Біохімічна регуляція апоптозу в умовах пухлинного процесу в нирках

Размещено на http://www.allbest.ru/

ЛУГАНСЬКИЙ ДЕРЖАВНИЙ МЕДИЧНИЙ

УНІВЕРСИТЕТ

УДК: 577.113.083:616.61-006

Біохімічна регуляція апоптозу в умовах пухлинного процесу у нирках

14.01.32 - медична біохімія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

ФІЛЬЧУКОВ Денис Олександрович

Луганськ - 2007



Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Луганському державному медичному університеті Міністерства охорони здоров'я України

Науковий керівник доктор медичних наук, професор Комаревцева Ірина Олександрівна, Луганський державний медичний університет, завідувачка кафедри медичної хімії

Офіційні опоненти: доктор медичних наук, професор Кульчицький Олег Костянтинович, Інститут геронтології АМН України, завідувач лабораторії регуляції метаболізму

доктор медичних наук, професор Казакова Світлана Євгенівна, завідувачка кафедри психіатрії і наркології ЛДМУ.

Захист відбудеться “22” _листопада__ 2007 року о _12⁰⁰ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 29.600.03 в ЛДМУ за адресою: 91045, м. Луганськ, кв. 50-років об. Луганська, 1г.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці ЛДМУ (м. Луганськ, кв. 50-років об. Луганська, 1.).

Автореферат розісланий “_19__” __жовтня____________2007 року.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради І.А. Вишницька



АНОТАЦІЯ

Фільчуков Д.О. Біохімічна регуляція апоптозу в умовах пухлинного процесу в нирках . - Рукопис. нирка рак апоптоз біохімічний

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 14.01.32 - медична біохімія. - Луганський державний медичний університет, 2007 р.

Дисертація присвячена вивченню біохімічної регуляції апоптозу в процесі онтогенезу на рівні сигнальних шляхів регуляції клітинних процесів - нейроендокринного, сфінгомієлинового, гліцерофосфоліпідного та оксиду азоту. Як показало наше дослідження, ДНК-фрагментація і клітинна проліферація у пухлинних тканинах у хворих на рак нирок вірогідно відрізнялися між стадіями пухлинного процесу: від Т1 до Т4. ДНК-фрагментація найбільш виражена у хворих початковими стадіями пухлинного процесу і знижувалася по мірі прогресування пухлини. Активність клітинної проліферації, навпроти, зі стадією пухлинного процесу зростає. При цьому виявлене вірогідне підвищення вмісту рівня сфінгозину в нирковій тканині в залежності від стадії раку нирки, а також підвищення рівня стабільних метаболітів оксиду азоту при всіх стадіях раку нирки, тобто ці сигнальні шляхи були задіяні в регуляції апоптозу в умовах онкогенезу нирок. Доведено, що ендогенні простаноїди відіграють роль тканинного фактора позаклітинного оточення пухлинних клітин, що створює сигнальний шлях дезадаптації процесів проліферації й апоптозу в пухлинних клітках, сприяючи їх росту і прогресуванню. Встановлено, що рівень досліджених класів простаноїдів при пухлинному ураженні з метастазуванням у 2 рази вище, ніж при раку нирки без метастазування. У пухлинній тканині вміст простаноідів за якісном складом був однаковим у хворих на рак нирок з метастазами і без метастазів: ТхВ₂ > ПГ_2б > ПГЕ₂ > ПГI₂.

У хворих на рак нирок розвивається гіперренінемічний гіпоальдостеронізм, що вказує на патогенетичну роль ренін-альдостеронової системи в розвитку і прогресуванні онкопроцесу.

Ріст клітинної проліферації і зниження швидкості апоптозу в пухлинній тканині супроводжується зниженням енкефалинергичної активності зі стадією раку нирки. Концентрація АКТГ, АДГ і пролактину в плазмі крові в хворих на рак нирки, навпроти, підвищена.

Ключові слова: нирка, рак, апоптоз, фрагментація ДНК, оксид азоту, простагландіни, опіоіди, регуляція.



АННОТАЦИЯ

Фильчуков Д.А. Биохимическая регуляция апоптоза в условиях опухолевого процесса в почках. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук по специальности 14.01.32 - медицинская биохимия. - Луганський государственний медицинский университет, 2007 г.

Диссертация посвящена изучению биохимической регуляции апоптоза в процессе онкогенеза на уровне сигнальных путей регуляции клеточных процессов - нейроэндокринного, сфингомиелинового, глицерофосфолипидного и оксида азота. В процессе работы было обследовано 54 больных опухолями почек. Во всех группах фотометрическими методами проводились исследования уровня фрагментации ДНК в почечной ткани, определялся уровень клеточной пролиферации (МТТ-метод), а также содержание свободного сфингозина в почечной ткани, биосинтез оксида азота в ткани почки по содержанию его стабильных метаболитов (NO₂^- + NO₃^-). Количественное содержание гормонов, простагландинов определяли методом радиоиммунологического анализа. Как показало наше исследование, ДНК-фрагментация и клеточная пролиферация в опухолевидный тканях у больных раком почек достоверно отличались между стадиями опухолевого процесса: от Т1 к Т4. ДНК-фрагментация наиболее выражена у больных начальными стадиями опухолевого процесса и снижалась по мере прогрессирования опухоли. Активность клеточной пролиферации, напротив, со стадией опухолевого процесса растет. При этом обнаружено достоверное повышение содержания уровня свободного сфингозина в почечной ткани в зависимости от стадии рака почки, а также повышение уровня стабильных метаболитов оксида азота при всех стадиях рака почки, т.е. эти сигнальные пути были задействованы в регуляции апоптоза в условиях онкогенеза почек. Показано, что эндогенные простаноиды играют роль тканевого фактора внеклеточного окружения опухолевых клеток, что создает сигнальный путь дезадаптации процессов пролиферации и апоптоза в опухолевых клетках, содействуя их росту и прогрессированию. Было установлено, что уровень исследованных простаноидов при опухолевом поражении с метастазированием в 2 раза выше, чем при раке почек без метастазирования. В опухолевой ткани качественное содержание простаноидов было одинаковым у больных раком почки с метастазами и без: ТхВ₂ > ПГ_2б > ПГЕ₂ > ПГI₂. У больных раком почек развивается гиперренинемический гипоальдостеронизм, что указывает на патогенетическую роль ренин-альдостероновой системы в развитии и прогрессировании онкопроцесса.

