Характеристика локального імунітету як критерій прогнозу та імунореабілітації хворих

Размещено на http://allbest.ru

МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ'Я УКРАЇНИ

НАЦІОНАЛЬНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук

14.03.08 - імунологія та алергологія

ХАРАКТЕРИСТИКА ЛОКАЛЬНОГО ІМУНІТЕТУ ЯК КРИТЕРІЙ ПРОГНОЗУ ТА ІМУНОРЕАБІЛІТАЦІЇ ХВОРИХ

ВИКОНАВ БЕРЕЖНИЙ КИРИЛО МИХАЙЛОВИЧ

Київ - 2007

АНОТАЦІЯ

Бережний К.М. Характеристика локального імунітету як критерій прогнозу та імунореабілітації хворих. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 14.03.08. - імунологія і алергологія. - Національний медичний університет імені О.О. Богомольця МОЗ України, Київ, 2007.

Дисертація присвячена вивченню локального імунітету хворих на перитоніт, а також системної імунологічної відповіді з метою визначення критеріїв прогнозування післяопераційного перебігу та обґрунтування доцільності включення локальної імунотерапії в комплексне лікування хворих з цією патологією.

На підставі одержаних даних встановлено, що при різних формах післяопераційного перебігу - серозно-фібринозний та гнійно-фібринозний перитоніт наступають достовірні зміни локальної імунологічної відповіді. Зокрема, при гнійно-фібринозному перитоніті в порівнянні з серозно-фібринозним збільшується кількість нейтрофілів при зниженні кількості макрофагів, підвищується експресія антигенів HLA-DR, збільшується кількість CD3⁺Т-лімфоцитів і знижується фагоцитарна активність. Вказані зміни локального імунітету відображають клінічні особливості післяопераційного перебігу перитоніту.

Зміни системного імунітету при гнійно-фібринозному перитоніті проявляються в зниженні кількості CD3⁺Т-лімфоцитів, CD19⁺ -лімфоцитів, збільшенні відсотку клітин, що експресують HLA-DR і зниженні фагоцитарної активності нейтрофілів в порівнянні з серозно-фібринозним.

Порівнянльна оцінка результатів вивчення локальної і системної імунологічної відповіді показала, що зміни локальної імунологічної відповіді наступають в більш ранні строки і виражені в більшому ступені.

Вперше була проведена локальна імунотерапія поліоксидонієм хворих з гнійно-фібринозним перитонітом за спеціально розробленою схемою. Локальна імунотерапія поліоксидонієм поліпшує клінічний перебіг і модулює імунологічну відповідь.

імунітет операція черевний перитоніт

1. ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. В загальному переліку ускладнень після операції на органах черевної порожнини перитоніт продовжує займати одне з перших місць і летальність від нього навіть у високорозвинених країнах досягає 38%, а при абдомінальному сепсисі - 80% (Гостищев В.К. и др.,2002; Стасенко А.А. та інш., 2005; Parker S. et al., 2001; Костюченко К.В., 2005). Відсоток післяопераційних ускладнень продовжує рости, що особливо виражено у осіб похилого віку (Иванов С.В., 1999).

Збільшення частоти тяжких ускладнень інфекційного генезу після операції на органах черевної порожнини, зокрема перитоніту, багато в чому обумовлено рядом об'єктивних обставин, серед яких в першу чергу слід відмітити такі.

1. Формування резистентності різних мікроорганізмів до дії різноманітних бактеріальних препаратів, що, перш за все, відноситься до бактерій групи ентерококів, серед яких найбільш частим етіологічним фактором розвитку перитоніту залишаються бактерії E. соli (May A. et al., 2000).

2. Збільшення кількості різних абдомінальних інфекцій (холецистити, гепатити, пієлонефрити та інші), які передують операції, що дозволяє розглядати хворих з такими інфекціями як групу ризику розвитку післяопераційних ускладнень, в тому числі і перитоніту (Blot S. et al., 2005). Останнє пояснюється тим, що, як відомо, різноманітні хронічні інфекції незалежно від їх локалізації сприяють імуносупресії. В результаті, імуносупресія не тільки виключає можливість оптимальної відповіді на інфекцію, але й сприяє розвитку резистентності багатьох штамів мікроорганізмів, зокрема E. сoli, з наступним розвитком спонтанних перитонітів (Cereto F. et al., 2003).

3. Передопераційний стрес, анестезія і наступне призначення лікарських препаратів, багато з яких (особливо антибіотики) можуть чинити виражену імуносупресивну дію (Tomassini N. et al., 2003; Wichmann M. et al., 2005; Moriyama M. et al., 2006; Chachkhiani I. et al., 2005).

4. В розвитку імуносупресії вельми істотною є і роль різних екологічних факторів, що в першу чергу відноситься до радіації та забруднення атмосфери різними токсичними речовинами, які впливають на різні системи організму, включаючи імунологічну (Гриневич Ю.А., 2006; Schwarz T., 2005).

5. Збільшення частоти розвитку алергічних захворювань, в першу чергу множинної медикаментозної алергії, що в багатьох випадках виключає можливість призначення антибактеріальних препаратів (D'Amato J. et al., 2005; Чучалин А.Г. и др., 2004; De Weck A. et al., 2005).

Приведені дані свідчать про те, що існує багато факторів, які негативно впливають на систему імунітету і створюють сприятливі умови як для виникнення, так і прогресії інфекційного процесу. Тому сьогодні стало очевидним, що в загальну стратегію лікування різноманітних післяопераційних ускладнень, в тому числі і перитоніту, доцільно включати і імунореабілітацію, маючи на увазі, що розвиток ускладнень багато в чому залежить від характеру взаємодії між патогеном і імунологічними механізмами захисту (Лебедев В.В., Покровский В.И., 2005; Chong A. et al., 2005; Підгірний Я.М., 2005; Козлов В.К., 2004; Fukatsu K. et al., 2006; Манько В.М. и др., 2002).

Відомо, що система імунітету функціонує як єдине ціле, проте локальні зміни нерідко мають вирішальне значення для перебігу патологічних процесів. Тому не випадково на сьогодні поряд з вивченням системної імунологічної відповіді все збільшується інтерес до вивчення місцевого імунітету, поняття про який сформулював А.М. Безредко ще в першій половині минулого століття.

