Вплив нікотину на функції клітин В-лімфоцитарного походження

Размещено на http://www.allbest.ru

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ БІОХІМІЇ ІМ. О.В. ПАЛЛАДІНА

УДК 577.27

Вплив нікотину на функції клітин В-лімфоцитарного походження

03.00.04 - біохімія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Коваль Людмила Миколаївна

Київ 2006

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України.

Захист відбудеться “5” червня 2006 р. о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.240.01 в Інституті біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України за адресою: 01601, м. Київ, вул. Леонтовича, 9.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України (м. Київ, вул. Леонтовича, 9).

Автореферат розісланий “4” травня 2006 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, кандидат біологічних наук Кірсенко О.В.

адгезія нікотиновий ацетилхолін

АНОТАЦІЯ

Коваль Л.М. Вплив нікотину на функції клітин В-лімфоцитарного походження.- Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 - Біохімія. - Інститут біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України, Київ - 2006.

Дисертацію присвячено дослідженню молекулярних основ впливу нікотину на клітини В-лімфоцитарного походження. Встановлено, що нікотин впливає на базові життєві функції клітинних ліній мієломи X63-Ag8, гібридом SP-2/0 і 1D6 та лімфом DT40 і Ramos, діючи на експресовані ними нікотинові ацетилхолінові рецептори (нАХР). Клітини досліджених ліній експресують 42- і 7(4)-вмісні нАХР, їх кількість і співвідношення відрізняються у клітин різного видового походження. Показано, що нікотин впливає на кількість нАХР, експресованих на поверхні досліджених клітин, здійснюючи їх ап- або даун-регуляцію, що залежить від функціонального стану клітин. Чутливість до дії нікотину залежить як від кількості нАХР, так і від їх функціональної активності, на яку зокрема впливають адгезивні контакти клітин. Нікотин стимулює проліферацію гібридом і опосередковано знижує продукцію ними антитіл, а також сприяє виживанню за несприятливих умов клітин пре-В лімфоми DT40. Механізм передачі проліферативного сигналу в клітинах досліджених ліній потребує відкриття іонного каналу, або конформаційних змін в молекулі рецептору. Отримані дані свідчать на користь про-проліферативної ролі нікотину для В-лімфоцитів, що може пояснити розвиток лімфопроліферативних захворювань і зниження кількості сироваткових імуноглобулінів у людей, що палять цигарки.

Ключові слова: нікотин, нікотиновий ацетилхоліновий рецептор, клітинні лінії В-лімфоцитів.

АННОТАЦИЯ

Коваль Л.Н. Влияние никотина на функции клеток В-лимфоцитарного происхождения. - Рукопись.

Дисертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.04 - Биохимия. - Институт биохимии им. А.В.Палладина НАН Украины, Киев - 2006.

Курение табака является большой медицинской и социальной проблемой. Никотин, содержащийся в табачном дыме, является причиной патологических изменений в дыхательных путях, коже, сосудах и иммунной системе. Никотин стимулирует пролиферацию многих типов клеток и подавляет иммунные реакции, что способствует росту опухолей. Клеточные эффекты никотина опосредованы никотиновыми ацетилхолиновыми рецепторами (нАХР), которые экспрессированы не только в нервных и мышечных, но и во многих невозбудимых тканях. Исследования последних лет показали присутствие нАХР в Т-лимфоцитах, в то время как наличие, состав и функции нАХР В-лимфоцитов оставались малоизученными. Задачей настоящей диссертационной работы было изучение влияния никотина, опосредованное никотиновыми ацетилхолиновыми рецепторами, на пролиферативные процессы и поддержание жизненных функций клеточных линий В-лимфоцитарного происхождения.

В работе изучали клетки мышиных миеломы X63-Ag8 и гибридом SP-2/0 и 1D6, пре-В лимфомы кур DT40 и лимфомы Беркитта человека Ramos. Методом клеточного иммуноферментного анализа и проточной цитофлуориметрии, с помощью антител и токсинов, специфичных к разным субъединицам нАХР, установлено, что клетки исследованных линий экспрессируют 42- и 7(4)-содержащие нАХР, причем количество и спектр представленных субтипов отличаются у клеток разного видового происхождения. Количество рецепторов на поверхности регулируется никотином, который может приводить к их как ап-, так и даун-регуляции, подобно нАХР нейронов.

Методом включения триазолила голубого показано, что никотин в дозах, соответствующих таковым в крови и органах курильщиков табака (1 нМ - 10 мкМ), стимулирует пролиферацию клеток гибридом и лимфом. При этом наблюдается снижение количества клеток, секретирующих антитела. Напротив, ?-кобратоксин и “слабый” токсин, конкурентные блокаторы 7-содержащих субтипов нАХР, угнетают пролиферацию клеток гибридомы и способствуют продукции антител. На основании этих данных сделан вывод о том, что никотин является про-пролиферативным фактором для клеток В-лимфоцитарного происхождения, и его эффект опосредован 7-содержащими нАХР. Кроме того, никотин способствует выживанию клеток линии DT40 в условиях перерастания культуры, то есть является источником анти-апоптических сигналов.