Рост клеточной пролиферации и снижение скорости апоптоза в опухолевидный ткани сопровождается снижением енкефалинергической активности со стадией рака почки. Концентрация АКТГ, АДГ и пролактина в плазме крови у больных раком почки, напротив, повышена.

Ключевые слова: почка, рак, апоптоз, фрагментация ДНК, оксид азота, простагландины, опиоиды, регуляция.



SUMMARY

Filchukov D.А. Biochemical regulation of apoptosis in conditions of kidney cancer. - Manuscript.

The dissertation on competition of a scientific degree of the candidate of medical sciences at a speciality 14.01.32 - medical chemistry. - Lugansk state medical university, 2007 y.

The dissertation is devoted to studying of a biochemical regulation of apoptosis in a process of oncogenesis at a level of alarm ways of regulation of cellular processes - neuroendocrinal, sphingomyelinal, glycerophospholipidum and nitric oxide. As our research has shown, the DNA - fragmentation and a cellular proliferation in tumorous tissues at patients with a kidney cancer authentically have differed between stages of tumoral process: from Т1 to Т4. The DNA - fragmentation is most expressed at patients with incipient stages of tumoral process and dropped on a measure of progressing of a tumour. Activity of a cellular proliferation grows with a stage of tumoral process. Thus there is the authentic rising of the contents of a level of sphingosine in a renal tissue in dependence of a stage of a kidney cancer, and also the rising of a level of stable metabolites of nitric oxide at all stages of a kidney cancer, i.e. these alarm ways have been involved in a regulation of apoptosis in conditions of kidney oncogenesis. It is shown, that endogenous prostanoid play a role of the histic factor of an exocellular environment timorous cells that frames an alarm way of a disadaptation of processes of a proliferation and apoptosis in tumor cells, promoting their growth and progressing. At a kidney cancer the leading part in oncogenesis plays ТхВ2. At patients with a kidney cancer the hyperreninemia hypoaldosteronism is developed, that specifies a pathogenetic role of a renin - aldosteronum system in development and progressing of oncoprocess. The growth of a cellular proliferation and dropping of speed of apoptosis in tumorous tissues is accompanied by dropping of encefalinergic activity with a stage of kidney cancer. The concentration of ACTH, ADH and of prolactin in a blood plasma at patients with a kidney cancer is increased.

Key words: kidney, cancer, apoptosis, DNA-fragmentation, nitric oxide, prostaglandins, opioids, regulation.



ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Ключовим моментом у розвитку пухлини є втрата кліткою чутливості до апоптозу (Plotkin J.B., Nowak M.A., 2002). Феномен апоптозу є результатом дії різних факторів, що призводять до загибелі клітини. Оскільки апоптоз фізіологічне явище, то в організмі повинні бути фактори, що приводять, як до апоптозу клітини, так і до його активації чи пригнічення (Sartorius U., et al., 2001; Park S.Y., et al., 2002).

На даний момент відомо, що апоптоз може викликатися як внутрішньоклітинними сигналами, так і зовнішніми, які реалізують свою дію через рецепторні системи, що самі по собі не є токсичними чи деструктивними. У цілому, якщо мова йде про фізіологічні фактори, то варто застосовувати термін регуляція апоптозу клітини, оскільки відома група фізіологічних активаторів і інгібіторів апоптозу. Фізіологічні регулятори апоптозу клітини викликають підвищений інтерес дослідників (Levin A., et al., 2001; Xaus J., et al., 2001).

Оксид азоту - сама маленька з відкритих сигнальних молекул. З одного боку, вона бере участь у метаболізмі фосфоліпідів, а з іншої, є індуктором апоптозу. При цьому темою для обговорення продовжує залишатися питання, які ефекти викликає NO, цитотоксичний чи цитопротекторний. Також залишаються суперечливими дані про ефект сфінгозину - метаболіту сфінгомієлінового сигнального шляху - на процеси проліферації, диференціювання та апоптозу (James A. 1996; Dressler K.A. 1992).

Швидкість апоптозу регулюється складною ієрархічною системою позаклітинних і внутрішньоклітинних факторів життєздатності і летальності клітини (McCarthy N., et al., 2001; Deveraux Q.L., et al., 2001). В існуючих сьогодні уявленнях майже цілком відсутні сходинки між рецепцією сигналу й ініціюючими механізмами загибелі клітини. Зовсім не вивчене питання про центральні механізми гормональної регуляції (зокрема, ролі ендогенних опіоідів) апоптозу на рівні цілісного організму, тим більше в онкогенезі. Так само становить інтерес участь ендогенних простаноїдів у регуляції апоптозу, проліферації та метастазуванні за умов розвитку пухлинного процесу в нирках.

