Взаємодія вірусних та полінуклеотидних індукторів з клітиною як первинний сигнал продукції інтерферонів і типу

Размещено на http://www.allbest.ru/

КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

ІМЕНІ ТАРАСА ШЕВЧЕНКА

УДК 577.245+578.086

ВЗАЄМОДІЯ ВІРУСНИХ ТА ПОЛІНУКЛЕОТИДНИХ ІНДУКТОРІВ З КЛІТИНОЮ ЯК ПЕРВИННИЙ СИГНАЛ ПРОДУКЦІЇ ІНТЕРФЕРОНІВ І ТИПУ

03.00.06 - вірусологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Манджос Олександр Павлович

КИЇВ - 2007

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано на кафедрі біотехнології мікробного синтезу Національного університету харчових технологій Міністерства освіти і науки України, м. Київ.

Науковий керівник:доктор біологічних наук, доцент Карпов Олександр Вікторович, професор кафедри біотехнології мікробного синтезу Національний університет харчових технологій Міністерства освіти і науки України, м. Київ

Офіційні опоненти:доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Кудрявець Юрій Йосипович, завідувач відділу експериментальних клітинних систем Інститут експериментальної патології, онкології і радіобіології імені Р.Є. Кавецького НАН України, м. Київ

доктор біологічних наук, професор Бучацький Леонід Петрович, провідний науковий співробітник кафедри біохімії Київський національний університет імені Тараса Шевченка

Провідна установа:Інститут епідеміології та інфекційних хвороб імені Л.В. Громашевського АМН України, м. Київ

Захист дисертації відбудеться “_27_” _лютого_ 2007 р. о _14_ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д26.001.14 Київського національного університету імені Тараса Шевченка за адресою: м. Київ, просп. Акад. Глушкова, 2/12; біологічний факультет, ауд. 434.

Поштова адреса: 01033, м. Київ, вул. Володимирська, 64, біологічний факультет; т. 522-16-48.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці імені М. Максимовича Київського національного університету імені Тараса Шевченка (01033, м. Київ, вул. Володимирська, 58).

Автореферат розісланий “_19_” ___січня___ 2007 р.

Учений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук О.В. Молчанець

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Інтерферони (ІФН) відомі як цитокіни з різними видами біологічної дії, у першу чергу, з противірусною. З часу відкриття ІФН (Issacs, Lindenmann, 1957) вивчено особливості їх індукції, синтезу та зупинки продукції. Виявлена локалізація генів ІФН, знайдено рецептори ІФН (Kontsek et al., 2003). З'ясовані основні шляхи розвитку противірусного стану клітин під дією ІФН, відкриті взаємозв'язки ІФН з іншими цитокінами та імунною системою (Samuel, 2001). Розв'язані практичні питання щодо отримання і клінічного застосування препаратів ІФН, які довели свою ефективність у лікуванні цілого ряду вірусних, злоякісних та аутоімунних захворювань (Ершов, 1996). іммобілізація індуктор інтерферон полірибонуклеотид

Експресія генів ІФН, як і багатьох інших цитокінів, починається з індукції, тобто активації генів ІФН при дії на клітини зовнішніх факторів. Індукторами ІФН І типу (ІФН-/) виступають віруси, а також природні дволанцюгові РНК (длРНК) різного походження, синтетичні дволанцюгові полінуклеотиди та ряд низькомолекулярних синтетичних сполук. Проте, до теперішнього часу молекулярний механізм індукції залишається майже повністю нез'ясованим. Запропоновано декілька пояснень того, яким чином формується сигнал, що призводить до експресії генів ІФН у клітинах, включаючи взаємодію індукторів з мембранними рецепторами (Field et al. 1967; Green et al. 1978), їх проходження всередину клітини і взаємодія з клітинними нуклеїновими кислотами або ефекторними білками, а також проникнення індукторів до ядра клітин (Садыков, 1978; Ершов, Новохатский, 1980). Останні дослідження вказують на те, що такі події як злиття вірусів з клітинною мембраною теж відповідають за індукцію ІФН І типу (Netterwald, 2004; Hidmark, 2005). Існування великої кількості різних за природою інтерфероногенів може пояснюватися наявністю універсального механізму індукції ІФН І типу, ключовим моментом якого є локальна деформація клітинної мембрани (Karpov, 1998; 1999). Дана робота присвячена вивченню ефектів, які супроводжують взаємодію зовнішньої мембрани клітин з індукторами ІФН І типу вірусної та полінуклеотидної природи.

Дослідження молекулярних механізмів інтерфероногенезу, одного з основних видів неспецифічної резистентності організму до вірусних та інших інфекційних агентів, сприятиме вирішенню кількох важливих медико-біологічних проблем - створення нових індукторів ІФН з прогнозованим впливом на клітини, подолання явища “рефрактерності” при повторному застосуванні індукторів, а також спрямованого керування біосинтезом цитокінів у культурах еукаріотичних клітин в промислових умовах. Вивчення початкових етапів індукції ІФН допоможе краще зрозуміти механізми активації експресії індукованих генів еукаріотів.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконувалась згідно тематики проекту Міністерства науки і освіти України: "Встановлення молекулярних механізмів індукції інтерферонів І типу (альфа/бета-інтерферонів) в умовах in vitro" 2002-2003 рр., № держреєстрації 0102U000557, виконаного на кафедрі біотехнології Національного університету харчових технологій.