Установлено, что чувствительность клеток к никотину не является постоянной, а зависит от количества экспонированных на поверхности нАХР и их функционального состояния. В частности, показано, что клетки, которые интенсивно делятся, экспонируют значительно больше нАХР, чем клетки, вышедшие из клеточного цикла и прочно прикрепившиеся к подложке. С другой стороны, лишение клеток адгезионных контактов с подложкой путем имитации условий микрогравитации или вибрации не влияет на количество экспонированных нАХР, но делает рецепторы нечувствительными к никотину, то есть десенситизирует их. При этом клетки увеличиваются в размере, прекращают деление, изменяют спектр молекул адгезии (гликозаминогликанов), и в них повышается содержание внутриклеточного кальция. Эти данные позволили сделать вывод о том, что подобно нАХР нервных клеток функциональная активность рецепторов В-лимфоцитарного происхождения зависит от концентрации внутриклеточного кальция, которая, в свою очередь, изменяется в процессе клеточного цикла, регулируемого адгезионными контактами клеток.

Поскольку нАХР являются ионными каналами, главным медиатором их внутриклеточного сигналинга считают катионы, в частности, ионы кальция, входящие в клетку при активации рецептора. Кроме того, открытие канала сопровождается конформационными переходами в молекуле нАХР, которые могут активировать другие сигнальные каскады. В настоящей работе обнаружено, что блокатор открытого ионного канала бензогексоний угнетает пролиферацию клеток гибридомы в присутствии никотина. Эти данные свидетельствуют о том, что механизм передачи пролиферативного сигнала требует открытия канала. Однако в клетках линии DT40 пролиферативным никотино-подобным эффектом обладал также 1 мкМ -кобратоксин. Вместе с имеющимися литературными данными этот результат свидетельствует, что для прохождения пролиферативного сигнала необходимы конформационные изменения в молекуле рецептора, которые могут быть вызваны открытием канала или связыванием специфических антагонистов.

Данные о даун-регуляции нАХР при хроническом воздействии никотина и стимулирующий эффект никотина на пролиферацию были подтверждены на нормальных В-лимфоцитах. Клетки селезенки крыс, которые получали никотин с питьевой водой в течение 10 месяцев, связывали существенно меньше нАХР-специфичных антител, чем клетки животных, которые пили чистую воду. В культуре клеток селезенки мышей, иммунизированных гемоцианином, никотин увеличивал число клеток, продуцирующих антитела.

В целом, описанные в диссертационной работе данные помогают понять молекулярные основы развития лимфопролиферативных заболеваний на фоне снижения количества сывороточных иммуноглобулинов у курильщиков табака.

Ключевые слова: никотин, никотиновый ацетилхолиновый рецептор, клеточные линии В-лимфоцитов.

SUMMARY

Koval L. M. The effect of nicotine on functions of B lymphocyte-derived cells. - Manuscript.

Thesis for the scientific degree of candidate of biological sciences (equivalent to PhD) by speciality 03.00.04 - Biochemistry. - O. V. Palladin Institute of Biochemistry of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2006.

The dissertation studies the molecular basis of nicotine effects on the cells of B-lymphocyte origin. It is established that nicotine influences the basic vital functions of myeloma X63-Ag8, hybridomas SP-2/0 and 1D6 and lymphomas DT40 and Ramos, such as proliferation and survival, by affecting their nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs). The cells under investigation express 42- and 7(4)-containing nAChRs, their numbers and ratios varying among the cells of different species origin. Nicotine is shown to either up- or down-regulate the number of nAChRs exposed on the cell surface, depending on the functional state of the cell. Sensitivity to nicotine depends on both the number of nAChRs and their functional activity, which is affected, in particular, by adhesive contacts of the cells. Nicotine stimulates hybridoma proliferation, indirectly decreases the antibody production and favors pre-B lymphoma DT40 survival in overgrowth conditions. The transduction of proliferative signal requires either the ion channel opening, or certain conformational changes in the receptor molecule. The data obtained demonstrates the pro-proliferative role of nicotine for B lymphocyte-derived cells and helps to explain the lymphoproliferative states accompanied with the decrease of serum immunoglobulins in tobacco smokers.

Key words: nicotine, nicotinic acetylcholine receptor, B-lymphocyte cell lines.

1. ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Паління тютюну є великою медичною і соціальною проблемою. Маючи певний позитивний вплив на психоемоційний стан людини, паління викликає стан психоемоційної залежності, яка пізніше підкріплюється також на молекулярному рівні. При цьому вживання тютюн-вмісних продуктів має високий фактор ризику для здоров'я, значно підвищуючи імовірність виникнення хвороб серцево-судинної системи, шлунково-кишкового тракту, гострих або хронічних інфекцій дихальних шляхів, злоякісних пухлин різних органів, патологічних змін в шкірі та імунній системі і є головною причиною захворюваності та смертності в більшості розвинутих країн.

Тютюновий дим містить близько 4 тис. компонентів, більшість з яких мають виражену біологічну активність. Дослідження, проведені в середині ХХ століття, показували, що багато негативних наслідків паління, в першу чергу, канцерогенний ефект, притаманні переважно смолам, які містяться в цигарковому димі, і їх похідним, таким як бензпірен. В такому випадку використання фільтрів, які ефективно затримують смоли, повинно було звести нанівець негативні наслідки паління. Однак цього не відбулося. Було встановлено, що саме нікотин, який і викликає позитивні психоемоційні ефекти та є причиною утворення залежності від паління, порушує природні процеси в дихальних шляхах, шкірі, судинах і імунній системі і є причиною патологічних процесів в цих органах. Достовірно встановлено зв'язок між вдиханням нікотину і утворенням дрібноклітинної карциноми легенів (Schuller H.M., Orloff M., 1998). Виявилось, що нікотин сприяє проліферації багатьох типів клітин (Conti-Fine B.M. et al, 2000), а також викликає розширення судин (Villablanca A.C., 1998) і посилений ангіогенез (Heeschen C. et al, 2001), що сприяє кровопостачанню осередків виникнення пухлин і їх швидкому росту.