Таким чином, вивчення нами механізмів регуляції апоптозу при пухлинному процесі нирок і вплив на них опіоідів вноситиме вклад у поглиблення розуміння згаданих вище актуальних проблем сучасної біохімії.

Мета і задачі дослідження. Встановити в нирковій тканині вміст метаболітів низки сигнальних шляхів апоптозу - системи оксиду азоту, сфінгомієлинового, гліцероліпідного та нейроендокринний стан за умов пухлинного процесу у нирці.

Для досягнення поставленої мети були вирішені наступні задачі:

1. Вивчити рівень клітинної проліферації (МТТ-метод), ДНК-фрагментації та генетичних маркерів апоптозу (р53, bcl-2) в хворих на пухлинні захворювання нирок.

2. Визначити вміст оксиду азоту за його стабільними метаболітами у нирковій тканині в хворих з пухлинним процесом.

3. Визначити вміст вільного сфінгозину у нирковій тканині в хворих з пухлинним процесом.

4. Дослідити інтенсивність протікання гліцероліпідного шляху регуляції клітинної проліферації - за рівнем циклооксігеназних метаболітів арахідонового каскаду - простаноїдів (простагландин Е₂, F₂, простациклін, тромбоксан) у хворих на пухлини нирок.

5. Дослідити рівень нейрогормонального фону (метіонін-енкефалин, АКТГ, ренін-альдостеронова система) у розвитку пухлинних захворювань нирок.

Об'єкт дослідження - нирки, сеча, плазма крові хворих з пухлинними захворюваннями нирок.

Предмет дослідження - стан внутрішньониркових гормонанальних систем та опіоідів у сигнальних механізмах апоптозу при онкогенезі.

Наукова новизна отриманих результатів. Уперше вивчена роль сфінгомієлинового шляху регуляції клітинного циклу й апоптозу в механізмах канцерогенезу. Дослідження двох альтернативних шляхів регуляції життєздатності клітини (проліферації та апоптозу) - гліцероліпідного і сфінгомієлинового при пухлинному процесі дало можливість встановити патогенетичну роль взаємин цих метаболічних шляхів під час онкогенезу. Вивчення сигнальної молекули оксиду азоту в модуляції апоптозу при пухлинах, вказало шляхи регуляції швидкості апоптозу в нормі та канцерогенезі. Вперше була встановлена роль оксиду азоту в ДНК-фрагментації клітин при пухлинному рості.

Вперше вивчено вміст простаноідів у пухлинній тканині в хворих на рак нирок з метастазами і без метастазів. Вивчення нейрогормональної регуляції внутрішньониркових метаболічних систем ( гліцероліпідної та сфінгомієлинової ) і оксиду азоту при пухлинах нирок дозволило встановити вертикальні ієрархічні взаємозв'язки модуляції апоптозу і канцерогенезу.

Практична значимість роботи. Виявлені показники рівня фрагментації ДНК, вмісту вільного сфінгозину, стабільних метаболітів оксиду азоту, показників біосинтезу простаноїдів з ендогенних попередників у нирковій тканині в зв'язку з показниками гормонального фону у здорових людей можуть служити нормативними показниками, що можуть бути використані для подальших досліджень при різних експериментальних моделях патології нирки.

Вивчення біохімічних механізмів апоптозу за умов пухлинного росту дозволяє розраховувати на можливість терапевтичного втручання у розвиток даного процесу.

Індукція апоптозу може використовуватися, як протипухлинна терапія. Отримані дані про вміст індукторів апоптозу - оксиду азоту і сфінгозину - дозволяє розглядати їх у якості потенційних фармакологічних протипухлинних агентів чи у якості патогенетичної мішені для таких.

Вивчення ранньої біохімічної стадії апоптозу за рівнем сфінгозину, ДНК-фрагментації дозволить розробити скринінг-метод детекції рівня апоптозу при різноманітній патології нирок.

Особистий внесок здобувача. У процесі виконання дисертації автор особисто відібрав і критично проаналізував усі сучасні літературні дані щодо теми проведеного наукового дослідження і запропонував його мету. Експериментальні дослідження проводилися самостійно. Опис отриманих результатів, висновки, пропозиції з практичного застосування результатів дослідження належать автору роботи.

Апробація результатів дисертації. Матеріали результатів дисертації були повідомлені й апробовані на ХVІ з'їзді Українського фізіологічного товариства (м. Вінниця, 2002 р.); на ІХ Конгресі СФУЛТ (м. Луганськ, 2002 р.); на VIII з'їзді Українського біохімічного товариства (м. Чернівці, 2002 р.); на 58 науково-практичній конференції (м. Київ, 2003); на кафедральному засіданні працівників кафедри медичної хімії і науково-дослідницького центру Луганського державного медичного університету; на ІХ з'їзді Українського біохімічного товариства (м. Харків, 2006 р.).

Публікації. За результатами дисертаційної роботи опубліковано 8 наукових праць. 4 статті - у фахових виданнях, (2 - без співавторів), і 4 тези - у матеріалах чотирьох наукових конференцій.

