Реакція гліальних клітин у гіпокампі при ішемічному ушкодженні мозку

Размещено на http://www.allbest.ru

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ ІМ. О.О. БОГОМОЛЬЦЯ

14.03.04 - Патологічна фізіологія

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук

Реакція гліальних клітин у гіпокампі при

ішемічному ушкодженні мозку

Цупиков Олег Михайлович

Київ - 2007

Размещено на http://www.allbest.ru

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у відділі цитології Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України.

Науковий керівник: доктор медичних наук, професор,

заслужений діяч науки і техніки України,

Скибо Галина Григорівна,

Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України,

завідувач відділу цитології

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

Квітницька-Рижова Тетяна Юріївна,

Інститут геронтології АМН України,

завідувач лабораторії морфології та цитології

доктор медичних наук,

Маньковська Ірина Микитівна,

Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця

НАН України, завідувач відділу гіпоксичних станів

Провідна установа: Національний медичний університет

ім.О.О.Богомольця МОЗ України,

кафедра патологічної фізіології

Захист відбудеться “_19”_червня___2007 р. о “_14.00_” годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.198.01 при Інституті фізіології ім.О.О.Богомольця НАН України за адресою: 01601, м. Київ-24, вул. Богомольця, 4.

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Інституту фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України (01601, м. Київ-24, вул. Богомольця, 4).

Автореферат розісланий “_17__”___травня_____2007 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради,

доктор біологічних наук Сорокіна-Маріна З.О.

Размещено на http://www.allbest.ru

Загальна характеристика роботи

Актуальність проблеми. Дослідження останніх двох десятиліть відкрили новий етап в розумінні процесів, що відбуваються при ішемічному інсульті, та визначили основні механізми трансформації гемодинамічних, клітинних та молекулярних змін при цій патології.

Ішемічний інсульт характеризується стабільним або частково регресуючим неврологічним дефіцитом. Поняття “ішемічний інсульт” передбачає розвиток гострого порушення мозкового кровообігу, зумовленого гіпоперфузією в певній ділянці мозку з формуванням зони некрозу -- інфаркту (загибель усіх тканинних елементів: нейронів і гліальних клітин) (Hacke W., 2003). Протягом перших 6 годин після розвитку інсульту зону інфарктного епіцентру оточує ділянка, в якій структурно-морфологічна організація нейронів та глії зберігається, але наявний дефект їх функціональної активності. Цю частину ішемізованого мозку називають ішемічна напівтінь, або англійським терміном “пенумбра” (Willis., 2003). З клінічної точки зору значення цієї зони полягає в тому, що порушення функції нейронів у ній мають зворотній характер протягом 1-6 год. Функціонування клітин саме цієї ділянки мозкової тканини, власне, й намагаються зберегти, щоб зменшити вираженість неврологічного дефіциту (Віничук С.М., 2005).

Відомо, що гліальні клітини відіграють значну роль у зміні морфологічної пластичності гіпокампа після ішемічного ушкодження (Trendelenburg G., 2005). Але питання про те, яке функціональне значення має активація гліальних клітин під час ішемічного ушкодження і, зокрема, в зоні ішемічної напівтіні, залишається досі суперечливим і недостатньо дослідженим.

Існування ішемічної напівтіні взаємопов'язано з уявленням про “терапевтичне вікно”. Протягом цього часу потрібно застосовувати фармакологічну корекцію, яка дасть змогу перервати каскад ушкоджуючих процесів у нейронах, забезпечити повернення їх до нормального стану та попередити відставлену нейрональну загибель. Найбільш перспективними у розробці нових нейропротекторів вважаються речовини, які впливають на динаміку ураження мозку декількома шляхами (Kagiyama T., 2004, Yam P.S., 2000). Однією з таких речовин є природний флавоноїд - кверцетин, який має властивості модулятора активності різних ферментів, що беруть участь у деградації фосфоліпідів, впливають на вільнорадикальні процеси і відповідають за клітинний біосинтез оксиду азоту, протеїназ (Middleton E.Jr., 2000).

Отже, у зв'язку з вищесказаним, актуальним є питання детального вивчення реакції астрогліальних та мікрогліальних клітин у різні терміни після ішемічного ушкодження гіпокампа - структури мозку, яка надчутлива до ішемії. Практичне значення цієї роботи полягає не лише в розумінні процесів, що відбуваються при ішемії, а і в дослідженні нейропротекторних властивостей природного флавоноїда - кверцетину, а також потенційної можливості використання його у клінічних дослідженнях.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Тема дисертації пов'язана з дослідженнями, які виконуються відділом цитології Інституту фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України: пошук ефективних засобів впливу на молекулярні механізми, що обумовлюють збудливість клітин та дослідження молекулярних механізмів проявів функціонування геному, що зумовлюють специфічність діяльності фізіологічних систем організму в нормі та при патології (№ державної реєстрації 0102U002472).

Мета і завдання дослідження. Метою роботи було вивчити реакцію гліальних клітин у гіпокампі та дослідити нейропротекторну дію водорозчинного флавоноїда кверцетину (ВК) в умовах ішемічного ушкодження мозку на моделі короткотривалої двосторонньої оклюзії сонних артерій у піщанки монгольської.

Для досягнення цієї мети були поставлені такі завдання:

дослідити зв'язок між порушенням поведінкових реакцій піщанки із загибеллю нейронів зони СА1 гіпокампа;

вивчити за допомогою імуногістохімічного аналізу якісні і кількісні характеристики астрогліальних клітин гіпокампа в різні строки після ішемічного ушкодження мозку;

вивчити за допомогою імуногістохімічного аналізу якісні і кількісні характеристики мікрогліальних клітин гіпокампа в різні строки після ішемічного ушкодження мозку;

оцінити дію водорозчинного кверцетину на астрогліальну реакцію в умовах моделювання ішемічного ушкодження мозку;

оцінити дію водорозчинного кверцетину на мікрогліальну реакцію в умовах моделювання ішемічного ушкодження мозку.

