Рео- та аденовірусна інфекції і їх вплив на ефективність вакцинопрофілактики інфекційного бронхіту птиці

Размещено на http://www.allbest.ru/

УКРАЇНСЬКА АКАДЕМІЯ АГРАРНИХ НАУК

НАЦІОНАЛЬНИЙ НАУКОВИЙ ЦЕНТР

“ІНСТИТУТ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЇ І КЛІНІЧНОЇ ВЕТЕРИНАРНОЇ МЕДИЦИНИ”

УДК: 619:616.233-002:578.823/.826:616-84/-85:636.5

Рео- та аденовірусна інфекції і їх вплив на ефективність вакцинопрофілактики інфекційного бронхіту птиці

16.00.03 - ветеринарна мікробіологія та вірусологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата ветеринарних наук

Пащенко Ольга Олексіївна

Харків 2007

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Луганському національному аграрному університеті Міністерства аграрної політики України

Науковий керівник - кандидат ветеринарних наук , доцент ПАРХОМЕНКО Людмила Іванівна, Луганський національний аграрний університет, доцент кафедри мікробіології і вірусології

Офіційні опоненти:

доктор ветеринарних наук, професор Білокінь Віктор Степанович, ННЦ “Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини”, головний науковий біотехнології,

кандидат ветеринарних наук, доцент Панікар Ігор Ігорович, Полтавська державна аграрна академія, завідувач кафедри біотехнології

Провідна установа: Національний аграрний університет Кабінету Міністрів України, кафедра мікробіології вірусології та біотехнології, м. Київ

Захист дисертації відбудеться “13” червня 2007р. о 9.00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради в ННЦ “Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини“ УААН за адресою: 61023, м. Харків, вул. Пушкінська,83

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці ННЦ “Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини“ УААН за адресою: 61023, м. Харків, вул. Пушкінська,83

Автореферат розісланий “ 10 ” травня 2007р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, доктор ветеринарних наук, професор Бабкін А.Ф.

реовірус аденовірус бронхіт імуносупресивний

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. На сьогодні в промисловому птахівництві широко застосовується щеплення птиці проти основного особливо небезпечного вірусного захворювання - інфекційного бронхіту курей (ІБК) (Казанцев И.В., 2003; Смоленский В., 2001; Дроздова Л.И., 2001). На ефективність вакцинопрофілактики в птахівництві негативно впливають різноманітні імуносупресивні фактори, до яких відносять і стационарні вірусні інфекції. За даними багатьох авторів (Коровин Р.Н., Рождественский Н.К., 1990; Hess M., 2000; Heggen-Peay C.L., 2002) рео- та аденовірусна інфекції птиці набули широкого поширення в багатьох країнах світу, в тому числі й в Україні. Персистентні інфекції знижують загальну резистентність організму та його імунний статус, що не дає змоги імунній системі адекватно реагувати на введення вірус-вакцин.

У звязку з цим доцільним є визначення циркуляції рео- та аденовірусів та їх впливу на ефективність вакцинопрофілактики інфекційного бронхіту курей. Актуальність наукових досліджень зумовлена необхідністю удосконалення схем щеплення інфекційного бронхіту курей на тлі персистенції рео- та аденовірусів.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота є складовою частиною досліджень за темою “Вивчення інфекційної патології молодняка сільськогосподарських тварин і птиці, розробка ефективних заходів боротьби в господарствах південно - східної частини України”, (2001-2005рр., номер державної реєстрації 0104U005403).

Мета та завдання досліджень. Мета досліджень - визначення циркуляції рео- та аденовірусів птиці та їх впливу на ефективність вакцинопрофілактики інфекційного бронхіту.

Для реалізації мети були поставлені наступні завдання:

Провести серологічний моніторинг реовірусної, аденовірусної інфекцій та інфекційного бронхіту серед сільськогосподарської, синантропної та дикої птиці.

Ізолювати від птиці та ідентифікувати польові штами адено- та реовірусів.

Вивчити біологічні властивості ізолятів рео- та аденовірусів.

Визначити вплив рео- та аденовірусів на напруженість імунітету до вірусу ІБК в умовах птахогосподарства та експерименті.

Обєкт дослідження. Рео- та аденовірусна інфекції птиці, вакцинопрофілактика інфекційного бронхіту птиці.

Предмет дослідження. Рео- та аденовіруси, їх біологічні властивості, динаміка формування специфічного імунітету щодо вірусу інфекційного бронхіту на фоні рео- та аденовірусної інфекцій.

Методи дослідження: епізоотологічні, серологічні, клінічні, патологоанатомічні, вірусологічні, мікробіологічні, біохімічні, гістоморфологічні, статистичні.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше визначено поширення рео- та аденовірусної інфекцій серед птахопоголівя господарств південно-східного регіону України, ідентифіковано та вивчено біологічні властивості епізоотичних ізолятів адено- та реовірусів з використанням різних біологічних систем, доведено ступінь їх імуносупресії щодо вакцинних штамів вірусу інфекційного бронхіту курей. В експерименті та виробничих умовах показано негативний вплив рео- та аденовірусів на функцію імунокомпетентних органів (бурси Фабриціуса) та формування групового імунітету при вакцинопрофілактиці ІБК. Новизна розробок захищена двома патентами на корисну модель України: “Ізолят А-1 як продуцент антигену аденовірусу птиці 1 групи” (Деклараційний патент України № 21178 від 15.03. 2007), “Ізолят R-1 як продуцент антигену реовірусу птиці” (Деклараційний патент України № 16439 від 15.08.2006).

Практичне значення отриманих результатів. На підставі отриманих результатів досліджень розроблено “Методичні рекомендації щодо оцінки впливу циркуляції рео- та аденовірусів на ефективність вакцинопрофілактики інфекційного бронхіту курей”, які затверджено Науково-методичною радою Державного департаменту ветеринарної медицини (протокол №3 від 20.12.2006).

Запроновано схеми імунізації птиці проти ІБК на фоні циркуляції рео- та аденовірусів у птахогосподарствах яєчного та мясного напрямків продуктивності.

