Размещено на http://www.allbest.ru/

Міністерство охорони здоров'я України

Національний медичний університет ім. О.О.Богомольця

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

14.01.32 - медична біохімія

Окислювальні та кон'югаційні реакції біотрансформації ксенобіотиків за умов гострого та хронічного запального процесу

Петровська Ганна Павлівна

Київ 2007

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Вінницькому національному медичному університеті ім. М.І.Пирогова Міністерства охорони здоров'я України

Науковий керівник: доктор медичних наук, професор ПЕНТЮК Олександр Олексійович, завідувач кафедри загальної та біологічної хімії Вінницького національного медичного університету ім. М.І.Пирогова

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, ЛЕВИЦЬКИЙ Євген Леонідович, старший науковий співробітник, Інститут біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України,

доктор медичних наук, НОВІКОВА Світлана Миколаївна головний науковий співробітник, Інститут геронтології АМН України

Захист відбудеться 06.12.2007 р. о 13_год_30___хв. на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.003.07 Національного медичного університету ім. О.О.Богомольця (03057, Київ, пр. Перемоги , 34, фізико-хімічний корпус НМУ)

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного медичного університету ім. О.О. Богомольця за адресою: 03057, м. Київ, вул. Зоологічна, 1.

Автореферат розісланий 05.11.2007 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради кандидат біологічних наук О.І.Толстих

1. Загальна характеристика роботи

ксенобіотик запалення автоімунний елімінація

Актуальність роботи. Біотрансформація ксенобіотиків є важливою складовою частиною процесу взаємодії чужорідних речовин з фізіологічними системами організму і суттєвим чином впливає як на вияви терапевтичної дії лікарських засобів, так і на біологічні ефекти токсикантів [Головенко Н.Я., 2001; Губський Ю.І. та співавт., 2004; Gonzalez F., 2005; Vereczkey L. et al., 2005; Nebert D.W., Dalton T.P., 2006; Kirchheiner J., Seeringer A., 2007]. Внаслідок біотрансформації можуть з'являтись як біологічно неактивні метаболіти, що притаманно багатьом лікарським засобам, так і реакційно-здатні метаболіти, які можуть мати цитотоксичну дію, що є типовим для алкілюючих цитостатиків, більшості гепато- та пульмотоксинів, мутагенів і канцерогенів [Пентюк О.О. та співавт., 2004; Губський Ю.І. та співавт., 2005; Scripture C. et al., 2005; Castell J. et al., 2005; Tang C. et al., 2005; Shimada T., 2006; Stachulski A.V., 2007]. Характерною особливістю метаболізуючих ферментів є значна індивідуальна варіабельність їх активності, здатність до індукції під впливом численних агентів екзогенного та ендогенного походження, наявність множинних форм ферментів і різних механізмів регуляції експресії [Aguiar M. et al., 2005; Xu C. et al., 2005; Robert J. et al., 2005; Maruo Y. et al., 2005]. На функціонування системи метаболізму ксенобіотиків впливають чисельні фактори: видова приналежність, вік, стать, міжіндивідуальні відмінності, генетичний поліморфізм, харчування, надходження до організму ксенобіотиків, паління тютюну, захворювання та інші чинники [Головенко Н.Я., 2001; Anderson G.D., 2002; Dyderski S., Grzymislawski M., 2005; Wauthier V. et al., 2007; Kirchheiner J., Seeringer A., 2007].

Відомо, що запальні процеси, включаючи і інфекційні захворювання, викликають значні зміни метаболізму, зокрема, процесів, пов'язаних з продукцією енергії, біосинтетичними реакціями, метаболізмом чужорідних речовин [Orellana M., Guajardo V., 2004; Kulmatycki K.M., Jamali F., 2006]. Зареєстровано значне посилення частоти ідеосинкратичних та токсичних реакцій на численні лікарські засоби у пацієнтів з запальними захворюваннями [Levy M., 1997; Roth R. et al., 2003; Haack M. et al., 2003; de Leon J., 2004; Alexandre J. et al., 2007], а між тим летальність від ускладнень фармакотерапії займає 5 місце серед причин смертності дорослого населення [Стефанов О.В. та співавт., 2002]. Механізми впливу запального процесу на процеси біотрансформації ксенобіотиків не з'ясовані, але є підстави пов'язувати їх з інгібуючою дією медіаторів запалення на ферменти цитохрому Р450, УДФ-глюкуронілтрансферазу та інші ферментні системи. Можливо, запалення супроводжується такими змінами експресії конститутивних та індуцибельних ферментів, які ведуть до порушення балансу між процесами біоактивації та детоксикації ендо- і ксенобіотиків, а також до підвищення імовірності токсичних та ідеосинкратичних реакцій на фармакотерапію [Пентюк А.А. и соавт., 2001; Renton K.W., 2004; Prandota J., 2005; Aitken A. et al., 2006; Kulmatycki K.M., Jamali F., 2006].

Механізми впливу запального процесу на біотрансформацію ксенобіотиків на сьогодні ще мало досліджені. Не відомо, якими будуть зміни в метаболізмі ксенобіотиків при різних формах та стадіях запалення, як буде змінюватись токсичність ксенобіотиків. Відсутність надійної інформації щодо метаболічних основ взаємодії між запальним процесом та системою біотрансформації ксенобіотиків не дає можливості обґрунтувати підходи до прогнозування та корекції небажаних змін в фармакологічній активності і токсичності лікарських засобів чи токсикантів при інфекційно-запальних захворюваннях.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконується в рамках планової НДР кафедри біологічної та загальної хімії Вінницького національного медичного університету: “Використання модуляторів активності метаболізуючих ферментів та сорбентів в якості засобів корекції фармакологічної активності та токсичності лікарських засобів”, № державної реєстрації 0101V002832.

Мета дослідження: визначити біохімічні механізми порушень ферментних систем біотрансформації ксенобіотиків за умов гострого та хронічного запального процесу та експериментально обґрунтувати можливість їх корекції інгібіторами синтази оксиду азоту.

Задачі дослідження:

1.Оцінити вплив гострого та хронічного автоімунного запального процесу на активність ферментних систем першої (множинні форми цитохрому Р450, зокрема Р450 1А2, 2В, 2С, 2D, 2Е1 та 3А) та другої фаз метаболізму ксенобіотиків (глюкуроніл-, сульфо-, глутатіонтрансферази, естерази) в печінці щурів на моделі з введенням ліпополісахариду Sh. Boydii та моделі ад'ювантного артриту.