Завдяки ліпофільній природі, нікотин може легко потрапляти всередину клітини. Однак більшість його біологічних ефектів пов'язують із дією на специфічні рецептори - рецептори до ацетилхоліну нікотинового типу (нАХР). Спочатку ці рецептори було знайдено і досліджено в м'язових і нервових клітинах (Lindstrom J., 1996), але дослідження останніх років показали наявність нАХР на багатьох незбудливих клітинах, включаючи кератиноцити шкіри (Grando S.A., 1997), епітелій дихальних шляхів (Maus A.D. et al, 1998), ендотелій судин (Macklin K.D. et al, 1998) і клітини імунної системи (Lebargy F. et al, 1996; Mihovilovic M. et al, 1997; Benhammou K. et al, 2000; Cormier A. et al, 2004). Саме вони опосередкують вплив нікотину на відповідні тканини. Припускають, що багато наслідків хронічного вдихання цигаркового диму, підвищення чутливості до інфекцій та пухлиноутворення у людей, що палять, можуть виникати за рахунок пошкодження імунної системи (Sopori M., 2002). Дослідження, проведені протягом останніх десяти років, показали наявність нАХР на Т-лімфоцитах - клітинах, що впізнають антиген і опосередкують знищення чужорідних або перероджених власних клітин (Mihovilovic M. et al, 1997; Kuo Y. et al, 2002). Було знайдено, що нікотин також впливає на імунні реакції, опосередковані В-лімфоцитами, які є основними провідниками гуморальної ланки імунітету, однак присутність, склад і фізіологічні функції нАХР в В-лімфоцитах залишались маловідомими (Sato K.Z. et al, 1999; Benhammou K. et al, 2000). Завданням нашої роботи стало заповнення цієї прогалини з метою зрозуміти, як впливає нікотин на життєві функції клітин В-лімфоцитарного походження і якими субтипами нАХР опосередковані ці ефекти.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Роботу виконано у відділі молекулярної імунології Інституту біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України протягом 2000 - 2005 рр. Дисертація безпосередньо зв'язана з плановими дослідженнями відділу за бюджетними темами: „Дослідження імунохімічної структури біологічно активних білків та пептидів”, розділ ІІ „Вивчення будови та функцій нікотинових та протеазо-активованих рецепторів на лімфоцитах”, ДР № 0104U003280 (1999 - 2003, 2004-2008) та „Протеомікс біологічно активних білків людини, розробка методів одержання білків, важливих для діагностики і лікування, розділ VIIІ - „Вивчення експресії нікотинових ацетилхолінових рецепторів на лімфоцитах і їхньої ролі в нормі та за патологічних умов”, ДР № 0102V006218 (2002 - 2006 рр.).

Мета і завдання дослідження.

Метою дисертаційної роботи було вивчення впливу нікотину, опосередкованого нікотиновими ацетилхоліновими рецепторами, на проліферативні процеси та підтримання життєздатності клітинних ліній В-лімфоцитарного походження.

Для реалізації поставленої мети необхідно було вирішити такі завдання:

визначити субодиничну будову нАХР, представлених на клітинних лініях В-лімфоцитарного походження;

визначити, чи є експресія нАХР на поверхні клітин чутливою до дії нікотину, подібно до нАХР нейронів;

визначити, як нікотин впливає на проліферативний потенціал клітинних ліній, що досліджуються;

вивчити роль адгезії клітин в чутливості до нікотину;

дослідити механізм функціонування нАХР в клітинах В-лімфоцитарного походження.

Об'єкт дослідження: нікотиновий ацетилхоліновий рецептор в клітинних лініях В-лімфоцитарного походження.

Предмет дослідження: експресія нАХР в клітинних лініях В-лімфоцитарного походження; вплив нікотину на базові життєві функції клітин В-лімфоцитарного походження.

Методи дослідження. Експресію нАХР вивчали за допомогою клітинного імуноферментного аналізу або проточної цитофлуориметрії. Мікроскопічне дослідження клітин проводили безпосередньо в культурі або після фарбування за методом Папенгейма-Крюкова. Оцінку кількості живих клітин та визначення швидкості проліферації проводили за включенням трипанового синього або тріазолілу блакитного. Кількість антитіл, продукованих клітинами гібридоми, визначали сорбційним імуноферментним аналізом. Підрахунок кількості антитіло-секретуючих клітин проводили методом імуноферментних відбитків.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше вивчено субодиничну будову нАХР клітинних ліній X63-Ag8, SP-2/0, 1D6, Ramos і DT40. Показано, що В-лімфоцити досліджених ліній експресують нАХР 4в2- і 7(в4)-вмісних субтипів. Рівень їх поверхневої експресії регулюється нікотином, подібно до нАХР нервових клітин, причому нікотин може сприяти як збільшенню, так і зменшенню кількості нАХР на поверхні. Вперше показано, що кількість нАХР і, відповідно, чутливість до нікотину залежать також від функціонального стану клітин і їх адгезивних контактів з оточенням. Подібно до нАХР нейронів, рецептори вивчених клітинних ліній підлягають десенситизації за підвищення концентрації внутрішньоклітинного кальцію, а передача сигналу всередину клітини потребує відкриття іонного каналу.