Існує певна кількість даних про те, що зміни локального імунітету випереджають системні, наступають раніше і є більш достовірними (Стасенко А.А. та інш., 2005; Wu F. et al., 2003; Riese J. et al., 2004). Але не дивлячись на це, при вивченні імунологічних змін при перитоніті в переважній кількості випадків увага зосереджується на системному імунітеті. Аналогічна ситуація спостерігається і при проведенні імунотерапії, яка, як правило, здійснюється шляхом системного застосування імуномодуляторів.

Недолік уявленнь про закономірності змін локальної імунологічної відповіді при перитоніті у людей знайшов своє відображення і на частоті застосування локальної імунотерапії при даній патології. Це робить зрозумілим, чому на сьогодні накопичено певний досвід імунотерапії при перитоніті переважно системного застосування (Гринев М.В. и др., 2004; Винницкий Л.И. и др., 2004). Поряд з цим актуальність розробки підходів до локальної імунотерапії при перитоніті підтверджується значною кількістю експериментальних досліджень, метою яких є пошук ефективних методів локальної імунотерапії ( Hurt R. et al., 2006; Rectenwald J. et al., 2002).

Як відомо загальний принцип обґрунтованого призначення імунотерапії - володіння інформацією про вихідний стан імунологічних змін та механізмів дії імуномодуляторів в повній мірі відноситься і до локального імунітету (Манько В.М. и др., 2002; Дранник Г.Н., 2006). Як зазначалось вище, зміни локальної імунологічної відповіді при перитоніті можуть передувати ситемним. Виходячи з цього результати вивчення локального імунітету можуть бути критеріями тактики лікування перитоніту з включенням імуномодуляторів вже на ранніх етапах розвитку процесу. Поряд з цим нечисельність даних про стан локального імунітету при перитоніті у хворих перешкоджає можливості вибору об'єктивних критеріїв як для призначення локальної імунотерапії, так і прогнозування перебігу перитоніту. У відповідності з приведеними вище міркуваннями завданнями цієї роботи було порівняльне вивчення локальної і системної імунологічної відповіді при різному перебігу перитоніту з метою визначення критеріїв прогнозування і призначення імунотерапії.

Мета і задачі дослідження. Вивчити особливості змін локального і системного імунітету при перитоніті з урахуванням особливостей післяопераційного перебігу і з'ясувати значення цих змін для його патогенетичних особливостей, прогнозування і обґрунтування доцільності локальної імунотерапії в комплексній реабілітації хворих на перитоніт.

Відповідно до мети роботи були поставлені слідуючі завдання:

1) вивчити стан місцевого імунітету хворих після операцій на черевній порожнині і виявити найбільш характерні імунологічні зміни в динаміці з урахуванням особливостей клінічного перебігу;

2) дослідити характер системних імунологічних змін після операції на органах черевної порожнини з урахуванням особливостей клінічного перебігу;

3) дати порівняльну оцінку змін локальної і системної імунологічної відповіді хворих після операції на органах черевної порожнини;

4) на підставі вивчення стану місцевого імунітету визначити критерії доцільності призначення локальної імунотерапії.

Об'єкт досліджень: клітини перитоніального ексудату, периферичної крові та сироватка хворих на перитоніт.

Предмет дослідженнь: показники особливостей змін локального та системного імунітету хворих на перитоніт.

Методи досліджень: клініко-лабораторні, імунологічні, цитологічні, мікробіологічні, статистичні.

Наукова новизна одержаних даних. Вперше з використанням сучасних методів імунологічних досліджень проведено паралельне вивчення локальних і системних імунологічних змін у хворих, що прооперовані на органах черевної порожнини. Вперше встановлено, що вже в день операції наступають зміни локального імунітету, які відображають характер подальшого перебігу процесу: при розвитку гнійно-фібринозного перитоніту найбільш характерним є достовірне збільшення кількості нейтрофілів, зменшення кількості макрофагів та зменшення кількості CD3⁺Т-лімфоцитів, виражене підвищення відсотку клітин, що експресують антигени HLA-DR перитоніального ексудату і зниження поглинальної активності фагоцитуючих клітин. Вперше показано, що вказані показники відображають особливості клінічного післяопераційного перебігу і тому вони можуть бути, як свідчать дані дисертації, критеріями прогнозу і призначення імуномодуляторів При дослідженні клітин периферичної крові при гнійно-фібринозному перитоніті в більшості випадків спостерігається підвищення відсотку клітин, що експресуют антигени HLA-DR (вказане підвищення значно менш виражене в порівнянні з цим показником при дослідженні перитоніального ексудату), зниження фагоцитарної активності, але достовірні зміни вказаних показників наступають лише через 24 - 48 годин після операції. Вперше при порівняльному вивченні місцевих і системних імунологічних змін показано, що місцеві зміни у хворих з гнійно-фібринозним перитонітом наступають раніше, носять закономірний характер, відображають особливості клінічного перебігу і мають прогностичне значення. На підставі одержаних даних вперше хворим з тяжким перебігом перитоніту розроблена схема, за якою проведена локальна імунотерапія імуномодулятором нового покоління.

Практичне значення одержаних результатів. Результати проведених досліджень дозволили визначити критерії прогнозу перебігу перитоніту і обгрунтувати доцільність імунотерапії в комплексному лікуванні хворих з перитонітом. Відповідно розроблена схема проведення локальної імунотерапії з використанням поліоксидонію, головною мішенню дії якого є клітини фагоцитуючої системи. Дані можуть бути використані при лікаванні хворих, прооперованих на органах черевної порожнини з різних причин. Результати роботи доцільно використовувати при викладанні курсу загальної імунології.

2. ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи дослідження. Предмет дослідження - клітини перитоніального ексудату і периферичної крові, а також сироватка, які були одержані від 94 хворих з гострою хірургічною патологією, прооперованих з приводу гострого апендициту (24 хворих), перфорації виразки шлунку та дванадцятипалої кишки (30 хворих), гострого холециститу та іншої гострої хірургічної патології (40 хворих). При вивченні системної імунологічної відповіді в якості контролю досліджувались також клітини і сироватка периферичної крові практично здорових осіб (22 донори). Загальна кількість обстежених - 116 осіб. Хворі були прооперовані в Київській міській клінічній лікарні швидкої медичної допомоги, що є клінічною базою кафедри хірургії стоматологічного факультету Національного медичного університету ім. О.О. Богомольця. Всі обстежені хворі в залежності від характеру перебігу післяопераційного періоду були розподілені на дві групи. Перша (56 хворих) - зі сприятливим післяопераційним перебігом, у яких розвивався місцевий серозний або серозно-фібринозний перитоніт. Друга (38 хворих) - з гнійно-фібринозним перитонітом.

Клітини перитоніального ексудату (КПЕ) отримували в динаміці (під час операції та через 24 - 72 години після операції). Шприцем (20 мл) в день операції з черевної порожнини і через 24 - 72 після операції з дренажа одержували ексудат. У випадках відсутності відтоку ексудату з дренажа в дренажну трубку вводили стерильний фізіологічний розчин в об'ємі 20,0-50,0 мл і через 5 хв одержували суміш з КПЕ. Одержані клітини відмивали забуференим фізіологічним розчином (ЗФР), який додавали до ексудату у відношенні 1:1 та центрифугували в звичайних центрифужних пробірках в центрифузі з горизонтальним ротором при 1000 об/хв двічі по 15 хв. Після чого підраховували кількість життєздатних КПЕ в камері Горяєва з 0,1% розчином трипанового синього по загальноприйнятій методиці. Для подальшої роботи використовували концентрацію клітин не менше 2,0-4,0х10⁶ клітин в 1 мл ЗФР. Одержану суспензію КПЕ використовували для виготовлення цитологічних препаратів, фіксували метанолом, фарбували за Романовським-Гімза і підраховували відсоток перитоніальних макрофагів, нейтрофілів, лімфоцитів та інших клітин.

Популяційцний та субпопуляційний склад лімфоцитів перитоніального ексудату і периферичної крові, а також експресію активаційних маркерів з використанням моноклональних антитіл визначали за допомогою методу непрямої імунофлюоресценції. Досліджувались лімфоцити з маркерами CD3, CD4, CD8, CD16, CD19, рецептор ІЛ-2 (CD25), адгезивні молекули (CD54), антигени ІІ класу ГКГ (HLA-DR) та рівень внутрішньоядерного маркера проліферації. Використовувались моноклональні антитіла, виготовлені в Інституті експериментальної патології, онкології та радіобіології ім. Р.Є. Кавецького (м. Київ) та в Інституті експериментальної імунотерапії Російського онкологічного центру (м. Москва).

На попередньо знежирені скельця поміщали смужки Раrafilm М (American Can Company, USA) з 8-12 отворами діаметром 5 мм. Після прикріплення Раrafilm М до лунок вносили по 10 мкл розчину poly-L-lisine (100 мкг/мл у ЗФР, м.м.40-80 кД, Sigma, USA) та інкубували при 37°С протягом 40-60 хв. (процедура проводилась у вологій камері). На відмиті у ЗФР скельця наносили суспензію клітин у концентрації 2-4х10⁶ млн/мл. Після 20 хвилинної інкубації при 37°С, препарати переносили до холодильника (4°С), де проводили інкубацію ще протягом 20 хв. Скельця промивали у склянці з ЗФР, після чого наносили по 10 мкл МКАТ, проводили інкубацію при 4°С протягом 30 хв і знову промивали у 2-х склянках з ЗФР. Наступний етап - 30-хвилинна інкубація при 4°С з FІТС-кон'югованими антитілами кролів до імуноглобулінів мишей (Sigma, USA). З промитих та висушених скелець знімали Раrafilm М, наносили суміш гліцерину і параформальдегіду у співвідношенні 1:1. Препарати накривали покровними скельцями, краї запаювали парафіном. При ідентифікації внутрішньоклітинного антигену проліферуючих клітин (для проникнення МКАТ до ядер клітин) клітини фіксували протягом 5 хв 3,7% розчином параформальдегіду (Sigma, USA), а потім обробляли клітини 0,2% розчином тритону X-100 (Sigma, USA) також на протязі 5 хв. Далі дослідження проводили як і у випадку виявлення поверхневих антигенів.

Облік результатів проводили використовуючи імерсійну флуоресцентну систему мікроскопу ЛЮМАМ-1 об.90, ок.5 з системою освітлення, яка забезпечує світло з довжиною хвилі 495 нм, при якому спостерігається максимальна флуоресценція мітки в місцях зв'язування антигена з антитілом. В кожному препараті вели підрахунок не менше 200 клітин. Процент досліджуваних клітин, які зв'язали МКАТ, вираховували виходячи з розрахунку, що загальна кількість підрахованих клітин складає 100%, а число клітин з флуоресцентною міткою складає процент, який визначався.

Проліферативну активність лімфоцитів вивчали на підставі їх здатності трансформуватися в бласти. Для стимуляції лімфоцитів використовували мітоген фітогемаглютинін (Difco, USA) в дозі 8 мкг/мл. В пробірки з 2 мл стерильного середовища RPMI з доданими антибіотиками та 15% ембріональної телячої сироватки добавляли 3 краплі цільної крові і мітоген, інкубували в термостаті 37⁰С протягом 3-х діб; паралельно вивчали рівень спонтанної трансформації (контроль). Після інкубації в термостаті культуральне середовище обережно видаляли і в пробірки додавали по 3 мл 10% оцтової кислоти, ретельно перемішували і центрифугували 10 хв при 1000 об/хв. Після центрифугування надосадкова рідина видалялась, клітинний осад використовували для приготування препаратів, які фіксували та фарбували за Романовським-Гімза. Під мікроскопом визначали відсоток бластних форм лімфоцитів.

