Ініціація, посилення та перенос протипухлинних імунних реакцій при злоякісних новоутвореннях

Визначення електрофоретичного заряду поверхні лімфоїдних клітин мишей C57BL/6 з підшкірним ростом карциноми 3LL або меланоми B16 дозволило виявити порушення процесів репопуляції в лімфоїдних органах при пухлинному рості. Дослідження ЕФР лімфоцитів дало можливість вперше звернути увагу на перерозподіл клітин з окремими функціями в популяціях лімфоїдних клітин як загальної реакції органів імуногенезу на пухлинний ріст. Порушення рециркуляції лімфоцитів асоціюється з дисфункцією тимуса, проявом чого є розвиток неадекватних клітинно-опосередкованих імунних реакцій. Введення тимічних препаратів в якості замісної терапії відновлює здатність лімфоцитів тварин з пухлиною до репопуляції в органах імуногенезу, про що свідчить реверсія показників їх ЕФР в динаміці пухлинного росту.

Отримані експериментальні дані дозволили зробити наступне узагальнення. Інтенсивне надходження лімфоцитів до запального вогнища, що формується навколо пухлинного імплантата, та їх рекрутування пухлинними клітинами підтримує опозитний ріст самої пухлини. Це, в свою чергу, призводить до порушення рециркуляції лімфоцитів, що складає основу процесів репопуляції в лімфоїдних органах, проявом чого може бути різке збіднення лімфоїдними елементами регіонарних ЛВ. На тлі накопичення лімфоцитів в пухлині та спустошення регіонарного лімфоїдного колектора відбувається дисемінація пухлинних клітин, що асоціюється з розвитком системної анергії Т-лімфоцитів.

Такі зрушення в імунній системі потребують виваженого патогенетично обгрунтованого підходу до їх корекції. На цій підставі застосування ендогенних біологічно активних факторів, індукованих введенням ІФН в малих дозах, є перспективним. Оскільки ріст пухлини (незалежно від її локалізації) супроводжується пригніченням ендокринної функції тимуса, що проявляється зниженням у циркуляції вмісту ТСА і зростанням рівня інгібітора ТСФ, є обґрунтованим застосування тимічних препаратів як однієї з важливих складових такої імунокорекції.

Вдосконалення методології застосування тимічних препаратів і інтерферонів при лікуванні хворих на злоякісні новоутворення. На сучасному етапі розвитку біотерапії основним напрямком залишається застосування різних модифікаторів біологічних реакцій, зокрема - цитокинів. Разом з тим, парентеральне введення великих доз препаратів цитокинів (зокрема, ІФН) може супроводжуватись виразними прозапальними ефектами, які провокують розвиток небезпечних гіперергічних запальних реакцій та порушення імунної відповіді. У зв'язку з цим, розроблений нами метод застосування малих доз -ІФН у сполученні з тимічними препаратами дає можливість уникнути небажаних реакцій з боку організму, ураженого пухлинним процесом і створює адекватні умови для розвитку протипухлинних імунних реакцій. Цей підхід грунтується на корекції ендогенної продукції біологічно активних факторів, які впливають на формування протипухлинної імунної відповіді.

Встановлено, що після введення екзогенного природного -ІФН, лімфоцити мишей набувають підвищеної здатності продукувати фактор, який активує КЕ імунної системи, зокрема макрофаги. Найбільший ефект спостерігається при введенні -ІФН в дозі 1000 Од, що зумовлює максимальну продукцію фактора протягом наступних трьох діб. У тій же модельній системі препарати екзогенного г-ІФН виявляють аналогічні ефекти, що підтверджує тезу про існування індукторного механізму дії екзогенних ІФН.

Результати, отримані на моделі пізньої ТЕ у мишей дозволили зробити важливий висновок, про те, що ІФН індукують продукування Т-лімфоцитами фактора, що активує КЕ імунної системи, і цей феномен реалізується під контролем тимуса, в першу чергу, за рахунок його ендокринної функції.

Як видно, супернатанти культур лімфоцитів селезінки і ЛВ ТЕ-тварин, що одержали -ІФН, так само, як і лімфоцитів ТЕ-мишей, яким було введено “псевдо”-ІФН (культуральну рідину лімфоцитів, які не були активовані вірусом хвороби Ньюкасла), не впливають на активність макрофагів. На відміну від цього, лімфоїдні клітини псевдотимектомованих (ПТЕ) мишей після введення їм -ІФН продукують фактор, який активує макрофаги, з піком активності на 3-ю добу після введення препарату. Наслідки пізньої ТЕ, що пов'язані з порушенням продукції описанного фактора, вдається частково нівелювати введенням тимічних препаратів та повністю - трансплантацією сингенного тимуса.