Мета і завдання дослідження. Мета роботи полягала у дослідженні взаємодії зовнішньої мембрани клітин з вірусними та полінуклеотидними індукторами ІФН, в умовах in vitro. Для досягнення зазначеної мети були поставлені такі завдання:

Встановити вплив іммобілізації полірибонуклеотидних індукторів на нерозчинних гранулярних носіях на індукцію ІФН І типу.

Вивчити динаміку структурних перебудов зовнішніх клітинних мембран в умовах індукції ІФН під дією вірусів та полірибонуклеотидів.

Виявити функціональні зміни зовнішніх мембран клітин та часові інтервали формування таких змін при індукції ІФН І типу.

Розкрити подібності або розбіжності впливу полінуклеотидних та вірусних індукторів на зовнішні мембрани клітин на початкових етапах індукції ІФН І типу.

Об'єкт дослідження - вірус везикулярного стоматиту, полірибонуклеотиди, культури клітин людини і ссавців.

Предмет дослідження - структурно-функціональні параметри зовнішніх клітинних мембран при взаємодії клітин з вірусними та полірибонуклеотидними індукторами ІФН І типу в умовах інтерфероногенезу.

Методи дослідження - вірусологічні, біохімічні, молекулярно-біологічні. Визначення активності синтезованого ІФН. Визначення активності маркерних ферментів зовнішньої стінки клітини в умовах індукції ІФН. Вимірювання інтенсивності флуоресценції зондів у мембранах клітин під дією вірусних та полірибонуклеотидних індукторів ІФН. Мікроскопічні дослідження поверхні клітин за допомогою атомно-силової мікроскопії (АСМ).

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше вивчено інтерферогенні властивості іммобілізованих полірибонуклеотидних індукторів в порівнянні з їх розчинними формами in vitro. Показані інтенсивні зміни мікров'язкості мембран клітин під дією вірусу везикулярного стоматиту та полінуклеотидів, які розвиваються через 10-30 хв від початку їх взаємодії з клітинами. Досліджена динаміка змін активності маркерних ферментів зовнішньої мембрани клітин (Nа⁺,K⁺-АТФази, Са²⁺,Mg²⁺-АТФази та 5'-нуклеотидази) при індукції ІФН І типу. За допомогою АСМ візуалізована взаємодія молекул полірибонуклеотидного індуктору з поверхнею моношарових клітин. Зібрано та проаналізовано ряд мембрано-зв'язаних процесів, які супроводжують дію вірусних та полірибонуклеотидних індукторів ІФН І типу.

Практичне значення одержаних результатів. Встановлення особливостей впливу індукторів на клітинні мембрани може бути використане для створення нових потужних індукторів ІФН. Розкриття механізмів індукції ІФН відкриває нові шляхи для подолання проблеми низької чутливості до терапії хворих з імуносупресорними станами та розробки нових методів лікування інфекційних захворювань. Отримані іммобілізовані полірибонуклеотидні індуктори можуть знайти застосування при промисловому отриманні препаратів ІФН І типу.

Особистий внесок здобувача. Автором особисто проведено інформаційний пошук, проаналізовано літературу, аргументовано мету і задачі роботи, а також їх методичне вирішення. Самостійно проведено більшість експериментів, статистично оброблено отримані дані, проведено їх аналіз та узагальнення, сформульовано висновки, написано і оформлено всі розділи дисертації.

Ми висловлюємо щирі подяки к.б.н. Н.М. Жолобак, з відділу проблем імуномодуляторів та інтерферонів, інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України за допомогу при титруванні противірусної активності ІФН, к.б.н. С.В. Верьовці, з відділу хімії та біохімії ферментів інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України, за іммобілізацію полірибонуклеотидів, к.б.н. К.В. Прокоповій, з кафедри біохімії Київського національного університету ім. Тараса Шевченка, за участь при визначенні активності маркерних ферментів, співробітникам відділу комбінаторної хімії біологічно активних сполук інституту молекулярної біології і генетики НАН України під керівництвом к.б.н. В.Б. Ковальської за консультації та експериментальну базу для проведення флуоресцентних досліджень, к.ф.-м.н. П.М. Литвину, відділ електронозондових методів структурного і елементного аналізу напівпровідникових матеріалів і систем інституту фізики напівпровідників ім. В.Є. Лашкарьова НАН України, за проведення досліджень з АСМ.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації були представлені на VІІІ-му Українському біохімічному з'їзді (Чернівці, 2002), міжнародній науково-практичній конференції „Нові технології отримання та застосування біологічно-активних речовин” (Алушта, 2002), 7-ій Пущинській школі-конференції молодих вчених „Біологія - наука XXI сторіччя” (Пущино, Росія, 2003), міжнародній науково-практичній конференції студентів, аспірантів та молодих вчених, присвяченої 190-річчю з дня народження Тараса Шевченка та 170-річчю заснування Київського університету „Шевченківська весна” (Київ, 2004), III-IV-ій міжнародній конференції „Біоресурси та віруси” (Київ, 2001, 2004).