Визначено роль нікотину в життєдіяльності клітинних ліній В-лімфоцитарного походження. Вперше показано, що в клітинах різного видового походження і різних ступенів диференціювання: пре-В лімфоми курчат DT40, лімфоми людини Ramos і мишачої гібридоми 1D6 нікотин стимулює проліферацію. Він також підтримує виживання клітин DT40 за несприятливих умов (перенаселення та дефіциту ростових факторів) і опосередковано знижує кількість антитіл, продукованих гібридомою.

Практичне значення роботи. Отримані результати свідчать, що нікотин примушує імунні клітини інтенсивно ділитися, замість того, щоб виконувати свої захисні функції, у випадку В-лімфоцитів - продукувати антитіла. Це може бути однією із причин зниження імунного захисту організму проти інфекцій і виникнення пухлин у людей, що палять. Більше того, при виникненні пухлини, яка походить із лімфоцитів, нікотин може сприяти її поширенню. Це означає, що паління знижує гуморальний імунітет шляхом прямого впливу на В-лімфоцити і може підтримувати ріст пухлин В-лімфоцитарного походження.

Особистий внесок здобувача. Дисертаційна робота - завершене дослідження, виконане автором відповідно до програми експериментальних досліджень, спланованих, проведених і узагальнених протягом 2000-2005 рр. Дисертантом особисто зроблено пошук та аналіз даних літератури, проведено більшість експериментів і зроблено науковий аналіз експериментальних даних, сформульовано основні положення та висновки. Результати досліджень, що викладені у підрозділах 3.1 - 3.4, 3.6 та 3.8, одержані автором особисто; підрозділи 3.5 та 3.7 виконано спільно з іншими співробітниками відділу молекулярної імунології в межах проекту УНТЦ „Вплив мікрогравітації на клітини, що продукують антитіла”. Антитіла проти субодиниць нАХР отримано у відділі молекулярної імунології молодшим науковим співробітником О.Ю. Лихмус. -Кобратоксин і його ФІТЦ-похідне, „слабкий токсин” і нейротоксин ІІ були надані професором В.Цетліним із Інституту біоорганічної хімії ім. Шемякіна-Овчіннікова РАН (Москва, Росія).

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень було оприлюднено на наукових семінарах відділу молекулярної імунології (2004, 2005 р.), конкурсах молодих вчених Інституту біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України (2003, 2004 рр.), на VIII Українському біохімічному з'їзді (м. Чернівці, 2002 р.), на Третій Українській конференції з перспективних космічних досліджень (Кацивелі, Крим, 2003 р.), Першому (Інагураційному) Українському з'їзді з клітинної біології (Львів, 2004 р.), а також на John Humphrey Advanced Summer Programme and Lecture Series in Immunology (Пущино, Росія, 2002 р.), 29th FEBS Meeting (Варшава, Польща, 2004 р.), 4th and 5th Parnas Conferences (Вроцлав, Польща, 2002 р. і Київ, 2005), 12th International Congress of Immunology and 4th Annual Conference of FOCIS, (Монреаль, Канада, 2004 р.).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 12 праць, з яких 3 статті в періодичних фахових наукових виданнях України та міжнародних наукових журналах і 9 тез доповідей у збірках вітчизняних та міжнародних конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація викладена на 139 сторінках друкованого тексту і складається з вступу, огляду літератури (8 підрозділів), експериментальної частини, що включає розділи „Матеріали і методи досліджень” (12 підрозділів) і „Результати досліджень і їх обговорення” (8 підрозділів), а також висновків, заключення, списку використаної літератури (290 найменувань), містить 36 рисунків, 107 сторінок основної текстової частини.

2. ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи дослідження. Більшість експериментів даної роботи було проведено на клітинних лініях, підтримуваних в культурі. Мишачу мієлому X63-Ag8 та гібридому SP2/0, яка є гібридом мієломи X63-Ag8 і нормальних В-лімфоцитів миші, брали з постійних запасів банку клітин відділу молекулярної імунології Інституту біохімії ім. О.В.Палладіна. Гібридому 1D6, яка є гібридом SP2/0 та нормальних лімфоцитів імунізованої миші і продукує моноклональні антитіла проти позаклітинного фрагменту (181-192) 3-субодиниці нікотинового ацетилхолінового рецептору щурів, було отримано, клоновано і охарактеризовано раніше у відділі молекулярної імунології Інституту біохімії ім. О.В.Палладіна (Skok M.V. et al., 1999). Клітинні лінії пре-В лімфоми курчат DT40 та лімфоми Беркіта людини Ramos були люб'язно надані доктором біологічних наук С.П. Сидоренко (Інститут експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України).