Фагоцитарна активність нейтрофілів була вивчена на підставі визначення відсотку фагоцитуючих клітин та мікробного числа (поглинальна здібність) за методом Г. Фримель (1987). Об'єкт фагоцитозу - добова вбита культура Staphylococcus aureus штам 209; культура отримана з музею кафедри мікробіології Національного медичного університету ім. О.О. Богомольця. Для обліку підраховували відсоток фагоцитуючих клітин (фагоцитарна активність) і кількість поглинутих мікробів клітиною (поглинальна здібність) - мікробне число.

Метаболічну активність нейтрофілів периферичної крові та фагоцитуючих клітин перитоніального ексудату вивчали за рівнем відновлення нітросинього тетразолію. З цією метою використовували 0,15% розчин нітросинього тетразолію (Reanal, USA) з подальшим обліком відсотку клітин, що включають гранули формазану та середнього цитохімічного коефіцієнту щільності цих гранул (Фримель Г., 1987).

Рівень сироваткових імуноглобулінів IgM, IgG, IgA визначали загальноприйнятим методом радіальної імунодифузії в агаровому гелі за Манчіні в сироватці периферичної крові.

Мікробіологічні дослідження перитоніального ексудату хворих з гнійно-фібринозним перитонітом були проведені на кафедрі мікробіології Національного медичного університету ім. О.О. Богомольця (завідувач - академік НАНУ, д.мед.н., професор В.П. Широбоков).

Статистична обробка результатів проводилась з використанням методів варіаційної статистики на персональному комп'ютері за допомогою програми Microsoft “EXCEL”. Обчислення основних статистичних показників проводили за безпосередніми кількісними даними, отриманими в результаті досліджень (середнє арифметичне значення - М; стандартна похибка середнього арифметичного - m). Для оцінки достовірності відмінностей виборок вдавались до параметричного методу за критерієм Ст'юдента. Вірогідними вважали відмінності, в яких імовірність статистичної похибки - р<0,01 та р<0,001.

Робота була розпочата з вивчення кількісного складу клітин перитоніального ексудату (макрофаги, нейтрофіли, лімфоцити) та їх функціональної активності в динаміці (в день операції та через 24 - 72 години після). Аналіз результатів базувався на порівнянні даних, одержаних при обстеженні хворих першої та другої груп, а також при порівнянні даних в межах однієї групи. Післяопераційний перебіг у хворих першої групи характеризувався відсутністю або незначною вираженістю інтоксикації, субфебрильною температурою, порушенням перистальтики та незначним больовим синдромом; у більшості випадків перитоніт у хворих цієї групи мав обмежений характер. Післяопераційний період у хворих другої групи на відміну від хворих першої характеризувався вираженою інтоксикацією, різким больовим синдромом, нерідко високою температурою, вираженим порушенням перистальтики; гнійно-запальний процес в черевній порожнині хворих цієї групи в переважній більшості мав розповсюджений характер.

Вивчення кількісного складу клітин перитоніального ексудату в день операції у хворих з різними формами перитоніту у більшості випадків виявило достовірні відмінності при порівнянні хворих першої і другої груп, що, в першу чергу, проявилось в вираженій відмінності кількості нейтрофілів і макрофагів уже в цей період дослідження. Так, кількість макрофагів у хворих першої групи (серозно-фібринозний перитоніт) була достовірно вищою в порівнянні з другою групою (гнійно-фібринозний перитоніт) - 48,631,5 і 32,571,65, відповідно, а у хворих другої групи відношення кількості нейтрофілів і макрофагів носило зворотній характер, так як кількість нейтрофілів була достовірно вищою (47,551,87) в порівнянні з хворими першої групи (29,911,83). Загальна кількість клітин перитоніального ексудату у хворих першої групи була достовірно вищою ніж у хворих другої групи і в динаміці достовірно зменшувалась у хворих обох груп.

Дослідження в динаміці показало, що кількість макрофагів у хворих першої групи продовжувала збільшуватись і надалі була достовірно вищою в порівнянні з кількістю макрофагів в перитоніальному ексудаті хворих другої групи (55,261,7 та 40,281,92, відповідно). В цей же період у хворих з гнійно-фібринозним перитонітом кількість нейтрофілів залишалась достовірно вищою в порівнні з хворими першої групи (39,502,96 та 22,052,64, відповідно). Через 24 - 72 години після операції у хворих з серозно-фібринозним перитонітом виявлена деяка тенденція до збільшення кількості макрофагів, в той час як у хворих з гнійно-фібринозним перитонітом зміни не були виразними. Таким чином, на підставі результатів цієї частини досліджень можна констатувати, що зміни кількості нейтрофілів і макрофагів перитоніального ексудату мали достовірні відмінності у хворих окремих груп та протилежну спрямованість. Наведені дані ілюструють рисунки 1 та 2.

Даючи загальну оцінку результатам визначення кількості нейтрофілів і макрофагів в перитоніальному ексудаті хворих з різним післяопераційним перебігом перитоніту потрібно відмітити наступне. По-перше, кількісні співвідношення вказаних популяцій клітин відображають подальший післяопераційний перебіг, проявляються вже в день операції і зберігаються в наступні терміни обстеження. По-друге, вірогідність виявлених змін і їх кореляція з особливостями клінічного перебігу дають підстави розглядати ці зміни як прогностичні.

Поряд з вказаними вище загальними характеристиками нейтрофілів, макрофагів та лімфоцитів, був також досліджений популяційний та субпопуляційний склад лімфоцитів за допомогою використання моноклональних антитіл проти різних антигенів: CD3, CD4, CD8, CD16, CD19. Результати показали, що вже в день операції у хворих другої групи достовірно збільшувалась кількість клітин, що експресують CD3 (56,501,88). При дослідженні через 24 - 72 години кількість CD3⁺Т-лімфоцитів у хворих другої групи мала тенденцію до подальшого підвищення, але збільшення не було достовірним. При дослідженні в день операції суттєвих змін в кількості В-лімфоцитів (CD19) відмічено не було. Але при подальших дослідженнях відмічено достовірне зниження CD19⁺В-лімфоцитів у хворих першої групи в порівнянні з хворими другої групи - 13,850,78 і 19,301,8 відповідно. В кількості СD4⁺Т-лімфоцитів у хворих першої групи в динаміці не спостерігалось змін, в той час як у хворих другої групи при дослідженні через 48 - 72 години їх кількість достовірно збільшувалась порівняно з першою групою, а також в динаміці: у хворих першої групи - в динаміці 26,82±2,96 та 23,50±1,04 , а у хворих другої групи - 31,20±2,40 та 40,25±1,40, відповідно. Суттєвих змін в кількості CD8⁺Т-лімфоцитів та CD16⁺природних кілерів у всіх обстежених хворих не спостерігалось.