2.Дослідити вплив запального процесу на фосфоліпідний склад мікросомальних мембран та солюбілізацію їх компонентів під впливом мембраноактивних агентів. Оцінити зв'язок між змінами в активності ферментів метаболізму ксенобіотиків та рівнем медіаторів запалення.

3.Визначити вплив запального процесу на екскрецію з сечею метаболітів модельних тест-препаратів амідопірину і ацетаніліду та на елімінацію, анальгетичний ефект, гастро- і нефротоксичність диклофенаку натрію.

4.Оцінити вплив селективного та неселективного інгібіторів синтази оксиду азоту (аміногуанідину та L-NAME) на індуковані запальним процесом зміни ферментних систем метаболізму ксенобіотиків.

5.В клінічних умовах дослідити вплив запального процесу при негоспітальній пневмонії на елімінацію диклофенаку натрію та парацетамолу з організму пацієнтів.

Об'єкт дослідження: індуковані запальним процесом зміни в системі біотрансформації чужорідних речовин у щурів та хворих з негоспітальною пневмонією.

Предмет дослідження: активність ферментів окислювальної і кон'югаційної фаз метаболізму ксенобіотиків, біотрансформація, елімінація, фармакологічна активність та токсичність лікарських засобів.

Методи дослідження. Біохімічні методи включали визначення активності множинних форм цитохрому Р450, UDP-глюкуронілтрансферази, фенолсульфотрансферази, глутатіонтрансферази, арілестерази в печінці, оцінку солюбілізації компонентів мікросомальних мембран, визначення медіаторів запалення, маркерів оксидативного стресу, застосування інгібіторів синтази оксиду азоту. Фармакологічні та токсикологічні методи включали дослідження елімінації, анальгетичного ефекту та токсичності диклофенаку натрію.

Наукова новизна. Вперше на основі експериментальних та клінічних досліджень доведено, що запальний процес впливає на всі етапи взаємодії ксенобіотиків з організмом, починаючи з вибіркового гальмування активності ферментів окислювальної і кон'югаційної фаз метаболізму, сповільнення процесів елімінації, і завершуючи змінами їх фармакологічної активності та токсичності.

Вперше показано, що як при гострому запальному процесі (введення ліпополісахариду Sh. Boydii), так і при автоімунному запаленні в найбільшій мірі пригнічуються активності цитохромів Р4502Е1, 2С та 3А, UDP-глюкуронілтрансферази, фенолсульфотрансферази і глутатіон-S-трансферази, та посилюється активність ферменту деградації гемопротеїнів - гемоксигенази. Менш чутливими до запального процесу є активності цитохромів Р4501А2 та 2D і естерази.

Вперше визначено, що зміни активності ксенобіотик-метаболізуючих ферментів тісно корелюють з активністю запального процесу, оксидативного та нітрозативного стресу, зокрема, з рівнем фібриногену та гаптоглобіну, нітратів і нітритів, МДА, активністю ферментів продуцентів активних форм кисню - ксантиноксидази та оксидази D-амінокислот. Гальмування реакцій метаболізму ксенобіотиків під час запалення йде паралельно накопиченню в мікросомальних мембранах печінки продуктів пероксидації ліпідів, змінам спектру фосфоліпідів, зменшенню стійкості мембран до дії пертурбантів.

Доведена провідна роль продукції оксиду азоту в формуванні депресії системи біотрансформаціі ксенобіотиків при запальному процесі, зокрема, зміни в активності метаболізуючих ферментів не лише тісно корелюють з рівнем метаболітів оксиду азоту, але і значною мірою попереджуються введенням інгібіторів синтази оксиду азоту, особливо, аміногуанідину.

Запальний процес супроводжується значним гальмуванням елімінації з організму щурів модельних препаратів - амідопірину і ацетаніліду, та лікарського засобу диклофенаку натрію, а також зростанням анальгетичної активності, гаcтро- і нефротоксичності останнього.

Максимальні зміни цитохром Р450-залежних монооксигеназ, ферментів кон'югації, метаболічної елімінації амідопірину, ацетаніліду і диклофенаку натрію виникають на пікові запальної реакції, з нормалізацією порушень паралельно зниженню активності запалення та стиханню явищ оксидативного і нітрозативного стресу.

Вперше в клінічних умовах у пацієнтів з негоспітальною пневмонією продемонстровано, що затримка метаболічної елімінації диклофенаку натрію і парацетамолу визначається активністю запального процесу та тяжкістю захворювання і корелює з рівнем прозапальних цитокінів (фактору некрозу пухлини-альфа і інтерлейкіну-6) та метаболітів оксиду азоту.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані нами результати розширюють існуючі уявлення щодо функціонування системи біотрансформації ксенобіотиків в патологічних умовах і демонструють багаторівневий вплив запального процесу на цю систему, який включає як зміни на рівні ксенобіотик-метаболізуючих ферментів і мембранних структур печінки, так і зміни на рівні цілісного організму - пригнічення процесів елімінації ксенобіотиків, модуляція їх фармакологічної активності та токсичності.

Отримані результати свідчать про суттєвий внесок посиленої продукції оксиду азоту у формування змін системи біотрансформаціі ксенобіотиків при запальних захворюваннях. Застосування інгібіторів синтази оксиду азоту, а особливо аміногуанідину - селективного інгібітора індуцибельної форми ферменту, може бути використано для корекції несприятливих змін в елімінації та токсичності лікарських засобів в умовах запального процесу.

В клінічній практиці слід враховувати, що за умов активного запального процесу може суттєво гальмуватись елімінація диклофенаку натрію і парацетамолу та посилюватись їх фармакологічна активність і токсичність. Такий вплив запального процесу є особливо небезпечним для препаратів з низькою терапевтичної широтою та високою імовірністю виникнення побічних ефектів. В цих випадках доцільно проводити корекцію дози.

Положення, сформульовані в роботі, дають можливість передбачити характер змін біотрансформації лікарських засобів за умов запальних захворювань. Якщо неметаболізована форма препарату має більшу активність, ніж його метаболіти, то слід очікувати посилення його терапевтичної дії та токсичності, тоді як у препаратів, що метаболізуються з утворенням фармакологічно активних метаболітів, лікувальна дія та токсичність будуть зменшуватись.