Об'єкт дослідження: астрогліальні та мікрогліальні клітини зони СА1 гіпокампа піщанок монгольських. ішемічний мозок астрогліальний кверцетин

Предмет дослідження: реакція гліальних клітин зони СА1 гіпокампа у різні терміни постішемічного періоду; якісні і кількісні характеристики астрогліальних та мікрогліальних клітин під впливом водорозчинного кверцетину після ішемічного ушкодження мозку.

Методи дослідження. Для досягнення мети даної роботи був використаний метод експериментальної короткотривалої глобальної ішемії головного мозку. Для аналізу якісних і кількісних характеристик гліальних клітин був використаний імуногістохімічний метод. Ультраструктурні характеристики гліальних клітин та нейронів зони СА1 гіпокампа у постішемічному періоді були дослідженні за допомогою методів електронної мікроскопії. Для узагальнення отриманих даних був використаний морфометричний аналіз та статистична обробка результатів за t-критерієм Стьюдента.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше проведено комплексні імуногістохімічні дослідження на світлооптичному та електронно-мікроскопічному рівнях динаміки якісних і кількісних змін гліальних клітин гіпокампа після двосторонньої короткотривалої оклюзії сонних артерій у монгольських піщанок. Вперше проведено імуногістохімічні дослідження мікрогліальних клітин гіпокампа піщанки після ішемічного ушкодження з використанням нового маркеру мікроглії - Iba-1. Вперше продемонстрований вплив водорозчинного біофлавоноїда кверцетину (ВК) на реакцію мікрогліальних клітин після короткотривалої глобальної ішемії мозку. Вперше показано на моделі двосудинної оклюзії сонних артерій у піщанок, що водорозчинний кверцетин має нейропротекторні властивості та зменшує активацію гліальних клітин.

Практичне значення одержаних результатів. Результати дослідження будуть мати фундаментальне значення для поглиблення відомостей про роль гліальних клітин у ішемічному ушкодженні мозку. В прикладному аспекті одержані дані вказують на наявність нейропротекторних властивостей водорозчинного кверцетину та розширюють уяву про механізми його дії на нейрональні та гліальні клітини гіпокампа, а також підтверджують необхідність використання кверцетину у медичній практиці з метою запобігання ішемічних ушкоджень мозку.

Особистий внесок здобувача. При виконанні роботи здобувачем проведений науковий пошук та обґрунтування вибраного напрямку досліджень, проведена морфологічна та морфометрична обробка матеріалу, статистична обробка та аналіз отриманих даних, а також написання роботи. Була вдосконалена методика імуногістохімічного аналізу реакції гліальних клітин на ішемічне ушкодження мозку. Планування експерименту, інтерпретація отриманих даних і формулювання висновків проведено спільно із науковим керівником. У проведенні хронічних експериментів брали участь співробітники відділу цитології Інституту фізіології ім.О.О. Богомольця НАН України.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації слухали та обговорювали на: Всеукраїнській конференції з міжнародним представництвом “Нейроендокринні та імунні механізми регуляції гомеостазу в нормі та патології” (Запоріжжя, 2005); конференції Українського товариства нейронаук з міжнародною участю, присвяченій 75-річчю Донецького державного медичного університету ім. М. Горького (Донецьк, 2005); 5th international symposium on experimental and clinical neurobiology (Tatranska Lomnica, 2005); науково-практичній конференції “Сучасні методи в дослідженні структурної організації органів та тканин”(Судак, 2006); конференції “Колосовские чтения-2006”, (Санкт-Петербург, 2006); IV Національному конгресі АГЕТ України (Сімферополь, 2006); conference IBRO-2006 (Budapest, 2006).

Публікації. Результати дисертації викладені в 12 публікаціях: статті - 5, тези конференцій, симпозіумів - 7.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація викладена на 132 сторінках і містить список скорочень, вступ, огляд літератури, розділ матеріалів і методів досліджень, розділ результатів досліджень, аналізу і узагальнення результатів дослідження, висновки та список використаних джерел. Робота ілюстрована 50 рисунками, серед яких 39 мікрофотографій. Перелік використаної літератури містить 225 посилань.

Основний зміст роботи

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ

Усі експерименти виконані з дотриманням міжнародних принципів Європейської конвенції про захист хребетних тварин, що використовуються в експериментальних та інших наукових цілях (European convention, Strasburg, 1986).

У нашій роботі було використано 110 статевозрілих (6-7 місяців) самців піщанок монгольських (Meriones unguiculatus) (вагою 80-90 г). Ішемія головного мозку викликалась оклюзією обох загальних сонних артерій протягом 7 хвилин. Піщанки були розподілені випадковим чином на три групи:

1 - контрольна (10 тварин) - (несправжньооперовані) тварини, у яких проводили оперативне втручання, як і при створенні ішемії, за винятком перетискування сонних артерій; їм також вводили фізіологічний розчин у еквівалентних об'ємах за протоколом введення водорозчинного кверцетину (ВК), який є комплексом кверцетину з полівінілпіролідоном (Борщагівський хіміко-фармацевтичний завод, Україна);

2 - група тварин з ішемією мозку (60 тварин), яким після ішемії вводили фізіологічний розчин у еквівалентних об'ємах за протоколом введення ВК;

3 - група тварин з ішемією (40 тварин), яким проводили профілактичне введення разової дози препарату ВК за 2 години до ішемії і далі за протоколом введення ВК.

За протоколом водорозчинний кверцетин (ВК) вводили інтраперитонеально у разовій дозі 50 мг/кг маси тіла тварини (ця доза містить 5 мг/кг кверцетину): перша доба експерименту: 1-е введення відразу (через 3-5 хвилин після ішемії, 2-е введення - через 2 години, 3-е введення - через 4 години; друга доба - 2 рази на добу через 12 годин; третя - шоста доба - одноразове введення у вищевказаній дозі.

Для оперативного втручання тварин попередньо наркотизували внутрішньом'язовим введенням каліпсолу (75 мг/кг) та ксилазину (2 мг/кг), робили поперечний розтин шкіри на шиї та тупе розшарування підшкірно-жирової тканини та м'язів з наступним відпрепаруванням обох загальних сонних артерій. Під обидві судини підводили шовкові лігатури. Ішемія головного мозку викликалась перетисканням (оклюзією) обох загальних сонних артерій за допомогою атравматичних мікрозатискачів протягом 7 хвилин з наступним їх зняттям та відновленням кровотоку. Післяопераційну рану обробляли порошком стрептоциду, зашивали поліамідним шовним матеріалом і обробляли шкіру 5% спиртовим розчином йоду.