Матеріали дисертації були включені до роботи „Розробка нової технології отримання інтерферону”, за яку присуджено премію Президента України для молодих вчених 2006 року (Указ № 1083/2006 від 16.12.2006 р.).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 12 робіт, в тому числі 6 експериментальних статей та 6 тез доповідей у вітчизняних та зарубіжних виданнях.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота викладена на 127 сторінках машинописного тексту та ілюстрована 41 рисунком і 8 таблицями, складається зі вступу, огляду літератури, розділів: матеріали та методи досліджень, результати досліджень, аналізу і узагальнення отриманих даних, висновків і переліку літературних джерел. У переліку зібрано 181 літературне джерело, із них 38 вітчизняних та 143 іноземне.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури. В огляді висвітлено сучасні відомості щодо індукторів ІФН - вірусів, дволанцюгової РНК (длРНК) та низькомолекулярних синтетичних сполук. Наведені дані щодо існування зв'язків структура-активність для інтерфероногенних длРНК в еукаріотичних клітинах, а також шляхів активації ферментів противірусної дії. Особливу увагу приділено явищам, що супроводжують адсорбцію і проникнення вірусних та полінуклеотидних індукторів до клітини, обговорено можливий зв'язок таких процесів із запуском синтезу ІФН.

Матеріали і методи дослідження. Об'єктами досліджень виступали: індуктори ІФН - вірус везикулярного стоматиту (ВВС), природні і синтетичні длРНК: полі(І)-полі(С), длРНК дріжджів S. cerevisiae (ридостин), вільний молекулярний комплекс (МК) - дріжджова РНК-тилорон, та МК, іммобілізований на синтетичному гранулярному носії - Сфероні-300 (іммобілізований молекулярний комплекс, ІММК), а також його складові - тилорон та одноланцюгова дріжджова РНК (олРНК). Клітини імунної системи: первинні культури спленоцитів та тимоцитів щурів, мононуклеарні клітини крові людини, перещеплювана лінія клітин тестикулів поросят (ПТП).

Виділення суспензійних культур клітин. Спленоцити щурів і первинні культури мононуклеарних клітин крові людини виділяли шляхом центрифугування суспензії клітин на градієнті фікол-урографіну ( = 1,077) при 800 g 40 хв. Тимоцити щурів - осадженням із суспензії центрифугуванням при 800 g 10 хв.

Культивування моношарових клітин ПТП. Проводили за прийнятою методикою (Фреши, 1989).

Розмноження вірусу везикулярного стоматиту. ВВС розмножували за стандартним методом. Інфекційний титр вірусу складав 10⁸-10⁹ ТЦД₅₀/мл. До клітин вірус вносили в дозі 100 ТЦД₅₀ на клітину.

Одержання нерозчинних індукторів ІФН. Препарати длРНК іммобілізували на полігліколевих гранулах носія для хроматографії - Сферону-300 ціанбромідним методом. Концентрацію РНК після іммобілізації визначали після лужного гідролізу орциновим методом. Для різних полірибонуклеотидів їх концентрація на гранулах знаходилася у межах 20-30 мкг на 1 мл носія.

Проведення інтерфероногенезу. Індукцію ІФН проводили у суспензії первинної культури мононуклеарних клітин периферійної крові І(0) групи людини за загальноприйнятим методом. Індукторна доза полінуклеотидів у дослідах складала 10-20 мкг/10⁶ клітин, індукторна доза ВВС - 100 ТЦД₅₀ /10⁶ клітин.

Титрування індукованого ІФН. Титри ІФН визначали шляхом мiкротитрування на клітинах ПТП при цитопатичній дії ВВС. Тип ІФН встановлювали за результатами визначення його противірусної активності після підкислювання культуральної рідини, що містила ІФН, до рН 2,0, та прогрівання при 56 С протягом 2 год.

Визначення активності маркерних ферментів цитоплазматичних мембран тимоцитів щурів. Активність ферментів у мембранній фракції визначали за кількістю неорганічного фосфору (Р_н), що утворювався під дією досліджених гідролаз на відповідні субстрати (Рыбальченко, Коганов, 1988).

Дослідження зовнішньої мембрани клітин за допомогою флуоресцентних зондів. До суспензії живих клітин (5-20) Ч 10⁶ мл-¹ у ФСБ додавали 1-5 мкМ на 10⁶ клітин розчину пірену в етанолі. Далі клітини обробляли індукторами ІФН і визначали флуоресценцію пірену при довжині хвилі збудження цієї речовини = 337 нм та білків мембрани клітин = 280-295 нм кожні 10 хв протягом 1 год. Константу Штерна-Фольмера (К) гасіння флуоресценції білків (л_фл. = 340 нм) обчислювали за формулою F₀ та F - інтенсивність флуоресценції білків у відсутності речовини-гасника та при концентрації гасника С, відповідно.

За співвідношенням флуоресценції мономеру та ексимеру пірену (F_m/F_ex), розчиненого у гідрофобному шарі мембран, оцінювали інтенсивність поступальної дифузії молекул зонду у мембранах, величина якої обернено протилежна мікров'язкості ліпідного шару мембран. Зміну мікров'язкості анулярного (прибілкового) шару ліпідів (на відстані менше 3 нм від білків - радіус Ферстера), визначали за співвідношенням флуоресценції пірену (мономер/ексимер) при збудженні білків мембрани клітин.

Отримання спектрів і вимірювання інтенсивності флуоресценції виконували на спектрофлуорофотометрах RF-510 („Shimadzu”, Японія) та Cary Eclipse („Varian”, США).