Клітини культивували у культуральному середовищі RPMI 1640 (“Sigma”, США) з додаванням 20 мМ HEPES, 20 мМ L-глютаміну, 510-5 М -меркаптоетанолу, 50 мкг/мл пірувату натрію, 41 мкг/мл інсуліну, 40 мкг/мл гентаміцину і 10% ембріональної сироватки теляти (“Sigma-Aldrich”, США). Життєздатність клітин оцінювали під мікроскопом за включенням трипанового синього. Морфологічне дослідження клітин проводили після фарбування за методом Папенгейма-Крюкова. Кількість живих клітин у пробах визначали за включенням тріазолілу блакитного (3-4,5диметилтриазол-2-іл-2,5-дифенілтетразолію броміду (МТТ)) (“Sigma”, США), який вносили до культурального середовища до досягнення кінцевої концентрації 0,4 мг/мл. По чотиригодинній інкубації при 37°С утворені кристали формазану розчиняли у диметилсульфоксиді, до лунок додавали 0,1 М гліциновий буфер з 0,1 М NaCl, рН 10,5 і фотометрували планшети на фотометрі “StatFax 2100” (“Awareness Technology”, США) за довжини хвилі 540нм (Carmichael J. et al., 1987). Кількість клітин визначали за допомогою попередньо побудованої калібрувальної кривої.

Співвідношення живих і мертвих клітин в суспензії оцінювали також за розміром і гранулярністю клітин методом проточної цитофлуориметрії в координатах пряме світлорозсіяння проти бокового на проточному цитофлуориметрі EPICS XL (“Beckman Coulter”, Франція). Кількість живих клітин визначали в області, що була попередньо встановлена за клітинами, які були підраховані з використанням трипанового синього.

Для вивчення поверхневої експресії нАХР клітинами досліджених ліній було використано метод клітинного імуноферментного аналізу. Суспензію клітин (1106 клітин/мл) в фізіологічному розчині, забуференому фосфатом (ЗФР), рН 7,2 - 7,4 з 0,5% бичачим сироватковим альбуміном (БСА, “Sigma”, США), вносили в лунки 96-лункових полістирольних планшетів для імуноферментного аналізу (ІФА) (“Nunc Maxisorp”, Данія), і фіксували висушуванням. Потому планшети блокували 1% розчином БСА (1 год. 37оС) і обробляли афінно-очищеними антитілами проти різних субодиниць нАХР (10 - 20 мкг/мл в ЗФР з 0,05% Твін 20 (ЗФР-Твін), 2 год., 37°С), отриманими і охарактеризованими раніше (Skok M.V. et al., 1999; Koval O.M. et al., 2004). Після відмивань ЗФР-Твіном планшети обробляли антитілами кози до імуноглобулінів G кроля, кон'югованих з пероксидазою, або кон'югатом екстравідину з пероксидазою (якщо антитіла були біотинільовані). Активність пероксидази проявляли розчином субстрату: 0,05 М фосфатний буфер, рН 6,0, з 0,01% перекису водню та 0,4 мг/мл о-фенілендіаміну (“Sigma”, США). Реакцію зупиняли додаванням 4Н розчину сірчаної кислоти та фотометрували за довжини хвилі 492 нм на фотометрі “StatFax 2100” (“Awareness Technology”).

Для вивчення поверхневої експресії 7-вмісних нАХР також було проведено експерименти з вивчення зв'язування -кобратоксину, міченого флуоресцентною міткою ФІТЦ (ізотіоціанат флуоресцеїну). Зв'язування -кобратоксину не є видоспецифічним, що дозволяє використовувати його на клітинних лініях різного видового походження. Клітини вносили в пробірки для аналізу, 1106 клітин на пробу в ЗФР з 1% БСА, інкубували протягом 15 хв. при 4оС з ФІТЦ-міченим -кобратоксином, оптимальну концентрацію якого визначали в попередніх експериментах. По цьому зразок розводили ЗФР з 1% БСА і клітини аналізували на проточному цитофлуориметрі EPICS XL (“Beckman Coulter”, Франція).

В моделі in vivo мишей BALB/c (дві групи по 5 тварин) і білих безпородних щурів (дві групи по 10 тварин) утримували у віварії Інституту біохімії. Контрольні тварини споживали чисту воду, а дослідні групи - отримували нікотин (“Sigma”, США) з питною водою (миші - 200 мкг/мл, щури - 40 мкг/мл). Наприкінці експерименту мишей умертвляли цервікальною дислокацією, а щурів - передозуванням ефіру, вилучали їхні селезінки, еритроцити руйнували осмотичним шоком за допомогою спеціального розчину для лізису (“Sigma”, США), а білі клітини крові аналізували методом клітинного ІФА, як описано вище.

Для вивчення проліферації клітин досліджених ліній до лунок 96-лункових планшетів для культури тканин (“Falcon”, США) вносили суспензію клітин з щільністю 2,5104 клітин/мл та розчини досліджуваних речовин. Клітини культивували протягом 3-5 діб. Кількість живих клітин підраховували методом включення (МТТ), як описано вище, або за включенням трипанового синього за допомогою гемоцитометру.

Час подвоєння (“2”t) для популяції посіяних клітин вираховували згідно рівняння

“2”t=t ln2/(lnx-lnx0),

де t - час культивування клітин (в годинах); х0 - початкова кількість посіяних клітин; х - кінцева кількість отриманих після культивування клітин.