Для оцінки наявності ішемічного ушкодження мозку усіх тварин протягом постоклюзійного періоду перевіряли за допомогою поведінкового тесту “відкрите поле”, який дозволяв виявляти тварин з ішемічним ушкодженням мозку за рахунок їх гіперактивної поведінки (Ishibashi S., 2006; Katsumata N., 2006). Тест “відкрите поле” проводили в спеціальній тестовій камері, підлога якої була поділена на квадрати розміром 15х15 см. Підраховували кількість квадратів, які перетинала піщанка протягом 5 хвилин. Аналізували також ще один показник - час відпочинку у куті. Цей показник був підрахований як загальний час, який піщанка витрачала, знаходячись в кожній із чотирьох кутових зон. Тести для тварин з усіх трьох груп виконували протягом усього експериментального періоду тричі на день і підраховували середнє значення.

У таких гіперактивних тварин робили забір матеріалу для морфологічних досліджень на 3, 7, 14 та 28 добу після оклюзії сонних артерій. Фіксацію тканини у піщанок для імуногістохімічних досліджень виконували методом транскардіальної перфузії-фіксації 4% розчином параформальдегіду (ПА) на 0,1 М фосфатному буфері (ФБ) з рН 7,4. Після дегідратації тканину заливали парафіном за загальноприйнятою методикою. Для імуногістохімічного дослідження гліальних клітин парафінові зрізи гіпокампа мітили поліклональними кролячими антитілами проти ГФКБ (специфічний маркер астроцитів, розведення 1:1000) (DAKO, Данія) і проти Iba-1 (специфічний маркер мікроглії, 1:750) (WAKO, Японія) та використовували вторинні анти-кролячі антитіла, кон'юговані з пероксидазою хріну (1:150) (DAKO, Данія). Після забарвлення зрізи гіпокампа вивчали за допомогою світлового мікроскопа XSP-139A-TP з цифровою камерою Canon Power Shot G-6 (NNJOI Co.Ltd, Японія-Китай).

Для проведення подвійної флуоресцентної імуногістохімії фронтальні зрізи головного мозку піщанки інкубували з двома первинними антитілами: анти-ГФКБ (1:1000) та анти-NeuN (специфічний маркер нейронів, 1:1000) (DAKO, Данія), або анти-Iba-1 (1:750) та анти-NeuN (1:1000). Інкубацію з вторинними антикролячими (для ГФКБ та для Iba-1) антитілами, кон'югованими з Alexa Fluor 488 (1:500) (Molecular Probes Inc., США) або антимишачими (для NeuN) антитілами, кон'югованими з Alexa Fluor 568 (1:500) (Molecular Probes Inc., США) робили протягом 12 годин при 40C. Забарвлені зрізи гіпокампа вивчали за допомогою конфокального мікроскопа FV1000-BX61WI (Olympus, Японія).

Для електронно-мікроскопічних імуногістохімічних досліджень проводили фіксацію мозку методом транскардіальної перфузії 4% розчином параформальдегіду і 0,25% розчином глютаральдегіду на 0,1 М фосфатному буфері, рН 7,4. Фронтальні зрізи виділеного гіпокампа завтовшки 50 мкм різали на вібратомі Vibroslice 752M (Campden Instruments Ltd, Англія) і залишали промиватися у 0,1 М ФБ, рН 7,4 протягом ночі при 4 0С. Наступного дня зрізи інкубували з первинними антитілами: анти-ГФКБ (1:1000), або анти-Iba-1 (1:750) в розчині, що містив 0,25 % Triton-X-100, протягом 48 годин при 40C, а потім з вторинними антикролячими (для ГФКБ), або антимишачими (для Iba-1) антитілами, кон'югованими з пероксидазою хріну (1:150) протягом 12 годин при 40C. Для візуалізації імуногістохімічного забарвлення використовували розчин 3,3'-діамінобензидину тетрагідрохлориду (ДАБ) з додаванням 0,03 % розчину перекису водню. Після постфіксації у 1% розчині OsO4 та дегідратації тканину заливали в епоксидні смоли (Epon - Araldit) за загальноприйнятою методикою. Ультратонкі зрізи, завтовшки 50 нм, контрастовані в уранілацетаті і цитраті свинцю, вивчали за допомогою трансмісійного електронного мікроскопа JEM-100CX (Японія).

Морфометричний аналіз розподілу астрогліальних та мікрогліальних клітин в різних шарах зони СА1 гіпокампа робили на парафінових зрізах з використанням комп'ютерної програми ImageTool (США).

Для характеристики щільності локалізації гліальних клітин використовували індекс щільності (ІЩ) - сумарна кількість мічених клітин, яка була порахована в кожному шарі середньої частини зони СА1 на 100 мкм2 площини зрізу. Статистичну обробку проводили за t-критерієм Стьюдента, відмінності вважалися достовірними при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Відомо, що після ішемічного ушкодження мозку спостерігається підвищення локомоторної активності у експериментальних тварин (Katsuta K., 2003). Тому, крім дослідження морфологічних змін, що відбуваються у ішемізованому мозку, ми аналізували поведінку піщанок протягом постішемічного періоду. Протягом 7 діб поведінкові реакції піщанок перевіряли за допомогою тесту “відкрите поле”.

У наших експериментах гіперактивна поведінка ішемізованих тварин сягала свого максимуму через 24 години після оклюзії і поступово зменшувалася протягом постоклюзійного періоду. На 7 добу локомоторна активність оперованих тварин дорівнювала показникам контрольних (несправжньооперованих) тварин (табл. 1).

Можливим поясненням цього факту може бути те, що надлишок глютамату, якій вивільняється під час ішемії, потенціює синтез АРР (білка-попередника амілоїда) (Yam P.S., 1997). АРР є чутливим індикатором порушення аксонального транспорту і накопичується в ушкоджених, але ще життєздатних, нейронах після ішемічного інсульту. Було показано, що накопичення АРР в гіпокампі призводить до порушення синаптичної передачі пірамідних нейронів зони СА1, яка спричиняє локомоторну гіперактивність; і АРР-імунореактивність і гіперактивність сягали свого максимуму через 24 години після двосторонньої оклюзії сонних артерій у піщанок (Katsumata N., 2006).