Вивчення функціональної активності клітин перитоніального ексудату базувалось на дослідженні експресії рецептора ІЛ-2 (CD25) - маркера ранньої активації, експресії внутрішньоклітинної адгезивної молекули CD54 та антигенів ІІ класу ГКГ - HLA-DR. Поряд з цим вивчався також рівень експресії внутрішньоклітинного антигену проліферації за допомогою моноклональних антитіл ІПО-38; характерною особливістю цього антигену є його експресія на всіх етапах проліферації клітин. Функціональна активність фагоцитуючих клітин досліджувалась за допомогою інтенсивності фагоцитозу та результатів НСТ-тесту.

Одержані результати свідчать про те, що вже в день операції у хворих другої групи (гнійно-фібринозний перитоніт) відмічено достовірне збільшення відсотку клітин, що експресують антигени HLA-DR в порівнянні з хворими першої групи (40,301,8 та 25,62,48 відповідно). Таке підвищення відсотку клітин, що експресують антигени HLA-DR, у хворих з тяжким перебігом перитоніту може бути обумовлене реакцією антигенпрезентуючих клітин, в першу чергу макрофагів і моноцитів, на масивне надходження антигенів, зокрема тих бактерій, що обумовили перитоніт. При дослідженні в динаміці у хворих з гнійно-фібринозним перитонітом спостерігалось достовірне зниження відсотку клітин, що експресують антигени HLA-DR.

У хворих другої групи в день операції спостерігалась тенденція до підвищення експресії CD25, а в подальшому (через 24 - 72 години) у хворих другої групи відмічено достовірне підвищення в порівнянні з першою групою. Вивчення експресії адгезивної молекули СD54 показало, що відсоток клітин, які експресують цю молекулу достовірно підвищувався тільки через 24 - 72 години у хворих другої групи в порівнянні з хворими першої групи: 33,75±2,32 та 18,92±1,52, відповідно.

Вивчення внутрішньоклітинного маркера проліферації, який визначається за допомогою моноклональних антитіл ІПО-38, показало, що тільки у хворих з серозно-фібринозним перитонітом мало місце незначне зниження цього показника лише в динаміці (таблиця 1).

При вивченні функціональної активності фагоцитуючих клітин встановлено, що в день операції відсоток таких клітин був достатньо високим і продовжував підвищуватись при подальшому дослідженні. В порівнянні з відсотком фагоцитуючих клітин другої групи в день операції він був 77,01,38 і 66,11,53, а в подальшому - 83,301,7 і 68,581,49, відповідно. Поряд з цим поглинальна здібність фагоцитарних клітин хворих першої групи в день операції була невисокою, але через 24 - 48 годин мала тенденцію до підвищення; цей показник у хворих другої групи був в день операції також невисоким і не збільшувався в подальшому.

Результати вивчення метаболічної активності нейтрофілів за відсотком клітин, що містять гранули формазану та середнім цитохімічним коефіцієнтом показали, що суттєвих відмінностей при порівнянні клітин хворих першої та другої груп відмічено не було.

Виявлені кількісні зміни клітинного складу перитоніального ексудату поєднувались і з деякими морфологічними відмінностями. Ці зміни були особливо вираженими у хворих з гнійно-фібринозним перитонітом і свідчать про те, що клітини перитоніального ексудату піддаються вираженій руйнації: деструкція і некробіоз макрофагів та нейтрофілів, поява епітеліоїдних клітин, які мають макрофаго-гістіоцитарне походження, а також багатоядерних гігантських клітин.

Таблиця 1. Експресія маркерів активації клітинами перитоніального ексудату хворих з різними формами перитоніту в динаміці

Причини зниження кількості макрофагів та їх виражена руйнація при гнійно-фібринозному перитоніті може бути наслідком вираженої інтоксикації (Lazarov S. et al., 2000; Ma J. et al., 2003), а також посиленням апоптозу. Останнє підтверджується тим, що багато патоген-асоційованих молекул сприяють експресії Fas-антигенів і роблять макрофаги більш чутливими до Fas-обумовленого апоптозу; такі макрофаги починають продукувати велику кількість прозапальних цитокінів (Fukui M. et al., 2003). Крім того, макрофаги дуже чутливі до змін, що відбуваються в шлунково-кишковому тракті (Moehrlen U. et.al., 2005). На можливість прогностичного значення підвищення кількості нейтрофілів при наявності активної їх руйнації вказують і деякі поодинокі роботи інших авторів (Помелов В.С. и др., 1983; Holzer K. et al., 2003).

У більшості хворих були проведені мікробіологічні дослідження перитоніального ексудату. Такі дослідження показали, що у 80% випадків етіологічним фактором перитоніту була змішана інфекція, обумовлена E. coli, St. аureus та диплококами. Моноінфекція, визвана E. coli, спостерігалась в 20%, а St. аureus - у 8%. Збільшення кількості CD4⁺Т-лімфоцитів в перитоніальному ексудаті хворих з гнійно-фібринозним перитонітом може бути обумовлено збільшенням того клону лімфоцитів, який володіє супресивною дією - CD4⁺CD25⁺Т-лімфоцитів (Romagnani S., 2002). Не дивлячись на те, що CD4⁺CD25⁺Т-лімфоцити у людей при перитоніті не досліджувались, треба мати на увазі, що вони мають Toll-рецептори, активація яких може бути обумовлена дією бактеріальних продуктів (Caramalho I. et al., 2003). До цього треба додати, що кількість цієї субпопуляції може підвищуватись при різних запальних захворюваннях кишечника (Mottet C. et al., 2003). Виражена експресія антигенів HLA-DR уже в день операції, очевидно, пов'язана з активацією антигенпрезентуючих клітин, до яких відносяться не тільки макрофаги, моноцити і В-лімфоцити, але й нейтрофіли (Wallace P. et. al., 2001). Подібні дані при дослідженні клітин перитоніального ексудату людини не відомі, але в експериментальних дослідженнях показано, що перитоніт характеризується високим рівнем експресії HLA-DR, яка знижується при наступному розвитку сепсису (McCully M. et al., 2005; Knudsen E. et al., 2002). Таке підвищення в подальшому не супроводжувалось мобілізацією імунологічних механізмів захисту, що пояснюється вираженою інтоксикацією і поглибленням супресії, а можливо і анергією Т-клітин (Cook D. et al., 2003).