Впровадження результатів роботи в практику. Результати дослідження використовуються в навчальному процесі кафедр загальної та біологічної хімії, фармакології, клінічної фармації і клінічної фармакології Вінницького національного медичного університету ім. М.І. Пирогова; кафедр медичної хімії Тернопільського державного медичного університету ім. І.Я. Горбачевського, Буковинського державного медичного університету, Одеського державного медичного університету; кафедри медичної хімії та лабораторної діагностики Запорізького державного медичного університету. Результати роботи впроваджено в практику ревматологічного відділення Українського державного НДІ реабілітації інвалідів, терапевтичного відділення МЛ№4 м. Маріуполя.

Особистий внесок здобувача. Дисертантом самостійно розроблена програма дослідження, проаналізована наукова література та патентна інформація, виконані всі експериментальні та клінічні дослідження. Спільно з науковим керівником дана інтерпретація отриманих результатів. Автором написані всі розділи дисертації, сформульовані висновки, оформлені публікації. В роботах, опублікованих у співавторстві, здобувачу належить основна ідея дослідження та фактичний матеріал. Біохімічні дослідження виконані в лабораторії кафедри біологічної та загальної хімії Вінницького національного медичного університету.

Апробація результатів дисертації. Основні матеріали дисертації обговорені на: VIII Українському біохімічному з'їзді (Чернівці, 2002), конференції молодих вчених (Вінниця, 2003); IV Українській науково-практичній конференції з міжнародною участю “Актуальні питання фармакології” (Вінниця, 2004); науково-практичній конференції з міжнародною участю “Сучасні проблеми медичної та клінічної біохімії” (Чернівці, 2005); науково-практичній конференції “Біопсихосоціальні аспекти здоров'я” (Вінниця, 2005); науково-практичній конференції з міжнародною участю “Біологічне окислення в нормі і патології” (Тернопіль, 2006), ІХ Українському біохімічному з'їзді (Харків, 2006).

Публікації. За результатами дисертації опубліковано 9 наукових праць: 7 статей (4 з них самостійні), в тому числі 6 у фахових наукових журналах, рекомендованих ВАК України та 2 тез у матеріалах наукових конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Робота викладена на 161 сторінці машинописного тексту і складається зі вступу, огляду літератури, експериментальної частини (матеріали і методи, результати і обговорення), висновків та списку літературних джерел - 275 посилань, в тому числі 229 латиницею. Робота ілюстрована 68 таблицями та 3 рисунками.

2. Основний зміст роботи

Матеріали та методи дослідження. Досліди проведені на 270 білих щурах-самцях згідно правил гуманного відношення до експериментальних тварин та затвердженні комітетом з біоетики Вінницького національного медичного університету. З досліду тварин виводили шляхом декапітації під ефірним наркозом.

Гостру запальну реакцію моделювали у щурів шляхом внутрішньоочеревинно введення 2,5 мг/кг ліпополісахариду Sh. boydii (Диа-М, Москва). Інгібітори синтази оксиду азоту - L-NAME та аміногуанідин вводили внутрішньоочеревинно в дозах 50 та 10 мг/кг за 1 годину до та через 12 годин після введення ліпополісахариду.

Ад'ювантний артрит у щурів моделювали субплантарним введенням в задню лапку 0,1 мл ад'юванта Фрейнда. Лікування ад'ювантного артриту проводили щоденним пероральним введенням метотрексату (0,2 мг/кг) з 8 по 27 день та диклофенаку натрію (2,5 мг/кг) з 14 по 25 день після введення ад'юванта Фрейда. Активність запального процесу оцінювали за об'ємом набряклої кінцівки, порогом больової чутливості [Тринус Ф.П., 1975], за числом лейкоцитів, вмістом в сироватці крові гаптоглобіну та фібриногену [Меньшиков В.В., 1987].

Біотрансформацію тест-препаратів оцінювали за екскрецією з сечею метаболітів амідопірину та ацетаніліду після їх внутрішньоочеревинного введення щурам в дозі 30 та 100 мг/кг, відповідно. Вільний та ацетильований 4-амiноантипiрин визначали за реакцією утворення iндофенолового барвника [Попов Т.А., Леоненко О.Б., 1977]. Загальну кількість метаболітів ацетанiлiду оцінювали за реакцією дiазосполучення, частку амiнофенольних метаболітів - за реакцією утворення iндофенолового барвника [Сиггиа С., Ханна Д.Г. 1983; Пентюк А.А. и др., 1990], дiазотування проводили натрію нітритом, а утворену речовину сполучали з альфа-нафтолом. Парацетамол екстрагували з сечі діетиловим ефіром. Вміст глюкуронiдних метаболітів визначали методом, що дозволяє диференціювати кон'юговану i вільну глюкуронову кислоту [Yuki H., Fischman N.H., 1963]. Вміст вільних та зв'язаних сульфатів визначали турбiдиметричним методом [Цевелева И.А., 1971]. Гідроліз сульфатних та глюкуронідних метаболітів проводили за допомогою арiлсульфатази і бета-глюкуронiдази. Меркаптуровi кислоти визначали за реакцією з реактивом Елмана.

Знеболюючу дію диклофенаку натрію визначали на моделі електричного подразнення слизової прямої кишки, після введення в дозі 10 мг/кг. Вміст диклофенаку та його глюкуронідного метаболіту визначали методом тонкошарової хроматографії [Станиславчук Н.А. и др., 1989]. Параметри фармакокінетики розраховували за двохчастинною моделлю зі всмоктуванням [Холодов Л.Е., Яковлев В.П., 1985]. Нефротоксичну дію диклофенаку визначали за кількістю білку, активністю гама-глутамілтрансферази в сечі, вмістом сечовини в сироватці крові. Стан слизової оболонки шлунку оцінювали візуально, враховуючи розміри та множинність виразок.