Особистий внесок дисертанта полягає в самостійному виконанні методичних, аналітичних і експериментальних досліджень. Пошукач особисто узагальнила отримані дані шляхом аналізу та статистичної обробки. Серологічні досідження здійснила разом із співробітниками вірусологічного відділу Луганської обласної державної лабораторії ветеринарної медицини.

Визначення морфофункціональної активності імунокомпетентних органів інфікованих курчат проведено у відділі патоморфології ННЦ “ІЕКВМ” (м.Харків) під керівництвом академіка УААН Краснікова Г.А.

Перещеплювану культуру клітин VERO отримано з лабораторії біотехнології ННЦ “ІЕКВМ” (м. Харків), за що щиро вдячні професору Білоконю В.С.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації апробовані та схвалені:

на звітних сесіях та науково-практичних конференціях вченої ради факультету ветеринарної медицини Луганського НАУ, 2003-2006 років;

міжнародній научно-практичній конференції молодих вчених “Современные проблемы диагностики инфекционных болезней животных”, м. Харків, 2-3 грудня 2003 р.;

науково-практичному семінарі з питань ветеринарної медицини птахівництва, м. Луганськ, червень 2004 р.;

міжнародній науково-практичній конференції “Забезпечення ветеринарно-санітарного благополуччя тваринництва, якості та безпеки продукції”, м. Одеса ,27-29 жовтня 2004 р.;

всеукраїнській конференції студентів, магістрантів, аспірантів “Майбутнє ветеринарної медицини, біології та біотехнології”, м. Луганськ, 26-28 квітня 2005р.

Публікації. За темою дисертації опубліковано 14 наукових робіт, 12 з яких у фахових виданнях України та одна у закордонному виданні.

Структура та обсяг дисертації. Основний зміст дисертації викладений на 121 сторінці компютерного друку, містить 28 таблиць, 49 рисунків.

МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Роботу виконано в Науково-виробничому центрі ветеринарної медицини птахівництва Луганського національного аграрного університету. Окремі дослідження проведено в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАНУ (м. Харків) та Національному науковому центрі “Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини” (м. Харків).

У роботі використано аденовіруси птиці: референтний штам - Phelps 1 серотипу, ембріональний, титр 10⁵ ЕІД₅₀ /см³ та ізоляти аденовірусу - А-1, А-2, А-3, А-4, А-5, А-6; референтний штам реовірусу - СП-73, культуральний, титр 10^6,5 ТЦД₅₀/см³ та ізоляти R-1, R-2 реовірусу, що отримані при виконанні роботи; вакцина проти ІБК CEBAK BROW, штам Н120, серія 0102 № 1S1A; виробництва CEVA Phylaxia, Угорщина.

Для ізоляції штамів реовірусу та аденовірусу патологічний матеріал (нирки, печінка, уражені суглоби) відбирали від курей з ознаками синдрому малоабсорбції та артриту, ураженнями респіраторних органів, а також від ембріонів-задохликів.

В дослідах з визначення інфекційної активності ізолятів рео- та аденовірусів використали 965 курячих зародків 9-11-добової інкубації, 40 гусячих зародків 11-добової інкубації, перещеплювану культуру клітин нирки зеленої мавпи -VERO та 25 курчат 5-10 добового віку.

Серологічний моніторинг птиці щодо виявлення антитіл до рео-, адено- та вірусу ІБК проведено в промислових птахогосподарствах різного напрямку продуктивності, а також серед синантропної, дикої та свійської птиці 17-ти районів Луганської області з використанням РНГА. З господарств яєчного напрямку продуктивності досліджували птицю у ВАТ “Сімейкінське”, СТОВ“Авіс”, ВАТ “Червоний прапор”, мясного напрямку - ВАТ “Агроукрптаха” та ВАТ “ПП Перевальський” протягом 2003-2005 років. У перших трьох птахогосподарства вирощується птиця кросів Хайсекс коричневий, Ломан-браун, Хай-Лайн, а ВАТ “Агроукрптаха” та ВАТ “ПП Перевальський”, з 2005 року - ЗАТ “Лантгут Бройлер“ - кросу Арбор-Айкерс та Хаббарт.

Вірусовиділення ізолятів R-1 та R-2 проводили із використанням різних біологічних систем. Проведено по 2 пасажі у курячих та гусячих зародках шляхом зараження досліджуваним матеріалом на хоріоналантоїсну оболонку (ХАО), в об'ємі 0,2см³. Інкубували за температури 37 С протягом 4 діб, після чого оцінювали зміни зародку, хоріоналантоїсної оболонки.

Проведено 4-х і 8-разове пасажування відповідно ізолятів R-1 та R-2 в перещеплюваній культурі клітин VERO. Поживне середовище містило рівні об'єми середовищ Ігла, 199 та 10% сироватки крові великої рогатої худоби. Титр вірусу визначали за методом Ріда і Менча. Патогенність ізоляту R-1 визначали на курчатах 5-добового віку. Інфікування проводили інтраплантарно в об'ємі 0,2 см³.

Ізоляти аденовірусу А-1, А-2, А-3 та А-5 пройшли по 2 пасажі на курячих зародках. Визначено репродуктивні властивості ізоляту А-1 у перещеплюваній культурі клітин VERO з наступною його індикацією на курчатах 6-ти добового віку.

Електрофоретичні профілі вірусних білків ізолятів R-1 та R-2 реовірусу та А-1, А-2, А-5 та А-6 вивчали за методом гельелектрофорезу у поліакриламідному гелі.

Ідентифікацію ізолятів рео- та аденовірусів проводили у реакції нейтралізації з специфічними гіперімунними сироватками до референтних штамів СП-73 та Phelps, відповідно. Специфічні гіперімунні сироватки до референтного штаму СП-73 реовірусу та Phelps аденовірусу отримували шляхом гіперімунізації кролів протягом 5 тижнів. В перші 4 тижні антигени вводили внутрішньовенно три рази через добу в обґємі 2, 3, 4 та 4 см³. На 5-тому тижні однократно - в обґємі 10 см³.

