Размещено на http://allbest.ru

Автореферат

дисертація на здобуття наукового ступеня

кандидата фармацевтичних наук

Застосування методів in vitro на етапах доклінічного вивчення лікарських засобів

1.ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

гепатопротектор печінка біохімічний

Актуальність теми. Останнім часом відзначається неухильний ріст захворювань печінки, що потребує від виробників насичення фармацевтичного ринку не тільки новими гепатопротекторами, але й проведення більш поглиблених досліджень вже існуючих препаратів [И.П.Алексеева, 2003]. Це пов'язано з тим, що механізми деяких препаратів маловивчені і вивчення продовжується навіть після їх впровадження в практику.

Вивчення властивостей препаратів традиційно проводиться за допомогою моделей, відтворюваних на тваринах. Використання цих методів вагомо відображається на собівартості готової лікарської форми. Тому останнім часом все частіше використовуються методи in vitro на основі культур клітин, зокрема гепатоцитів [A. Wolf et al, 1997; The Report and Recommendations of ECVAM Workshop 29, 1999]. Використання таких методів дозволяє зекономити досить часу та грошей, а крім того це є гуманним ставленням до тварин з боку етичних норм і є однією з вимог GLP [A. P. Li et al, 1998; R.L.Fisher et al, 1995; Schramm U. et al, 1999; S. Coecke et al, 1999]. Тому дослідження в цому напрямі є актуальними.

В останні роки використання культур клітин тварин і людини з чисто експериментальної процедури перетворилося в технологічний компонент багатьох біологічних досліджень і виробничих процесів [Hartung T., 2001, Zucco F., 1997]. Багато недоліків, що мають місце при проведенні експериментів на тваринах, при цьому зникають. Культури клітин легко доступні і стабільні, легко відтворюються, їх можна стандартизувати і поширювати між лабораторіями, а також кріоконсервувати [Hartung Thomas, D-Konstanz, Gstraunthaler Gerhard et al., 2000; Hartung T., Gstraunthaler G., Coecke S. et al., 2001; Clemendson C., Barile F.A., Chesne C. et al, 2000; Genschow E., Spielmann H., Scholtz G. et al., 2002]. Методи з використанням клітин також легше валідувати.

Використання для дослідження нативних клітин або культури гепатоцитів є підходящою моделлю для дослідження широкого спектра ксенобиотиків і індукуємою ними токсичності [Яковлев С.В., 2002; J. G. Hengstler, D. Utesch, P. Steinberg et al, 2000; A. P. Li, P. D. Gorycki, J. G. Hengstler et al, 1999].

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація виконана за планом науково-дослідних робіт Національного фармацевтичного університету з проблеми МОЗ України „Хімічний синтез, виділення та аналіз нових фармакологічно активних речовин, встановлення зв'язку „структура-дія”, створення нових лікарських препаратів”. Номер держреєстру 0198U007011.

Мета і задачі дослідження. Мета дисертаційної роботи - експериментальне обгрунтування застосування методів in vitro на етапах доклінічних досліджень гепатозахистних лікарських засобів. Виходячи з поставленої мети було необхідним вирішення наступних завдань:

1. Визначити перспективність застосування методів дослідження лікарських засобів за допомогою культури клітин на основі гепатоцитів людини.

2. Визначити LC₅₀ гепатотоксинів СС1₄, гентаміцину, тетрацикліну та Д-галактозаміну.

3. Визначити ЕС₅₀ гепатопротекторів Ліолів, Глутаргін, Силібор та кардіопротектору Предуктал in vitro.

4. Вивчити вплив гепатопротекторів на гепатоцити in vitro за умов створення модельної патології різного походження та дослідити:

- виживаність гепатоцитів в культурі під впливом гепатопротекторів та кардіопротектору на фоні ураження гепатотоксинами;

- біохімічні зміни в клітинах під впливом гепатопротекторів та кардіопротектору на фоні ураження гепатотоксинами;

- морфометричні та морфологічні зміни гепатоцитів в культурі під впливом гепатопротекторів на фоні ураження гепатотоксинами.

5. Порівняти результати вивчення лікарських засобів Ліолів, Глутаргін, Силібор, отриманих шляхом in vivo та in vitro на моделі ураження СС1₄.

6. Провести порівняння фармакоекономічних витрат, що необхідні для вивчення токсикологічних властивостей лікарських засобів та вивчення їх ефективності in vitro та in vivo.