Для виділення ІФН-індукованих факторів була розроблена технологія їх одержання з низькомолекулярного екстракту (Мм>25 кД) клітин лімфоїдних органів через 72 год після введення тваринам ІФН. Такий підхід дозволив отримати ендогенні фактори із спленоцитів свиней після введення останнім гомологічних ІФН. Доведено, що індуковані гомологічними ІФН фактори володіють рядом імунотропних властивостей, зокрема, вони здатні посилювати спонтанну та мітоген-індуковану проліферацію лімфоцитів та підвищувати їх цитотоксичну активність in vitro та in vivo. Деякі з цих препаратів ефективно посилюють цитотоксичність макрофагів. Крім того, до складу низькомолекулярних факторів входить субстанція, яка ефективно пригнічує проліферацію злоякісних гемопоетичних клітин, що свідчить про протипухлинні властивості зразків, які індуковані б-ІФН.

Механізм дії отриманих препаратів низькомолекулярних факторів свиней пов'язаний із секрецією лімфоїдними клітинами РТПА і появою ТСА в циркуляції, що є важливим аргументом для їх застосування при корекції секреторної активності тимуса. Цей підхід можна розглядати як альтернативу застосуванню в якості замісної терапії тільки тимічних препаратів.

Результати, отримані на моделях експериментального пухлинного росту, свідчать про те, що біологічно активні низькомолекулярні фактори з лімфоцитів свиней здатні модифікувати пухлинний процес у ксеногенній системі: їх введення гальмує на 37 % ріст пухлини та вірогідно (p<0,05) подовжує тривалість життя щурів з КГ, а також справляє антиметастатичний вплив у мишей з карциномою 3LL (зменшує частоту метастазування на 30 % і середню кількість метастазів в 2,1 рази та їх загальний об'єм - в 3,4 рази, p<0,05).

Таким чином, отримані результати свідчать, що ІФН індукують вироблення Т-лімфоцитами факторів, які впливають на формування та активність протипухлинної імунної відповіді. Ці дані, вперше отримані нами, дозволяють глибше зрозуміти механізми ад'ювантної дії екзогенних ІФН та обгрунтовують доцільність їх використання в малих концентраціях у сполученні з тимічними препаратами в імунотерапії хворих на злоякісні новоутворення.

Проведено клінічну апробацію методів післяопераційного впливу на імунну систему організму, спрямованих на підвищення ефективності радикального лікування хворих на злоякісні новоутворення, шляхом введення тимічних препаратів або рекомбінантного 2b-ІФН.

Вивчення впливу імунотерапії, що заснована на тривалому введенні тимічного препарату, показало різну клінічну ефективність такого підходу у хворих на рак стравоходу і рак шлунка з поширенням на стравохід. Встановлено, що тривале введення тимостимуліну протягом першого року після комбінованого лікування хворих на рак стравоходу, не відновлює показники клітинної ланки імунної системи. Більше того, функціональна активність лімфоцитів залишається порушеною, про що свідчить неадекватна відповідь на мітоген в РГМЛ, що, на нашу думку, є поганим прогностичним фактором. При цьому результати комбінованого лікування хворих на рак стравоходу погіршуються (5-річна виживаність знизилась до 12 % проти 25 % в контрольній групі, p>0,05). Навпаки, тривале введення тимостимуліну при комбінованому лікуванні хворих на рак шлунка з поширенням на стравохід призводить до коригування порушень в клітинній ланці імунної системи і, що важливо, відновлює здатність лімфоцитів відповідати на мітогенний стимул протягом усього терміну спостереження. Під впливом такої імунотерапії підвищилась ефективність комбінованого лікування хворих на рак шлунка з поширенням на стравохід (5-річна виживаність збільшилась до 54,6 % проти 34,1 % в контрольній групі, p>0,05), що є показанням до її застосування при проведенні комбінованого лікування цієї категорії хворих.