Імуносупресивні властивості рео- та аденовірусів вивчали на курчатах, для чого було сформовано 7 груп по 5 голів, яких за 5 тижнів до вакцинації проти вірусу інфекційного бронхіту інфікували польовим ізолятом (R-1) - група 1; референтним штамом (СП-73) реовірусу - група 2; польовим ізолятом аденовірусу (А-1)- група 3; референтним штамом аденовірусу (Phelps)- група 4. Одночасно інфікували курчат групи 5 штамами СП-73 реовірусу та Phelps аденовірусу, курчат групи 6 - ізолятами R-1 реовірусу та А-1 аденовірусу. Сьома група курчат залишалася не інфікованою. Через 2 та 5 тижнів після вакцинації проти вірусу інфекційного бронхіту проводили серологічні дослідження курчат, через 10 тижнів - гістологічні дослідження бурси Фабриціуса.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Результати серологічного моніторингу птиці промислових птахогосподарств, синантропних і диких птахів щодо адено- і реовірусної інфекцій, ефективність вакцинопрофілактики інфекційного бронхіту курей. Ефективність вакцинопрофілактики вірусних інфекцій в промисловому птахівництві залежить як від правильного підбору програм вакцинації, так і врахування епізоотичної ситуації у регіоні. Для цього необхідним є впровадження моніторингових досліджень птиці щодо визначення спектру латентних вірусів, що циркулюють у господарстві.

Проведений нами серологічний моніторинг синантропної, дикої та свійської птиці виявив наявність у неї антитіл у титрах різного рівня до адено-, рео- та вірусу ІБК. До 80-100% синантропних птахів (горобці, голуби, ворони), що реагували до адено-, рео- та вірусу ІБК, встановлено у Сватівському, Станично-Луганському, Краснодонському та Перевальському районах Луганської області.

Високий титр антитіл (4,0 log₂) до реовірусу та аденовірусу виявлено у свійської птиці (кури, гуси) у Біловодському районі Луганської області, серед синантропних птахів (3,6 log₂ і 3,4 log_2, відповідно), які мешкають на території промислових птахогосподарств Краснодонського району, ВАТ “Агроукрптаха” та ВАТ “Сімейкінське”. Аналогічна ситуація спостерігалася також серед синантропних птахів ВАТ “Червоний прапор” Перевальського району та СТОВ “Авіс” Лутугінського району Луганської області (титр антитіл до рео- та аденовірусів - 3,0 log₂).

Серед диких птахів (граки, качки) антитіла до зазначених вірусів на рівні 3 log₂ реєстрували у Станично-Луганському, Марківському та Попаснянському районах Луганської області.

Найбільш високий рівень антитіл до вірусу ІБК встановлено у Станично-Луганському, Кременському та Попаснянському районах.

У птиці яєчного напрямку продуктивності ( ВАТ “Червоний прапор”, СТОВ “Авіс”, ВАТ “Сімейкінське”) антитіла щодо адено- та реовірусів реєструвалися впродовж трьох років (2003-2005 рр.). При цьому титр антитіл коливався від 1,5 до 5,0 log₂ у різні періоди вирощування. Антитіла виявляли фактично у 100% досліджених проб сироватки крові. Середні показники серопозитивної птиці з діагностичним титром (3,0 log₂) по господарствах наведено на рисунках 1 та 2.



Оскільки вакцинопрофілактика проти рео- та аденовірусної інфекцій у господарствах яєчного напрямку продуктивності не проводилася, отримані результати серологічного моніторингу вказують на циркуляцію епізоотичних штамів рео- та аденовірусів. Необхідно зазначити, що антитіла до цих вірусів виявлялися протягом трьох років поспіль, а профілактичні засоби не проводилися проти жодної з інфекції, які вивчались, що свідчить про стаціонарність адено- та реовірусної інфекцій.

Для зменшення негативного впливу зазначених вірусів на рівень групового імунітету виникає необхідність введення до схем вакцинації птиці у господарствах щеплення проти реовірусної та аденовірусної інфекцій (АВІ) або корегування існуючих схем специфічної профілактики інфекційного бронхіту курей.

При аналізі ефективності вакцинопрофілактики ІБК на фоні циркуляції рео- та аденовірусів у трьох птахогосподарствах яєчного напрямку продуктивності найбільша ефективність щеплення проти ІБК встановлена у ВАТ “Червоний прапор”. Використання 4-кратної імунізації птиці живими вакцинами різних штамів (а саме: 4/91 та Ма5) призвело до формування напруженого групового імунітету у 2004-2005р навіть на фоні циркуляції рео- та аденовірусів (рис.3).

Використання схеми вакцинопрофілактики ІБК у 2003-2004 роках із застосуванням вакцини лише із штаму Ма5 у ВАТ “Сімейкінське” не забезпечувало формування напруженого імунітету до збудника ІБК. Проте, у 2005 році за умов застосування програми вакцинопрофілактики ІБК, що передбачала використання вакцин з різних штамів вірусу ІБК (4/91 та Ма5), груповий імунітет до ІБК на фоні циркуляції епізоотичних штамів рео- та аденовірусів у було сформовано на рівні 76%, що значно вище порівняно із 2003 (50%) та 2004 (62%) роками.

У СТОВ “Авіс” протягом 2003-2005 років птицю не щепили проти РВІ та АВІ, профілактика ІБК здійснювалась із застосуванням вакцини з одного штаму вірусу (Н-120). Групова імунна відповідь щодо ІБК була на невисокому рівні впродовж усього періоду спостереження ( рис.3).

В господарстві мясного напрямку продуктивності ВАТ “Агроукрптаха” антитіла до аденовірусу 1 серотипу реєстрували у 100% дослідженої птиці на рівні від 3,0 до 5,0 log₂. Титр антитіл до реовірусу коливався в межах від 1,0 - 3,0 log₂ (2003 р.) до 3,0 - 4,0 log₂ (2004 р.). Оскільки вакцинація проти РВІ не проводилась, наявність антитіл щодо цього збудника свідчить про циркуляцію епізоотичного штаму. У 2005 році в цьому господарстві впроваджено щеплення птиці проти РВІ, але з використанням лише однократної імунізації курчат у 10-добовому віці, що не призвело до формування напруженого імунітету до РВІ впродовж усього періоду вирощування та не вплинуло позитивно на формування імунітету до ІБК.