Кількість антитіл, секретованих гібридомою 1D6, визначали в культуральній рідині традиційним сорбційним ІФА. В якості антигену використовували пептид 3(181-192) нАХР, кон'югований з БСА. Планшети фотометрували за довжини хвилі 492 нм на фотометрі “StatFax 2100”.

Кількість клітин, що секретують антитіла, визначали методом імуноферментних відбитків. Клітини гібридоми, 5104 клітин/мл, культивували на нітроцелюлозних фільтрах (“Sigma”, США) за присутності чи за відсутності нікотину протягом 3 днів. Потім фільтри ретельно промивали ЗФР, обробляли антитілами кози проти імуноглобулінів G миші, кон'югованими з пероксидазою хрону (1 год., 37°С), і плями секретованих антитіл проявляли розчином субстрату, який містив 0,6 мг/мл 4-хлоро-1-нафтолу в 0,05 М фосфатному буфері з 0,01% Н2О2.

В іншій серії експериментів визначали, як нікотин впливає на кількість клітин, що секретують антитіла, утворених in vivo. Мишей BALB/c імунізували внутрішньочеревно гемоцианіном равлика (“Sigma”, США) в дозі 50 мкг/мишу 3 рази с інтервалом в 2 тижні. Першу імунізацію проводили з повним (“Calbiochem”, США), наступні - з неповним ад'ювантом Фрейнда (“DIFCO Laboratories”, США). Селезінки вилучали на 5-й день після останньої імунізації. Спленоцити, 5106 клітин/мл, культивували в 96-лункових планшетах (“Falcon”, США) з різними дозами нікотину або токсинів протягом 5 днів при 37°С в такому ж середовищі, як і клітини гібридоми. Для визначення кількості клітин, що секретують антитіла (АСК), клітини (2106 клітин/мл) переносили в лунки планшетів з нітроцелюлозними фільтрами (“Sigma”, США) на дні. На фільтрах попередньо адсорбували антиген (розчин гемоцианіну, 10 мкг/мл в ЗФР) і потім блокували 1% розчином овальбуміну. Клітини інкубували на фільтрах протягом 3 днів, після чого фільтри відмивали водою та ЗФР-Твін і обробляли кролячими антитілами проти імуноглобулінів миші (“Sigma”, США) 1 год. при 37°С. Відбитки АСК проявляли комплексом пероксидаза-анти-пероксидаза в ЗФР-Твін (1 год. при 37°С) і хромогенним субстратом, що містив 0,6 мг/мл 3-3'-діамінобензидину (“Sigma”, США), 0,013 % перекису водню і 0,03% хлориду кобальту в 50 мМ трис-HCl буфері рН 7,6. Кількість відбитків підраховували під бінокуляром з використанням масштабної мікросітки.

Штучні анти-адгезивні умови для культивованих клітин створювали за допомогою кліностату - приладу, який імітує умови мікрогравітації. Принцип його дії полягає в створенні вектора гравітації змінного напрямку шляхом обертання, в результаті чого клітини не мають можливості осісти і прикріпитися до підложки. Контрольні клітини гібридом культивували у флаконах для культури тканин (“Nunc”, Данія) в окремому інкубаторі (К) або в одному інкубаторі з кліностатом, але на окремій полиці (К1). Іншу порцію клітин у флаконі або планшеті розміщали на основі працюючого кліностату, електричний двигун якого створює вібрацію, що порушує прикріплення клітин до дна флакону. Дослідні клітини поміщали в стерильні центрифужні пробірки і обертали в кліностаті із швидкістю 1,5 оберти на хвилину.

Обробку даних (обчислення середніх значень та стандартного відхилення, статистичний аналіз достовірності відмінності величин всіх описаних експериментів за стандартним критерієм t-тесту Ст'юдента) та побудову графіків виконували за допомогою пакету програм OriginPro 7.5. Всі результати експериментів виражені як значення стандартна помилка. Значення при р0,05 розглядались як достовірні.

Результати досліджень та їх обговорення. В серії робіт, виконаних у відділі молекулярної імунології Інституту біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України у співробітництві із Інститутом Пастера в Парижі, було вперше показано наявність нАХР в клітинах мієломи і в нормальних В-лімфоцитах миші. В експериментах, проведених М.В.Скок (Skok M.V. et al., 2003), було знайдено, що клітини мієломи X63-Ag8 специфічно зв'язували радіоактивні ліганди нАХР: 3Непібатидин і 125І--бунгаротоксин. Для того, щоб з'ясувати, які саме субтипи нАХР представлено на клітинах мієломи та інших клітинних ліній В-лімфоцитарного походження, ми використали антитіла проти різних субодиниць нАХР, що були отримані раніше у відділі молекулярної імунології (Skok M.V. et al., 1999; Koval O.M. et al., 2004). Слід зазначити, що антитіла, використані в наших дослідженнях, було отримано проти фрагментів нАХР щура, які містять функціонально важливі ділянки рецептору, будова яких є консервативною і мало відрізняється між нАХР різних видів тварин. Присутність певних субтипів нАХР на поверхні клітин В-клітинних ліній було досліджено нами методом клітинного ІФА. Спочатку було використано антитіла тільки проти альфа-субодиниць, які є головними для зв'язування ацетилхоліну і нікотину. Як показано на рис.1, як мієломні, так і гібридомні клітини зв'язували переважно антитіла проти 4- і 7-субодиниць нАХР і не зв'язували антитіл проти 3- і 5-субодиниць.