Об'єкт дослідження - фармакологічна активність Ліоліву, Глутаргіну, Силібору та Предукталу in vitro

Предмет дослідження - застосування культури клітин HepG2 для дослідження токсикологічних та фармакологічних властивостей лікарських засобів (гепатопротекторів).

Методи дослідження. При виконанні дисертаційної роботи були використані фармакологічні, токсикологічні, біохімічні, гістологічні, морфологічні методи дослідження та методи математичної статистики.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше проведене вивчення гепатопротекторів вітчизняного виробництва за допомогою методів in vitro. Встановлено, що на різних моделях ураження гепатоцитів в культурі досліджувані гепатопротектори Ліолів, Глутаргін та Силібор виявили стимулюючий ефект щодо проліферативної активності клітин в культурі. Виявлено, що під впливом гепатопротекторів нормалізувалися біохімічні та морфометричні показники уражених гепатоцитів в культурі. Спостерігалася позитивна динаміка у морфологічному стані уражених гепатоцитів під впливом гепатопротекторів на фоні ураження токсинами.

Показано, що зміни функціональних показників гепатоцитів in vivo та in vitro мали однакову тенденцію, що свідчить про автентичність застосованого методу на основі культури гепатоцитів. Вперше проведений порівняльний фармакоекономічний аналіз щодо оцінки ефективності Ліоліву in vivo та in vitro показав економічну доцільність застосування методу з використанням культури гепатоцитів.

Новизна роботи підтверджена патентом ₍₁₉₎UA₍₁₁₎66216₍₁₃₎A від 15.04.2004 р. на спосіб визначення токсичних або фармакотерапевтичних доз лікарських речовин.

Практичне значення одержаних результатів. Експериментально обгрунтовано використання методів in vitro на основі клітинних культур на етапі доклінічних досліджень лікарських речовин і скринінгових досліджень хімічних сполук.

За матеріалами дисертації опубліковані методичні рекомендації „Використання тест-системи на основі гепатоцитів у вивченні ефективності біологічно активних речовин” (Київ, 2005), затверджені МОЗ України.

Результати дисертаційної роботи впроваджено в навчальний процес на кафедрі загальної та клінічної фармакології Одеського державного медичного університету, кафедрі фармакології Тернопільского державного медичного університету ім І.Я. Горбачевського, кафедрі фармакології з курсом клінічної фармакології Криммедуніверситету, кафедрі фармакології та клінічної фармакології Дніпропетровської медичної академії, кафедрі фармакології Вінницького національного медичного університету ім М.І. Пирогова, кафедрі фармакології Луганського державного медичного університету.

Особистий внесок дисертанта в одержання наукових результатів. Разом з науковим керівником визначені мета, завдання, розроблені методичні підходи, згідно з якими відібрані моделі та методи для виконання експериментальної частини дисертаційної роботи. Особисто проведені: патентно-інформаційний пошук, експериментальні дослідження, фармакоекономічний аналіз, статистична обробка, аналіз та систематизація отриманих результатів, сформульовані висновки дисертації. В наукових працях, опублікованих у співавторстві, дисертантом наведені результати власних експериментальних досліджень, прийнята участь в аналізі й узагальненні отриманих даних, у написанні статей.

Апробація результатів дисертації. Основні положення роботи викладені і обговорені на Міжнародному семінарі „Лабораторные животные - возможные альтернативы в экспериментальной фармакологии” (м. Харків, 2002); науково-практичній конференції “Гепатопротекторы в Украине: перспективы и реалии” (м. Харків, 2003); Всеукраїнській науково-практичній конференції з міжнародною участю „Лекарства-человеку” (м. Харків, 2004); науково-практичній конференції “Досягнення та перспективи використання вітчизняного препарату Глутаргін в клініці внутрішніх хвороб” (м. Харків, 2005).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 11 наукових робіт. З них - 5 статей (у наукових фахових виданнях), 4 тези доповідей, 1 патент, 1 методичні рекомендації.

Обсяг та структура дисертації. Дисертація викладена на 161 сторінках, має 40 рисунків, 32 таблиці і складається з вступу, огляду літератури, матеріалів і змісту досліджень, 5 розділів власних експериментальних досліджень, аналізу і узагальнення результатів досліджень, висновків, списку літератури. Перелік використаних джерел містить 227 найменувань, в тому числі 156 іноземних.

2. ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи експериментальних досліджень. Розробку моделей гострого ураження гепатоцитів в культурі проводили за допомогою внесення гепатотоксинів в різних концентраціях в культуру клітин HepG2 виробництва лабораторії іммуногенетики МГНЦ РАМН. Для моделювання патології на культурі гепатоцитів були застосовані традиційно використовувані токсини in vivo: СС1₄, тетрациклін, Д-галактозамін (Доклінічні дослідження лікарських засобів: Метод. рек., 2001). Також для моделювання патології in vitro використовували гентаміцин, який з ціллю моделювання патології печінки на тваринах раніше не використовувався, але є експериментальні та клінічні свідчення про його гепатотоксичну дію (Хазанов А.И. и др. 2000 г.).

Для визначення LC₅₀ токсинів використовували концентрації в таких діапазонах: СС1₄ - (0,41-13,0) нмоль/мл, гентаміцин - (0,00022-0,0053) ммоль/мл, тетрациклін - (0,0078-0,13) мкмоль/мл та Д-галактозамін - (0,07-2,24) мкмоль/мл.

Вивчення ЕС₅₀ досліджуваних лікарських засобів проводилося у наступному диапазоні концентрацій: Ліолів - (80-320) мкг/мл; Глутаргін - (150-600) мкг/мл; Силібор - (20-80) мкг/мл, Предуктал - (5-20) мкг/мл.

Зміни біохімічного стану гепатоцитів в культурі визначали за показниками, що є найбільш характерними для патології печінки: АЛТ, АСТ, ЛФ, ЛДГ, -ГТП (за допомогою наборів ЗАТ “Диакон-ДС”) та МДА, ДК (Медицинские лабораторные технологии, 1998).

Крім того, вивчався вплив гепатотоксинів на морфологічний стан клітин в культурі та на їх морфометричні показники, оцінка яких проводилась за допомогою комп'ютерної програми “Scion Image”.

Токсини вносили до культури гепатоцитів на 2-у добу після їх розсіювання, а оцінку виживаності клітин, біохімічних показників та морфологічних і морфометричних показників проводили на 3-ю добу.

Дослідження лікарських засобів in vivo проводили на статевозрілих нелінійних щурах-самцях вагою 200-270 г, що утримувались в стандартних умовах віварію, на базі ЦНДЛ НФаУ. Усього в експерименті було використано 40 тварин. Експеримент проводився згідно з методичних рекомендацій під ред. О.В. Стефанова, 2001.

Результати власних досліджень. При дослідженні виживаності гепатоцитів в культурі під впливом токсинів у різних концентраціях було виявлено, що СС1₄ у концентрації 0,0065 мкмоль/мл призвів до загибелі 53,87 % клітин в культурі, гентаміцин призвів до загибелі 62,44 % клітин в культурі у концентрації 1,1 мкмоль/мл, тетрациклін у концентрації 0,062 мкмоль/мл загубив 52,5 % клітин та Д-галактозамін у концентрації 0,559 мкмоль/мл призвів до загибелі 54,6 %. Таким чином, ці концентрації відповіли LC₅₀ для використовуваної нами культури клітин.

Найбільш токсичним виявився тетрахлорметан, тому що для того, щоб викликати загибель приблизно 50 % клітин у культурі він використовувався в найменшій концентрації в порівнянні з іншими токсинами. Найменш токсичний виявився гентаміцин, оскільки викликає 50 % загибелі клітин в найбільшій концентрації в порівнянні з іншими гепатотоксинами.

Дія токсинів у вказаних концентраціях (LC₅₀) сприяє порушенню біохімічних показників в культурі (рис. 1).

Рис. 1. Ступінь змін біохімічних показників після внесенні СС1₄ в культуру гепатоцитів.

Дані рис. 1 свідчать про те, що дія СС1₄ в концентрації LС₅₀ призводить до порушення біохімічних показників печінки. При проведенні послідуючих експериментів з гентаміцином, тетрацикліном і Д-галактозаміном спостерігався такий саме ефект. Усі досліджувані показники змінилися наступним чином: активність АЛТ зросла в (1,6 - 2,3) рази, АСТ - у 2,1 рази, -ГТП - в (1,8 - 2,0) рази, ЛФ - в (2,0 - 2,2) рази, ЛДГ - в (1,8 - 2,0) рази, вміст ДК зріс в (1,9 - 2,2) рази і МДА - в (1,8 - 2,0) рази.