Таблиця 1

Підрахунок кількості квадратів, що пересікалися піщанкою під час тесту “відкрите поле”.

	Кількість квадратів, що пересікалися протягом 5 хвилин
Доба	контроль (n=10)	оклюзія 7 хвилин (n=60)
1	120 ± 3	640 ± 12
2	122 ± 7	581 ± 9
3	117 ± 5	407 ± 13
4	109 ± 3	370 ± 11
5	121 ± 4	262 ± 15
6	118 ± 3	148 ± 9
7	120 ± 4	119 ± 5

Інший показник, який аналізували протягом тесту “відкрите поле”, був час відпочинку у кутових зонах. У групі несправжньооперованих тварин відсоток часу відпочинку у кутах був високим і в середньому становив 35 % від загального часу тестування (300 секунд) (табл. 2).

Таблиця 2

Час відпочинку у кутових зонах.

	Загальний час знаходження в кутових зонах, с
Доба	контроль (n=10)	оклюзія 7 хвилин (n=60)
1	105 ± 9	18 ± 7
2	103 ± 7	21 ± 6
3	107 ± 5	32 ± 5
4	102 ± 3	36 ± 8
5	105 ± 4	41 ± 7
6	109 ± 3	48 ± 9
7	104 ± 4	55 ± 5

У піщанок, які мали ішемічне пошкодження мозку, в першу добу після оклюзії відсоток часу відпочинку у кутах був значно менший (6,2%) ніж у контрольних тварин і поступово збільшувався протягом постоклюзійного періоду, проте залишався незначним навіть на 7 добу після оклюзії (18,3 %). Таке порушення поведінкових реакцій особливим чином корелює із загибеллю нейронів зони СА1 гіпокампа і може бути використане як важливий діагностичний фактор наявності ушкодження зони СА1 гіпокампа (Mileson B.E., 1991).

Анатомічною особливістю гіпокампа є розташування в зоні СА1 пірамідних нейронів, соми яких згруповані в пірамідному шарі, дендрити в str. radiatum, а аксони - в str. oriens. Завдяки такому специфічному розташуванню гіпокамп є найбільш придатною системою для кількісної оцінки структурних змін при ішемії мозку (Kirino T., 2000).

Після ішемії-реперфузії у гіпокампі піщанок ми спостерігали ушкодження пірамідних нейронів зони СА1 разом із активацією гліальних клітин. Загибель пірамідних нейронів зони СА1 гіпокампа має відстрочений характер і стає помітною на світлооптичному мікроскопічному рівні на 2-4 добу після ішемії-реперфузії у піщанок (Padosch S.A., 2003). Ця відстрочена загибель пірамідних нейронів корелює з активацією як астроцитів, так і мікрогліальних клітин.

Імуногістохімічне дослідження астроцитів зони СА1 гіпокампа показало, що після оклюзії сонних артерій відбувалося збільшення кількості ГКФБ-позитивних астрогліальних клітин у порівнянні з контрольною групою, яке суттєво залежало від строку постішемічного періоду. В першу добу після 7-хвилинної оклюзії сонних артерій не спостерігалося суттєвих морфологічних змін ГФКБ-позитивних астроцитів. Вже на третю добу після оклюзії нейропіль зони СА1 гіпокампа був сильно вакуолізований, переважно через наявність великої кількості набряклих відростків астроцитів. ГФКБ-позитивні астроцити були добре помітні завдяки гіпертрофії їх соми та відростків.

Електронно-мікроскопічне імуноцитохімічне дослідження показало, що ядра ГФКБ-позитивних астроцитів були округлими і світлішими ніж у контрольній групі (через зменшення кількості гетерохроматину) та розташовувалися ексцентрично, відштовхуванні масами гліальних філаментів, які займали центральну частину.

Морфометричний аналіз, який проводили на парафінових зрізах, показав, що значення індексу щільності (ІЩ) ГКФБ-позитивних астроцитів у несправжньооперованих піщанок було таким: str. pyramidale - 1,3±0,05, str. radiatum - 1,7±0,04, lacunosum-moleculare - 3,9±0,12, moleculare - 2,5±0,05, hilus - 1,3±0,03 (рис.1).

На третю добу індекс щільності астроцитів був найбільшим в str. radiatum (2,6±0,03; p<0,001), lacunosum-moleculare (5,9±0,04; p<0,001) і moleculare (3,8±0,03; p<0,001), але залишався незмінним в шарі str. pyramidale (1,3±0,04; p<0,05).

Рис. 1. Значення індексу щільності (ІЩ) астроцитів у різні строки постішемічного періоду в різних шарах зони СА1 гіпокампа. По горизонталі - час після оклюзії сонних артерій; по вертикалі - значення ІЩ,

(** - p<0,01; *** - p<0,001).

Слід зазначити, що кількість ГФКБ-позитивних астроцитів була однаковою в str. radiatum (2,6±0,03; p<0,001) на 3, 7 і 14 добу після ішемії і зменшувалась на 28 добу (1,8±0,03; p<0,05). На 7-14 добу мічені астроцити у своїй більшості концентрувались в str. lacunosum-moleculare, str. moleculare, hilus, їх кількість в str. рyramidale помітно збільшувалася. На 28 добу реактивність астроцитів була дещо меншою в усіх шарах зони СА1 у порівнянні із 14 добою.

Подвійне флуоресцентне імуногістохімічне дослідження гіпокампа у різні строки постішемічного періоду з використанням антитіл до ГФКБ та NeuN показало, що розвиток реактивного астрогліозу збігається зі структурними змінами у нейронах. Найбільш показовими були зміни у гіпокампі на 7 добу після оклюзії сонних артерій. У цей строк імунофлюоресцентне забарвлення NeuN-позитивних нейронів у шарі str. pyramidale майже не виявлялося, тоді як інтенсивність флуоресценції ГФКБ-позитивних астроцитів збільшувалася вдвічі у порівняні з контролем, що свідчило про розвиток реактивного астрогліозу.