Більш ефективним виявився підхід, який включає застосування тактивіна в сполученні з препаратами, що пригнічують супресорну функцію імунокомпетентних клітин, в післяопераційному періоді радикально оперованих хворих на рак легені. Встановлено, що така імунотерапія відновлює показники імунної системи, що позначається зниженням частоти післяопераційних гнійно-септичних ускладнень (1,7 % проти 10,9 % при суто хірургічному лікуванні, p<0,05) та сприяє покращанню віддалених результатів хірургічного лікування хворих на рак легені без метастазів в регіонарних ЛВ (5-річна виживаність збільшилась до 63,1 % проти 38,1 % при суто хірургічному лікуванні, p<0,05).

ІФН-терапія у вигляді курсу ад'ювантної імунотерапії не сприяла відновленню показників імунної системи та не впливала на ефективність радикального хірургічного лікування хворих на рак легені І-ІІ стадії. Разом з тим, ІФН-терапія покращила безпосередні результати хірургічного лікування хворих на рак легені (зниження частоти гнійно-септичних ускладнень до 2,9 % проти 10,9 % при суто хірургічному лікуванні, p<0,05) та істотно збільшила медіану виживаності хворих з метастазами в регіонарних ЛВ (з 14,9+1,3 до 21,4+0,8 міс, p<0,05).

Таким чином, ад'ювантне застосування як тимічних препаратів, так і рекомбінантного 2b-ІФН справляло певний позитивний вплив на характеристики імунної системи і покращувало виживаність хворих на рак шлунка з поширенням на стравохід і хворих на рак легені без метастазів в регіонарних ЛВ. Водночас, у пацієнтів на рак стравоходу та на рак легені (з метастазами в регіонарних ЛВ) застосування кожного з досліджених імунотропних чинників (у вигляді моноімунотерапії) не впливало на ефективність основного лікування, що обумовило подальшу розробку та вдосконалення схем комбінованого використання тимічних препаратів і екзогенних ІФН при лікуванні хворих на злоякісні новоутворення.

Розробка і застосування технології адоптивної імунотерапії хворих на злоякісні новоутворення. АІТ, що заснована на переносі живих активованих поза організмом автологічних лімфоцитів з вираженою протипухлинною активністю, на даний час вважається одним з найбільш перспективних методів лікування хворих на солідні злоякісні новоутворення. Перевага методу активації імунокомпетентних клітин in vitro полягає насамперед у можливості одержання достатньої кількості КЕ для терапевтичного використання за рахунок створення оптимальних умов індукції протипухлинної активності лімфоцитів онкологічних хворих у контрольованій системі. Перенос цих клітин дозволяє елімінувати не просто будь-які активно проліферуючі клітини, як це має місце при проведенні променевої чи хіміотерапії, а вибірково пухлинні.

Для одержання АЛК в лабораторних умовах нами використаний методичний підхід, що грунтується на стимуляції отриманих з регіонарних ЛВ лімфоцитів in vitro автологічними пухлинними клітинами у присутності рекомбінантного ІЛ-2. Складність цієї технології обумовлена багатьма проблемами біотехнологічного та суто медичного характеру, які вперше у вітчизняній практиці довелось вирішувати в масштабах клінічного дослідження. Зокрема, це стосується методів генерації цитотоксичної активності in vitro, які відрізняються залежно від походження і кількості лімфоїдних кліток, що на початку вносяться в культуру; умовами і факторами активації і/або індукції специфічної протипухлинної цитотоксичності. Лімфоцити, отримані з різних джерел, відрізняються за кінетикою росту і рівнем індукції цитотоксичної активності, що, у свою чергу, впливає на клінічну ефективність кожного методу.

Метою наших конструкційних зусиль була розробка систем культивування, які відповідали б фізіологічним умовам життєдіяльності і проліферації лімфоїдних клітин. Були розроблені суспензійні системи вібраційного та мембранного типів і на їх основі створено апаратуру для технологічного процесу довготривалого культивування лімфоцитів людини в керованих умовах. Вивчення цих систем для культивування лімфоцитів, отриманих з регіонарних ЛВ хворих зі злоякісними пухлинами з метою генерації протипухлинної цитотоксичності, дозволило надати перевагу системі з використанням вібраційного біореактора. Ця система, відрізняючись простотою і оптимально розрахованою конструкцією біореактора, дозволяє отримувати на кінцевих етапах культивування до 5,0х10⁸ клітин/мл (при початковому вмісті - 5,5х10⁵ клітин/мл), що є достатнім для забезпечення оптимальної кількості клітин, які вводяться хворим. Отримання аналогічної концентрації клітин раніше досягали при використанні більш складних культуральних систем і з більшою втратою життєздатних клітин. Динаміка росту лімфоїдних клітин у вібраційному біореакторі відповідає загальним характеристикам клонування цитотоксичних Т-лімфоцитів in vitro, оскільки відомо, що час їх подвоєння доволі малий, і на 7-10-у добу після експоненційної фази росту кількість клітин в культурі починає зменшуватись.