Отримані результати свідчили про наявність на досліджених клітинах 7- та 4-вмісних нАХР.

Оскільки 4 субодиниця завжди входить до складу гетеромерних субтипів нАХР, а 7 субодиниця може формувати як гетеромерний, так і гомомерний субтипи, в подальших експериментах ми використали також антитіла проти бета-субодиниць. Нами було показано, що клітини гібридом SP-2/0 та 1D6 (рис.2) зв'язують переважно антитіла проти 4- і 7- субодиниць нАХР та проти структурних 2- і 4- субодиниць.

В наступних експериментах зв'язування антитіл проти 4-, 7, 2- і 4- субодиниць нАХР було показано також на клітинних лініях Ramos та DT40. Присутність 7-вмісних нАХР на клітинах DT40 і Ramos було підтверджено зв'язуванням ФІТЦ-міченого -кобратоксину, антагоністу 7-вмісних нікотинових рецепторів, в експериментах з проточної цитофлуориметрії. При цьому -кобратоксин зв'язувала вся популяція клітин DT40, тоді як у клітин Ramos зв'язування спостерігали лише на половині їх популяції, тобто 7-вмісні нАХР були представлені на клітинах DT40 значно більше, ніж на клітинах Ramos.

Отримані результати свідчили на користь того, що на досліджених нами клітинних лініях експресуються 4-вмісні і 7-вмісні нАХР, які також містять структурні 2- і 4- субодиниці. Ці дані співпадали з отриманими пізніше на нормальних В-лімфоцитах миші (Skok et al., 2005). Експерименти з мишами, нокаутними за генами 7- або 2-субодиниць, показали, що в В-лімфоцитах ці субодиниці належать до різних субтипів рецептору (Skok et al., 2006). Відповідно, отримані нами дані були інтерпретовані так, що в досліджених клітинних лініях В-лімфоцитарного походження 4- і 2-субодиниці об'єднані в один субтип нАХР, а 7-субодиниця може утворювати гомопентамерний субтип або поєднуватися з 4-субодиницею в гетеромерному субтипі. Кількість представлених нАХР і співвідношення субтипів відрізняється у клітин різного видового походження і стадій диференціювання.

Наявність на поверхні клітин субодиниць нАХР, визначена за допомогою зв'язування специфічних антитіл, ще не означала присутності на досліджених клітинних лініях повноцінного функціонального рецептору. Тому дуже важливими виявились дані щодо зміни кількості експресованих субодиниць нАХР під дією нікотину. Ефект ап-регуляції рецептору під дією агоністу є класичною характеристикою нАХР нервових клітин і однією з молекулярних основ виникнення нікотинової залежності. Наші подальші експерименти було спрямовано на визначення факторів, які впливають на рівень експресії нАХР і, відповідно, чутливість до нікотину, та на визначення функціональних наслідків впливу нікотину на досліджені клітинні лінії.

Перш за все, було показано, що за присутності в середовищі інкубації нікотину протягом 4 днів, підсилюється зв'язування 4- і 7-специфічних антитіл на клітинах гібридоми 1D6, тобто нікотин призводить до збільшення кількості відповідних субодиниць нАХР на досліджених клітинах (рис. 3).

Нікотин в концентрації 10 мкМ призводив також до ап-регуляції субодиниць нАХР на клітинах DT40. На відміну, інкубація з нікотином клітин мієломи X63-Ag8 призвела до зменшення кількості зв'язаних антитіл. Феномен ап-регуляції експресії нАХР під впливом нікотину широко повідомлений в багатьох типах нервових клітин (Marks M. et al., 1992; Yates et al., 1995; Peng et al., 1997). Його молекулярні механізми до кінця не з'ясовані. Було знайдено, що зміни відбуваються переважно на пост-транскрипційному і навіть пост-трансляційному рівні і можуть бути спричинені прискореним збиранням синтезованих субодиниць, стабілізацією утворених пентаметрів і/або їх сповільненим катаболізмом (Pauly J. et al., 1991; Peng X. et al., 1994). Зменшення кількості нАХР на клітинах під дією нікотину також повідомлено, проте причини такого феномену до кінця не з'ясовані (Kimura R. et al., 2003). Ми вважаємо, що в наших експериментах додавання нікотину призводило до перерозподілу мембранних і внутрішньоклітинних нАХР: стабілізації мембранних форм (збільшення) або їх ендоцитозу (зменшення), хоча від чого залежала спрямованість ефекту нікотину, залишалось невідомим. Додаткову інформацію з цього приводу надали експерименти, проведені з клітинами тварин, які отримували нікотин in vivo.

Дві групи тварин, мишей і щурів, отримували нікотин з питною водою протягом 10 місяців. Миші швидко звикали до присутності нікотину у питній воді (200 мкг/мл) і не відмовлялись її вживати. Загальна кількість нАХР в клітинах їх селезінки, за даними клітинного ІФА, не відрізнялася від такої у мишей, які пили чисту воду. На відміну від мишей, щури відмовлялися пити воду з нікотином (аж до загибелі від спраги), і тільки зменшення його концентрації в п'ять разів (до 40 мкг/мл) дозволило примусити їх вживати нікотин. При цьому кількість нАХР, що виявлялася в клітинах їх селезінки, була суттєво нижчою, ніж у щурів, що пили чисту воду (рис. 4).