Таким чином, після ішемії в зоні СА1 гіпокампа спостерігався реактивний астрогліоз, в першу чергу і максимально в hilus, тоді як в str. pyramidale ця реакція розгорталась з найбільшою затримкою. Збільшення кількості ГФКБ-позитивних астроцитів в str. pyramidale лише на 7-14 добу після ішемії-реперфузії можливо було пов'язано зі значною деградацією тіл пірамідних нейронів в цьому шарі та міграцією в нього астроцитів. Інтенсивність забарвлення таких ГФКБ-позитивних астроцитів можливо збільшувалася шляхом активації синтезу цього білка (Panickar S.K., 2005); за рахунок агрегації гліальних філаментів, що створювали видимість збільшення концентрації ГФКБ, або появи в гіпертрофованих астроцитах нових епітопів, які раніше були замасковані (Kimelberg H.K., 2005).

Значення реактивного астрогліозу після ішемії-реперфузії можливо полягає у відновленні функцій ушкоджених нейронів шляхом регуляції позаклітинного середовища, а саме: рН, йонного балансу, видалення вільних радикалів. Відомо, що в більш пізню фазу постішемічного періоду астроцити продукують нейропротективні фактори, такі як фактори росту, цитокіни, які задіяні в процесах репарації і регенерації.

Результати імуногістохімічного дослідження Iba-1-позитивних мікрогліальних клітин показали, що після ішемії-реперфузії спостерігалась їх гіпертрофія за рахунок збільшення розміру соми та ретракції відростків; відбувалося також різке збільшення кількості мікрогліальних клітин у порівнянні з несправжньооперованими тваринами. В контрольній групі Iba-1-позитивні клітини виявлялися в усіх шарах зони СА1, але імуногістохімічне забарвлення таких клітин було слабким. Після ішемії-реперфузії мікроглія в шарі str. radiatum мала паличкоподібний вигляд і розташовувалася вздовж апікальних дендритів пірамідних нейронів.

Ультраструктурне імуногістохімічне дослідження таких активованих мікрогліальних клітин показало, що вони виглядали гіпертрофованими і мали ядро з неправильним контуром; відростки їх були товстішими ніж у нормальної розгалуженої мікроглії.

Морфометричний аналіз Iba-1-позитивних клітин показав, що індекс щільності мікроглії у несправжньооперованих піщанок був таким: str. pyramidale - 1,3±0,3, str. radiatum - 1,1±0,2, lacunosum-moleculare - 1,7±0,1, moleculare - 1,5±0,2, hilus - 1,6±0,2. Ступінь імунореактивності мікрогліальних клітин і локалізація їх в шарах гіпокампа суттєво залежала від строку постішемічного періоду. Вже на першу добу після 7-хвилинної оклюзії сонних артерій Iba-1-імунореактивні мікрогліальні клітини були добре помітні завдяки їх амебоїдній формі, характерній для активованої мікроглії, та дифузному розташуванню в шарах: str. рyramidale, radiatum, lacunosum-moleculare, moleculare та hilus. На третю добу індекс щільності мікроглії був найбільшим в str. pyramidale (7,1±0,4; p<0,001), lacunosum-moleculare (4,3±0,2; p<0,001) і moleculare (2,8±0,4; p<0,001), але залишався майже незмінним в шарі str. radiatum (1,9±0,05; p<0,001) (рис.2).

На 7-14 добу мічені мікрогліальні клітини в основному концентрувались в str. рyramidale (ІЩ дорівнював 57,5±4,6 (p<0,001) та 58,2±5,3 (p<0,001) відповідно) біля тіл пірамідних нейронів. На 28 добу реактивність мікроглії залишалась достатньо високою в str. рyramidale (ІЩ -36,0±2,5; p<0,001), але значно меншою у порівняні з 7 і 14 добою після ішемії.



Рис.2. Значення індексу щільності (ІЩ) мікрогліальних клітин у різні строки постішемічного періоду в різних шарах зони СА1 гіпокампа. По горизонталі - час після оклюзії сонних артерій, доба; по вертикалі - значення ІЩ, (** - p<0,01; *** - p<0,001).

Подвійне флуоресцентне імуногістохімічне дослідження гіпокампа у різні строки постішемічного періоду з використанням антитіл до Iba-1 та NeuN засвідчило наявність зв'язку між рівнем імунореактивності Iba-1-позитивних мікрогліальних клітин і явним проявом морфологічних змін нейронів. Збільшення кількості Iba-1-позитивних мікрогліальних клітин на 7-14 добу після ішемії в str. pyramidale було пов'язане зі значною деградацією тіл пірамідних нейронів в цьому шарі та міграцією в нього мікроглії із сусідніх ділянок СА1 зони.

Відомо, що після ішемічного ушкодження мозку в мікрогліальних клітинах відбувається активація різних сигнальних шляхів: JAK-STAT шлях - класична мішень для IL-6 (Justicia C., 2000; Suzuki S., 2001); мітоген-активований протеїнкіназний (MAPK) шлях, що активується цитокінами і ростовими факторами (Wang X., 2003) та р38 шлях (Piao C.S., 2002). Активація цих сигнальних шляхів викликає секрецію прозапальних цитокінів і водночас продукування нейротрофних факторів. Пригнічення цих шляхів має нейропротекторний ефект, але слід враховувати те, що їх інгібування може призвести і до нівелювання дії нейротропних факторів.

Крім класичних транскрипція-залежних шляхів, мікроглія у постішемічному періоді збільшує активацію сигнальних субстратів, таких як протеїнкіназа С-дельта (РKС-), протеїн-тирозин кіназа PYK-2 і Src, та тирозинфосфатаза SHP-1 (Tian D., 2000; Wishcamper C.A., 2003). Ці молекули можуть бути задіяні при регуляції швидкодіючих змін у мікроглії, незалежно від процесу транскрипції. Показано, що активація цих швидкодіючих кіназ/фосфатаз без стимуляції транскрипція-залежних шляхів може вибірково стимулювати вивільнення мікрогліальних нейротрофінів без збільшення секреції прозапальних цитокінів (Nakajima K., 2002).