Атомна-силова мікроскопія. Візуалізацію поверхні клітин ПТП, зафіксованих 2% розчином глютарового альдегіду, відмитих та зневоднених водно-ацетоновими розчинами (Микроскопическая техника 1996), проводили у режимі переривчастого контакту на зондовому мікроскопі NanoScope ІІІ („Digital Instruments”, США).

Статистична обробка. Інтервал надійності для чисельних даних отримували за критерієм Стьюдента з вірогідністю 95 %. Для визначення результатів титрування ІФН використовували метод Кербера у модифікації Ашмаріна, інтервал надійності даних оцінювали за середнім геометричним логарифму дози (Ашмарин, Воробьёв, 1962).

Результати досліджень, аналіз та узагальнення отриманих даних. На першому етапі досліджень вивчали здатність іммобілізованих на гранулах Сферону препаратів індукторів індукувати ІФН І типу. Особливістю ІММК як індуктору було те, що при його деградації короткі фрагменти длРНК комплексу легко дисоціюють на олРНК та тилорон, які нездатні індукувати помітні кількості ІФН у досліджуваних умовах. Порівняння інтерфероніндукуючої активності іммобілізованих індукторів, їх розчинних форм та ВВС наведено на рис. 1.

Показано, що суспензія Сферону та розчин тилорону у кількостях, які складають ІММК, не викликали продукції ІФН у суспензії лейкоцитів. Найвищий вихід ІФН спостерігався при індукції ІФН за допомогою ВВС (7,8±1,24 log₂). Індуктори нуклеїнової природи - МК, ридостин та полі(I)-полі(С), індукували нижчі титри ІФН (4,0±0,65; 2,9±0,7 та 3,8±0.87 log₂, відповідно). У той же час іммобілізація МК на гранулах сферону не тільки не перешкоджала, а навіть певним чином підвищувала вихід ІФН: на 1,25 log₂ для ІММК, 1,1 log₂ для ридостину та на 0,55 log₂ полі(I)-полі(С). Іммобілізована дріжджова олРНК (3,25±0,52) виявила достатню інтерфероногенність, що на наш погляд пояснюється фіксацією спонтанно утворених дволанцюгових фрагментів РНК на гранулах в процесі іммобілізації.

Динаміка продукції ІФН лейкоцитами у відповідь на індукторну дію МК, ІММК та ВВС, представлена на рис. 2.

З наведених даних можна зробити висновок щодо подібності динаміки синтезу ІФН під дією іммобілізованої (ІММК) та розчинної форми (МК) нуклеотидного індуктору. У випадку використання ВВС як індуктору продукція ІФН починалася дещо пізніш і водночас проходила значно інтенсивніше.

Таким чином, індукторні властивості ІММК практично співпадають з визначенням „швидкого” індуктору з інтенсивною продукцією ІФН на 4-8 годину і досягненням плато на 16-18 год (Ершов 1996). Такі часові інтервали характерні виключно для „класичних” дволанцюгових полірибонуклеотидних індукторів. Отримані нами дані можуть вказувати на те, що механізм індукції для іммобілізованих та розчинних длРНК є подібним. Про це, зокрема, свідчать як абсолютні величини продукції ІФН під дією різних длРНК, так і динаміка синтезу ІФН у присутності іммобілізованої та вільної МК.

Відомо, що поява противірусної активності ІФН спостерігається у культуральній рідині через 1,5-4 год. після початку дії на клітини індукторів як вірусної так і полінуклеотидної природи (Садыков 1978). Ефекти взаємодії полінуклеотидних індукторів з поверхнею чутливих клітин можуть мати спільні риси зі структурними змінами, викликаними впливом на клітинні мембрани вірусних часток під час вірусної інфекції. Що обумовило вивчення процесів, що супроводжували адсорбцію індукторів різної природи на зовнішніх мембранах клітин на початку синтезу ІФН.

Під час взаємодії клітин з ВВС та полірибонуклеотидними інтерфероногенами спостерігали ефекти, які можна інтерпретувати у якості непрямих доказів наявності структурних перебудов зовнішніх мембран тимоцитів і спленоцитів. Згадані ефекти виявили шляхом вимірювання флуоресценції пірену, розчиненого у ліпідному шарі мембран досліджуваних клітин (рис. 3-6). Мікров'язкість вільних ліпідів тимоцитів у присутності і вірусного, і полінуклеотидного індукторів достовірно не змінювалася. Тоді як у суспензії спленоцитів відбувалося зменшення співвідношення F_m/F_ex пірену в обох випадках. Зниження співвідношення F_m/F_ex пірену свідчить про підвищення локальної мікров'язкості вільних ліпідів мембран клітин внаслідок взаємодії останніх з індукторами. Коефіцієнт нахилу залежності F_m/F_ex від часу інкубації для ВВС виявився у 2,6 разів більший ніж для МК. В абсолютних величинах зростання F_m/F_ex становило 38±4,1% для ВВС та 12±1,1% для МК за 1 год (рис. 3, 4).

Зміни мікров'язкості анулярних ліпідів мембран мали виражені екстремуми (рис. 5, 6). Максимальні значення підвищення мікров'язкості анулярних ліпідів мембран тимоцитів спостерігалися на 20 хв дії ВВС (зростання на 66±7,1%, порівняно з початковим рівнем) і на 10 хв - МК (зростання на 45±5,5%, порівняно з початковим рівнем).