Вплив гепатотоксинів призвів також до морфологічних і морфометричних змін у клітинах, характерних для грубих морфо-патологічних порушень у гепатоцитах. Під їх впливом відбулися зміни форми і цілісності клітин, у ядрах спостерігалися коагуляція хроматину, пікноз, лізис ядра. Морфометрично спостерігається збільшення площі та переметру клітин, а також ядерно-цитоплазматичних відносин (відносини площі та периметра ядра до площі і периметра цитоплазми відповідно). Ядерно-цитоплазматичні відношення за площею збільшилися на (63,16 - 115,79) %, за периметром - на (32,5 - 65,0) %.

Ці дані, також як і біохімічні показники, є підтвердженням того факту, що оцінка токсичності тієї або іншої речовини по виживанню гепатоцитів у культурі є інформативним і достовірним показником.

Проведений експеримент дозволив визначити LС₅₀ СС1₄, гентаміцину, тетрацикліну та Д-галактозаміну для подальшого моделювання патології гепатоцитів в культурі. Вивчення змін біохімічних та морфометричних показників та морфологічного стану гепатоцитів в культурі показали, що мають місце грубі порушення, що характерні для патології печінки in vivo. Внесення токсинів в концентрації LС₅₀ призвело до зміни біохімічних та морфометричних показників майже вдвічі.

Визначення ЕС₅₀ лікарських засобів проводилося на моделі ураженя СС1₄ гепатоцитів в культурі. Токсин використовувався у концентрації LC₅₀. Експеримент займав 4 доби, оскільки гепатопротектори вносилися до культури клітин на 3-ю добу експерименту.

Ліолів виявив найбільш високу протекторну дію у концентрації 160 мкг/мл культурального середовища, Глутаргін - у концентрації 300 мкг/мл, Силібор - 40 мкг/мл та Предуктал - 10 мкг/мл. Таким чином, ці концентрації є ЕС₅₀ для випробовуваних лікарських засобів та були використані у подальшіх експериментах на культурі клітин. Предуктал був залучний до експерименту з метою визначення специфічності дії випробовуваних гепатопротекторів на моделі ураження культури клітин.

В експерименті по вивченню ефективності Ліоліву, Глутаргіну, Силібору та Предукталу in vitro досліджувався їх вплив на виживаність гепатоцитів в культурі, зміни їх біохімічного стану та вплив гепатопротекторів на морфологічні і морфометричні зміни на фоні ураження 4-ма токсинами.

Для цього проводили моделювання ураження культури гепатоцитів СС1₄, гентаміцином, тетрацикліном та Д-галактозаміном у концентраціях LC₅₀.

В таблиці 1 наведені дані, щодо виживаності клітин в кульутурі після внесення гепатопротекторів в концентраціях ЕС₅₀ на фоні ураження клітин токсинами у концентраціях LC₅₀.

Як видно з таблиці 1 при внесенні токсинів в культуру гепатоцитів виживаність клітин впала на (49,75-53,22) %. При внесенні Ліоліву в культуру клітин на фоні ураження токсинами виживаність гепатоцитів зросла у порівнянні з групою негативного контролю на (31,33 - 36,97) %, при внесенні Глутаргіну - на (40,54 - 51,76) %, при внесенні Силібору - на (39,08 - 52,7) %, при внесенні Предукталу - на (22,2 - 27,1) %.

Таблиця 1.Оцінка виживаності клітин в культурі при різних моделях їхнього ураження.

Примітки: Gt - гентаміцин, Т - тетрациклін, D-gl - Д-галактозамін, L - Ліолів, Glu - Глутаргін, Sb - Силібор, Pr - Предуктал.

* - вірогідна відмінність від контрольної групи;

** - вірогідна відмінність від інтактної групи.

Таким чином, вплив лікарських засобів на ураженні гепатоцити призвів до підвищення виживаність цих клітин в культурі, що свідчить про ефективність відтворюваних моделей in vitro. Але вплив гепатопротекторів виявився ефективнішим у порівнянні з кардіопротектором, що свідчить про специфічність дії гепатопротекторів відносно даної культури клітин, тобто гепатоцитів.