Цитотоксичну активність лімфоцитів визначали до і після культивування. Вихідні значення ЦІ, як правило, були вкрай низькими. Наприкінці культивування цей показник зростає в десятки разів. Важливо підкреслити, що на кінцевих етапах культивування, АЛК достатньо ефективно лізують також резистентні до дії природних кілерів клітини-мішені (Daudi).

Таким чином, розроблені системи суспензійного культивування дозволили оптимізувати культуральний об'єм, забезпечити мінімально допустиму початкову щільність лімфоцитів, здійснювати контроль за станом клітинної популяції і проведення технологічних операцій з незначним ризиком контамінації. На цій основі був складений “Лабораторний регламент отримання автологічних лімфоцитів з протипухлинними властивостями” для проведення АІТ в клініці.

Для подолання порушень в клітинній ланці імунної системи хворих, які можуть обмежувати приживлення та функціонування лімфоцитів in vivo під час проведення АІТ, була розроблена схема супровідної імунотерапії. Вона грунтується на здатності -ІФН, при його введенні з інтервалом 48-72 год на тлі замісної терапії тимічними препаратами, індукувати в організмі продукцію ендогенних факторів. Власне кажучи, дана схема є варіантом комбінованої імунотерапії, що включає застосування на різних етапах лікування хворих тимічних препаратів у сполученні з рекомбінантним 2b-ІФН і адоптивного переносу автологічних АЛК. Апробація розробленого методу в клініці показала, що АІТ добре переноситься хворими, не ускладнює перебіг післяопераційного періоду.

Отримані дані дозволили нам застосувати розроблений метод АІТ в комбінованому лікуванні хворих на рак легені. Встановлено, що адоптивний перенос генерованих in vitro АЛК викликає посилення функціональної активності імунокомпетентних клітин і, зокрема, цитотоксичності лімфоцитів (ЦІ до введення АЛК складає - (21,5+1,5) %, після - (33,3+2,1) %, p<0,05). Важливо підкреслити, що проведена АІТ призвела до реверсії відповіді лімфоцитів на мітоген. Якщо до лікування лімфоцити хворих були анергичні (індекс міграції - (142,0+15,0) %), то після терапії активно відповідають на мітоген виробленням фактора, що пригнічує міграцію лейкоцитів (індекс міграції - (91,0+7,1) %, p<0,05). Про те, що проведена АІТ викликає появу цілого спектру ендогенних факторів, свідчить поява ТСА у циркуляції, що є об'єктивною ознакою відновлення імунної системи цих хворих. Це позначилось на об'єктивному зниженні кількості післяопераційних ускладнень.

Враховуючи, що більше половини хворих на рак легені помирає протягом перших двох років, при аналізі віддалених результатів основну увагу приділяли 2- та 5-річній виживаності в групах з суто хірургічним лікуванням і в комбінації з АІТ, в залежності від стадії захворювання або від наявності метастазів (N0 або N1-2) без урахування стадії хвороби.

2-річна виживаність хворих після АІТ склала: при І-ІІ стадії - (80,0012,65) %; при ІІІА стадії - (85,71+9,35) %; за відсутності метастазів в регіонарних ЛВ -- (81,3411,92) %; за наявності метастазів в регіонарних ЛВ -- (84,6210,01) %. В групі з хірургічним лікуванням -- (78,163,37); (27,843,39); (59,683,35) і (32,71+4,46) % відповідно. Статистично вагома різниця у виживаності хворих виявлена при ІІІА стадії (p<0,05). 5-річна виживаність хворих з проведеною АІТ склала: при І-ІІ стадії - (41,6714,23), при ІІІА стадії - (32,27+12,07) %; за відсутності метастазів в регіонарних ЛВ -- (42,8613,23), за наявності метастазів в регіонарних ЛВ -- (30,0012,85) %. В групі з хірургічним лікуванням -- (56,614,30); (10,612,62); (38,103,56) і (18,24+3,93) % відповідно.