Для спленоцитів ця величина, навпаки, зменшувалася у 3,5 разів через 30 хв після обробки клітин ВВС та у 4,6 та 1,4 рази через 10 та 50 хв, відповідно, після обробки МК (рис. 5, 6). Відмічене явище можна пояснити виникненням центрів зв'язування індукторів з білками цитоплазматичної мембрани. Утворені агрегати, у свою чергу, виявляються здатними здійснювати суттєвий вплив на близьке ліпідне оточення (ефективний перенос енергії з білків на пірен відбувається на відстані близько 3 нм), вірогідно внаслідок їх проходження крізь зовнішню клітинну мембрану.

Як ВВС, так і полірибонуклеотидний індуктор впливали на реологічні параметри мембран обох видів клітин у часовому інтервалі приблизно 10-30 хв. Індивідуальними фізіологічними відмінностями реакції тимоцитів і спленоцитів на індуктори ІФН може пояснюватися і різна спроможність до продукції ІФН І типу при стимуляції цих клітин.

Наявність процесу білок-опосередкованої адсорбції індукторів ІФН на поверхні чутливих клітин підтверджено шляхом вивчення процесу гасіння флуоресценції мембранних білків у суспензії лімфоїдних клітин щурів. Розраховані за рівнянням Штерна-Фольмера константи гасіння мембранних білків під дією зростаючих концентрацій ол- і длРНК наведені у табл. 1.

Препарати длРНК (ридостин та МК) виявилися більш активними факторами гасіння флуоресценції мембранних білків порівняно з олРНК. Так, константи гасіння флуоресценції білків мембран для длРНК були у 1,5-2 рази вищими у випадку спленоцитів та у 2,8-5,5 разів вищими у випадку тимоцитів, ніж згадані величини для олРНК, що вказує на утворення у цих випадках відмінних один від одного за фізико-хімічними властивостями білок-нуклеїнових комплексів. Отримані дані можна пов'язати з добре встановленим фактом, використання вірусами білкових рецепторів зовнішньої мембрани клітин для специфічної адсорбції і наступного проникненням всередину клітин (Букринская, Жданов 1991).

Інтенсивні мембранні перебудови в принципі здатні приводити до певних змін у функціонуванні зовнішніх мембран клітин, показником чого, в першу чергу, є активність асоційованих з мембраною маркерних ферментів (Nа⁺,K⁺-АТФази, Са²⁺,Mg²⁺-АТФази, 5'-нуклеотидази). Наступні дослідження стосувалися змін активності вказаних ферментів у складі цитоплазматичних мембран тимоцитів щурів під дією полінуклеотидних індукторів ІФН (рис. 7 а-в).

Зміни активності маркерних ферментів мембран відстежували в інтервалі від 10 хв до 2,5 год, тобто від початку адсорбції індукторів на поверхні клітин до появи синтезованого de novo ІФН. Отримані в дослідах криві активності ферментів мали виражений двохфазний характер. При цьому активність ферментів після обробки клітин препаратами індукторів зростала у 2-6,5 разів порівняно з початковою.

Зміни активності ферментів спостерігалися у досить близьких часових інтервалах. Максимуми ферментативної активності припадали на 20-30 хвилину інкубації клітин з індукторами, вторинна активація ферментів відбувалася через 2-2,5 години. При цьому МК діяв на клітини порівняно швидше (активація на 20-ту хвилину та через 2 години) і викликав активацію головним чином 5'-нуклеотидази. Для дріжджової олРНК була притаманна більш виражена друга фаза активації, яка припадала на 2,5 години інкубації. Також олРНК інтенсивніше впливала на активність 5'-нуклеотидази та Na⁺,K⁺-ATФази і, майже, зовсім не активувала Са²⁺,Мg²⁺-АТФазу. Характерно, що ІММК виявив лише один виражений пік активності Na⁺,K⁺-ATФази у дослідженому часовому періоді, але практично не вплинув на активність Са²⁺,Мg²⁺-АТФази. Зазначені відмінності, на наш погляд, можуть бути пов'язані зі стеричними ефектами, які ускладнюють контакт молекул полірибонуклеотидного індуктору, розміщених на поверхні часток ІММК, з зовнішньою клітинною мембраною. Більш виражений у випадку олРНК другій максимум активності ферментів міг бути обумовлений посиленням загального рівня метаболізму у клітинах, викликаного олРНК (Земсков с соавт., 1985).

Під дією ВВС у тимоцитах, навпаки, відбувалося пригнічення активності маркерних ферментів мембран. Так, активність Са²⁺,Мg²⁺-АТФази знижалася у 8,1 разів, Na⁺,K⁺-ATФази - у 1,9 разів, 5'-нуклеотидази - у 3,5 разів, порівняно з інтактним рівнем. Мінімум активності цих ферментів знаходився у межах 30-60 хв від початку адсорбції вірусу на клітинах (рис. 8).

Припускають, що після зв'язування вірусів з відповідними рецепторами на поверхні еукаріотичних клітин ініціюється каскад процесів у клітинній мембрані, в результаті якого вірусна генетична інформація проникає до клітин (Pietiainen, 2005). Той факт, що часовий інтервал, за яким відбувається найбільша зміна активності мембранних ферментів, в наших дослідах виявився практично однаковим як для вірусів, так і для длРНК (30-60 хв), може свідчити, що саме цей період є критичним для розпізнавання клітиною потенційної небезпеки проникнення до клітини інфекційного агента.