Дослідження активності ксенобіотик-метаболізуючих ферментів. Для отримання субклiтинних фракцій печінки щурів декапітували під легким ефірним наркозом. Для отримання мікросомної фракцію печінки використовували її здатність до агрегації під дією катіонів магнію та кальцію [Kamath SA. et al., 1971]. Чистоту мiкросомної фракції тестували за маркерними ферментами мітохондрій, лізосом, плазматичних мембран та мiкросом. Активність мiтохондрiальної глутаматдегiдрогенази (КФ 1.4.1.2) оцінювали за реакцією вiдновного амiнування альфа-кетоглутарової кислоти, а кислої фосфатази лiзосом (КФ 3.1.3.2) та глюкозо-6-фосфатази мiкросом (КФ 3.1.3.9) - за кількістю неорганiчного фосфату [Покровский А.А., Арчаков А.И., 1968].

В мікросомній фракції визначали активність NADH- і NADPH-редуктаз, вміст цитохрому Р450 та активності його множинних форм: амідопірин-N-, еритроміцин-N-, індометацин-О-, метопролол-О- деметилази, ацетанілідгідроксилази, анілінгідроксилази [Карузина И.И., Арчаков А.И., 1977], гексобарбіталгідроксилази [Breyer U., Villumsen D., 1975], пара-нітрофенолгідроксилази [Koop D.R., 1986]. Активність UDP-глюкуронілтрансферази оцінювали за швидкістю кон'югації пара-нітрофенолу [Burchell B., Weatheril P., 1981]. В постмітохондріальній фракції визначали активність глутатіон-S-трансферази за утворенням кон'югатів глутатіону з 1-хлор-2,4-динітробензолом та нітрогліцерином [Habig W.H., Jacobi W.B., 1981; Nigam R, et al., 1996; Ploemen JP, et al., 1996]. Активність фенолсульфотрансферази оцінювали за утворенням сульфоефіру бета-нафтолу [Kempen G.M., Jansen G.S., 1971]. Активність ксантиноксидоредуктази визначали як суму ксантиндегідрогеназної та ксантиноксидазної активностей. [Xia Y. Zweier J. L., 1995; Suzuki H. et al., 1998]. Активність оксидази D-амінокислот (КФ 1.4.3.3) оцінювали за перетворенням D-аланіну в піруват [D'Aniello A et al.,1993]. Вміст відновленого глутатiону та його окисленої форми визначали в глутатiонтрансферазнiй реакції [Asaoka K., Takahashi K., 1981].

Нітрити та нітрати в сироватці крові визначали за реакцією Гріса після осадження білків ацетонітрилом [Коренман И.М., 1975]. Вміст малонового діальдегіду та активність аскорбат-залежної пероксидації ліпідів визначали за реакцією з тіобарбітуровою кислотою [Владимиров Ю.В., Арчаков А.И., 1972]. Вміст фосфоліпідів визначали за утворенням гідрофобного комплексу з феротіоціанатом амонію [Пентюк А.А. и др., 1987], а білка - біуретовим методом [Кочетов Г.А.,1980]. Фосфоліпідний спектр визначали методом тонкошарової хроматографії на силікагелі Л5/40 [Кейтс, 1975]. Вміст гаптоглобіну визначали за його здатністю утворювати комплекси з гемоглобіном [Архипова О.Г., 1988], а фібриногену - уніфікованим методом [Меньшиков В.В., 1987].

Клінічні дослідження. Обстежено 39 пацієнтів (було 30 чоловіків і 9 жінок, середнього віку 53,3±2,75 років) з негоспітальною пневмонією, які перебували на лікуванні в терапевтичному відділені міської лікарні №4 міста Маріуполя. Хворі були проінформовані щодо мети проведення біохімічних досліджень і була отримана їхня згода. Вміст інтерлейкіну-6 та фактору некрозу пухлини-альфа в сироватці крові визначали імуноферментними методами (набори фірми IMMUNOTECH, Франція).

Статистичну обробку результатів проводили за допомогою стандартних статистичних програм “MS Exel”. Оцінювали середнє значення, стандартні помилки, достовірність відмінностей за t-критерієм Стьюдента, проводили парний кореляційний аналіз.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Введення ліпополісахариду Sh. boydii викликало у щурів гостру запальну реакцію, яка проявляється зростанням числа лейкоцитів на 56, 90 та 19% на 12, 24 та 48 годині спостереження, відповідно, підвищенням рівнів фібриногену та гаптоглобіну - на 22, 93 та 33% і 21, 92 та 32%, відповідно. Вже через 6 годин після введення ліпополісахариду рівень нітритів та нітратів в крові зростав майже в 10 раз (з 49,4±4,93 до 475±71 мкмоль/л), а на 12 та 24 годину перевищував контроль в 6,2 та 2,0 рази, відповідно. В печінці посилювались активності ксантиноксидази і оксидази D-амінокислот (на 24 годину зростання складало 218 та 183%, відповідно), зростав вміст малонового діальдегіду (на 220%), падала активність супероксиддисмутази і каталази (на 30 та 32%, відповідно).

Суттєві зміни спостерігались з боку мембран ендоплазматичного ретикулуму печінки. На 24 годині досліду в мікросомах в 2,74 рази зростав вміст лізофосфатидилхоліну при одночасному падінні частки фосфатидилхоліну і фосфатидилетаноламіну, зменшувалась стійкість мембран до дії дезоксихолату натрію та трипсину. Зокрема, якщо обробка мікросом печінки дезоксихолатом солюбілізувала 6,7±0,81% мікросомального білку та 5,66±0,99% активності NADPH-редуктази, то у тварин, що отримували ліпополісахарид - вже 29,1±1,74 та 24,1±2,18%, відповідно.

Застосування інгібіторів синтази оксиду азоту (особливо аміногуанідину) значною мірою блокувало формування запальної відповіді: гальмувалось зростання числа лейкоцитів, вмісту фібриногену, гаптоглобіну, нітратів і нітритів, зменшувались зміни з боку мікросомальних мембран, процесів пероксидації ліпідів, активності прооксидантних та антиоксидантних ферментів.