Медіана виживаності у хворих при І-ІІ стадії склала - (37,00+2,35) міс; при ІІІА стадії - (28,75+1,01) міс; за відсутності метастазів у регіонарних ЛВ

була більше 45 міс, а за наявності метастазів у регіонарних ЛВ (N1-2) - (36,50+1,93) міс. В контрольній групі (тільки операція) медіана виживаності склала: при І-ІІ стадіях більше 60 міс, при ІІІА стадії - (12,66+1,32) міс; за відсутності метастазів у регіонарних ЛВ - (34,22+3,29) міс, а за наявності метастазів - (14,89+1,29) міс.

Отже, проведення за розробленим протоколом АІТ хворим на рак легені із застосуванням на різних етапах лікування НАІ та адоптивного переносу генерованих в системі in vitro АЛК призвело до покращання деяких показників імунної системи. АІТ добре переноситься хворими, не ускладнює перебіг післяопераційного періоду, попереджує розвиток гнійно-септичних ускладнень. Збільшення 2-річної виживаності хворих з ІІІА стадією після комбінованого лікування з використанням АІТ і збереження цієї тенденції при аналізі 5-річної виживаності свідчить про доцільність проведення імунотерапії і поза стаціонаром протягом тривалого періоду. Кращі результати виживаності хворих на рак легені при наявності метастазів у регіонарних ЛВ, що отримані нами при проведенні АІТ, можна пояснити існуванням локальної імунної реакції на пухлинні антигени, яку вдалося підсилити за допомогою адоптивного переносу сенсибілізованих in vivo та активованих in vitro лімфоцитів регіонарних ЛВ, що, на нашу думку, ініціювало розвиток в організмі хворого системної протипухлинної імунної відповіді.

Таким чином, біотерапія, що ініціює протипухлинні цитотоксичні механізми в процесі розпізнавання та елімінації пухлинних клітин, є методом, який підвищує ефективність хірургічного лікування хворих на рак легені. При цьому, покращання віддалених результатів хірургічного лікування хворих на рак легені в більшій мірі досягається проведенням АІТ із застосуванням генерованих in vitro цитотоксичних КЕ, ніж НАІ з введенням тимічних препаратів або -ІФН.

Індукція протипухлинної імунної відповіді організму за допомогою пухлиноспецифічного фактора переносу. Для розробки технології отримання препаратів пухлиноспецифічного ФП нами використаний оригінальний підхід, що грунтується на трансплантації пухлинної тканини в паренхіму селезінки інтактних щурів з подальшим виділенням НЕЛ з клітин її неураженої частини. Це дозволило всебічно оцінити характер впливу пухлинного процесу на властивості НЕЛ та регламентувати оптимальні умови для отримання препарату пухлиноспецифічного ФП.

Вивчення деяких фізико-хімічних властивостей НЕЛ за допомогою метода спектроскопії ППР дозволило з'ясувати, що у фізіологічних умовах до складу НЕЛ входять пептиди із залишками негативно заряджених амінокислот, які визначають їх високу гідрофільність. В динаміці пухлинного росту у складі НЕЛ відбувається збільшення залишків гідрофільних неполярних амінокислот і відповідно зростає адсорбція цих зразків. При генералізації пухлинного процесу в складі НЕЛ збільшується кількість складових Т-лімфоцитів. Ці результати знайшли підтвердження при вивченні складу НЕЛ за допомогою методу високоефективної рідинної хроматографії. Встановлено, що зміна хроматографічної картини НЕЛ реєструється з початком активного росту пухлини: виникають перехідні сполуки, які потім зникають, з'являються нові фракції виходу низькомолекулярних пептидів. Генералізація процесу призводить до появи у складі НЕЛ компонентів, які характерні для Т-лімфоцитів селезінки на початку росту в ній КГ.