Таким чином, стратегії, спрямовані на лікування ішемічного інсульту, мають містити агенти, які крім прямої нейропротекторної дії повинні впливати на внутрішньоклітинні сигнальні субстрати гліальних клітин.

У даний час нейропротекторні стратегії, що спрямовані лише на одну ланку патобіохімічного каскаду, який виникає при ішемічному ушкодженні мозку, не довели своєї успішності у клінічних випробуваннях.

В роботах останніх років з'явились дані про природний флавоноїд кверцетин, який є одним з найпотужніших антиоксидантів не тільки серед флавоноїдів, а і серед сполук інших фармакологічних груп, переважаючи за цими властивостями -токоферол. Кверцетин має також властивості модулятора активності різних ферментів, що беруть участь у деградації фосфоліпідів (фосфоліпаз, фосфогеназ, циклооксигеназ) (Middleton E.Jr., 2000).

Застосування численних корисних фармакологічних властивостей кверцетину та інших біофлавоноїдів протягом довгого часу було обмежене низькою біодоступністю існуючих лікарських форм внаслідок поганої розчинності їх у воді в біологічних рідинах організму. Тому українськими дослідниками, клініцистами та фармакологами (О.О.Мойбенко, Ю.М.Колчин, Н.П.Максютіна та інші) було створено перший у світі водорозчинний інгібітор ліпоксигенази, придатний для внутрішньовенного введення хворим - водорозчинний кверцетин (ВК).

Саме тому, враховуючи потужний вплив кверцетину на прооксидантно-антиоксидантний гомеостаз та його здатність проходити через гематоенцефалічний бар'єр (Youdim K.A., 2004), доцільним було дослідження нейропротекторної дії цього препарату та його впливу на гліальну реакцію після короткотривалої глобальної ішемії мозку.

У наших експериментах застосування водорозчинного кверцетину (ВК) у тварин з ішемією гальмувало розвиток реактивного астро- та мікрогліозу, а також збільшувало кількість неушкоджених нейронів після ішемії-реперфузії.

Морфометричний аналіз, який проводили на парафінових зрізах, показав, що значення індексу щільності (ІЩ) ГФКБ-позитивних астроцитів зменшувалося в 1,5 рази порівняно з ішемізованими тваринами (рис. 3).

Рис. 3. Значення ІЩ астроцитів в зоні СА1 гіпокампа. ІЩ - загальна кількість мічених клітин, яка була порахована в усіх шарах середньої частини зони СА1 гіпокампа на 100 мкм2 площини зрізу; (*** - p<0,001).

Імуногістохімічне дослідження Iba-1-позитивних мікрогліальних клітин показало, що після оклюзії сонних артерій із застосуванням ВК в постішемічному періоді відбувається суттєве зменшення інтенсивності забарвлення мікроглії у порівнянні з ішемізованими тваринами.

Морфометричний аналіз, який проводили на парафінових зрізах, показав, що значення індексу щільності Iba-1-позитивних мікрогліальних клітин зменшувалося в 3,5 рази порівняно з ішемізованими тваринами (рис. 4).

Рис. 4. Значення ІЩ мікроглії в зоні СА1 гіпокампа. ІЩ - загальна кількість мічених клітин, яка була порахована в усіх шарах середньої частини зони СА1 гіпокампа на 100 мкм2 площини зрізу; (*** - p<0,001).

Отже, проведені нами дослідження свідчать про досить ефективний нейропротекторний вплив водорозчинного кверцетину при ішемії-реперфузії мозку. Слід зазначити, що природній флавоноїд кверцетин крім прямого нейропротекторного впливу має й опосередковану нейропротекторну дію, захищаючи гліальні клітини та судини від ішемічного ушкодження.

Механізм дії кверцетину на процеси, що відбуваються при ішемічному ушкодженні мозку, ще не повністю зрозумілі, але протизапальну дію кверцетину пов'язують з його здатністю пригнічувати прозапальні MAPкіназні шляхи, такі як JNK (Wang L., 2002). Кверцетин також пригнічує активацію NFkB шляхом стабілізації NFkB/ІkB комплексу і прозапальних цитокінів (Peet G.W., 1999). Крім того, кверцетин інгібує інші кінази, такі як сАМР-залежну кіназу, протеїнкіназу С і кальмодулін-залежну кіназу (Formica J.V., 1995). Відомо також, що кверцетин інгібує ензимну активність ММП (матриксні металопротеїнази) (Cho J.Y., 2006).

Таким чином, кверцетин має множинні ефекти на клітину і може одночасно впливати на кілька ланок патобіохімічного каскаду, який виникає при ішемічному ушкодженні мозку. Хоча дослідження, які спрямовані на розкриття механізмів дії флавоноїдів на мозок, ще тривають, можна передбачати, що кверцетин займе передові позиції у розвитку нового покоління лікарських засобів, які будуть ефективними при лікуванні ішемічного ушкодження мозку.

Висновки

У дисертаційній роботі представлено морфо-функціональне дослідження реакції гліальних клітин СА1 зони гіпокампа та нейропротекторної дії водорозчинного флавоноїда кверцетину (ВК) в умовах ішемічного ушкодження мозку на моделі короткотривалої двосторонньої оклюзії сонних артерій у піщанки монгольської.

Після ішемічного ушкодження мозку порушення поведінкових реакцій піщанки монгольської корелюють із загибеллю нейронів зони СА1 гіпокампа. Такі зміни поведінкових реакцій можна використовувати як важливий діагностичний фактор наявності пошкодження зони СА1 гіпокампа.

На підставі імуногістохімічного аналізу гліальних клітин гіпокампа після ішемічного ушкодження встановлено, що розвиток реактивного гліозу відбувається неоднаково у різних шарах зони СА1 і залежить від тривалості постішемічного періоду.

Подвійне імунофлуоресцентне дослідження гіпокампа на різних строках постішемічного періоду з використанням антитіл до ГФКБ та NeuN показало, що розвиток реактивного гліозу збігається зі структурними змінами у нейронах.

Першою на ішемічне ушкодження мозку реагує мікроглія, в той час як відповідь астроцитів відстрочена. Протягом 28 діб після ішемічного ураження мозку як мікрогліальна, так і астроцитарна активації зменшуються, проте залишаються вищими, ніж у контрольних тварин.