Структура й обсяг дисертації. Дисертація викладена на 138 сторінках машинописного тексту і складається з вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів дослідження, 3 глав власних досліджень, заключного обговорення результатів, висновків. Список використаних джерел включає 309 найменувань, з них 29 - українською та російською мовами і 280 іншими мовами. Робота ілюстрована 8 таблицями, 10 діаграмами.



ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали і методи дослідження. Було обстежено 54 хворих на пухлини нирок.

Згідно класифікації TNM, хворі злоякісними новоутвореннями нирок мали такі стадії пухлинного процесу: T₁N₀M₀ - 1 (1,9%); T₂N₀M₀ - 13 (25%); T₂N_xM₀ - 4 (7,8%); T₃N₀M₀ - 15 (28,8%); T₃N₂M₁ - 1 (1,9%); T₃N₃M₀ - 1 (1,9%); T₃N_xM₀ - 6 (11,6%); T_3AN_xM₀ - 1 (1,9%); T₄N₀M₀ - 1 (1,9%); T₄N₁M₀ - 1 (1,9%); T₄N₂M₀ - 1 (1,9%); T₄N_xM₀ - 4 (7,8%); T₄N₀M₁ - 2 ( 3,8% ); T₄N_xM₁ - 1 ( 1,9% ). У 2 хворих - встановлені доброякісні фіброми нирок.

Хворі усіх клінічних груп знаходились на обстеженні в урологічному відділенні Луганської обласної клінічної лікарні та урологічному відділенні Луганського обласного онкологічного диспансеру. Контрольну групу (62 особи) - склали здорові донори на дієті з нормальним вмістом натрію (80-120 ммоль/добу) віком 18-55 років. Під час обстеження була проведена поглиблена біохімічно-інструментальна діагностика з додаванням запропонованих нами радіоімунологічних методів.

У кожній групі методом фотометрії вивчалися відсотки фрагментації ДНК у тканині нирки для оцінки активності апоптозу (Messmer U.K. 1996) та рівень клітинної проліферації (МТТ-метод), а також вміст вільного сфінгозину в нирковій тканині (Прохорова М.И. 1982), вміст оксиду азоту в тканині нирки за його стабільними метаболітами ( NO₂^- + NO₃^- ) (Орлова Е.А. 2001).

Кількісний вміст гормонів, простогландинів визначали методом радіоімунного аналізу за допомогою наборів реактивів для визначення АКТГ, пролактину, АРП фірми "CIS Biointernational" (Франція), альдостерону фірми "Sorin Biomedica" (Італія), АДГ фірми "Buhlmann Laboratories AG" (Щвейцарія), мет-енкефаліну фірми "Instar Corporation" (США), тромбоксану В₂, 6-кето-ПГ_1альфа (стійкого метаболіту простаціклину) і ПГ_2альфа фірми "Institute of isotopes" (Угорщина), ПГЕ₂ фірми "Advanced Magnetics Inc." (Англія). Підрахунок радіоактивності здійснювався на рідинних сцінтиляціоних лічильниках “Бета-1” і “Гамма-1”. Біосинтез простаноїдів у нирковій тканині перераховували на 1 мг білка, обрахованого за (Лоури 1951).

Крім того, проводилося кількісне визначення генетичних маркерів апоптозу p53, bcl-2 імуноферментним методом за допомогою наборів фірми “Amersham” (Англія).

Статистична обробка результатів досліджень Результати всіх клініко-лабораторних досліджень опрацьовані методами варіаційної статистики, (Стентон Гланц 1999). за допомогою комп'ютерної програми Microsoft Exel з розрахунком середніх величин, їх похибки, критерієм достовірності різниці. Для оцінки імовірності отриманих результатів був використаний критерій Стьюдента. Результати розцінювалися як достовірні при р<0,05.

Результати дослідження і їх обговорення. У нашому дослідженні за морфологічним типом пухлини розподілилися наступним чином: нирково-клітинний рак нирок - 45 (72,6%) хворих, аденома нирки - 2 (3,2%) хворих, перехідно клітинний рак ниркової лоханки - 3 (4,9%) хворих, аденокарцинома - 2 (3,2%) хворих, фіброма - 2 (3,2%) хворих. У групі хворих на нирково-клітинний рак цитологічно світло клітинна форма була виявлена у 31 хворого (68,8%); зернисто клітинна - у 9 (20%); саркомоподібна - у 2 (4,5%); змішано-клітинна - у 2 хворих (4,5%).

Чітка клітинна межа була встановлена у 28 випадках (53,8%), а нечітка - в 24 випадках (46,2%). Ступінь диференціювання пухлини: висока - у 29 хворих (55,7%); помірна - у 16 (30,8%); низька - у 7 (13,5%) хворих.

Одним з найбільш характерних біохімічних критеріїв оцінки активності процесів апоптозу в тканині є показник фрагментації виділеної ДНК (Walker P.R. 1994). Проведені нами дослідження показали, ДНК-фрагментація була найбільш виражена в хворих початковими стадіями пухлинного процесу і знижувалася по мірі прогресування пухлини: T₁N₀M₀ - 56,2 %; T₂N₀M₀ - 32,5± 4,8 %; T₂Nx₀ - 30,1± 7,4 %; T₃N₀M₀ - 20, 3±6,4 %; T₃N₂M₁ - 18,8 %; T₃N₃M₀ - 17,7 %; T₃Nx₀ - 16,4±8,4 %; T_3ANx0 - 15,9 %; T₄N₀M₀ - 6,3 %; T₄N₁M₀ - 5,8 %; T₄N₂M₀ - 4,7 %; T₄Nx₀ - 4,8±1,3 %; T₄N₀M₁ - 3,6 %; T₄Nx₁ - 1,8 %.