Систематичне щеплення птиці проти РВІ у ВАТ “ПП Перевальський” протягом трьох років за схемою дворазового застосування живої та одноразово - інактивованої вакцин забезпечувало формування напруженого імунітету під час імунізації птиці проти ІБК. Птиця весь період вирощування була захищена від інфікування епізоотичними штамами вірусу інфекційного бронхіту. Отже, профілактика РВІ за запропонованою нами схемою вакцинації, що передбачала триразове введення живої та однократне - інактивованої вакцин, позитивно впливало на формування імунної відповіді у птиці щодо вакцинних штамів ІБК.

Ізоляція, індикація та вивчення біологічних властивостей збудників реовірусної інфекції. За реовірусної інфекції, що встановлена нами серед птиці ВАТ “Агроукрптаха”, хвора птиця відставала в рості та розвитку, в неї спостерігали артрити та теносиновіти. Схожі клінічні ознаки нами виявлено серед курчат-бройлерів, що утримувались у приватному секторі. Захворюваність сягала 80% як бройлерів, так і курей яєчного напрямку продуктивності, з патологічного матеріалу яких отримали ізоляти R-1 та R-2.

Під час ізоляції епізоотичних штамів реовірусу (R-1, R-2) в курячих зародках, виявлено застійні явища у внутрішніх органах, збільшення нирок, набряк ХАО. Типова ознака дїї реовірусів - утворення некротичних вогнищ на ХАО - в наших дослідженнях виявлена у 20% випадків у першому пасажі ізоляту R-1. Загибель ембріонів склала 20 та 40% у першому та другому пасажах (табл. 1).

Таблиця 1 Біологічна активніть ізолятів реовірусів птиці у курячих та гусячих зародках ( n=5)

Зміни	У курячих зародках,%	У гусячих зародках,%
	ізолят R-1, пасаж	ізолят R-2, пасаж	ізолят R-1, пасаж	ізолят R-2, пасаж
	1	2	1	2	1	2	1	2
Набряк ХАО	100	80	100	100	40	40	80	80
Вогнища некрозу на ХАО	20	-	-	-	-	-	20	-
Затримка в розвитку	20	40	-	20	40	60	60	40
Некрози печінки	-	20	-	-	-	20	40	-
Застійні явища у внутрішніх органах	100	100	100	100	-	-	-	-
Збільшення нирок	60	80	100	80	20	40	100	60
Крововиливи по тілу зародка	-	-	-	-	-	20	-	80
Загибель ембріонів	20	40	20	20	-	20	-	-

Примітка: - зміни не виявлені

Розмноження ізолятів R-1 та R-2 у гусячих ембріонах характеризувалося затримкою в рості та розвитку ембріонів, крововиливами по тілу зародка, вогнищами некрозів на ХАО та печінки без застійних явищ у внутрішніх органах.

При визначенні інфекційної активності ізоляту R-1 у біопробі на курчатах встановлено, що захворюваність через тиждень складала 67%, через два тижні - 80%. Клінічні ознаки проявлялися вже на другу добу після інфікування курчат, в яких домінували проноси, збільшення гомілкових суглобів, слабкість кінцівок. Відмічено відставання в рості, зменшення на 25% маси інфікованих курчат через 7 діб після зараження порівняно з інтактними. За серологічними дослідженнями з реовірусним еритроцитарним антигеном виявили найбільший рівень титру антитіл (від 3,0 до 5,0 log₂ ) через 10 діб після інфікування курчат.

Адаптація ізоляту R-1 до культивування у перещеплюваній культурі клітин VERO відбувалась уже з першого пасажу з розвитком цитопатогенної дії (ЦПД) через 120 годин після інфікування. Зі збільшенням кількості пасажів скорочувався термін прояву ЦПД вірусу. На четвертому пасажі округлення та утворення осередків уражених клітин моношару у вигляді синцитію виявляли вже через 22 години. Інфекційна активність ізоляту R-1 після четвертого пасажу становила 6,5 lg ТЦД₅₀/см³(рис. 4).

За результатами визначення інфекційності ізолят R-1 віднесено до високопатогенного, що підтверджується високим рівнем захворюваності курчат у біопробі з проявом типових клінічних ознак та ізоляції його в курячих та гусячих ембріонах вже з першого пасажу.

ЦПД ізолята R-2 реовірусу проявлялася лише в четвертому пасажі через 120 годин після інфікування моношару клітин. Після наступних трьох пасажів термін прояву ЦПД скорочувався на 24 години. Титр вірусу становив 5,0 lg ТЦД₅₀/см³, що вказує на його менш виражені патогенні властивості в порівнянні з ізолятом R-1.

Ізоляція, індикація та вивчення біологічних властивостей збудників аденовірусної інфекції. Для ізоляції аденовірусів нами був використаний патологічний матеріал, відібраний у випадках прояву різних симптомокомплексів, які зустрічаються при аденовірусній інфекції курей. Так, ізолят А-1 був отриманий із матеріалу, відібраного від птиці із ознаками респіраторної інфекції, А-2 та А-3 - курячих ембріонів, що загинули на останніх етапах ембріогенезу, А-5 -завмерлого ембріону папуги Розели (Platycereus eximius), а ізолят А-6 - від птиці з ознаками гідроперикардиту.

Індикація ізолятів аденовірусу (А1, А-2, А-3, А-5) в курячих зародках характеризувалась відставанням у рості та розвитку ембріона, набряком підшкірної клітковини, гіпертрофією та утворенням локальних некрозів печінки, набряком та бляшками на ХАО.

У біопробі на курчатах ізоляту А-1 спостерігали пригнічення, зменшення апетиту, діарею. Смертність становила 17% інфікованого поголівя. За серологічними дослідженнями курчат виявили антитіла до аденовірусу 1 серотипу. При патологоанатомічному розтині загиблих курчат реєстрували ураження легень, печінки та нирок.

При культивуванні ізоляту аденовірусу А-1 у перещеплюваній культурі клітин VERO ЦПД проявлялась у вигляді округлення клітин через 172 години після інфікування у першому, та через 96 годин у 2-3 пасажах. Титр вірусу становив 4,0 lg ТЦД₅₀/см³.