Введення ліпополісахариду викликало значні зміни активності ксенобіотик-метаболізуючих ферментів печінки щурів (табл. 1). На 24 годині рівень цитохрому Р450 знизився на 40%, маркерні активності цитохрому Р4502Е1 (анілін- та пара-нітрофенолгідроксилаза) - на 53 та 52%, відповідно, цитохрому Р4502С (напроксен-О-деметилаза та гексобарбіталгідроксилаза) - на 56 та 54%, цитохрому Р4503А (еритроміцин-N-деметилаза) - на 60%. Меншим (на 30 та 32%, відповідно) виявилось пригнічення ацетанілідгідроксилази та метопролол-О-деметилази (цитохроми Р4501А2 та Р4502D). Однією з причин зниження вмісту цитохрому Р450 та активності його множинних форм, очевидно, є його посилений катаболізм. Про таку можливість свідчить різке (в 3,3 рази) зростання активності гемоксигенази (з 0,11±0,008 до 0,36±0,02 нмоль/хв. на 1 мг білку).

Таблиця 1 Вплив ліпополісахариду (ЛПС) і інгібіторів синтази оксиду азоту на активність ферментів в печінці щурів (М±m; n =8-10)

Введення ліпополісахариду викликало зниження активності арілестерази (на 31%), UDP-глюкуронілтрансферази (на 38%), фенолсульфотрансферази (на 36%), вмісту глюкуронідів і сульфатів (на 32 та 34%, відповідно). Активність глутатіон-S-трансферази зменшувалась на 34%, вміст відновленого глутатіону - на 52% при одночасному зростанні рівня глутатіондисульфіду (в 6,4 рази). Застосування L-NAME та аміногуанідину зменшувало виразність змін з боку цитохрому Р450, активності гемоксигенази, ферментів та субстратів кон'югації. В усіх випадках протекторний вплив аміногуанідину був більш потужним.

Кореляційний аналіз показав, що між індукованими ліпополісахаридом змінами в складі мікросомальних мембранах, активності прооксидантних та антиоксидантних і ксенобіотик-метаболізуючих ферментів, з одного боку, та маркерами запального процесу, оксидативного і нітрозативного стресу, з іншого боку, існують достовірні залежності (r = 0,41-0,55).

Нами було оцінено також і вплив хронічного автоімунного запалення (ад'ювантний артрит) на процеси біотрансформації ксенобіотиків. В процесі моделювання ад'ювантного артриту в сироватці крові щурів зростав вміст фібриногену, нітратів і нітритів (на 82 та 85%, відповідно), розвивався набряк кінцівки, об'єм якої на 27 добу збільшився в 4,8 рази. В печінці посилювались активності ксантиноксидази та оксидази D-амінокислот (на 129 та 126%), в мікросомах печінки зростав вміст малонового діальдегіду, частка лізофосфатидилхоліну (в 2,54 рази), але зменшувався вміст фосфатидилхоліну і фосфатидилетаноламіну.

Розвиток автоімунного запалення супроводжувався прогресуючим падінням вмісту цитохрому Р450, його монооксигеназних активностей, ферментів та субстратів кон'югації (табл. 2). Ці зміни ставали помітними на 9 добу і сягали максимуму на 27 добу. Найбільше пригнічувались активності цитохромів Р4502Е1, 2С та 3А (на 46-56%), дещо менше активності цитохромів Р4501А2 та 2D (на 36-34%). Активність UDP-глюкуронілтрансферази на 27 добу досліду знижувалась на 37%, фенолсульфотрансферази - на 38%, глутатіон-S-трансферази - на 38%. Вміст глюкуронідів, сульфатів та відновленого глутатіону в печінці на 27 добу падав на 31, 39 та 35%, відповідно, а рівень глутатіондисульфіду зростав в 2,48 рази. Різко підвищувалась активність мікросомальної гемоксигенази (з 0,12±0,010 до 0,29±0,012 нмоль/хв/мг білка).

Таблиця 2 Активність ферментів в печінці щурів в процесі розвитку ад'ювантного артриту (М±m; n =8-10)

Лікування ад'ювантного артриту метотрексатом та диклофенаком натрію суттєво зменшувало активність запального процесу. Зокрема, рівні фібриногену та гаптоглобіну на 27 добу досліду у лікованих тварин виявились вдвічі меншими ніж у нелікованих щурів, а нітратів та нітритів - втричі меншими. Зміни мембранних фосфоліпідів у лікованих щурів виявлялись лише на рівні тенденції. Якщо рівень малонового діальдегіду в мікросомах печінки тварин з нелікованим артритом зростав в 2,5 рази, то у лікованих - лише в 1,5 рази. Активності ксантиноксидази та оксидази D-амінокислот на 27 добу у нелікованих щурів зростали в 2,29 та 2,26 рази, а у лікованих - лише в 1,35 та 1,34 рази, відповідно. Лікування значною мірою попереджувало падіння рівня цитохрому Р450, активності його ізоформ, ферментів кон'югації, вмісту глюкуронідів, сульфатів та глутатіону.

В наступній частині роботи ми оцінили в якій мірі індуковані запальним процесом зміни в активності ферментів апроксимуються на цілісний організм. Для цього ми використали метаболічні зонди - ацетанілід і амідопірин, метаболізм яких добре вивчений і охоплює більшість реакцій метаболізму ксенобіотиків, а практично всі метаболіти елімінуються з сечею.

Виявилось, що введення щурам ліпопосіхараиду викликає значне пригнічення метаболізму амідопірину та ацетаніліду (табл. 3). На 24 годину падіння екскреції вільного, загального та ацетильованого 4-аміноантипірину склало 49, 60 та 63%, відповідно. За умов введення L-NAME та аміногуанідину зниження елімінації цих метаболітів було значно меншим - 21, 27 та 28% і 11, 16 та 17%, відповідно. Гостре запалення блокувало гідроксилювання ацетаніліду до амінофенольних похідних та кон'югацію останніх з глюкуроновою кислотою, сульфатом та глутатіоном, а введення інгібіторів NO-синтази - протидіяло цим змінам.

Таблиця 3 Вплив ліпополісахариду (ЛПС) і інгібіторів синтази оксиду азоту на екскрецію з сечею метаболітів амідопірину та ацетаніліду (М±m; n =8-12)

Хронічне автоімунне запалення також викликало гальмування процесів біотрансформації амідопірину та ацетаніліду. Вже з 9 дня після введення ад'юванта реєструвалось зниження елімінації вільного та загального 4-аміноантипірину та N-ацетил-4-аміноантипірину, амінофенольних метаболітів ацетаніліду, глюкуронідних, сульфатних та меркаптуратних метаболітів ацетатаніліду. Максимальні зміни в метаболізмі тест-препаратів припадали на 27 добу і мали тенденцію до ослаблення на 45 день досліду.