Активність клітинної проліферації, навпроти, зі стадією пухлинного процесу зростала: T₁N₀M₀ - 0,8 %; T₂N₀M₀ - 7,4±1,9 %; T₂Nx₀ - 8,3±1,6%; T₃N₀M₀ - 15,6±2,7%; T₃N₂M₁ - 17,2 %; T₃N₃M₀ - 16,6 %; T₃Nx₀ - 16,3±4,1 %; T_3ANx0 - 17,0 %; T₄N₀M₀ - 20,2 %; T₄N₁M₀ - 20,6 %; T₄N₂M₀ - 21,4 %; T₄Nx₀ - 21,5±4,3 %; T₄N₀M₁ - 22,1 %; T₄Nx₁ - 22,4 %.

ДНК-фрагментація і клітинна проліферація в пухлинних тканинах достовірно відрізнялися між стадіями пухлинного процесу: від Т₁ до Т₄. Метастазування в лімфатичні вузли чи віддалені метастази не впливає на активність процесів проліферації й апоптозу в первинній пухлині (Tannapfel A., et al., 1997). ДНК-фрагментація в тканині нирок дітей з пухлиною Вильмса (стадія захворювання - T₂N₀M₀ ) була 66,8±7,4 %, тоді як у дорослих хворих з аналогічною стадією захворювання ДНК-фрагментація відзначалася майже в 2 рази менша - 32,5±4,8 %. Рівень клітинної проліферації в пухлинних тканинах у хворих дітей також був значно вище (21,3±3,8 %), чим у дорослих (7,4±1,9 %). Очевидно, це зв'язано з ісходно високим рівнем процесів проліферації і програмованої клітинної загибелі у дітей.

Співвідношення ДНК-фрагментації до клітинної проліферації по стадіях пухлинного процесу склало: T₁N₀M₀ - 56; T₂N₀M₀ - 4,6; T₂Nx₀ - 3,75; T₃N₀M₀ - 1,3; T₃N₂M₁ - 1,06; T₃N₃M₀ - 1,06; T₃Nx₀ - 1,0; T_3AN_x0 - 0,88; T₄N₀M₀ - 0,3; T₄N₁M₀ - 0,25; T₄N₂M₀ - 0,19; T₄Nx₀ - 0,19; T₄N₀M₁ - 0,14; T₄Nx₁ - 0,09.

Відзначимо, що в початкових стадіях пухлини нирки процес апоптозу переважає над клітинною проліферацією, що вказує на активацію механізмів клітинної загибелі, спрямовану на боротьбу зі злоякісними клітинами (Mangili F., et al., 1997; Zhang X.H., Takenaka I., 1997). По мірі прогресування стадії раку нирки співвідношення апоптозу і клітинної проліферації зрівнюється і складає 1 у хворих з Т₃ стадією. Далі виявляється зниження швидкості апоптозу на фоні активації клітинної проліферації. Таким чином, наші дані вказують на дисрегуляцію апоптозу у хворих на пухлини нирок. Блокування процесу апоптозу, яке пов'язане з постійною дією промоторів пухлинного росту, приводить до зниження здатності трансформованих клітин активувати програму клітинної загибелі, що визначає прогресію пухлинного захворювання (Todd D., et al., 1996).

Найбільш аргументованою на наш час є концепція онкогенів, яка стверджує, що виникнення клітин із специфічно зміненим генотипом відбувається як результат індукованих канцерогенами мутацій. Важливим аргументом, що свідчить про провідну дію мутацій у перетворенні нормальної клітини у пухлинну, служать дані про те що зміна лише одного нуклеотиду у протоонкогенах може викликати їх функціонування як онкогенів та наступне злоякісне перетворення клітин. Реплікація яка містить активований протоонкоген ДНК, що відбувається під час мітозу, є необхідним етапом ініціювання канцерогенезу.

У нашому дослідженні в хворих на рак нирок кількість р53-позитивних пухлин знижувалося зі стадією захворювання: T₁N₀M₀-76%; T₂N₀M₀ - 52%; T₃N₀M₀ - 20%; T₄N₀M₀ - 2%, а кількість р53-негативних пухлин відповідно зростала зі стадією захворювання: T₁N₀M₀-24%; T₂N₀M₀ - 48%; T₃N₀M₀ - 80%; T₄N₀M₀ - 98%.

У фізіологічних умовах посилена експресія bcl-2 захищає клітини від загибелі, спричинену р53, тоді як за умов онкогенезу цей генетичний механізм життєздатності клітин сприяє ліквідації контролю над апоптозом у пухлинних клітинах (Cote R.J., Chatterjee S.J., 1999).

Природна при цьому динаміка експресії bcl-2 у хворих на рак нирки, що корелює з експресією р53. Зі стадією онкопроцесу спостерігалася гіперекспресія bcl-2: T₁N₀M₀-28%; T₂N₀M₀ - 42%; T₃N₀M₀ - 58%; T₄N₀M₀ - 70% у порівнянні з контрольною групою - 18%. Кількість bcl-2-негативних пухлин знижувалося: T₁N₀M₀-72%; T₂N₀M₀ - 58%; T₃N₀M₀ - 42%; T₄N₀M₀ - 30% (контроль - 82%).