З метою дослідження імуноспецифічної активності НЕЛ по відношенню до клітин КГ використовували ПАМ-тест. В першу чергу досліджували наявність такої активності у зразках НЕЛ, отриманих в різні строки росту КГ в селезінці. Встановлено, що зразки НЕЛ, отримані на 7-14-у добу росту КГ в селезінці, здатні переносити імунореактивність до її клітин in vitro антиген-залежним чином. Ці зразки НЕЛ також володіють виразною імунофармакологічною активністю, що є характерною ознакою ФП. Інкубація лімфоцитів тварин з пухлиною in vitro з НЕЛ, отриманими на різних етапах росту пухлини, призводить до генерації цитотоксичності проти автологічних пухлинних клітин (ЦІ при інкубації з НЕЛ-7 складає - (21,3+4,4)%, НЕЛ-14 - (16,6+3,2) %, НЕЛ-25 - (18,3+2,9) %, в контролі - (9,0+2,1) %, p<0,05), що слід розглядати як один з важливих механізмів дії ФП. НЕЛ інтактних тварин такою здатністю не володіє.

Натомість, перенос імунореактивності до антигенів пухлини інтактним щурам вдалося відтворити тільки за допомогою введення НЕЛ-7, що, на нашу думку, пов'язано з відсутністю в його складі супресорної активності, яка перешкоджає розвитку імунної відповіді. Визначення у зразках НЕЛ рівня ТСА та інгібітора ТСФ показало, що обидва види активності мають Т-клітинне походження і містяться у зразках НЕЛ інтактних тварин у співвідношенні 3 : 1, але в процесі пухлинного росту це співвідношення змінюється на користь інгібітора ТСФ. Як з'ясувалось, інгібітор ТСФ в НЕЛ-7 не визначається, а ТСА співвідноситься з такою в екстракті лімфоцитів селезінки інтактних тварин. Отже, в процесі росту КГ в селезінці щурів простежується чітка тенденція до зниження індукторної (тимозиноподібної) та підвищення супресорної активності. Ці дані, вперше отримані нами, дозволяють глибше зрозуміти механізм дії пухлиноспецифічного ФП та застосувати такий методичний підхід для визначення його біологічної активності, що важливо враховувати при стандартизації препаратів ФП.

Вивчення протипухлинної дії отриманих зразків НЕЛ показало, що тільки НЕЛ-7 володіє виразним протективним ефектом при його попередньому введенні реципієнтам пухлини, що обумовило запобігання розвитку КГ у 57,2% тварин або гальмування її росту. В даній експериментальній системі НЕЛ-Н і НЕЛ-25 протективним ефектом не володіли, навпаки, їхнє попереднє введення призводить до посилення росту КГ, що може свідчити про перенос слабкої імунної реакції на антигени КГ. НЕЛ-14 у ряді вивчених препаратів посідає проміжне положення, оскільки, з одного боку, його введення не впливає на кінетику росту КГ у експериментальних тварин, з іншого - трохи продовжує латентний період появи пухлин, запобігаючи розвитку останніх у 28,6 % випадків. Визначення цитотоксичної активності лімфоцитів у щурів з пухлиною на 14-у добу після трансплантації КГ показало, що попереднє введення НЕЛ-7 сприяє значному підвищенню ЦІ до (28,3+6,1) % і вірогідно (p<0,05) перевищує показники в контрольній групі (ЦІ - (5,0+1,2) %), а також у тварин, яким попередньо введено НЕЛ-14 (ЦІ - (13,9+3,6) %), НЕЛ-25 (ЦІ - (3,4+1,5) %) та НЕЛ-Н (ЦІ - (6,41+0,72) %). Зважаючи на те, що ефект одноразового введення НЕЛ-7 триває довгий час і супроводжується виразною протективною дією, можна припустити, що в цьому процесі важлива роль належить розвитку специфічних імунних механізмів з генерацією та підтримкою клону пухлиноспецифічних ЦТЛ. Таке припущення базується на тій обставині, що в застосованій експериментальній системі зразок НЕЛ-Н такою дією не володіє, хоча в інших умовах експерименту виявляє виражені ад'ювантні властивості.