Лікування ад'ювантного артриту метотрексатом та диклофенаком натрію протидіє змінам в біотрансформації цих тест-препаратів. Якщо у нелікованих щурів екскреція амінофенольних метаболітів падає на 26%, а незміненого ацетаніліду зростає в 3,0 рази, то у лікованих - лише на 13% та 1,5 рази, відповідно.Встановлено, що у щурів з ад'ювантним артритом сповільнюється елімінація незміненої форми диклофенаку та суттєво зменшується частка його глюкуронідного метаболіту порівняно з тваринами контрольної групи (рис. 1).

Розрахунок параметрів елімінації диклофенаку підтвердив факт сповільнення елімінації препарату з крові тварин з ад'ювантним артритом. Зокрема, період напіввиведення (t1\2в) незміненої форми препарату зростав зі 167±10 до 255±10 хв., а кліренс падав з 9,26±0,66 до 6,26±0,24 мл/хв.

Гостре запалення індуковане введенням ліпополісахариду також сповільнювало елімінацію диклофенаку натрію з організму щурів. Період напіввиведення (t1\2в) незміненої форми диклофенаку збільшувався на 85% - зі 167±10 до 310±10 хв., а кліренс, навпаки, падав на 44% - з 9,26±0,66 до 5,21±0,26 мл/хв.

Затримка елімінації диклофенаку у тварин з хронічним та гострим запальним процесом супроводжувалась значним (на 42-65%) зростанням знеболюючого ефекту препарату, посиленням ульцерогенної дії диклофенаку (множинність виразок шлунку зростала на 45 та 38%, відповідно) та його нефротоксичність (екскреція гама-глутамілтрансферази - маркера тубулярних уражень нирок зростала на 33 та 20%, відповідно).

В клінічній частині роботи у хворих на негоспітальну пневмонію дослідили вплив активності запального процесу на біотрансформацію диклофенаку натрію і парацетамолу. Виявилось, що на пікові запального процесу - на початку захворювання реєструється більш висока стаціонарна концентрація диклофенаку в плазмі крові (на 24,4%) та зниження (в 1,51 та 2,0 рази) вмісту глюкуронідних метаболітів і співвідношення глюкуроніди/незмінений диклофенак порівняно зі станом після 2-3-х-тижневого лікування. На висоті захворювання сповільнюється також біотрансформація парацетамолу. Якщо на початку захворювання з сечею екскретується лише 61,0±1,81% від введеної дози парацетамолу, то при видужанні пацієнтів (через 2-3 тижні) - вже 83,8±1,73% введеної дози препарату. Особливістю впливу запального процесу на метаболізм парацетамолу є гальмування утворення його токсичного метаболіту - N-ацетил-пара-бензохіноніміну, про що свідчить зменшення майже в 1,5 рази екскреції продукту його кон'югації з глутатіоном - меркаптурових кислот.

Рис. 1 Динаміка вмісту незміненого диклофенаку (А) та його глюкуронідного метаболіту (Б) в плазмі крові у щурів контрольної групи та тварин з ад'ювантним артритом, після введення 10 мг/кг препарату (* - р<0,05 відносно контролю)

Для більш коректної оцінки впливу запального процесу на елімінацію диклофенаку та парацетамолу ми розділили пацієнтів на дві групи - з низьким та високим рівнем прозапального цитокіну - фактору некрозу пухлини-альфа (табл. 4). Виявилось, що стаціонарна концентрація диклофенаку в плазмі крові і екскреція незміненої форми з сечею у пацієнтів з високим рівнем фактору некрозу пухлини-альфа була вищою (на 32 та 32%, відповідно) ніж у пацієнтів з низьким рівнем цього цитокіну. У пацієнтів з високим рівнем фактору некрозу пухлини-альфа виявляється і більш значне гальмування елімінації парацетамолу, ніж у хворих з низьким рівнем цитокіну, про що свідчить зниження екскреції з сечею більшості метаболітів парацетамолу.

Таким чином, в експериментальних та клінічних дослідженнях нами доведено, що як гострий, так і хронічний запальний процес викликають пригнічення активності ферментів окислювальної та кон'югаційної фаз біотрансформації чужорідних речовин, сповільнення елімінації ксенобіотиків та змінює фармакологічну активність і токсичність лікарських засобів.

Виразність цих змін тісно пов'язана з активацією утворення активних форм кисню і корелює з рівнем прозапальних цитокінів. В патогенезі індукованих запаленням змін в метаболізмі ксенобіотиків суттєва роль належить посиленій продукції оксиду азоту, оскільки інгібітори синтази оксиду азоту значною мірою попереджують ці зміни.

Гальмування метаболізуючих ферментів в умовах запалення може мати наслідки двоякого роду: посилення фармакологічної дії та токсичності тих лікарських засобів, біотрансформація яких пов'язана з утворенням біологічно неактивних метаболітів та навпаки, - ослаблення токсичності тих засобів, які в процесі біотрансформації утворюють реакційно-здатні інтермедіати. Цілком очевидно, що при проведенні фармакотерапії у пацієнтів з інфекційно-запальними захворюваннями препаратами першого типу, слід очікувати підвищення ризику побічних ефектів, що вимагає моніторингу токсичності, корекції дози чи застосування протекторів.

Таблиця 4 Стаціонарна концентрація диклофенаку натрію в плазмі крові та екскреція метаболітів диклофенаку і парацетамолу з сечею пацієнтів з негоспітальною пневмонією в залежності від рівня фактору некрозу пухлини-альфа (M±m)

Висновки

У дисертації узагальнено дані щодо системного впливу запалення на процеси біотрансформації ксенобіотиків, який проявляється пригніченням активності множинних форм цитохрому Р450 та ферментів кон'югації, сповільненням елімінації лікарських засобів, змінами їх фармакологічної активності і токсичності.