Вивчення явища адсорбції вірусів на поверхні клітин з подальшим проникненням їх до цитоплазми здійснюється шляхом його візуалізації за допомогою багатьох цитологічних методів, включаючи метод АСМ (Moloney, 2004). На відміну від класичної електронної мікроскопії цей метод дозволяє спостерігати молекулярні об'єкти з розмірами на порядок меншими за вірусні частки, зокрема молекули полінуклеотидів, безпосередньо на поверхні зовнішньої мембрани клітин.

На всіх наведених зображеннях поверхні клітинної мембрани, отриманих за допомогою АСМ, добре вирізняються елементи цитоскелету у вигляді світлих ниток неправильної форми довжиною до 2,5 мкм (рис. 9). Роздільна здатність методу дозволила виявити окремі молекулярні агрегати длРНК з розміром часток (50-100) Ч (15-25) мкм на поверхні клітин. При цьому через 15 хв після початку індукції стабільного контакту між агрегатами МК і поверхнею клітин не виникало, а спостерігалися лише поодинокі частки длРНК (рис. 9б). Найбільш виражені морфологічні зміни мембранної поверхні відбувалися на 30 хв (рис. 9в), коли на цій поверхні виявляється велика кількість молекулярних агрегатів МК (позначені білими стрілками). На 60 хв інкубації зображення молекулярних агрегатів МК зникають, натомість, спостерігаються помітні заглиблення цитоплазматичної мембрани з типовими для часток МК розмірами - темні ділянки (позначені стрілками, рис. 9г). Вважається, що подібні заглиблення можуть бути наслідком проникнення молекулярних агрегатів МК до клітин.

Для подальшої інтерпретації отриманих даних проводили вимірювання розмірів часток (рис. 10 а-г) та заглиблень на поверхні досліджуваних клітин (рис. 10 д-ж).

Розмір утворень на клітинній поверхні відповідав розмірам молекул індуктору - МК, визначеним окремим дослідженням (рис. 11 а-ж).

Таким чином, при прямому спостереженні поверхні індукованих клітин методом АСМ процес взаємодії клітин з МК виявився подібним тому, що спостерігається при інфікуванні клітин багатьма вірусами (Marsh, 1984). Це, зокрема, відноситься до етапу адсорбції часток МК з наступною деформацією клітинної мембрани. Ймовірно, що згадані мембранні перебудови пов'язані з включенням специфічного „контактного” механізму активації експресії генів ІФН І типу (Karpov, 1998; 1999).

Результати проведених досліджень додають нову інформацію щодо механізму взаємодії вірусів і полірибонуклеотидів з клітинами та дозволяють більш повно уявити картину клітинних процесів, які супроводжують індукцію ІФН І типу (рис. 12). Так як після проникнення вірусних нуклеїнових кислот всередину клітин під час вірусної інфекції відбувається швидке пригнічення транскрипції власних генів клітин з подальшим блокуванням трансляції, то формування сигналу для індукції ІФН І типу має розпочинатися при взаємодії вірусів із зовнішньою поверхнею клітин. Зі схеми видно, що як для вірусів так і для полінуклеотидів характерні приблизно однакові часові межі присутності і впливу на зовнішню мембрану клітин. Швидка реакція мембран клітин при дії як вірусів, так і полінуклеотидів, як ми вважаємо, є визначальною для розпізнавання клітинами вірусної атаки та запуску універсальної системи противірусного захисту - синтезу ІФН І типу і здійснюється за подібним механізмом, незалежно від природи індуктору - вірусної чи полінуклеотидної.

ВИСНОВКИ

Сконструйовані полірибонуклеотидні індуктори ІФН на основі молекулярних комплексів (МК) одноланцюгової РНК з гідрохлоридом тилорону, іммобілізованих на нерозчинних гранулах Cферону-300. Показана інтерфероногенна здатність згаданих конструкцій, вивчена динаміка синтезу індукованого ними ІФН і доведена його приналежність до ІФН І типу (б/в-ІФН).

Встановлено зменшення мікров'язкості анулярних ліпідів мембран спленоцитів в 3,5 та у 4,6 рази під дією вірусу везикулярного стоматиту (ВВС) та МК, відповідно. Мікров'язкість вільних ліпідів зростала на 38±4,1% для ВВС та на 12±1,1% для МК за 1 годину інкубації порівняно з початковою.

Для анулярних ліпідів мембран тимоцитів показано підвищення мікров'язкості на 66±7,1% та 45±5,5% під дією ВВС та МК, відповідно. Мікров'язкість вільних ліпідів майже не змінювалася протягом 1 год інкубації з цими індукторами.

Визначені константи гасіння флуоресценції білків цитоплазматичної мембрани під дією індукторів: 8,8±0,45 і 17,5±1,6 у суспензії тимоцитів, та 3,0±0,14 і 4,4±0,37 у суспензії спленоцитів для МК і ридостину відповідно.

Виявлено, що взаємодія клітинної мембрани тимоцитів щурів з полінуклеотидними інтерфероногенами призводить до підвищення рівнів активності трьох мебранозв'язаних ферментів - Nа⁺,K⁺-АТФази, Са²⁺,Mg²⁺-АТФази та 5'-нуклеотидази у 2-6,5 разів. ВВС, навпаки, пригнічував активність цих ферментів у 1,9-8,3 рази.

Одержано зображення поверхні моношарових клітин ПТП при дії полінуклеотидного індуктору (МК). Виявлені морфологічні зміни на поверхні цитоплазматичної мембрани у вигляді адсорбованих часток та заглиблень розміром (50-100) Ч (15-25) мкм.