При введенні різних зразків НЕЛ тваринам з підшкірною КГ встановлено, що тільки НЕЛ-14 вірогідно (p<0,05) збільшує СТЖ при порівнянні з контрольною групою (відповідно - (35,50+3,06) та (19,80+1,54) діб), а також при порівнянні з тваринами, яким вводили НЕЛ-7 (СТЖ - (23,88+2,13) діб) і НЕЛ-25 (СТЖ - (24,50+3,22) діб). Порівняльний аналіз показників ІР пухлин, проведений на основі розрахунку площі під кінетичними кривими росту КГ в умовах дії різних зразків НЕЛ, показав, що введення НЕЛ-14 дещо уповільнює (ІР складає - 0,77), а НЕЛ-25 стимулює (ІР складає - 1,22) її ріст. НЕЛ-7 суттєвого впливу не має (ІР складає - 0,92). Отже, отримані результати свідчать, що в умовах росту трансплантованої під шкіру пухлини більш ефективний вплив чинить НЕЛ-14, введення якого уповільнює ріст КГ та покращує виживаність тварин з пухлиною.

Отримані результати свідчать про те, що пухлинний процес призводить до втрати імуноспецифічного компонента ФП, який експресується в процесі формування протипухлинної імунної відповіді в зразках НЕЛ на ранніх стадіях пухлинного росту і зникає при генералізації процесу. Препарати НЕЛ, отримані в період, що передує активному росту пухлини на тлі загасання запальної реакції, володіють високою імуноспецифічністю, що асоціюється з виразною протективною дією. Це може бути пов'язано з відсутністю в їхньому складі супресорної активності при збереженні індукторної. Одноразове внутрішньовенне введення зразка НЕЛ-7 у дозі 1 пг на 1 г маси тварини ініціює за короткий час формування протипухлинної резистентності, тим самим, запобігаючи розвитку пухлини у реципієнтів. При наявній пухлині (об'єм до 1 см³) більш ефективним є НЕЛ-14, який при внутрішньовенному введенні у тій же дозі покращує виживаність тварин з пухлиною. На підставі цих даних, слід вважати, що властивостям пухлиноспецифічного ФП відповідають зразки НЕЛ, які отримані в період, що передує активному росту пухлини на тлі загасання запальної реакції і володіють високою імуноспецифічністю.

Вивчення механізмів дії неспецифічного (НЕЛ-Н) та пухлиноспецифічного (НЕЛ-7) ФП було проведено на моделі внутрішньоорганного росту КГ в печінці щурів. Встановлено, що введення досліджуваних препаратів ФП суттєво пригнічує ріст КГ в печінці щурів (інгібіція росту для НЕЛ-Н складає - 70,9 %, для НЕЛ-7 - 78,3 %). Проте, при застосуванні неспецифічного ФП в 50 % випадків спостерігаються чисельні імплантаційні пухлинні вузли по вісцеральній очеревині, тоді як введення пухлиноспецифічного ФП попереджає розвиток останніх, що, на нашу думку, є проявом його специфічної дії. На це вказують результати дослідження активності протипухлинних КЕ. Введення пухлиноспецифічного ФП супроводжується суттєвим підвищенням цитотоксичної активності лімфоцитів (ЦІ складає - (72,0+11,4) % проти (23,5+6,7) % в контролі і (25,5+7,6) % при введенні неспецифічного ФП, p<0,05) і метаболічної активності МФПЕ (індекс стимуляції складає - 1,34+0,13 проти 0,73+0,17 в контролі і 0,86+0,17 при введенні неспецифічного ФП, p<0,05).

Отже, проведений комплекс досліджень дозволив визначити властивості НЕЛ, що обумовлені стадією пухлинного процесу, і на цій основі оптимізувати технологію отримання стандартизованого препарату пухлиноспецифічного ФП. Застосування пухлиноспецифічного ФП в біотерапії тварин з пухлиною продемонструвало його терапевтичну ефективність. Введення препарату на ранній стадії росту КГ в печінці щурів індукує розвиток протипухлинних імунних реакцій, результатом чого є пригнічення росту КГ в печінці і гальмування розповсюдження імплантаційних вузлів по очеревині, що вказує на системний характер розвитку імунної відповіді. Неспецифічний ФП володіє ад'ювантною дією; на відміну від пухлиноспецифічного ФП, його ефект триває недовго і стосується стимуляції переважно факторів неспецифічної резистентності.

Таким чином, підвищити протипухлинну резистентність організму в алогенній системі можливо на основі адоптивного переносу протипухлинних імунних реакцій за допомогою ФП з визначеною активністю, що є обгрунтуванням для розробки принципово нового підходу до біотерапії хворих на злоякісні новоутворення.