Ідентифікація ізолятів рео- та аденовірусів. Ідентичність ізолятів аденовірусу ( А-1, А-2, А-5, А-6) та реовірусу (R-1, R-2) визначалась за показниками електрофоретичних профілів вірусних білків у порівнянні з референтними штамами. Зокрема, поліпептиди IIIа та III пентону виявлено в ізоляті А-1. Поліпептид V серцевини та VIII гексону входив до складу ізолята А2 аденовірусу. В ізолятах А-5 та А-6 також знайдено білки з молекулярною масою, відповідною щодо маси основних структурних білків референтного штаму аденовірусу.

Результати досліджень електрофоретичних профілів польових ізолятів R-1, R-2 вказують на наявність основних білків реовірусу 1 та 2 в ізоляту R-1. В ізоляту R-2 виявлено основний 2 та мінорний 2 компоненти серцевини віріону, які є основною складовою референтного штаму реовірусу -СП-73.

Належність ізолятів А-1 та R-1, R-2 відповідно до адено- та реовірусів птиці підтверджено за допомогою реакції нейтралізації зі специфічними гіперімунними сироватками до референтних штамів аденовірусу (Phelps) та реовірусу ( СП-73) .

Результати реакції нейтралізації штамів R-1 та R-2 свідчать, що гіперімунна сироватка до референтного штаму СП-73 реовірусу нейтралізувала цитопатогенну дію ізолятів у перещеплюваній культурі клітин VERO. Титр ізоляту R-1 та R-2 під дією специфічної сироватки знизився на 3,0 lg ТЦД_50/см³, що вказує на гомологічність досліджених ізолятів та гіперімунної сироватки, а відповідно і про ідентичність ізолятів R-1, R-2 та референтного штаму СП-73 реовірусу. Індекс нейтралізації ізолятів R-1 та R-2 специфічною гіперімунною сироваткою становив 1000 (табл.2).



Таблиця 2 Показники індексу нейтралізації специфічними гіперімунними сироватками референтних штамів рео- та аденовірусів

Індекс нейтралізації
штам	гіперімунна сироватка крові до штаму СП-73 реовірусу	штам	гіперімунна сироватка крові до штаму Phelps аденовірусу
СП-73	1000	штаму -Phelps	1000
R-1	1000	штам А-1	100
R-2	1000

Ідентичність ізоляту А-1 референтному штаму Phelps аденовірусу птиці встановлена за нейтралізацією специфічною гіперімунною сироваткою до штаму Phelps у перещеплюваній культурі клітин VERO. При цьому інфекційний титр вірусу знизився на 2,0 lg ТЦД_50/см³, що на 1,0 lg менше, ніж за нейтралізації штаму Phelps цією ж сироваткою. Індекс нейтралізації ізоляту А-1 специфічною гіперімунною сироваткою становив 100.

Експериментальне визначення впливу рео- та аденовірусів на напруженість імунітету щодо вакцинного штаму вірусу інфекційного бронхіту. Для досліду щодо визначення впливу рео- та аденовірусів на ефективність вакцинопрофілактики ІБК було сформовано 7 груп курчат, які були попередньо інфіковані епізоотичними та референтними штамами рео- та аденовірусів, через 5 тижнів після цього - щеплені проти ІБК живою вакциною (штам Н-120). Серологічні дослідження сироваток крові курчат проводили через 2 та 5 тижнів після вакцинації курчат.

Встановлено достовірну різницю у рівні імунної відповіді до вірусу ІБК курчат, інфікованих різними штамами реовірусу птиці, та контрольних. Так, в інфікованих піддослідних 1 і 2 груп курчат як польовим (R-1), так і референтним (СП-73) штамами реовірусу титр післявакцинальних антитіл після щеплення вакциною проти ІБК достовірного знаходився на рівні 3 ±0,31 log₂ та 3±0,32 log₂, відповідно, в той час як у контрольній групі імунізованих проти ІБК інтактних курчат рівень антитіл досягав 5±0,31 log₂ через 2 тижні після вакцинації (табл. 3).

Таблиця 3

Рівень антитіл до рео- аденовірусу та вірусу ІБК у курчат дослідних груп (n=5)

Групи курчат	Штами вірусів	Рівень антитіл щодо вірусів у РНГА,log2
		через 3тижні п/з	через 7 тижнів п/з, через 2 тижні п/в	Через 10 тижнів п/з, через 5 тижнів п/в
		реовірус	аденовірус	реовірус	аденовірус	вірус ІБК	реовірус	аденовірус	вірус ІБК
1	R-1	2,2 ±0,37	-	3,4± 0,24	-	3±0,31 ***	3,0± 0,21	-	2,9±0,4***
2	СП-73	2±0,45	-	3,2± 0,37	-	3±0,32 ***	3,2± 0,32	-	2,8±0,36***
3	А-1	-	2±0,31	-	2,6± 0,24	3,8± 0,2**	-	2,1± 0,26	3,5±0,31**
4	Phelps	-	1,6± 0,24	-	3,2± 0,2	3,4± 0,4**	-	2,5± 0,32	3,5±0,26**
5	Phelps + СП-73	2,6±0,24***	2±0,31	3,2± 0,37	2,6± 0,4	2,6± 0,5 ***	3,4± 0,24	3,2± 0,2*	2,8± 0,2***
6	А1+ R-1	1±0,32	1,4± 0,24	4±0,31	3±0,32	3,4± 0,24 **	3,2± 0,2	2,4± 0,24	2,6± 0,24 ***
7	контроль на	-	-	-	-	5±0,31	-	-	5±0,32

n=кількість голів у групі; п/з - після зараження ; п/в - після вакцинації

***Р<0,001 ;** Р<0,01; ** Р<0,05 дослідні групи відповідно контрольних

Інфікування курчат аденовірусами також пригнічувало імунну відповідь щодо вірусу ІБК, але в меншій мірі. Через два тижні після вакцинації антитіла до вірусу ІБК реєстрували на рівні 3,8±0,2 log₂ та 3,4±0,4 log₂ у курчат, інфікованих ізолятом А-1 та штамом Phelps, відповідно, що на 1,2 та 1,6 log₂ менше, ніж у контрольній групі.