Отримані нами дані показують, що вміст вільного сфінгозину є підвищеним у порівнянні з контролем на всіх стадіях раку нирки. Однак на стадіях T₁N₀M₀ - T₂N₀M₀ концентрація сфінгозину знаходиться в діапазоні мітогенних концентрацій, що не суперечить даним (Futerman A., 1998) про вміст вільних сфінгоідних основ. На інших стадіях концентрація сфінгозину була значно підвищена.

Програмована клітинна смерть розвивається за специфічною програмою, у якій продукти сфінгомієлинового циклу - церамід і сфінгозин - відіграють важливу роль. Як вторинні посередники, вони забезпечують трансдукцію різних зовнішніх сигналів у клітину, і вони, водночас, діють як міжклітинні медіатори (Kim Y.M., et al., 1998). Показано, що кінцевий метаболіт сфінгозину, сфінгозин-1-фосфат запобігає розвитку апоптозу, виникаючого на тлі підвищеного вмісту цераміду, індукованого TNF-a, антитілами к Fas, сфінгомієлиназою чи аналогами церамідів, проникаючими в клітину (Zhang H., et al., 1990). Крім того, інгібування РКС, як і інгібування сфінгозинкінази діметілсфінгозином, індукує апоптоз, що може бути переборений додаванням сфінгозин-1-фосфату (Zhang H., et al., 1990).З огляду на отримані нами дані можна припустити, що важливою ціллю РКС за умов пригнічення апоптозу є активація сфінгозинкінази, що приводить до збільшення рівня сфінгозин-1-фосфату у клітині.

Нами були проведені дослідження широкого спектру простаноїдів не тільки в добовій сечі, але й вперше, у пункційному вмісті пухлин нирок, отриманому під контролем ультразвуку ("Toshiba", Японія) під місцевим знеболюванням. Визначення процентного вмісту окремих простаноїдів у добовій сечі від їхньої загальної суми, прийнятої за 100%, показало, що основним продуктом окислювання поліненасичених жирних кислот у нирці людини є простациклін ПГI₂ > ТхВ₂ > ПГ_2б > ПГЕ₂ . Добова екскреція тромбоксану із сечею в хворих на пухлини нирок з метастазуванням і без не відрізнялася від контрольної групи.

Екскреція ПГ_2б зростала тільки при пухлинах нирок без метастазування і не відрізнялася від вихідних цифр здорових донорів у хворих на пухлини нирок з метастазуванням. А от рівні ПГЕ₂ і проcтацикліну різко знижувалися в хворих на пухлини нирок без метастазування і тим більше з метастазуванням, що, природно, позначалося на співвідношенні ПГЕ₂ / ПГ_2б і ПГI₂ / ТхВ₂ , а саме, приводило до їхнього зменшення. Співвідношення екскреції всіх класів простаноїдів із сечею в хворих на пухлини нирок без метастазів було дзеркальним у порівнянні з контрольною групою: ТхВ₂ > ПГI₂ > ПГ_2б > ПГЕ₂. На перше місце по екскреції простаноідів у хворих з метастазами був також тромбоксан В₂, а друге місце простациклін поступив синергисту тромбоксану В₂ за механізму дії - ПГ_2б: ТхВ₂ > ПГ_2б > ПГI₂ > ПГЕ₂.

У пухлинній тканині вміст простаноідів за якісном складом був однаковим у хворих на рак нирок з метастазами і без метастазів: ТхВ₂ > ПГ_2б > ПГЕ₂ > ПГI₂. У порівнянні з екскрецією рівень простацикліну в пухлинній тканині був найменшим, якщо порівняти з іншими простаноідами. При порівнянні вмісту простаноїдів у пухлинному вмісті раку нирки без метастазування і з метастазуванням виявилося, що рівень усіх досліджуваних класів простаноїдів у перерахуванні на 1 мг тканини при пухлинному ураженні з метастазуванням значно вище, ніж при раку нирки без метастузування (у середньому в 2-3 рази).

Як показали наші дослідження, продукція ПГЕ₂ і ПГI₂ нирками знижується (і досить значно) у хворих на пухлини нирок з метастазуванням на тлі незміненої екскреції з сечею ТхВ₂ і збільшеної ПГ_2б . Таке зниження вмісту ПГЕ₂ і ПГI₂ у добовій сечі, дійсно, може бути пов'язане з активацією метаболізму, що погоджується з експериментальними даними про ріст активності НАД-залежної I5-OH-дегідрогенази в цитозольнії фракції кори нирки на моделі обструкції сечоводу, а також з активацією 9-кето-редуктази, яка катаболізує ПГЕ₂ у ПГ_2б, що відповідає отриманим даним.

Таким чином, ендогенні простаноїди відіграють роль тканинного фактора позаклітинного оточення пухлинних клітин, що у поєднанні з цитокіновою ланкою (Nussdorfer G.G., Mazzocchi G., 1998) створює сигнальний шлях дезадаптації процесів проліферації й апоптозу (Zhang X., Takenaka I., 2000) у пухлинних клітинах, сприяючи їхньому зростанню та прогресуванню. При раку нирок провідну роль в онкогенезі відіграє ТхВ₂.