При вивчені біохімічного стану клітин після дії гепатопротекторів на фоні ураження токсинами в культурі гепатоцитів у порівнянні з групою негативного контролю також спостерігалася нормалізація досліджуваних показників.

Вплив гепатотоксинів призвів до таких змін біохімічних показників: активність АЛТ зросла у 1,32-2,1 рази, АСТ - у 1,9-2,11 рази, -ГТП - у 1,8-2,2 рази, ЛФ - у 2,0-2,15 рази, ЛДГ - у 1,8-2,2 рази, ДК - у 2,2-2,4 рази, МДА - у 1,8-1,9 рази.

Проведені експерименти показали, що, незалежно від моделі ураження культури гепатоцитів, використовувані препарати виявляють протекторний ефект. Цей ефект виражається в нормалізації перелічених біохімічних показників. Під впливом Ліоліву на моделі ураження СС1₄ означені показники знизилися у порівнянні з групою негативного контролю: активність АЛТ знизилася у 1,32 рази, АСТ - у 2,1 рази, -ГТП - у 1,8 рази, ЛФ - у 1,9 рази, ЛДГ - у 2,0 рази, ДК - у 1,7 рази, МДА - у 1,6 рази. Під впливом Глутаргіну зниження цих показників сталося таким чином: АЛТ - 1,4 рази, АСТ - у 2,1 рази, -ГТП - у 1,9 рази, ЛФ - у 2,0 рази, ЛДГ - у 2,0 рази, ДК - у 2,6 рази, МДА - у 1,7 рази. Силібор призвів до зниження досліджуваних показників таким чином: АЛТ - у 1,4 рази, АСТ - у 2,1 рази, -ГТП - у 1,8 рази, ЛФ - у 2,0 рази, ЛДГ - у 1,9 рази, ДК - у 2,3 рази, МДА - у 1,6 рази. Дія Предукталу також знизила значення біохімічних показників: АЛТ - 1,2 рази, АСТ - у 1,8 рази, -ГТП - у 1,7 рази, ЛФ - у 1,6 рази, ЛДГ - у 1,9 рази, ДК - у 1,7 рази, МДА - у 1,7 рази.

Вплив лікарських засобів на фоні дії гентаміцину, тетрацикліну та Д-галактозаміну призвів до таких саме знижень активності АЛТ, АСТ, -ГТП, ЛФ, ЛДГ та вмісту ДК і МДА.

Таким чином, виявлені зміни біохімічних показників свідчать про те, що використовувані гепатопротектори виявляють більший у порівнянні з кардіопротектором стабілізуючий ефект in vitro. Результати, отримані для гепатопротекторів узгоджуються з відомими результатами експериментів in vivo [Бабак О.Я., Фролов В.М., Харченко Н.В., 2005].

Як було показано раніше, введення в культуру гепатоцитів токсинів CCl₄, гентаміцину, тетрацикліну і Д-галактозаміна призвело до грубих морфологічних та морфометричних порушень у цих клітинах. Після введення в культуру гепатоцитів препаратів Ліолів, Глутаргін і Силібор більшість цих явищ усувалася. Морфологічно відзначалося більш високе збереження структурної цілісності клітин у порівнянні з інтактним контролем. Візуально клітини за розміром порівнянні з клітинами інтактної групи (після внесення Глутаргіну в культуру), або були трохи більше (після внесення Ліоліву і Силібору в культуру). Але у всіх випадках спостерігалася ізоморфність клітин, наявність чітких клітинних границь, амфофільність цитоплазми, нормальний стан і розташування ядерця в ядрі. Лише частина клітин була гіпертрофована, зруйнована та характеризувалася зернистістю цитоплазми і зміненим станом ядра. Особливої різниці між дією гепатопротекторів на фоні ураження токсинами не спостерігалося.

Ядерно-цитоплазматичні відношення за площею збільшилися в 1,63 - 2,21 рази, за периметром - в 1,3 - 1,55 рази. Подібні зміни морфометричних показників ще раз свідчать про наявність грубих патологічних порушень у структурі гепатоцитів.