1. Гострий запальний процес, індукований введенням мікробного ліпополісахариду, як і автоімунне запалення (ад'ювантний артрит) викликають зниження вмісту цитохрому Р450 та гальмування активності його множинних форм в печінці щурів, причому найбільше гальмуються активності цитохромів Р4502Е1, 2С та 3А, в меншій мірі - цитохромів Р4501А2 та 2D. Ці зміни йдуть паралельно індукції ферменту деградації гема - гемоксигенази. Запальний процес викликає гальмування активності ферментів кон'югації ксенобіотиків, причому активності UDP-глюкуронілтрансферази та фенолсульфотрансферази зменшуються в більшій мірі, ніж глутатіон-S-трансферази.

2. Зміни активності ксенобіотик-метаболізуючих ферментів у щурів є максимальними на висоті проявів запального процесу і корелюють (r=0,48 та більше) з підвищеними рівнями фібриногену, гаптоглобіну, нітратів і нітритів в сироватці крові щурів. Пригнічення реакцій метаболізму ксенобіотиків йде паралельно накопиченню в мікросомальних мембранах печінки продуктів пероксидації ліпідів, зміні співвідношення між фракціями фосфоліпідів, зменшенню стабільності мембран, посиленню активності ферментів - продуцентів активних форм кисню - ксантиноксидази та оксидази D-амінокислот та падінню активності супероксиддисмутази і каталази в печінці.

3. Введення щурам L-NAME та, особливо, інгібітора індуцибельної синтази оксиду азоту - аміногуанідину, значною мірою попереджує формування запальної відповіді на введення мікробного ліпополісахариду та ад'юванта Фрейнда, пригнічення активності ферментів окислювальної та кон'югаційної фаз метаболізму ксенобіотиків, а також зменшує зміни фосфоліпідного складу мікросомальних мембран і накопичення в них малонового діальдегіду.

4. Результатом індукованого запальним процесом пригнічення активності метаболізуючих ферментів є гальмування біотрансформації в організмі щурів тест-препаратів амідопірину та ацетаніліду. Суттєво і залежно від активності запального процесу пригнічувалось (на 30-60%) окислення амідопірину до 4-аміноантипірину, гідроксилювання ацетаніліду до парацетамолу та його перетворення в меркаптуратні, глюкуронідні і сульфатні метаболіти, при відносній стійкості реакцій N-ацетилування.

5. У щурів, з запальним процесом індукованим ліпополісахаридом чи ад'ювантом Фрейнда, значно сповільнюється виведення диклофенаку з крові: період напівелімінації його незміненої форми зростає у 1,5 рази, а частка його глюкуронідного метаболіту зменшується більш ніж в 3 рази. Пригнічення елімінації диклофенаку натрію приводить до зростання його анальгетичної дії, гаcтро- та нефротоксичності.

6. У клінічних умовах у пацієнтів з пневмонією встановлено, що висока активність запального процесу асоціюється з гальмуванням метаболічних перетворень диклофенаку натрію та парацетамолу. Ступінь затримки елімінації цих препаратів визначається тяжкістю перебігу захворювання та тісно корелює з рівнем прозапальних цитокінів - фактору некрозу пухлини-альфа, інтерлейкіну-6 та метаболітів оксиду азоту.

Перелік робіт, опублікованих за темою дисертації

1. Петровська Г.П., Пентюк О.О., Дмитрієва К.Ю. Вплив ендотоксину Sh.Boydii на біотрансформацію амідопірину та ацетаніліду і активність цитохрому Р450 та кон'югуючих ферментів в печінці щурів // Вісник Вінницького державного медичного Університету. - 2000. - Т.4, №2. - С. 414-416; (здобувач особисто виконав всі досліди, підготував статтю до друку).

2. Некоторые механизмы депримирующего влияния бактериального эндотоксина на метаболизм лекарственных веществ / А.А Пентюк, А.П Петровская, А.Н Яворский, Е.Ю Дмитриева, Д.В Дмитриев // Экспериментальная и клиническая фармакология. - 2001. - Т.64, №5. - С. 56-59; (здобувач особисто виконав всі досліди, провів аналіз матеріалу).

3. Вплив ендотоксину Sh.Boydii на активність ксенобіотично-метаболізуючих ферментів / О.О. Пентюк, Г.П. Петровська, К.Ю. Дмитрієва, Г.З. Личик, О.В. Тертишна // Матеріали VIII Українського біохімічного з'їзду // Укр. біохім. журн. (додаток). - 2002. -Т.74, № 4а. - С. 168-169; (здобувач виконав всі досліди).

4. Петровська Г.П. Фармакокінетика, анальгетичний ефект та токсичність диклофенаку натрію у щурів з експериментальним запальним процесом // Biomedical and Вiosocial Anthropology. - 2004. - №3. - С. 87-91.

5. Петровська Г.П. Ферментні системи кон'югації ксенобіотиків у щурів з ад'ювантним артритом, кореляція з активністю запального процесу // Буковинський медичний вісник. - 2005.- Т.9, №2. - С. 192-194.

6. Петровська Г.П. Пентюк О.О. Гальмування процесів біотрансформації ксенобіотиків при ад'ювантному артриті. Зв'язок з активністю запального процесу та оксидативним і нітрозативним стресом // Медична хімія. - 2005. - Т.7, №2. - С. 5-9; (здобувач виконав всі досліди, спільно з керівником підготував рукопис статті до друку).

7. Петровська Г.П. Вплив активності запального процесу на метаболізм та елімінацію диклофенаку нартію і парацетамолу у пацієнтів з негоспітальною пневмонією // Вісник Вінницького державного медичного університету. - 2006. - Т.10, №1. - С.62-65.

8. Петровська Г.П. Вплив інгібіторів синтази оксиду азоту на ефекти ліпополісахариду щодо ферментних систем біотрансформації ксенобіотиків у щурів // Медична хімія. - 2006. - Т.8, №.4 - С.42-44.

9. Вплив запального процесу на ферментні системи, що метаболізують ксенобіотики в печінці щурів / Г.П. Петровська, О.І. Штатько, Р.П. Піскун, О.В. Смірнова // Матеріали ІХ Укр.біохімічного з'їзду 24-27 жовтня 2006 р.- Харків; Укр. біохім. журн. - 2006.- Т. 2.- С.100-101; (здобувач виконав досліди та підготував тези).

Анотація

Петровська Г.П. Окислювальні та кон'югаційні реакції біотрансформації ксенобіотиків за умов гострого та хронічного запального процесу. -Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 14.01.32 - медична біохімія. Національний медичний університет ім. О.О.Богомольця, Київ, 2007.