Як показали наші дослідження, активність реніну плазми (АРП) плавно зростала в хворих на рак нирки зі стадією онкологічного процесу. Так, у хворих зі стадією T₄N₀M₀, АРП була вище контрольної групи в 2,5 рази.

З огляду на реципрокні відносини ренін-ангіотензинової системи й альдостеронової, логічно було очікувати синхронного зростання з АРП рівня альдостерону у плазмі. Однак у хворих на рак нирки рівень плазмового альдостерону виявився зовсім протилежним показникам альдостерону при захворюваннях нирок не пухлинного генезу: його концентрація в плазмі крові знижувалася зі стадією онкопроцесу.

Підвищення АРП при полікістозі і раку нирки можна було б пояснити ішемією ниркової тканини об'ємними процесами, що мають місце в обох випадках.

Але, з іншого боку, полікістоз і рак нирки - два захворювання з різними швидкостями апоптозу. При полікістозі швидкість апоптозу - максимальна, у порівнянні з іншими захворюваннями нирок, а рак нирки - характеризується прогресуючим зниженням апоптозу зі стадією пухлинного росту (Zhang X., Takenaka I., 2000). І незважаючи на те, що і при полікістозі, і при пухлинах нирок ми спостерігали гіперренінізм, але ступінь його прояву в хворих на рак нирки, у порівнянні з полікістозом, була в 2 рази меншою.

Інакше кажучи, із прогресуванням пухлини розвивається гіперренінемічний гіпоальдостеронізм. Ряд авторів, пояснюють гіперренінемічний гіпоальдостеронізм, який ми спостерігали у хворих на пухлини нирок, дією паранеопластичної гіперкальціемії (Sowers J.R., Barrett J.D., 1982). Інші ж дослідники, пов'язують даний синдром із пригнічувальною дією деяких цитокинів на ренін-альдостеронову систему (Hermus A.R., Sweep C.G., 1990).

З іншого боку, відомо, що пухлинні клітини нирок мають рецептори до альдостерону, який може блокувати цитолітичну дію TNF-альфа. Також відомо, що активність ангіотензін перетворюючого ферменту регулюється оксидом азоту.

У наших дослідженнях зростання клітинної проліферації і зниження швидкості апоптозу в пухлинній тканині супроводжувалося зниженням енкефалінергічної активності зі стадією раку нирки. Але його рівень був значно вище ніж у здорових осіб. Залежно від стадії раку нирки він знижувався хоча й не доходив до рівня контрольної групи. Можливо припустити, що такі зміни залежать від активності ангіотензін перетворюючого ферменту, який бере участь у процесінгу та інактивації енкефалінів. Секреція та фізіологічна роль ендогенних опіоідів тісно пов'язана з іншими гіпоталамо-гіпофізарними гормонами. Концентрація АКТГ і пролактину в плазмі крові у хворих усіх нозологічних груп була підвищеною. Це може бути пов'язане з тим, що оверекспресія гена пухлинної супресії bcl-2 викликає специфічну експресію, як АКТГ, так і проопіомеланокортину - попередника більшості пептидних гіпофізарних гормонів, у тому числі й ендогенних опіоідів (Untegasser G., et al., 1999; Stattin P., et al., 2001). Енкефаліни, як і всі регуляторні пептиди, мають широкий спектр біологічної дії. Виконуючи в організмі функції нейромодуляторів, нейромедіаторів і гормонів (Tirelli А., et al., 2001), энкефаліни впливають на багато які системи організму, включаючи нейромедіаторну (Amandusson А., Blomqvist А., 2001), нейроендокринну, імунореактивну, на емоційний і психічний стан організму, характеризуються високою знеболюючою активністю, а також антистресорною дією (Roques B.P., 2000).

Така різноманітність біологічних властивостей енкефалинів дозволяє розглядати їх як ендогенні регулювальники багатьох фізіологічних і патологічних процесів в організмі. Однак механізми прояву такого роду поліфункціональності регуляторних пептидів та особливості їх дії при різних фізіологічних і патологічних станах організму досі залишаються предметом дискусії.

Енкефаліни, як і інші ендогенні опіоіди, відносяться до центральної регуляторної системи. Однак, останнім часом, з'являється все більше даних про їх паракринний рівень регуляції і навіть цитокіноподібний (Plotnikoff N.P., et al., 1997). Встановлені механізми пострецепторної дії ендорфінів і енкефалінів на клітину через простаноїди, внутрішньоклітинні системи посередників: цАМФ (Комаревцева И.О., 1998), інозітол-3-фосфат (Goswami R., et al., 2000). Є дані про взаємозв'язок ендогенних опіоідів з цитокінами на рівні експресії їх синтезу; про прямий вплив енкефалінов на ДНК-фрагментацію і на інші ланки апоптозу клітини (Dermitzaki Е., et al., 2000). Метіонин-енкефалін - називають ендогенним опіоідним фактором росту, який є тоничним інгибитором клітинной проліферації в онтотенезі, онкогенезі, ангіогенезі (Bisignani G.J., et al., 1999). У наших дослідженнях ріст клітинної проліферації та зниження швидкості апоптозу в пухлинній тканині супроводжувався зниженням енкефалінергічної активності зі стадією раку нирки (таб. 2, рис. 8). Як відомо, (Комаревцева И.О., 2001), мет-енкелалін стимулює апоптоз, впливаючи беспосередньо на внутришньонуклеосомальну ДНК-фрагментацію. Саме з цим механізмом пов'язують цитолітичну дію мет-енкефаліну (Mernenko O.A., et al., 1996) та відому його антиметастатичну активність (Scholar E.M., et al., 1987). Таким чином, стає зрозумілим, чому зниження секреції мет-енкелаліну у хворих на рак нирки сприяє метастазуванню та прогресуванню захворювання.