Після внесення в культуру гепатоцитів, уражену різними токсинами, гепатопротекторів морфометричні показники вірогідно знизилися у порівнянні з групою негативного контролю. Під впливом ядерно-цитоплазматичні відношення за площею знизилися у 1,8-2,4 рази; за відношенням по периметру - у 1,2-1,4 рази. При внесенні Глутаргіну ядерно-цитоплазматичні відношення знизилися таким чином: за відношенням по площі - у 1,6-2,2 рази; за відношенням по периметру - у 1,2-1,4 рази. Силібор призвів до зниження ядерно-цитоплазматичних відношень за площею - у 1,7-2,4 рази; за периметром - у 1,1-1,4 рази.

Отримані результати є ще одним доказом ефективності препаратів Ліолів, Глутаргін і Силібор. Завдяки їх дії значення морфометричних показників, що зросли під впливом гепатотоксинів, знизилися, а деякі не відрізнялися від значень у групі інтактного контроля. Таким чином, біохімічні та морфологічні зміни показують, що незалежно від виду патології на культурі клітин спостерігалася одна і та ж тенденція, що свідчить про позитивний вплив лікарських засобів з гепатопротекторною активністю.

З метою визначення змін, що відбулися у культурі клітин, було б доцільно провести аналогічні випробування in vivo. Для цього був використаний СС1₄ для відтворення модельної патології.

Введення CC1₄ викликає в щурів важке отруєння, що призводить до загибелі 25 % тварин. У тварин, що вижили, не відзначені статистично значимого зниження маси тіла порівняно з вихідним рівнем (табл. 2). Масовий коефіцієнт печінки збільшився і перевищував на 54 % показник інтактних тварин (табл. 2).

Таблиця 2. Вплив Глутаргіна, Силібора і Ліоліва на показники виживаності, маси тіла і масовий коефіцієнт печінки (МКП) щурів в умовах підгострого CCl₄ - гепатиту (М m)

Примітка: * - розходження статистично вірогідні у порівнянні з інтактним контролем; ** - розходження статистично вірогідні у порівнянні з негативним контролем; МКП - масовий коефіцієнт печінки.

Введення СС1₄ у культуру гепатоцитів HepG2 призвело до загибелі 53,22 % клітин у культурі (табл. 1) та до інтенсифікації процесів цитолізу і ПОЛ.

Підгострий вплив CC1₄ викликав порушення біохімічних показників у гомогенатах печінки, що виявлялося в підвищенні рівня сироваткових ферментів, активації процесів ПОЛ (табл. 3).

Таблиця 3. Зміна біохімічних показників під впливом Ліоліва, Глутаргіна і Силібора in vivo на фоні ураження тварин СС1₄.

Примітки: L - Ліолів; Glu - Глутаргін; Sb - Силібор.

Внесення гепатопротекторів в культуру гепатоцитів призвело до вірогідного підвищення виживаності клітин у цій культурі в порівнянні з негативним контролем (табл. 3).

Досліджувані біохімічні показники після дії гепатопротекторів вірогідно знизилися, як у гомогенатах печінки тварин, так і в культурі клітин, наближаючись до рівня інтактного контролю (табл. 3).

Введення тетрахлорметану викликало у щурів важке ураження печінки. Везикули переважно великі, часто займають усю цитоплазму гепатоцитів. У багатьох клітинах трапляється жирова і гидропічна (балонна) дистрофія. Досить часто спостерігаються мікрокісти і руйнування клітин. В осередках деструкції спостерігається помірна кількість лімфоцитів, макрофагів, нечисленні поліморфноядерні лейкоцити, що місцями формують дрібні ліпогранульоми навколо жирових кист. Чисельність двуядерних гепатоцитів візуально знижена. Відзначено значне коливання розмірів ядер клітин (анізонуклеоз). У деяких з них збільшена кількість ядерець (до 3-4 на ядро). Мітози в гепатоцитах дуже рідкі. СС1₄, введений в культуру гепатоцитів, як було сказано вище, призвів до патологічних змін морфофункціонального стану цих клітин.

Введення тваринам гепатопротекторів призвело до значного поліпшення морфологічного стану печінки і стабілізації морфометричних показників.

У стані печінки щурів, що лікувалися ліолівом, спостерігається значно більш слабка виразність стеатозу центролобулярних і перипортальних зон. Гідропічна дистрофія - слабка або помірна. Активізуються процеси регенерації: більше мітозів у гепатоцитах, клітин у фазі синтезу ДНК, двуядерних клітин.

