроводов, датчиков КИП), загрузочные люки, а в разводках трубопроводов - тупиковые места, которые образуются на ответвлениях и в местах присоединения к аппаратам.

Для достижения равной степени стерилизации в перечисленных «слабых» точках и в основном обьеме аппарата продолжительность выдержки различается примерно в 100 раз, если принять температуру пара в них 100 С.

Наличие большого количества “слабых точек” обусловлено тем, что конструкционные решения большинства узлов промышленного ферментера часто заимствуются из химической технологии и поэтому они не соответствуют требованиям стерилизации.

Наиболее действенной мерой повышения эффективности стерилизации оборудования и коммуникаций является разработка оборудования с наименьшим числом таких «слабых» точек или принудительная подача пара в эти зоны через дополнительные термические затворы, специально встроенные в те участки ферментера, где наблюдается максимальная концентрация таких«слабых» точек. Так же такими термическими затворами должны быть снабжены и все трубопроводные линии аппаратов.

Второй процесс определяющий конструктивные особенности аппаратуры, - ее герметизация. Она решает две задачи - защиту внутреннего объема от посторонней микрофлоры и защиту окружающей среды от продуктов биосинтеза. Одним из важных направлений повышения эффективности герметизации является переход на сварные соединения вместо фланцевых (соединение отдельных узлов за счет болтов), на сильфонные или мембранные вентили вместо обычных, на создание торцевых уплотнений для валов перемешивающих устройств с контролируемой герметичностью.

Для снижения риска попадания извне посторонней микрофлоры внутри ферментера создают небольшое избыточное давление.

В зависимости от требований предъявляемых к чистоте продукции (лекарственные, пищевые продукты) проводят работы по дезинфекции рабочих мест и целых производственных участков, очистке воздуха рабочих зон.

Предварительная обработка сырья. Если сырье поступает в производство в виде, непригодном для непосредственного использования в биотехнологическом процессе, то проводят операцию по предварительной подготовке сырья.

В правилах организации производства и контроля качества ЛС (GMP) отражаются все основные производственные факторы, оказывающие влияние на качество различных групп ГЛС, а именно: здания и помещения, персонал, оборудование, организация и ведение процесса производства, документация, постадийный контроль процесса производства, контроль качества готового продукта, содержит классификацию помещений производства стерильных ЛС по содержанию в воздухе помещений механических частиц и микроорганизмов, которые соответствуют международным требованиям, и классификацию помещений производства нестерильных ЛС по содержанию в воздухе микроорганизмов.

Асептика производства при организации процесса ферментации обеспечивается соблюдением требований Приказа Министерства промышленности и торговли от 14 июня 2013 г. № 916 "Об утверждении Правил организации производства и контроля качества лекарственных средств".

Список литературы

1. Приказ Министерства промышленности и торговли от 14 июня 2013 г. № 916 "Об утверждении Правил организации производства и контроля качества лекарственных средств"

2. Воробьева Л. И. Промышленная микробиология. - М.: МГУ, 1990.- 294с.

3. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. М. "Мир". 2002.- 590 с.

4. Егоров Н.С. Основы учения об антибиотиках: Учебник.- М.: Изд-во МГУ, 1994.-512 с.

5. Егорова Т.А., Клунова С.М., Живухина Е.А., Основы биотехнологии. М.: Издательский центр "Академия", 2003.-208с.

6. Елинов Н.П. Основы биотехнологии. М.: Издательская фирма “Наука”, СПБ, 1995.- 600 с.

7. Кантере В.М. Теоретические основы технологии микробиологических производств. - М.: Агропромиздат, 1990. - 271с.

8. Османов В.К., Бирюкова О.В., Борисов А.В., Борисова Г.Н., Мацулевич Ж.В. Инженерная энзимология. Учебно-методическое пособие для студентов фармацевтического факультета. - Нижний Новгород: Изд-во Нижегородской государственной медицинской академии, 2006.- 104с.

9. Османов В.К., Бирюкова О.В., Борисов А.В., Борисова Г.Н., Мацулевич Ж.В. Методы выделения и очистки продуктов биотехнологических производств. Учебно-методическое пособие для студентов фармацевтического факультета. - Нижний Новгород: Изд-во Нижегородской государственной медицинской академии, 2006.- 104с.

10. Сазыкин Ю.О. Антибиотики как биохимические реагенты. - М.: ВИНИТИ, 2004.-203 с.

11. Страчунский Л.С, Белоусов Ю.Б, Козлов С.Н, Практическое руководство по антиинфекционной химиотерапии.- М.: ВИНИТИ, 2007.- 178с.

12. Шилова СВ., Пузакова СМ. и др. Организация производства лекарственных средств с учетом правил GMP. Химико-фармацевтическое производство, обзорная информация.- М.: ВНИИСЭ ГГИД 2006. - 36 с.

Размещено на Allbest.ur