Поряд з відомими фактами, отримані експериментальні дані підтверджують можливість індукування сигналу до експресії генів ІФН внаслідок структурно-функціональної перебудови клітинних мембран під дією індукторів як вірусної, так і полінуклеотидної природи.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ ПРАЦЬ

Манджос О.П., Карпов О.В. Вплив комплексного індуктора інтерферону на клітинну поверхню: дані атомно-силової мікроскопії. // Доп. НАНУ. - 2005. - № 7. - С. 188-192.

Манджос А.П., Прокопова К.В., Жолобак Н.М., Карпов О.В. Изменение активности маркерных ферментов плазматических мембран под действием полинуклеотидного индуктора интерферона. // Доп. НАНУ. - 2005. - № 3. - С. 148-151.

Карпов О.В., Верьовка С.В., Манджос О.П., Поводзинський В.М., Жолобак Н.М., Співак М.Я., Кисельова О.К. Індукція інтерферонів І типу в умовах in vitro за допомогою іммобілізованого комплексного інтерфероногену. // Доп. НАНУ. - 2003. - № 9. - С. 178-181.

Жолобак Н.М., Манджос А.П., Поводзинський В.М., Веревка С.В., Карпов А.В. Интерфероногенное действие рибополинуклеотидов in vitro. // Укр. Біохім. Журн. - 2003. - т. 75. - № 6. - С. 106-110.

Карпов О.В., Жолобак Н.М., Манджос О.П., Пенчук Ю.М., Співак М.Я. Вивчення зв'язку структура-активність в ряду лігандів інтерфероніндукуючих молекулярних комплексів з однонитчастою РНК. // Вісник. Біологія. - К.: КНУ ім. Т. Шевченка. - 2001. - Вип. 35. - С. 25-28.

Карпов А.В., Жолобак Н.М., Манджос А.П., Пенчук Ю.Н., Спивак Н.Я. Изучение святи структура-активность в ряду лигандов интерферониндуцирующих молекулярніх комплексов с однонитевой РНК. // Анали Мечніковського інституту. - Харків: ін-т мікробіології та імунології ім. І.І. Мечнікова, 2001. - № 1. - С. 68.

Жолобак Н.М., Манджос О.П., Карпов О.В., Співак М.Я. Інтерфероніндукуюча здатність молекулярних комплексів одноланцюгових гомополінуклеотидів з 2,7-біс[2-(діетиламіно-етоксі)-флуорен]-9-он дігідрохлори-дом (тилороном). // Тези ІІІ Міжнар. конф. „Біоресурси та віруси”. - Київ, 11-15 вересня 2001. - С. 9.

Манджос О.П., Пенчук Ю.Н. Карпов А.В. Интерферониндуцирующее действие иммобилизованной дрожжевой РНК в комплексе с тилороном. // Тез. Междунар. научно-практ. конф. „Новые технологии получения и применения биологически активных веществ”. - Алушта, 20-25 мая 2002. - С.117.

Манджос О.П., Карпов О.В., Кисельова О.К. Контакт індуктора полінуклеотидної природи із клітинною стінкою як початковий сигнал для індукції in vitro інтерферонів типу I. // Матеріали VIII Українського біохімічного з'їзду. - Чернівці, 1-3 жовтня 2002: Укр. біохім. журн. - 2002. - Т.74, № 4б (додаток 2). - С. 187.

Жолобак Н.М., Манджос А.П., Карпов А.В. Индукция интерферонов I типа путем контакта иммобилизованной двуспиральной РНК с клеточной мембраной. // Тез. 7-ой Пущинской школы-конференции молодых ученых „Биология - наука ХХI века”. - Пущино (Россия), 14-18 апреля 2003. - С. 351.

Манджос О.П., Карпов О.В. Вивчення адсорбції полірибонуклеотидного індуктора інтерферону І типу на поверхні клітин ПТП за допомогою атомно-силової мікроскопії. // Тези ІV Міжнар. конф. „Біоресурси і віруси”. - Київ, 27-30 вересня 2004. - С. 16.

Манджос О.П., Прокопова К.В., Карпов О.В. Вплив індуктора інтерферону І типу на активність маркерних ферментів плазматичних мембран тимоцитів щурів. // Матеріали міжнар. науково-практ. конф. студ., асп. та молодих вчених, присвяченої 190-річчю з дня народження Тараса Шевченка та 170-річчю заснування Київського університету. „Шевченківська весна”. - Київ, 2004. - Випуск ІІ. - С. 17-18.

АНОТАЦІЯ

Манджос О.П. Взаємодія вірусних та полінуклеотидних індукторів з клітиною як первинний сигнал продукції інтерферонів І типу. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук зі спеціальності 03.00.06 - вірусологія. Київський національний університет імені Тараса Шевченка, Київ, 2007.

Робота присвячена дослідженню початкових стадій індукції інтерферонів (ІФН) І типу під дією вірусних та полінуклеотидних індукторів.