Введення на фоні впливу CCl₄ глутаргіну поліпшувало стан печінкової паренхіми. Жирова дистрофія гепатоцитів в основному середньо- і мілкокрапельна. Гідропічна дистрофія клітин зустрічається рідко. У самих зонах ураження збільшена кількість клітин, що зберігають усі ознаки життєздатності. Добре простежується інтенсифікація ознак регенерації: збільшений анізонуклеоз; є клітини, ядра яких - у фазі синтезу ДНК. У препаратах збільшена чисельність мітотичних клітин, що поділяються, візуально підвищена наявність двоядерних гепатоцитів, що синтезують більшу кількість білка.

Силібор у трохи меншому ступені, у порівнянні з глутаргіном, впливає на інтенсивність жирової дистрофії, яка викликана CCl₄: везикули часто ще досить великі, але жирові кисти рідкі. Гідропічна дистрофія гепатоцитів виражена слабко. Істотно звужуються розміри осередків ураження, що розташовуються часто ізольовано один від одного або обмежуються периметром судини, не поширюючи всередину паренхіми. Підвищена кількість клітин з незміненим ядром і цитоплазмою. Збільшена кількість клітин, що знаходяться у фазі синтезу ДНК, визначаються і гепатоцити, що знаходяться на різних стадіях мітозу.

Після внесення в культуру гепатоцитів гепатопротекторів, що вже описувалося, спостерігалися позитивні зміни у морфофункціональному стані клітин (структурна цілісність клітин, більша ізоморфність у порівнянні з негативним контролем, чіткі клітинні границі, амфофільність цитоплазми, нормальний стан і розташування ядерця в ядрі).

Морфометричні показники клітин на гістопрепаратах після введення СС1₄ тваринам вірогідно зросли (рис. 7), а також у гепатоцитах на пофарбованих мазках in vitro (рис. 6). Після впливу гепатопротекторів ці показники значно знизилися у порівнянні з негативним контролем, як in vivo (рис. 7), так й in vitro (рис. 6).

Таким чином, отримані результати свідчать про те, що гепатопротектори в умовах інтоксикації, викликаної 4-х денним введенням CCl₄, запобігають загибелі тварин і в значній мірі зменшують біохімічні ознаки інтоксикації.

В умовах ураження культури гепатоцитів тим же токсином спостерігалося поліпшення проліферативних здібностей клітин після введення в культуру гепатопротекторів і ослаблення процесів цитолізу і ПОЛ (см. вище). Це свідчить про наявність однакових тенденцій у змінах морфологічних і морфометричних показників як in vivo, так і in vitro, і про те, що моделі ураження тварин і гепатоцитів у культурі, створені за допомогою СС1₄, відповідають один одному.

Фармакоекономічний аналіз показав, що експеримент по визначенню ефективності Ліоліва на тваринах коштував 2920,53 грн., а за часом на його проведення необхідно було 14 днів. На проведення експерименту по вивченню фармакологічної активності Ліоліва на культурі гепатоцитів було витрачено 510,70 грн. За часом експеримент зайняв 4 дні.

Таким чином, на експеримент in vitro було витрачено в 4,69 рази менше грошей, ніж на експеримент in vivo та в 3,5 менше часу.

Виходячи з усього вище сказаного випливає очевидна затратно-ефективна вигода використання методів на основі культури гепатоцитів або будь-якої іншої культури клітин при проведенні фармакологічних досліджень на етапы скринінгу, що свідчить про значно більшу комплаєнтність зазначеного методу.

ВИСНОВКИ

Теоретично обгрунтована та експериментально доведена можливість моделювання патології in vitro (на культурі гепатоцитів) за допомогою різних гепатотоксинів, використовуваних з метою створення модельної патології різної етиології на тваринах. Отримані результати свідчать про автентичність методу in vitro традиційно використовуваним методам in vivo. Запропонований метод з використанням культури клітин економічний і гуманний стосовно тварин. Застосування методу in vitro на основі культури клітин відповідає вимогам GLP і директивам ЄС по обмеженню використання тварин у біомедичній практиці.

1. Доведена перспективність застосування культур клітин при дослідженні лікарських засобів

2. Визначені LC₅₀ токсинів на культурі клітин.

3. Визначені ЕС₅₀ лікарських засобів за допомогою культури гепатоцитів.

4. На відтворених різних моделях патології печінки in vitro була показана можливість порівняльного вивчення лікарських препаратів: патологічні зміни біохімічних і морфо-функціональних показників клітин в культурі під впливом гепатотоксинів нормалізуються після внесення досліджуваних гепатопротекторів.