Підсумовуючи результати досліджень, представлених в цьому розділі роботи, можна констатувати, що уже в перший день операції в перитоніальній порожнині хворих з перитонітом наступають імунологічні зміни, які проявляються у: відношенні кількості макрофагів і нейтрофілів в перитоніальному ексудаті при різноспрямованості цих змін у хворих першої і другої груп, підвищенні рівня експресії антигенів ГКГ клітинами хворих другої групи, підвищенні кількості CD3⁺Т-лімфоцитів у хворих другої групи в порівнянні з першою. Відмічені зміни відображають особливості подальшого клінічного пербігу і тому можуть бути використані для прогнозування.

Паралельно з дослідженнями локальної імунологічної відповіді хворих з перитонітом були також вивчені і показники, що характеризують системну імунологічну відповідь; дослідження також проведені в динаміці. Вивчення загального аналізу крові не виявило достовірних відмінностей при порівнянні хворих першої та другої групи в день операції, але були відмічені вірогідні відмінності в порівнянні з контролем, що було більш вираженим у хворих другої групи.

Дослідження субпопуляційного складу лимфоцитів периферичної крові хворих з перитонітом проводили за допомогою методу непрямої імунофлюоресценції. Одержані результати свідчать про достовірне зниження кількості CD3⁺Т-лімфоцитів у хворих з гнійно-фібринозним перитонітом: 44,51,87 (друга група), 56,33,46 (перша група), 59,862,01 (контроль). Змінювалась і кількість клітин з маркером CD19 (В-лімфоцити): у хворих першої групи під час операції кількість вказаних клітин була достовірно вищою як в порівнянні з контролем, так і з хворими другої групи (12,502,10; 9,120,56; 6,330,74 відповідно); при подальшому дослідженні кількість В-лімфоцитів у хворих першої групи продовжувала підвищуватись (14,51,9), в той час як підвищення у хворих другої групи в порівнянні з контролем не було достовірним. Дослідження кількості СD4⁺, CD8⁺Т-лімфоцитів і CD16⁺-лімфоцитів не виявило достовірних відмінностей як в порівнянні результатів обстеження хворих першої та другої груп, так і з контролем.

Визначення кількості клітин, що експресують антигени ІІ класу ГКГ (HLA-DR) показало їх достовірне підвищення в периферичній крові хворих першої групи (25,503,50) в порівнянні з хворими другої групи в день операції (12,751,90), а також з контролем (11,84±0,46); порівняння рівня експресії цього маркера лімфоцитами хворих другої групи з контролем достовірних відмінностей не виявило. Через 24 - 72 години рівень експресії HLA-DR у хворих першої групи мав тенденцію до зниження, а у другої - до підвищення; у хворих обох груп рівень цієї експресії був вищим порівняно з контролем. Достовірних змін в експресії CD25 та проліферативній активності лімфоцитів при порівнянні хворих першої і другої групи відмічено не було.

Рівень експресії адгезивної молекули CD54 достовірно збільшувався клітинами хворих обох груп як в день операції, так і через 24-72 години і складав в день операції - 17,00,70 (перша група), 16,03,33 (друга група) та 4,660,48 (контроль) а в подальшому - 18,360,43 (перша група), 19,210,75 (друга група) та 4,660,48 (контроль) Наведені дані ілюструє рисунок 3.

Порівняння результатів визначення фагоцитарної активності нейтрофілів периферичної крові хворих першої і другої групи показало достовірне зниження відсотка фагоцитуючих нейтрофілів хворих другої групи (63,132,51 і 51,232,1, відповідно) паралельно зі зниженням фагоцитарного числа (6,352,51 і 3,530,12, відповідно). Зміни фагоцитарної активності нейтрофілів першої групи в порівнянні з контролем не мали суттєвої різниці. Через 24 - 72 годин у хворих першої і другої груп у показниках відсотку фагоцитуючих клітин помітних змін не спостерігалось; фагоцитарне число у хворих другої групи в порівнянні з контролем і хворими першої групи залишалось достовірно нижчим. При вивченні метаболічної активності нейтрофілів, а також рівня імуноглобулінів класів M, G, A відмінностей не виявлено в день операції; через 24 - 72 години у хворих другої групи відмічено підвищення відсотку фомазан-позитивних клітин.

Підсумовуючи результати дослідженнь клітин периферичної крові хворих можна констатувати, що в день операції імунологічні зміни проявились в основному зниженням кількості CD3⁺Т-лімфоцитів, достовірному зниженням В-лімфоцитів (CD19), підвищенням експресії HLA-DR клітинами хворих першої групи і зниженням фагоцитозу клітинами хворих другої групи.

На підставі викладених вище даних була проведена порівняльна оцінка результатів вивчення імунологічних змін в черевній порожнині та периферичній крові хворих. При проведенні такого аналізу уявлялось доцільним дати оцінку лише тим показникам, зміни яких мали виражений характер: кількість CD3⁺Т-лімфоцитів, CD19⁺В-лімфоцитів, відсоток клітин, що експресують адгезивну молекулу CD54, антигени ІІ класу ГКГ (HLA-DR) та активність фагоцитуючих клітин (фагоцитарне число). Було показано, що кількість CD3⁺Т-лімфоцитів в день операції суттєво збільшується в перитоніальному ексудаті хворих першої групи в динаміці; суттєвих змін цього показника в периферичній крові не відмічено. Поряд з цим у хворих другої групи в день операції відмічено достовірне підвищення (р<0,01) кількості CD3⁺Т-лімфоцитів в перитоніальному ексудаті при порівнянні з цим показником в периферичній крові; при дослідженні в динаміці вказані відмінності зберігались.