Водорозчинний кверцетин у використаній концентрації гальмує розвиток реактивного астрогліозу у СА1 зоні гіпокампа після ішемічного ушкодження мозку.

Водорозчинний кверцетин у використаній концентрації гальмує розвиток реактивного мікрогліозу у СА1 зоні гіпокампа після ішемічного ушкодження мозку.

Водорозчинний кверцетин у використаній концентрації має виражену нейропротекторну дію в умовах моделювання ішемічного ушкодження мозку. Цей результат припускає потенційну можливість застосування цього препарату у медичній практиці в групах хворих з ризиком розвитку цереброваскулярних порушень.

Список опублікованих за темою дисертації робіт

Статті

Цупиков О.М., Півнева Т.А., Скибо Г.Г. Імуногістохімічне дослідження стану астроцитів гіпокампа після короткотривалої ішемії мозку // Запорожский медицинский журнал. - 2005. - №6. - С. 107-109.

Пивнева Т.А., Цупиков О.М., Пилипенко М.Н, Василенко Д.А., Скибо Г.Г. Структурные изменения астроцитов в гиппокампе песчанки после экспериментальной ишемии мозга // Нейрофизиология. - 2005. - Т. 37, №5/6. - С. 410-415.

Коваленко Т.Н., Осадченко И.А., Сможаник Е.Г., Цупиков О.М., Скибо Г.Г. Морфологические исследования действия кверцетина как нейропротектора при экспериментальной ишемии мозга // Физиология, морфология и патология человека и животных в условиях Кыргыстана: Сб. Статей медфакультета КРСУ. - Бишкек, 2006. - в.6. - С. 81-87.

Коваленко Т.М., Осадченко І.О., Цупиков О.М., Півнева Т.А., Шаламай А.С., Мойбенко О.О., Скибо Г.Г. Нейропротекторний ефект кверцетину при експериментальній ішемії мозку // Фізіологічний журнал. - 2006. - Т.52, №5. - C.17-23.

Півнева Т.А., Цупиков О.М., Скибо Г.Г Вивчення стану мікроглії гіпокампа після короткотривалої ішемії мозку // Таврический медико-биологический вестник. - 2006. - Т. 9, №3. - С. 129-132.

Тези доповідей

Коваленко Т.Н., Осадченко И.В., Сможаник Е.Г., Цупиков О.М., Скибо Г.Г. Нейропротекторное действие кверцетина при экспериментальной ишемии мозга // Нейроендокринні і імунні механізми регуляції гомеостазу в нормі та патології: Матеріали Всеукраїнської конференції з міжнародним представництвом - Запорожский медицинский журнал. - 2005. - Т.30, №3. - С. 108.

Цупиков О.М., Пивнева Т.А., Реакция астроцитов гиппокампа на кратковременную глобальную ишемию у песчанок // Нейронауки: теоретичні та клінічні аспекти: Матеріали конференції Українського товариства нейронаук (з міжнародною участю), присвяченої 75-річчю Донецького державного медичного університету ім. М. Горького - Донецьк, 2005. - Т.1, №1 (додаток). - С. 130.

Коваленко Т.Н., Осадченко И.В., Цупиков О.М., Сможаник Е.Г. Структурні прояви нейропротекторної дії кверцетину щодо гіпокампa при експериментальній ішемії мозку // Нейронауки: теоретичні та клінічні аспекти:Матеріали конференції Українського товариства нейронаук (з міжнародною участю), присвяченої 75-річчю Донецького державного медичного університету ім. М. Горького - Донецьк, 2005. - Т.1, №1(додаток). - C. 50.

Tsupykov O., Pivneva T., Skibo G. Astrocytic activation after transient forebrain ischemia in Gerbil Mongolian // 5th International Symposium on Experimental and Clinical Neurobiology: Abstracts, - Stara Lesna, Slovak Republic, - 19-22 Sept.2005. - P.122.

Цупиков О.М., Пивнева Т.А., Скибо Г.Г. Глиальная реакция гиппокампа на экспериментальную ишемию мозга // Проблемы, достижения и перспективы развития медико-биологических наук и практического здравоохранения -2006. - Т.142,часть.1. - С.134-135.

Пивнева Т.А., Цупиков О.М., Скибо Г.Г. Влияние кратковременной глобальной ишемии на микроглиальную и астроглиальную реакции в зоне СА1 гиппокампа песчанки // Морфология. - 2006. - т.129. - №2. - С.76.

Tsupykov O.M., Pivneva T.A., Skibo G.G. Quercetine protects against global cerebral ischemic injury in gerbils // IBRO conference Budapest, J. Clinical Neurosci. - 2006. - V59.(S1). - P.67.

Анотація

Цупиков О.М. Реакція гліальних клітин у гіпокампі при ішемічному ушкодженні мозку. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 14.03.04. - патологічна фізіологія. - Інститут фізіології ім.О.О.Богомольця НАН України, Київ - 2007.

Дисертація присвячена якісному і кількісному аналізу гліальних клітин гіпокампа після короткотривалої ішемії головного мозку та вивченню нейропротекторної дії водорозчинної форми кверцетину. Глобальну ішемію мозку у піщанок монгольських викликали шляхом 7-хвилинної двосторонньої оклюзії сонних артерій та досліджували СА1 зону гіпокампа на 3, 7, 14 і 28 доби після ішемії-реперфузії. Відомо, що ішемічне ушкодження мозку спричиняє тимчасову локомоторну гіперактивність у експериментальних тварин, тому для подальшого морфологічного аналізу СА1 зони гіпокампа бралися лише ті тварини, у яких спостерігалася така гіперактивна поведінка. Імуногістохімічне забарвлення на ГФКБ (маркера астроцитів) і Iba-1 (маркера мікроглії) робили на парафінових зрізах гіпокампа; підраховували кількість забарвлених клітин в усіх шарах зони СА1. Після ішемії-реперфузії спостерігалося збільшення ГФКБ- та Iba-1-імунореактивності в зоні СА1 гіпокампа: максимальна кількість забарвлених клітин була на 14 добу, з 14 по 28 добу активація глії знижувалася. Також вивчали вплив флавоноїда кверцетину на життєздатність клітин зони СА1 гіпокампа та їх морфологію після ішемії-реперфузії. Встановлено, що кверцетин знижує кількість загиблих нейронів і зменшує реактивний гліоз після ішемічного ушкодження. Таким чином, кверцетин проявляє виражену нейропротекторну дію на клітини зони СА1 гіпокампа, що припускає потенційну можливість використання його водорозчинної форми при ішемічному ушкодженні мозку.