Менший рівень антитіл щодо ВІБ майже в два рази зареєстровано через 2 тижні після вакцинації у курчат 5-ї групи (інфікованих референтними штамами СП-73 рео- та Phelps аденовірусів) порівняно з контрольною групою курчат.

Найбільшу імуносупресивну дію епізоотичних ізолятів R-1 та А-1 встановлено через 5 тижнів після вакцинації курчат проти ІБК, вірусоспецифічні антитіла до якого реєстрували лише на рівні 2,6±0,24 log₂, що достовірно відрізнялося від показників у курчат контрольної групи (рис.5).

Імуносупресивні властивості рео- та аденовірусів підтверджено результатами гістологічних досліджень основного імунокомпетентного органу птиці - бурси Фабриціуса. У курчат, інфікованих референтними штамами та польовими ізолятами рео- та аденовірусів (групи курчат 1, 2, 3, 4), спостерігали різний ступінь деструктивних змін, а саме: гіпоплазію фолікулів, зменшення їх кількості та залозисте переродження, місцями заміщення фолікулів сполучною тканиною. Польовий ізолят аденовірусу А-1 також обумовлював руйнування епітелію слизової оболонки бурси Фабриціуса.

У курчат, одночасно інфікованих рео- і аденовірусами (групи 5 та 6), спостерігали найбільш тяжкі зміни бурси Фабриціуса: близько 50% фолікулів були частково делімфатизовані і не мали коркової речовини. Розмір фолікулів, які були розділені широкими прошарками сполучної тканини, складав 100-160 мкм. Значна частина органу представлена залозистими структурами, які утворилися на місці делімфатизованих фолікулів.

Отже, шляхом використання серологічних та гістоморфологічних методів підтверджено супресивну дію рео- і аденовірусів на органи імунної системи курчат. В той же час моноінфекція реовірусу спричиняє більш виражений імуносупресивний стан в організмі птиці, ніж аденовіруси. В асоціації рео- та аденовіруси посилюють імуносупресивні властивості один одного.

ВИСНОВКИ

1. Результати вірусологічних та серологічних досліджень, проведених впродовж 2003-2005 рр., свідчать про широку циркуляцію серед птиці промислових і приватних птахогосподарств рео- та аденовірусів, які негативно впливають на ефективність щеплення проти інфекційного бронхіту курей. З урахуванням напрямку продуктивності птиці випробувані та впроваджені ефективні схеми вакцинопрофілактики інфекційного бронхіту курей та реовірусної інфекцій, що забезпечують формування групового імунітету у птиці на рівні відповідно 80-92 та 84-87%.

2. Циркуляція серед курей рео- та аденовірусів супроводжується індукцією вірусоспецифічних антитіл, рівень яких, за даними серологічного моніторингу, коливається від 1,0 до 5,0 log. Найвищий титр антитіл до рео- та аденовірусів реєструється у птиці промислових господарств.

3. На фоні циркуляції рео- та аденовірусів серед птиці яєчного напрямку продуктивності груповий імунітет щодо інфекційного бронхіту курей при щепленні вакциною з одного виробничого штаму формується лише у 30-76% птахопоголівґя. Більш ефективною є схема вакцинації ІБК із використанням різних штамів вірусу ІБК - 4/91 та Ма5. Включення до схеми щеплення птиці м'ясного напрямку продуктивності вакцини проти реовірусної інфекції підвищує ефективність формування групового імунітету до ІБК на рівні 93%.

4. Для виділення рео- та аденовірусів придатні ембріони курей 9-11-добової інкубації та перещеплювана культура клітин VERO. Репродукція вірусів у курячих зародках спричиняє набряк ХАО, утворення бляшок, затримку розвитку, крововиливи по тілу зародка, набряк підшкірної клітковини, застійні явища у внутрішніх органах, осередкові некрози печінки. В культурі клітин VERO реовірус розмножується з проявом ЦПД за типом синцитію, а аденовірус - осередкового округлення клітин. Титр інфекційності ізолятів R-1 та R-2 становить 6,5 і 5,0, а ізолятів аденовірусу - 4,0 lg ТЦД₅₀/см³.

5. За електрофоретичними профілями вмісту білків серцевини віріонів референтних штамів СП-73 (1,2,2) та Phelps (IIIа та III пентону, VIII гексону) ізоляти R-1 та R-2 та А-1, А-2, А-5, А-6 відносяться відповідно до рео- та аденовірусів.

6. Результати нейтралізації специфічними гіперімунними сироватками розмноження в культурі клітин VERO ізолятів R-1, R-2 та А-1 у порівнянні з референтними штамами СП-73 реовірусу та Phelps аденовірусу свідчать про відповідну їх антигенну гомологічність. Інфекційний титр ізолятів R-1, R-2 реовірусу та А-1 аденовірусу, а також референтних штамів під дією специфічної сироватки знижується відповідно на 3,0 та 2,0 lg ТЦД₅₀/см³. Індекс нейтралізації специфічною гіперімунною сироваткою референтного штаму СП-73 та ізолятів R-1 і R-2 реовірусу, референтного штаму Phelps аденовірусу становить 1000, а ізоляту А-1 аденовірусу -100.

7. Рео- та аденовіруси як у моноінфекції, так і в асоціації проявляють в організмі інфікованої птиці імуносупресивні властивості. У птиці, зараженої реовірусом, при щепленні проти інфекційного бронхіту пригнічується продукція вірусоспецифічних антитіл на 2,0 log_2, а у інфікованої аденовірусом - на 1,2-1,6 log₂. При змішаному перебігу рео- та аденовірусної інфекцій титр антитіл у птиці, щепленої вакциною проти ІБК, не перевищує 2,6 log₂.

8. Результати гістологічних досліджень бурси Фабриціуса свідчать про імуносупресивні властивості рео- та аденовірусів в організмі інфікованої птиці, які спричиняють виражені деструктивні зміни, зокрема, делімфатизацію, зменшення розмірів фолікулів до 100-160 мкм та сполучнотканинне заміщенням фолікулів.