Дисертація присвячена вивченню стану системи біотрансформації ксенобіотиків при гострому запаленні (введення ліпополісахариду Sh. Boydii), хронічному автоімунному запаленні (ад'ювантний артрит) у щурів та пацієнтів з негоспітальною пневмонією. Запальний процес викликає значне гальмування активності ізоформ цитохрому Р450 (переважно Р4502Е1, 2С та 3А), UDP-глюкуронілтрансферази, фенолсульфотрансферази та глутатіон-S-трансферази, сповільнює елімінацію з організму щурів ацетаніліду, амідопірину і диклофенаку та підвищує анальгетичну дію, гастро- і нефротоксичність останнього. Депресія ферментів асоціюється з посиленням утворення активних форм кисню і оксиду азоту, накопиченням в мікросомальних мембранах печінки продуктів пероксидації ліпідів, зміною співвідношення між фракціями фосфоліпідів, посиленням активності ксантиноксидази та оксидази D-амінокислот. Інгібітори синтази оксиду азоту L-NAME та аміногуанідин попереджують пригнічення активності ферментів метаболізму ксенобіотиків.

Висока активність запального процесу у пацієнтів з пневмонією асоціюється з гальмуванням метаболічних перетворень диклофенаку натрію та парацетамолу. Ступінь затримки елімінації препаратів визначається тяжкістю перебігу захворювання та тісно корелює з рівнем фактору некрозу пухлини-альфа, інтерлейкіну-6 і метаболітів оксиду азоту.

Ключові слова: запалення, ліпополісахарид, ад'ювантний артрит, пневмонія, метаболізм ксенобіотиків, інгібітори синтази оксиду азоту.

Аннотация

Петровская А.П. Окислитительные и конъюгационные реакции биотрансформации ксенобиотиков в условиях острого и хронического воспалительного процесса. -Рукопись.

Диссертация на соискание научной степени кандидата медицинских наук по специальности 14.01.32 - медицинская биохимия. Национальный медицинский университет им. А.А.Богомольца, Киев, 2007.

Диссертация посвящена изучению системы биотрансформации ксенобиотиков в условиях экспериментального воспаления у крыс, а также влиянию воспалительного процесса на элиминацию лекарственных препаратов у пациентов с негоспитальной пневмонией.

Показано, что как острый воспалительный процесс (введение липополисахарида Sh. boydii), так и хронический (адъювантный артрит) вызывают в печени крыс значительное угнетение активности множественных форм цитохрома Р450 (преимущественно изоформ Р4502Е1, 3А, 2С и в меньшей степени Р4502D и 1А2), активности UDP-глюкуронилтрансферазы, фенолсульфотрансферазы и глутатион-S-трансферазы, а также повышение активности фермента деградации гемопротеинов - гемоксигеназы. Это приводит к угнетению в организме крыс окислительных и конъюгационных превращений модельных (амидопирина и ацетанилида) и лекарственных (парацетамола и диклофенака натрия) препаратов, а также обуславливает повышение анальгетической активности, гастро- и нефротоксичности диклофенака натрия.

Максимальное угнетение активности ферментов метаболизма ксенобиотиков регистрируется на пике проявлений воспаления и тесно коррелирует с активностью воспалительного процесса, выраженностью оксидативного и нитрозативного стрессов, активацией ксантиноксидазы и оксидазы D-аминокислот, накоплением в микросомальных мембранах продуктов пероксидации липидов, изменением фосфолипидного состава мембран и их устойчивости по отношению к дезоксихолату и трипсину.

Введение неселективного ингибитора синтазы оксида азота L-NAME, а особенно, селективного ингибитора индуцибельной формы фермента - аминогуанидина в значительной мере предупреждает вызванное воспалением угнетение окислительной и конъюгационной фаз метаболизма ксенобиотиков, а также изменения со стороны микросомальных мембран.

У пациентов с негоспитальной пневмонией высокая активность воспалительного процесса сопровождается задержкой элиминации диклофенака натрия и парацетамола, степень которой определяется тяжестью течения заболевания и тесно коррелирует с уровнем провоспалительных цитокинов (фактора некроза опухоли-альфа, интерлейкина-6) и метаболитов оксида азота.

Ключевые слова: воспаление, липополисахарид, адъювантный артрит, пневмонія, метаболизм ксенобиотиков, ингибиторы синтазы оксида азота.

Summary

Petrovska G.P. The oxidative and conjugation reactions of xenobiotic's biotransformation in the conditions both acute and chronical inflammation processes.- Manuscript.

Dissertation on the science degree competition of the candidate of medical sciences in speciality 14.01.32 - Medical Biochemistry. National Medical O.O.Bogomolets' Memorial Medical University, Kyiv, 2007.

The dissertation is devoted to study the state of xenobiotic's biotransformation system in the condition of acute inflammation (administration of Sh. Boydii lipopolysacharide), in the condition of chronic autoimmune inflammation (adjuvant arthritis) in rats and the patients with community-acquired pneumonia. Inflammatory process caused significant inhibition of multiple cytochrome isoforms P450 (mainly Р4502Е1, 2С and 3А) activities as well as in UDP-glucuronosyl transferase, phenolsulfotransferase and glutathione-S-transferase, and delayed elimination of the test-drugs - acetanilide, aminopyrine and diclofenac from the rats, increasing analgesic activity of diclofenac and its gastro- and nephrotoxicity.

Depression of metabolic enzymes associated with increase production of active oxygen forms and nitric oxide, accumulation in a microsomal liver membranes lipid peroxidation products, change of the ratio between phospholipids fractions and increase activity level of xanthine oxidase and D-amino acid oxidase. NO-synthase inhibitors - L-NAME and aminoguanidine both prevent inhibition of activity of xenobiotic-metabolizing enzymes. High level of inflammatory process activity in patients with community-acquired pneumonia is associated with inhibition of metabolic transformation of diclofenac sodium and paracetamol as well. Level of the elimination detention are determined by the severity of the disease and closely correlated with levels of tumor necrosis factor-alpha, interleukine-6 and nitric oxide metabolites.

Key words: inflammation, lipopolysacharide, adjuvant arthritis, pneumonia, drug metabolism, nitric oxide synthase inhibitors.

Размещено на Allbest.ru