Ключові слова: ішемія мозку, гліоз, кверцетин.

Аннотация

Цупиков О.М. Реакция глиальных клеток в гиппокампе при ишемическом повреждении мозга. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук по специальности 14.03.04. - патологическая физиология. - Институт физиологии им.А.А.Богомольца НАН Украины, Киев - 2007.

Диссертация посвящена качественному и количественному анализу глиальных клеток гиппокампа после кратковременной ишемии головного мозга и изучению нейропротекторного действия водорастворимой формы кверцетина. Глобальную ишемию мозга у песчанок монгольских вызывали путем 7-минутной двусторонней окклюзии сонных артерий и исследовали зону СА1 гиппокампа на 3, 7, 14 и 28 сутки после ишемии-реперфузии. Известно, что ишемическое повреждение мозга вызывает временную локомоторную гиперактивность у экспериментальных животных. Нарушения поведенческих реакций у песчанок оценивали с помощью теста “открытое поле”. Для дальнейшего морфологического анализа зоны СА1 гиппокампа отбирали только тех животных, у которых наблюдалась значительная локомоторная гиперактивность.

Для выявления глиальной реакции применяли иммуногистохимическое окрашивание парафиновых срезов гиппокампа с использованием антител к маркерам астроцитарных (ГФКБ) и микроглиальных (Iba-1) клеток. Статистический и морфометрический анализ распределения ГФКБ- и Iba-1-позитивных клеток проводили с применением компьютерной программы “ImageTool”. Измеряли площадь каждого слоя гиппокампа и рассчитывали плотность локализации микроглиальных клеток и астроцитов во всех слоях зоны СА1 гиппокампа на третьи, седьмые, 14-е и 28-е cутки после ишемического воздействия. Полученные данные сравнивали с результатами иммуноокрашивания глиальных клеток у ложнооперированых животных. Результаты данной работы показали, что уже на третьи сутки после глобальной ишемии микроглиальные клетки трансформировались из разветвленной формы (в состоянии покоя) в ярко выраженную кустистую и амебоидную. Количество Iba-1-позитивных окрашенных микроглиальных клеток увеличивалось во всех слоях СА1 зоны и их наибольшая плотность локализации отмечалась в str. pyramidale на 14-е сутки после повреждения. Увеличение количества ГФКБ-позитивных астроцитов отмечалось также на третьи сутки после ишемического воздействия. Они располагались равномерно по всем слоям гиппокампа с несколько повышенной плотностью в str. lacunosum-moleculare и str. moleculare (в областях локализации синаптических терминалей коллатералей Шаффера). В этих слоях максимальное увеличение количество ГФКБ-позитивно меченных астроцитов наблюдалось на вторую неделю после экспериментального воздействия. На 30 сутки реактивность как астроцитов, так и микроглиальных клеток была несколько снижена по сравнению с 14-ми сутками во всех слоях СА1 зоны.

Полученные результаты показывают, что после вызванной кратковременной ишемии прослеживается связь между степенью морфологических изменений нейрональных клеток и уровнем активации глиальных клеток, что отражает динамику повреждения нейронов гиппокампа после ишемии.

Исследования последних лет показывают, что флавоноиды проявляют нейропротекторное действие, однако механизмы их протекторного действия изучены недостаточно. Мы исследовали влияние флавоноида кверцетина на выживаемость клеток зоны СА1 гиппокампа и их морфологию после ишемии-реперфузии. Была подсчитана средняя плотность пирамидных нейронов и глиальных клеток зоны СА1 у ложнооперированных животных, в группе животных с ишемией и группе, которой вводили водорастворимую форму кверцетина. Установлено, что кверцетин уменьшает количество погибших нейронов и снижает реактивный глиоз после ишемического повреждения.

Таким образом, кверцетин проявляет выраженное нейропротекторное действие на клетки зоны СА1 гиппокампа, что допускает потенциальную возможность применения его водорастворимой формы при ишемическом повреждении мозга.

Ключевые слова: ишемия мозга, глиоз, кверцетин.

Annotation

Tsupykov O.M. The reaction of hippocampal glial cells to ischemic brain injury. - Manuscript.

The thesis for the defense of scientific degree of candidate of medical sciences in speciality 14.03.04. - pathological physiology. - Bogomoletz Institute of Physiology, National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv - 2007.

The thesis deals with the analysis of qualitative and quantitative changes of hippocampal glial cells after transient forebrain ischemia and the neuroprotective effect of water-soluble flavonoid quercetine. Mongolian gerbils were subjected to global forebrain ischemia by bilateral occlusion of common carotid artery during 7 min. Hippocampal CA1 area was examined 3, 7, 14 and 28 days after ischemia-reperfusion. It is known, that ischemic brain injury causes transient locomotor hyperactivity in experimental animals. The morphology of hippocampal CA1 area of ischemic hyperactive animals was analysed. GFAP (astrocyte marker)- and Iba-1 (microglia marker)-immunohistochemistry was performed in hippocampal sections. Immunopositive cells were counted in every layer of CA1 region. GFAP- and Iba1-immnunoreactivity increased gradually in CA1 area after ischemia-reperfusion. The number of stained cells reached a maximum at day 14, while from day 14 to 28 glial activation was found to decrease. In addition, the effect of quercetin on the viability and morphology of hippocampal CA1 area cells was studied after induced ischemia-reperfusion. Quercetin assisted in decreasing delayed neuronal death and reducing reactive gliosis after ischemic injury. Thus, quercetin demonstrates a neuroprotective effect on hippocampal cells, suggesting its potential efficacy to treat ischemic brain injury.

Key words: brain ischemia, gliosis, quercetin.

Размещено на Allbest.ru