Встановлено здатність іммобілізованих дволанцюгових РНК (длРНК) викликати продукцію ІФН І типу. За часовими характеристиками індукція ІФН І типу за допомогою іммобілізованих длРНК виявилася подібною до незв'язаних індукторів - вірусу везикулярного стоматиту (ВВС) і длРНК. Показані зміни мікров'язкості вільних та анулярних ліпідів мембран тимоцитів та спленоцитів щурів під час вірусної та полірибонуклеотидної індукції, що вивчали за допомогою флуоресцентного зонду - пірену. Відмічено зміни активності маркерних ферментів мембран клітин під дією полірибонуклеотидів та ВВС. Вперше проведено пряме спостереження за зовнішньою поверхнею клітин при їх взаємодії з полірибонуклеотидним індуктором за допомогою атомно-силової мікроскопії (АСМ).

Найбільш виражені структурно-функціональні зміни мембран клітин при дії длРНК, підтверджені вищезгаданими методами, відбуваються на 10-30 хв після початку контакту клітин з індукторами ІФН. На основі аналізу відомих і отриманих даних висловлено вирішальне значення первинного впливу вірусних та полінуклеотидних індукторів на мембрани клітин для початку синтезу ІФН І типу.

Ключові слова: ІФН, індукція, длРНК, клітинна мембрана, АСМ.

АННОТАЦИЯ

Манджос А.П. Взаимодействие вирусных и полинуклеотидных индукторов с клеткой как первичный сигнал продукции интерферонов І типа. - Рукопись.

Диссертация на соискание научной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.06 - вирусология. Киевский национальный университет имени Тараса Шевченко, Киев, 2007.

Работу посвящено изучению начальных стадий индукции интерферонов (ИФН) І типа под действием вирусных и полинуклеотидных индукторов.

Изучено интерфероногенные свойства иммобилизированных полирибонуклеотидных индукторов. По динамике синтеза ИФН І типа такие двухцепочечные РНК (дцРНК) почти не отличались от растворимых форм - вируса везикулярного стоматита (ВВС) и дцРНК. Максимальную скорость синтеза ИФН І типа наблюдали через 4-8 часов после индукции, выход на плато - через 16-18 часов.

Изменения микровязкости липидов мембран тимоцитов и спленоцитов крыс при индукции ИФН І типа с помощью вируса везикулярного стоматита и дцРНК получены по соотношению флуоресценции мономерной и эксимерной форм пирена. В этих же условиях оценены изменения поступательной диффузии пирена в окружении свободных и анулярных липидов внешних мембран клеток. Снижение микровязкости мембран спленоцитов достигало 4,6 раз - дцРНК и 3,5 раз - ВВС для прибелковых липидов. Микровязкость свободных липидов спленоцитов постепенно возрастала на 38±4,1% и 12±1,1% в присутствии ВВС и дцРНК, соответственно. В суспензии тимоцитов микровязкость анулярних липидов возросла на 66±7,1% та 45±5,5% при действии ВВС и дцРНК, соответственно, микровязкость свободных липидов при этом почти не менялась. Показана активация маркерных ферментов внешней мембраны тимоцитов: Nа⁺,K⁺-АТФазы, Са²⁺,Mg²⁺-АТФазы та 5'-нуклеотидазы в условиях индукции ИФН. Возрастание ферментной активности под действием полинуклеотидов происходило в 2-6,5 раз в сравнении с контрольным уровнем. ВВС, напротив, вызывал снижение ферментной активности в 2,2-8,3 раза.

Присутствие дцРНК на клеточной поверхности подтверждено методом атомно-силовой микроскопии (АСМ). Наибольшие морфологические изменения поверхности клеток ПТП, при обработке их МК, наблюдались на 30 мин после начала индукции.

Наиболее выраженные структурно-функциональные перестройки внешней клеточной мембраны, вызванных индукторами ИФН, и наступали через 10-30 мин после взаимодействия изученных индукторов с клетками.

На основе анализа известных и полученных данных, наличие структурно-функциональных перестроек внешней клеточной мембраны, вызванных вирусными и пролирибонуклеотидными индукторами ИФН и наступающих через 10-30 мин после взаимодействия индукторов с клетками, определенно влияет на формирования сигнала экспрессии генов ИФН І типа.

Ключевые слова: ИФН, индукция ИФН, дцРНК, клеточная мембрана, АСМ.

SUMMARY

Mandzhos O.P. Interaction of viral and polyribonucleic inducers with a cell as a primary signal for IFN type I production. - Manuscript.

The thesis for taking PhD degree by speciality 03.00.06 - virology. Taras Shevchenko' Kyiv national university, Kyiv, 2007.

The thesis is dedicated to exploring initial stages of antiviral interferons' (IFN) type I induction.

A possibility of IFN producing by immobilized double stranded RNA (dsRNA) was found out. A time dependence of IFN type I synthesis by immobilized dsRNA was similar to that of soluble inducers - vesicular stomatitis virus (VSV) and dsRNA. An outer membrane annular and free lipids viscosity of rat tymocytes and splenocytes changes during IFN induction with VSV and dsRNA, studied with the aim of fluorescent probe - pyrene, was established. Cell membrane enzymes' variations under VSV and polyribonucleic inducers was determined. A direct cell surface observation, in an dsRNA presence, was fulfilled using atomic-force microscopy (AFM).The most prominent structural and functional alterations under IFN induction, proved by mentioned above methods, occurred after 10-30 min cells-inducers interaction.

After analysis of known and obtained data, the significance of IFN inducers interaction with cells' membrane for IFNs type I induction was suggested.

Keywords: IFN, IFN induction, dsRNA, cell membrane, AFM.

Размещено на Allbest.ru