Кількість В-лімфоцитів (CD19) у хворих першої групи в перитоніальному ексудаті була збільшена в порівнянні з такою у периферичній крові; підвищення цих клітин в периферичній крові було значно меншим, але відрізнялось від контролю. Через 24 - 48 годин різниця в кількості В-лімфоцитів в перитоніальному ексудаті і периферичній крові хворих першої групи була практично відсутня. Дуже ілюстративними були зміни кількості В-лімфоцитів в перитоніальному ексудаті хворих другої групи - кількість цих клітин залишалась високою в порівнянні з першою групою, в той час як в периферичній крові цих хворих кількість цих клітин практично не відрізнялась від контролю; ці дані характеризуються високим ступенем достовірності - р<0,001.

Викликають зацікавленість зміни відсотку клітин, що експресують антигени HLA-DR як в периферичній крові, так і перитоніальному ексудаті. Так, в периферичній крові хворих першої групи в день операції спостерігалось підвищення відсотку клітин, що експресують антигени HLA-DR в порівнянні з контролем; відсоток аналогічних клітин в перитоніальному ексудаті досягав такого ж рівня. Через 24 - 48 годин після операції мало місце незначне зниження цього показника при відсутності відмінностей в клітинах перитоніального ексудату і периферичної крові. На відміну від цього у хворих другої групи (гнійно-фібринозний перитоніт) в день операції мала місце достовірна різниця (р<0,001) в кількостях клітин, що експресують антигени HLA-DR, в порівнянні з цим показником у хворих першої групи; такі ж достовірні відмінності спостерігаються і при дослідженні в динаміці, але величина цього показника була нижчою.

Особливу увагу звертає на себе той факт, що поряд з вираженими змінами кількості клітини, що експресують антигени HLA-DR в перитоніальному ексудаті, його зміни в периферичній крові були недостовірними ні в динаміці, ні в порівнянні з контролем (рисунок 4).

В процесі розвитку перитоніту спостерігались і зміни в кількості клітин, що експресують внутрішньоклітинну адгезивну молекулу CD54: кількість цих клітин підвищувалась у хворих першої групи як в перитоніальному ексудаті, так і в периферичній крові. Через 24 - 48 годин після операції відсоток вказаних клітин знизився в перитоніальному ексудаті і лишився без змін в периферичній крові. У хворих другої групи рівень цього показника в периферичній крові не мав суттєвих відмінностей, а в при дослідженні клітин перитоніального ексудату був майже в 2 рази вищим (рисунок 5).

Рис. 4. Кількість клітин, що експресують антигени HLA-DR, в перитоніальному ексудаті і периферичній крові хворих різних груп в динаміці

Дослідження фагоцитарної активності клінин показало, що достовірні зміни відносились переважно до показника поглинальної активності. В зв'язку з цим можна відмітити, що його інформативність в день операції була значно быльшою у хворих першої групи; в динаміці спостерігалось підвищення фагоцитарної активності лише при дослідження фагоцитуючих клітин перитоніального ексудату. В периферичній крові хворих другої групи спостерігалось достовірне зниження цього показника і не змінювалось в динаміці.

Таким чином, на підставі порівняльного аналізу можна прийти до висновку, що зміни кількості і функціональної активності клітин хворих на перитоніт в післяопераційому періоді мають найбільш інформативний характер при вивченні клітин перитоніального ексудату, що особливо чітко проявляється при дослідженні хворих з гнійно-фібринозним перитонітом уже в ранньому періоді обстеження.

Рис. 5. Кількість клітин, що експресують адгезивну молекулу CD54, в перитоніальному ексудаті і периферичній крові хворих різних груп в динаміці

На підставі вивчення змін локального імунітету, в першу чергу у хворих з гнійно-фібринозним перитонітом, для імунореабілітації був застосований препарат нового класу сполук - поліоксидоній (Некрасов А.В., Пучкова Н.Г., 2000; Манько В.М., Петров Р.В. и др., 2000; Пинегин Б.В., Некрасов А.В., 2006). Вибір цього препарату був обумовлений тим, що основною мишенню його дії є фагоцитуючі клітини, які зазнають найбільшого ушкодження.

Поліоксидоній був застосований в комплексній базисній терапії 15 хворих з гнійно-фібринозним перитонітом (підгрупа А); групою порівняння були хворі з гнійно-фібринозним перитонітом, в терапію яких поліоксидоній не включався (підгрупа Б); підгрупи були сформовані з загальної кількості обстежених хворих з гнійно-фібринозним перитонітом, ураховуючи вік, стать та особливості перебігу захворювання. Основними критеріями для призначення поліоксидонію були: зміни у співвідношенні макрофагів та нейтрофілів за рахунок вираженого підвищення

останніх в перитоніальному ексудаті, кількості CD3⁺Т-лімфоцитів, підвищення рівня експресії антигенів ІІ класу ГКГ антигенпрезентуючими клітинами перитоніального ексудату та зниження поглинальної активності фагоцитуючих клітин. Локальна терапія поліоксидонієм проводилась за розробленою нами схемою.

Таблиця 2. Зміни локальної імунологічної відповіді (клітини перитоніального ексудату) хворих з гнійно-фібринозним перитонітом при включенні поліоксидонію в традиційну терапію

Клініко-імунологічні результати проведеної терапії свідчать про те, що під впливом поліоксидонію достовірних змін зазнають (при дослідженні перитоніального ексудату) всі показники. Найбільш достовірні зміни проявились відносно кількості макрофагів, нейтрофілів, відсотку фагоцитуючих клітин та відсотку клітин, що експресують антигени HLA-DR. Таблиця 2 узагальнює результати імунологічних досліджень в умовах локальої імунотерапії.