ВИСНОВКИ

В дисертації на основі теоретичного обгрунтування та експериментальних і клінічних досліджень науково вирішена актуальна проблема сучасної онкології - підвищення ефективності лікування хворих на злоякісні новоутворення шляхом розробки нових та удосконалення вже існуючих (застосування тимічних препаратів, б-інтерферону, низькомолекулярних екстрактів лімфоцитів, фактора переносу) ад'ювантних методів біотерапії. Розроблені принципи комбінованої біотерапії з використанням тимічних препаратів, б-інтерферону та автологічних лімфоцитів з генерованою in vitro цитотоксичною активністю.

На оригінальних моделях внутрішньоорганного росту карциноми Герена (КГ) в селезінці і печінці щурів доведено, що інвазія пухлини в лімфоїдну тканину збільшує вірогідність розвитку продуктивної імунної відповіді і, навпаки, ріст пухлини в паренхімі печінки асоціюється з розвитком стійкої анергії Т-лімфоцитів.

Експериментальними і клінічними дослідженнями доведено, що ріст пухлин незалежно від їх локалізації супроводжується пригніченням ендокринної функції тимуса, порушенням рециркуляції лімфоцитів, анергією Т-лімфоцитів, зниженням функціональної активності макрофагів. Відновлення ендокринної функції тимуса сприяє репопуляції в органах імуногенезу, покращує протипухлинну реакцію макрофагів, лімфоцитів периферичної крові, лімфатичних вузлів (ЛВ) і селезінки, визначає ефективність продукції Т-лімфоцитами ендогенних факторів з імуномодулюючою активністю.

Встановлено, що екзогенні - і -інтерферони індукують продукцію Т-лімфоцитами біологічно активних низькомолекулярних факторів, які позитивно впливають на формування та рівень протипухлинної відповіді лімфоцитів і макрофагів; розроблено методику одержання цих факторів та показано, що їх введення на 37,5 % гальмує ріст пухлини та вірогідно (p<0,05) подовжує тривалість життя щурів з КГ, а також справляє антиметастатичний вплив у мишей з карциномою Льюїс (зменшує частоту метастазування на 30 %; середню кількість метастазів - в 2,1 рази, p<0,05; їх загальний об'єм - в 3,4 рази, p<0,05), що вказує на перспективність їх клінічного застосування.

Визначено, що після сумісного застосування б-інтерферону і тимічних препаратів вірогідно підвищується продукція Т-лімфоцитами ендогенних факторів, які посилюють протипухлинну активність лімфоцитів і макрофагів; це обґрунтовує доцільність введення препаратів рекомбінантного б2b-інтерферону (в дозі 1х10⁶ МО з інтервалом 48-72 год) на тлі відновлення ендокринної функції тимуса.

Розроблено технологію генерації в керованій системі in vitro активованих лімфоїдних клітин (АЛК) з регіонарних ЛВ хворих на злоякісні новоутворення шляхом стимуляції лімфоцитів автологічними пухлинними клітинами в присутності рекомбінантного ІЛ-2 (100 Од/мл), яка дозволяє при низькій початковій концентрації клітин (2,0х10⁵ кл/мл) одержувати на кінцевому етапі культивування достатню для імунотерапії кількість АЛК (до 10⁹) з високою цитотоксичною активністю.

Розроблено технологію отримання пухлиноспецифічного фактора переносу (ФП) з лімфоцитів селезінки за умов росту модельної пухлини (КГ) в цьому органі. Встановлено, що за допомогою ФП можна ініціювати у алогенного реципієнта розвиток продуктивної імунної відповіді на ріст гомологічної пухлини та досягти протипухлинного ефекту, що виражається в зменшенні частоти підшкірного прищеплення КГ (на 42,9 %), гальмуванні росту пухлин (підшкірних - на 64,1 %, в печінці - на 78,3 %) та розповсюдження імплантаційних вузлів по очеревині. Це обгрунтовує перспективність впровадження імунотерапії з використанням пухлиноспецифічного ФП в клініці.

Встановлено, що тривале введення тимостимуліну при комбінованому лікуванні спричиняє більш виражений імуномодулюючий вплив на імунну систему хворих на рак шлунка з поширенням на стравохід, збільшуючи 5-річну виживаність до 54,6 % (в контрольній групі - 34,1 %, p>0,05), ніж у хворих на рак стравоходу, результати комбінованого лікування яких погіршились (5-річна виживаність знизилась до 12 % проти 25 % в контрольній групі, p>0,05).