ПРОПОЗИЦІЇ ДЛЯ ПРАКТИКИ

1. Методичні рекомендації щодо оцінки впливу рео- та аденовірусів на ефективність вакцинопрофілактики інфекційного бронхіту курей (Затверджені Науково-методичною радою Державного департаменту ветеринарної медицини, протокол №3 від 20.12.2006).

2. Ізолят А-1 як продуцент антигену аденовірусу птиці 1 групи ( Деклараційний патент України № 21178 від 15.03. 2007).

3. Ізолят R-1 як продуцент антигену реовірусу птиці ( Деклараційний патент України № 16439 від 15.08.2006).

4. Схема щеплення птиці м'ясного напрямку продуктивності (батьківського стада) проти інфекційного бронхіту та реовірусної інфекції.

5. Схема щеплення птиці яєчного напрямку продуктивності проти інфекційного бронхіту на фоні циркуляції рео- та аденовірусів.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ

1.Серологічний контроль деяких інфекційних хвороб птиці в птахогосподарствах Луганської області /Л.І.Пархоменко, Л.Ю.Петренко, О.О.Землянська, О.В. Івлєва //Зб.наук.праць ЛДАУ. Біол.науки.- Луганськ: Вид-во ЛДАУ, 2001.- №13 (25).-С.143-146.

2. Землянська О.О., Пархоменко Л.І. Біологічні властивості авіреовірусів курей та індиків // Матеріали міжнар. студ. наук. конф. "Молодь за вирішення аграрних проблем XXI століття",- Львів, 2001.- Ч.1.- С. 6-9.

3. Определение иммунного статуса кур к инфекционному бронхиту с учетом циркуляции эпизоотических штаммов рео- и аденовирусов, ассоциированых с микоплазмой /Д.А.Пономаренко, Л.И.Пархоменко, Л.Ю.Петренко, О.А.Землянская, Л.М. Пороло, Е.П. Ткачева // 3б. наук, праць ЛНАУ.Вет.науки.-Луганськ: Вид-во "Елтон-2", 2003.- № 27/39.- С.77-82.

4. Авиреовирусная инфекция птицы: вопросы специфической профилактики /О.А.Землянская, Л.Ю. Петренко, Д.А. Пономаренко, Л.И. Пархоменко // Вісн. СНАУ:Наук.-метод. ж. вет. медицина.- 2003.- № 3393, вип. 9.- С. 33-35

5. Антигенна та імуногенна варіабельність вірусу інфекційного бронхіту курей/ Л.Ю. Петренко, О.А. Землянская, Д.А. Пономаренко, Л.И. Пархоменко//Вісн.СНАУ: Наук.-метод. ж. вет. медицина.- 2003.- № 3393, вип.9.-С.99-101

6. Землянская О.А. Серологический контроль некоторых вирусных инфекций сельскохозяйственной и синантропной птицы // Вет. медицина: Міжвідом.темат.наук. зб.- X., 2004.- Вип. 83.- С. 94-97

7. Діагностика асоційованої аденовірусної інфекції, мікоплазмозу та колібактеріозу курей / О.О. Землянська, Д.А. Пономаренко, Л.Ю. Петренко, Л.И.Пархоменко// 3б. наук. праць ЛНАУ. Вет. науки.- Луганськ: Вид-во "Елтон-2".-2004-№35/47.-С. 66-73.

8. Землянська О.О., Пархоменко Л.І. Проблема аденовірусної інфекції у птахогосподарствах Луганської області // Аграр. вісн. Причорномор'я: Матеріали міжнарод, наук.-практ. конф.- Одеса, 2004.- Ч. 1.- С. 94-101.

9. Землянська О.О., Пархоменко Л.І. Характеристика симптомокомплексів, викликаних різними серотипами аденовірусів птахів // Вісн. СНАУ: Наук.-метод.ж. Вет. медицина.- 2004.- № 8217, вип. 7(12).- С. 49-52

10. Землянська О.О. Визначення вірулентності ізоляту реовірусу птахів для курчат // 3б. наук, праць ЛНАУ. Вет. науки.- Луганськ: Вид-во "Елтон-2".- 2005.-№50/73.-С. 83-86.

11. Viral and bacterial parasitocinosis among farm, synanthropic and ornamental birds /L.Parhomenko, N. Ignatov, L. Petrenko, O. Zemlyanskaya, D. Ponomarenko, M. Popov, Y.Zelukina // Emerging Diseases and Diseases of Complex or Unknown Etiology:14^й World Veterinary Poultry Congr.- Istanbul, 2005.- P. 483

12. Пархоменко Л.I., Ігнатов М.М., Землянська О.О. Біологічні властивості ізолятів реовірусу птахів при культивуванні у різних біосистемах // Вет.медицина України.- 2006.- № 5.- С. 35-36

13. Пащенко О.О. Ідентифікація польових штамів аденовірусу птахів з використанням методу гель електрофорезу // 3б. наук, праць ЛНАУ. Вет. науки.-Луганськ, 2006.- № 63/86.- С. 111-114.

14. Иммуноморфология органов иммунитета цыплят при смешанных вирус-вирусных и вирус-микоплазменных инфекциях / Г.А. Красников, Л.И. Пархоменко,О.А. Землянская, Д.А. Пономаренко // Проблеми зооінженерії та вет.медицини.-2006.- Вип. 13(38), Ч. 3.- С.73-79

15. Пархоменко Л.І., Пащенко О.А., Зелюкіна Я.С. Визначення електрофоретичних профілів польових ізолятів реовірусу птахів // Наук. вісн. ЛНАВМ ім. С.З.Гжицького.- Львів, 2006.- Т. 8, № 3 (30), ч. 1.- С. 147-150

АНОТАЦІЇ

Пащенко О.О. Рео- та аденовірусна інфекції і їх вплив на ефективність вакцинопрофілактики інфекційного бронхіту птиці . - Рукопис. Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата ветеринарних наук за спеціальністю 16.00.03 - ветеринарна мікробіологія та вірусологія.-ННЦ “Інститут експериментальної та клінічної ветеринарної медицини”, Харків, 2007.

Дисертація присвячена вивченню імуносупресивних властивостей рео- та аденовірусів птиці та визначенню їх негативного впливу на формування поствакцинального імунітету щодо вірусу інфекційного бронхіту у курчат.