Також стає ясним паралелізм що просліджується у зміні гормонального фону пептидних гормонів (АКТГ, пролактину, мет-енкефаліну) у хворих на рак нирки і зміною рівня bcl-2-позитивних і bcl-2 - негативних пухлин в обстежених нами хворих.

Ще однією ілюстрацією цієї гіпотези служать дані за рівнем антидіуретичного гормону в плазмі крові в хворих раком нирки. А саме, плазмена концентрація АДГ у всіх хворих клінічних груп, що спостерігаються, на порядок відрізнялася від показників контрольної групи. Це природньо, тому що нирка - фізіологічний орган-мішень для антидіуретичного гормону (Zhuo J.L., 2000). АДГ стимулює проліферацію (Ghosh P.M., et al., 2001) і інгібує апоптоз у гломерулярних мезангіальних клітинах через V₁ - рецептори (Higashiyama M., et al., 2001), активуючи епідермальний фактор росту (Ghosh P.M., et al., 2001) і утягуючи Ras мітоген-активуючу протеінкіназу, фосфоінозитол-3-фосфатний і цАМФ-залежний сигнальні шляхи (Yamaguchi T., et al., 2000).



ВИСНОВКИ

У дисертаційній роботі наведене теоретичне узагальнення та нове вирішення наукової задачі - встановлення ролі дезінтеграції центральних і паракринно-молекулярних механізмів регуляції рівня апоптозу у патогенезі розвитку раку нирок.

ДНК-фрагментація і клітинна проліферація в пухлинних тканинах у хворих на рак нирок достовірно відрізнялися між стадіями пухлинного процесу: від Т1 до Т4. ДНК-фрагментація найбільш виражена у хворих початковими стадіями пухлинного процесу і знижувалася по мірі прогресування пухлини. Активність клітинної проліферації, навпроти, зі стадією пухлинного процесу зростає.

Виявлено підвищення рівня оксиду азоту незалежне від стадії раку нирки в сполученні зі зниженням ДНК-фрагментації та зростанням активності клітинної проліферації, із супутнім зменшенням кількості р53 позитивних пухлин і ростом bcl2 позитивних свідчить про його протекторну дію в пухлинних клітинах.

При пухлинному процесі нирок виявлене достовірне зростання вмісту рівня вільного сфінгозину в пухлинній тканині в залежності від стадії раку нирки.

Встановлено, що рівень досліджених класів простаноїдів при пухлинному ураженні з метастазуванням у 2 рази вище, ніж при раку нирки без метастазування. У пухлинній тканині вміст простаноідів за якісном складом був однаковим у хворих на рак нирок з метастазами і без метастазів: ТхВ₂ > ПГ_2б > ПГЕ₂ > ПГI₂.

У хворих на рак нирок розвивається гіперренінемічний гіпоальдостеронізм, що вказує на патогенетичну роль ренін-альдостеронової системи в розвитку і прогресуванні онкопроцесу.

Зростання клітинної проліферації і зниження швидкості апоптозу в пухлинній тканині супроводжується зниженням енкефалінергічної активності зі стадією раку нирки. Концентрація АКТГ, АДГ і пролактину в плазмі крові в хворих на рак нирки, навпроти, підвищена.



СПИСОК РОБІТ ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

Комаревцева И.А., Фильчуков Д.А., Благодаренко Е.А., Головченко Н.Н., Харченко В.В. Апоптоз и патоморфоз опухолей почек // Лікарська справа. - 2001. - т.1059, № 4.- С.115-118.

Комаревцева І. О., Фільчуков Д.О. , Холіна О.А., Комаревцева К.В., Гризунова Г.К. Апоптоз і онкогенез нирок, сечового міхура і простати // Мат. IХ конг-ресу.СФУЛТ.- 2002.- С.271.

Комаревцев В.Н.. Комаревцева И.А., Орлова Е.А., Благодаренко Е.А., Фильчуков Д.А., Головченко Н.Н. Биохимические механизмы апоптоза при заболеваниях почек // Український медичний альманах.- 2001.-Т.4 -№ 5.-С.188-193

Комаревцева И.А., Фильчуков Д.А., Холина Е.А. Триггерные механизмы апоптоза в онкогенезе // Мат.VIII зїзду Укр. біохімічного товариства.- 2002.- С.100.

Фильчуков Д.А. Глицеролипидный метаболический каскад у больных раком почки // Український журнал екстремальної медицини ім.. Г.О. Можаєва- 2003. -№ 5. -С.72-75.

Фільчуков Д.О. Оксид азоту та рівень апоптозу при злоякісних пухлинах нирок // Тези 58 науково-практичної конференції.- 2003.-С.92.

Фільчуков Д.О. О роли сфингозина в передаче сигнала апоптоза при опухолевом процессе в почках.// Український медичний альманах.- 2004.-Т.7 -№ 2. (Додаток)- С.25-27.

Комаревцева І. О., Фільчуков Д.О. Біохімічна регуляція апоптозу в умовах пухлинного процесу в нирках// Мат. IХ зїзду Укр. біохімічного товариства.- 2006, Т. 2 - С.10.

Размещено на Allbest.ru