5. Порівняльні дослідження, проведені на культурі клітин і на білих лабораторних щурах, показали наявність однакових тенденцій у змінах біохімічних і морфо-функціональних показниках клітин як in vitro, так і in vivo.

6. Порівняльний аналіз економічних витрат, необхідних для вивчення ефективності гепатопротектора Ліолів in vitro і in vivo, показав очевидну перевагу використання культури клітин на цьому етапы доклінічних досліджень у порівнянні з використанням тварин.

7. Проведені порівняльні дослідження по ефективності використання методів in vitro на деяких етапах доклінічного вивчення лікарських засобів доказали комплаєнтну наукову, економічну та біоетичну перевагу цих методів у порівнянні з традиційними методами з використанням тварин.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Волчик І.В., Дроговоз С.М., Чернова Т.М. Використання клітинних ліній у фармакології і токсикології. // Одеський медичний журнал. - 2002. - № 4(72). - С. 110. (Особистий внесок здобувача - узагальнення результатів).

2. Волчик І.В., Дроговоз С.М., Чернова Т.М. Переваги використання клітинних ліній для фармакологічних та токсикологічних досліджень. // Фізіологічно активні речовини. - 2002. - № 2(34). - С. 80-82. (Особистий внесок здобувача - узагальнення результатів).

3. Цитопротекторні властивості Глутаргіну у відношенні клітин лінії HepG2 при токсичному впливі гентаміцину в експерементах in vitro. / І. В. Волчик, С. М. Дроговоз, О. В. Доровський, Т. М. Зубченко, О. В. Супрун // Вісник фармації. - 2003. - № 4(36). - С. 95-98. (Особистий внесок здобувача - експериментальні дослідження).

4. Оцінка ефективності дії гепатопротекторів in vitro на моделі ураження клітин лінії HepG2 Д-галактозаміном. / І. В. Волчик, Л. М. Малоштан, В. М. Коваленко, Ю. Ю. Микулинський // Фармацевтичний журнал. - 2004. - № 4. - С. 91-94. (Особистий внесок здобувача - дослідження, статистична обробка даних).

5. Волчик І. В., Малоштан Л. М.. Гепатозахисна активність Глутаргіну in vitro. // Клінічна фармація. - 2004. - Т.8, № 4. - с. 46-49. (Особистий внесок здобувача - проведення експерименту, статистична обробка даних).

6. Волчик И. В., Дроговоз С. М., Прокопищак Н. И. Оценка in vitro эффективности и токсичности препарата лиолив. // Материалы научно-практической конференции “Лекарства - человеку”. - Харьков. 2002. - Т. XVII. - С. 106.

7. Волчик И. В. Изучение фармакотерапевтических свойств аргинина глутамата in vitro. // Международный семинар „Лабораторные животные - возможные альтернативы в экспериментальной фармакологии”: Тез. докл. - Харьков. 2002. - С. 45.

8. Волчик І.В., Малоштан Л.М. Вплив гепатопротекторів на біохімічний стан гепатоцитів на моделі ураження СС1₄ in vitro. // Всеукраинская научно-практическая конференция с международным участием „Лекарства-человеку”. Материалы конференции. - Харьков. 2004. - с. 39.

9. Черних В.П., Малоштан Л.М., Дроговоз С.М., Волчик І.В., Микулінський Ю.Ю., Щегільська О.А. Використання тест-системи на основі гепатоцитів у вивченні ефективності біологічно активних речовин. Методичні рекомендації. - Київ. 2005.

10. Волчик И.В., Малоштан Л.Н., Доровской А.В. Изучение гепатопротекторных свойств глутаргина на культуре гепатоцитов человека. // Науково-практична конференція “Досягнення та перспективи використання вітчизняного препарату Глутаргін в клініці внутрішніх хвороб”: Тез. докл. - Харків. 2005. - с. 152.

11. Деклараційний патент на винахід: Спосіб визначення токсичних або фармакотерапевтичних доз лікарських речовин. Волчик І. В., Микулінський Ю. Ю., Дроговоз С. М., Чепелюк В. І., Щегільська О. А. / ₍₁₉₎UA₍₁₁₎66216₍₁₃₎A. - Бюл. № 4 від 15.04.2004. 5с.

Размещено на Allbest.ru