Проведено серологічний моніторинг реовірусної та аденовірусної інфекцій серед сінантропної, дикої птиці в промислових птахогосподарствах та приватному секторі. Встановлено низький рівень імунної відповіді при щепленні проти інфекційного бронхіту серед птиці господарств яєчного та мясного напрямку продуктивності під час циркуляції адено- та реовірусів.

Із використанням серологічних та гістологічних методів в експерименті підтверджено імуносупресивні властивості рео- та аденовірусів. За умов моноінфекції реовіруси викликають більш виражений імуносупресивний стан в організмі птиці порівняно з аденовірусами. Проте в асоціації рео- та аденовіруси посилюють імунодепресивні властивості один одного.

Проведено індикацію та ідентифікацію польових ізолятів рео- та аденовірусів із використанням курячих та гусячих зародків, перещеплюваної культури клітин VERO, сприйнятливого молодняка.

Ключові слова: реовіруси та аденовіруси птиці, імунодепресивні властивості, серологічний моніторинг, ізоляція, індикація, ідентифікація.

Пащенко О.А. Рео- и аденовирусная инфекции и их влияние на эффективность вакцинопрофилактики инфекционного бронхита птицы.- Рукопись. Диссертация на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук по специальности 16.00.03.- ветеринарная микробиология и вирусология.- ННЦ “Институт экспериментальной и клинической ветеринарной медицини”, Харьков, 2007.

В диссертации отражены результаты определения негативного влияния рео- и аденовирусов на формирование поствакцинального иммунитета к вакцинным штаммам вируса инфекционного бронхита птицы.

Проведен серологический мониторинг реовирусной и аденовирусной инфекции среди синантропной, дикой, домашней птицы в промышленных птицехозяйствах и частном секторе. Установлен высокий уровень антител к этим вирусам, особенно у синантропной, которая находится на территориях обследованных промышленных птицехозяйств.

Выявлено низкий уровень группового иммунного ответа к вакцинным штаммам вируса инфекционного бронхита в хозяйствах яичного и мясного направления продуктивности на фоне циркуляции эпизоотических штаммов рео- и аденовирусов.

Проведено изоляцию возбудителей рео- и аденовирусной инфекций в разных биосистемах (куриные и гусиные эмбрионы, перевиваемая культура клеток VERO, цыплятах восприимчивого возраста). При вирусовыделении изолятов R-1 и R-2 на куриных и гусиных эмбрионах отмечали проявление типичных для реовирусов птиц изменений хорионаллантоисной оболочки и эмбриона. При определении инфекционной активности изолята R-1 на цыплятах выявили характерные клинические признаки и наличие антител к реовирусу в сыворотках крови инфицированных цыплят. Цитопатогенное действие вируса по типу синцития индуцировали изоляты R-1 и R-2 в перевиваемой культуре клеток VERO.

Вирусовыделение изолятов А-1, А-2, А-3, А-5 аденовирусов на куриных эмбрионах сопровождалось отставанием в росте и развитии эмбрионов, отеком подкожной клетчатки, гипертрофией и участками некрозов в печени, отеком и бляшками на хорионаллантоисной оболочке. Культивирование изолята А-1 на перевиваемой культуре клеток VERO характеризовалось появлением цитопатогенного действия в первом пассаже в виде округления клеток через 172 часа после инфицирования.

Выявлено наличие основных полипептидов пентона, гексона и сердцевины вириона аденовирусов в изолятах А-1, А-2, А-5 и А-6. Электрофоретические профили изолятов R-1 и R -2 сходны с таковым референтного штамма СП-73 по основным компонентам сердцевины вириона. При проведении реакции нейтрализации изолятов R-1 и R -2 реовируса и А-1 аденовируса в перевиваемой культуре клеток VERO со специфическими гипериммунными сыворотками к референтным штаммам реовируса (СП-73) и аденовируса (Phelps) отмечено снижение инфекционной активности полевых изолятов.

При экспериментальном определении влияния реовирусов на напряженность иммунитета к вакцинному штамму вируса инфекционного бронхита установлено достоверную разницу между уровнем иммунного ответа у цыплят контрольной группы (на 2 lоg₂ больше) и инфицированных штаммами реовируса. Заражение аденовирусами также негативно отражается на формировании иммунного ответа к вирусу инфекционного бронхита, но в меньшей мере.

Выраженное влияние оказывает одновременное инфицирование цыплят адено- и реовирусами. Гистологическим исследованием бурсы Фабрициуса установлены наиболее деструктивные изменения при инфицировании цыплят и рео- и аденовирусами. При этом наблюдаются делимфатизация фолликулов, их гипоплазию, разрастание соединительной ткани.

Ключевые слова: реовирусы и аденовирусы птицы, иммунодепрессивные свойства, серологический мониторинг, изоляция, индикация, идентификация.



Paschenko O.O. Reo-, adenoviruses infections and influence on intensity of immunity to vaccinal strains of birds infectious bronchitis virus. - The manuscript.

The dissertation on reception of a scientific degree of the candidate of veterinary sciences in speciality 16.00.03-veterinary microbiology and virology. - NNC Institute of experimental and clinical veterinary medicine, Kharkov, 2007.

The dissertation is devoted to studying of immunosuppressive properties reo- and adenoviruses in birds and to definition of their negative influence on formation postvaccinated immunity concerning a virus of an infectious bronchitis at chickens.

Serological monitoring of reoviruses and adenoviruses infections of synantropic, flying, birds poultry flocks and private sector was carried out. The low level of the immune answer concerning an infectious bronchitis among a bird of poultry flock is established at circulation reo- and adenoviruses.

Using of serological and histological methods in experiment it is confirmed immunosuppressive properties reo- and adenoviruses. At monoinfection reoviruses cause the greater immunosuppressive condition in an organism of a bird than adenoviruses. Nevertheless in association reo- and adenoviruses strengthen immunosuppressive properties each other.

Indication and identification of field reo- and adenoviruses with use of chicken and goose embryos, in VERO cells, susceptible young growth is carried out.

Key words: reo- and adenoviruses of birds, immunosuppressive properties, serological monitoring, isolation, indication, identification.

Размещено на Allbest.ru