Поряд з описаними імунологічними змінами, які відмічались у хворих груп А і Б, була виявлена різниця і в клінічному перебігу гнійно-фібринозного перитоніту. Так, практично у всіх хворих, в традиційну терапію яких був включений поліоксидоній, спостерігалась більш рання нормалізація перистальтики кишечника, зниження різних проявів інтоксикації організму (нудота, блювота, запаморочення, загальна слабкість та інш.). Слід відмітити, що такі позитивні зміни відмічались вже на другий день після локального введення поліоксидонію. Післяопераційна рана у хворих, які одержували поліоксидоній, загоювалась первинним натягом і строк перебування в стаціонарі не перевищував 6 - 8 днів, в той час як у окремих хворих групи Б термін перебування в стаціонарі доходив до 21 доби і більше.

Приведені дані свідчать про те, що включення поліоксидонію в традиційну терапію хворих з гнійно-фібринозним перитонітом призводить до локальних імунологічних змін, які відбуваються на фоні загального поліпшення клінічного стану хворих.

ВИСНОВКИ

Післяопераційний перебіг перитоніту, як серозно-фібринозного, так і гнійно-фібринозного, супроводжується локальними та системними імунологічними змінами. Найбільш суттєві зміни спостерігаються в локальному імунітеті при гнійно-фібринозному перитоніті, характеризуються ранньою появою, відображають тяжкість післяопераційного перебігу і можуть бути використані для пронозування та призначення локальної імунотерапії.

При серозно-фібринозному перитоніті в день операції в перитоніальному ексудаті в порівнянні з гнійно-фібринозним перитонітом збільшується кількість макрофагів, зменшується кількість нейтрофілів, а через 24 - 48 годин після операції зменшується кількість В-лімфоцитів.

Розвиток гнійно-фібринозного перитоніту характеризується достовірними локальними імунологічними змінами (дослідження перитоніального ексудату) і проявляється зменшенням кількості макрофагів, збільшенням кількості нейтрофілів та CD3⁺Т-лімфоцитів, зниженням фагоцитарної активності, підвищенням кількості клітин, що експресують адгезивні молекули CD54 та різким підвищенням кількості антигенпрезентуючих клітин, що експресують антигени HLA-DR; характер виявлених змін суттєво відрізняється від аналогічних при серозно-фібринозному перитоніті.

При вивченні системної імунологічної відповіді (периферична кров) виявлено збільшення відсотку клітин, що експресують антигени HLA-DR тільки у хворих з серозно-фібринозним перитонітом, кількості В-лімфоцитів у цих же хворих, але протягом всього періоду обстеження, а також збільшення кількості клітин, що експресують CD54, у хворих обох груп в порівнянні з контролем та зниження фагоцитарної активності у хворих з гнійно-фібринозним перитонітом в порівнянні з хворими першої групи.

Порівняльна оцінка системної і локальної імунологічної відповіді показала, що найбільш суттєвими були: зміни кількісті CD3⁺Т-лімфоцитів і В-лімфоцитів в перитоніальному ексудаті були достовірними уже в день операції; ці показники при дослідженні периферичної крові практично не відрізнялись від контролю; достовірне підвищення кількості клітин, що експресують антигени ІІ класу ГКГ (HLA-DR) в перитоніальному ексудаті з перевагою у хворих з гнійно-фібринозним перитонітом; цей показник при дослідженні периферичної крові суттєво не змінювався в порівнянні з контролем.

Зміни локального імунітету були використані для обгрунтування критеріїв призначення локальної імунотерапії з використанням імуномодулятора нового покоління - поліоксидонію.

Для проведення локальної терапії поліоксидонієм була розроблена схема застосування, яка відзначалась ефективністю, що проявлялось сприятливим післяопераційним перебігом, зменшенням перебування в стаціонарі в порівнянні з хворими, які знаходились тільки на традиційній терапії, а також позитивними імунологічними змінами.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Куюн Л.А., Бордонос В.Г., Дюговская Л.А., Бережной К.М. Способ прогнозирования тяжелого течения перитонита Авторское свидетельство // Бюлл. изобретений и патентов СССР.- 1991. - № 20- С. 1-2.

2. Куюн Л.А., Бережной К.М. Прогноз течения послеоперационного перитонита у больных прооперированных на органах брюшной полости // Імунологія та алергологія.- 2005. - №3. - С. 16-20.

3. Куюн Л.А., Бережной К.М. Сравнительная характеристика системного и локального иммунологического ответа больных после операций на органах брюшной полости // Імунологія та алергологія.- 2005. - №3.- С. 91-92.

4. Бережной К.М., Куюн Л.А., Тутченко Н.И., Хоменко И.П. Сравнительная оценка локального и системного иммунологического ответа больных, прооперированных на органах брюшной полости // Імунологія та алергологія.- 2005. - №4. - С. 68-72.

5. Куюн Л.О., Бережний К.М., Тутченко М.І., Хоменко І.П., Бордонос В.Г. Імунологічні зміни у хворих, які прооперовані на органах черевної порожнини // Науковий вісник Національного медичного університету. - 2006.- № 1.- С. 79-82.

6. Бережной К.М. Локальный иммунитет желудочно-кишечного тракта // Імунологія та алергологія. - 2006. - №3.- С. 7-14.

7. Бережной К.М., Куюн Л.А., Тутченко Н.И., Хоменко И.П. Локальная иммунотерапия больных с гнойно-фибринозным перитонитом // Імунологія та алергологія.- 2006. -№4. - С. 51-54.

8. Тутченко М.І., Куюн Л.О., Хоменко І.П., Бережний К.М. Спосіб лікування гнійно-фібринозного перітоніту у хворих з гострими хірургічними захворюваннями // Бюлл. изобретений и патентов України . - 2006. - №11.

9. Бережной К.М., Куюн Л.А., Тутченко Н.И., Хоменко И.П, Ярощук Д.В. Системный ответ при локальной иммунотерапии больных с гнойно-фибринозным перитонитом // Аллергология и иммунология. - 2006. - №4. - С. 123.

10. Куюн Л.А., Бережной К.М., Тутченко Н.И., Хоменко И.П. Функциональная активность клеток перитонеального экссудата и периферической крови больных с различными формами перитонита // Імунологія та алергологія. - 2006. -№2.- С. 89.

Размещено на Allbest.ru