Різна чутливість мишей і щурів до нікотину пояснюється інтенсивністю метаболізму нікотину, що відрізняється у різних видів тварин (Benowitz N. et al., 1990). Зниження загальної кількості нАХР у щурів, очевидно, було реакцією захисту від токсичної дії нікотину, що може, певною мірою, бути фізіологічним поясненням “даун”-регуляторної ролі нікотину. Ми не можемо визначити, за рахунок чого, ендоцитозу мембранних рецепторів або скорочення біосинтезу, відбувалось це зниження. Однак сам факт свідчив про те, що нормальні імунні клітини, подібно до вивчених нами клітинних ліній, здатні модулювати свою чутливість до нікотину шляхом регуляції кількості експресованих рецепторів. Отримані нами результати свідчили, що наявні на клітинах В-лімфоцитарного походження нАХР є чутливими до дії нікотину, їхня кількість регулюється під дією нікотину, подібно до нАХР нейронів, а отже рецептори є функціонально важливими і їх кількість може певним чином відображати функціональний стан клітин.

В процесі культивування частина клітин гібридоми за звичайно прикріплюється до дна флакону, тоді як інші знаходяться у суспензії. За класичною точкою зору, інтенсивне ділення супроводжується відкріпленням від підложки, а клітини, що виходять із циклів ділення, залишаються прикріпленими. Ми розділили клітини на прикріплені і ті, що знаходяться в суспензії, і виявили, що антитіла значно краще зв'язувались з клітинами, що ділилися, ніж з клітинами у спокої (рис. 5).

Ці дані означали, що рівень експресії нАХР на клітинах гібридоми залежить від інтенсивності їхнього ділення. Відповідно, можна було очікувати, що нікотин впливатиме на проліферацію клітин, а чутливість до нього залежатиме від кількості представлених на клітині нАХР.

Для перевірки цього припущення в наступних експериментах ми механічно відривали клітини від підложки і визначали, як нікотин впливає на їхню проліферацію. Як показано на рис. 6, клітини, переведені в суспензію із стану спокою, починали інтенсивно ділитися. Одночасно вони підвищували кількість нАХР на поверхні (дані не наведено).

Додавання нікотину в культуру стимулювало проліферацію тільки тих клітин, які перед початком експерименту мали високий рівень нАХР на поверхні (в наших експериментах - суспендовані). Ті клітини, які були механічно відірвані від підложки і переведені в суспензію, виявились нечутливими до дії нікотину.

Ці дані свідчили про те, що чутливість клітин до нікотину не є постійною, а змінюється в залежності від кількості нАХР на поверхні, що в свою чергу, залежить від того, знаходиться клітина у фазі інтенсивного ділення або спокою.

Оскільки активація нАХР нікотином призводила до прискорення пролі-ферації клітин, можна було очікувати, що його блокування буде несприятливим для їхнього поділу. Ми вивчили вплив на проліферацію клітин гібридоми специфічних блокаторів нАХР - токсинів змій. -Кобратоксин та „слабкий токсин” є конкурентними блокаторами як 7-вмісних нАХР, так і нАХР м'язового типу, а нейротоксин ІІ є специфічним до м'язового типу нАХР. -кобратоксин та „слабкий токсин” пригнічували проліферацію клітин гібридоми, в той час, як нейротоксин ІІ не мав такого ефекту (рис.7).

Ці дані свідчили про те, що нікотин сприяє проліферації клітин гібридоми і його ефект опосередкований саме 7-вмісними нАХР, а не рецепторами м'язового типу. Використання клітин гібридоми в якості моделі зрілих В-лімфоцитів дало нам можливість вивчити, як впливає активація чи блокування нАХР на продукцію ними антитіл. Клітини, які більш інтенсивно ділились за дії нікотину, продукували менше антитіл. Відповідно, клітини, які уповільнювали поділ під дією токсинів, секретували більше антитіл в культуральне середовище.

Стимулювання проліферації нікотином було знайдено також для клітин ліній Ramos і DT40, хоча дози нікотину, які викликали ефект, і ступінь стимулювання відрізнялись між лініями. Це відповідало різниці в експресії субтипів нАХР, визначеній в попередніх експериментах.

Дані, отримані нами на клітинних лініях, було підтверджено на нормальних плазматичних клітинах мишей. Мишей імунізували гемоцианіном, вилучали їхні

спленоцити на 5-й день після імунізації, інкубували їх за присутності або у відсутності нікотину і визначали кількість клітин, що продукують антитіла проти гемоцианіну методом імуноферментних відбитків. Така схема експерименту забезпечувала активацію В-лімфоцитів in vivo, а проходження ними декількох циклів поділу - в культурі. Було знайдено, що нікотин збільшував кількість відбитків, тобто сприяв поділу активованих В-лімфоцитів перед їх остаточною диференціацією (рис.8).

Таким чином, нікотин мав про-проліферативні властивості як для клітинних ліній В-лімфоцитарного походження, так і для нормальних В-лімфоцитів. Таке спостереження узгоджувалось із описаною раніше про-проліферативною дією нікотину на інші типи клітин. Воно означало, що нікотин здатний підтримувати, а можливо, і стимулювати лімфопроліферативні захворювання, принаймні, за участю В-лімфоцитів.

Відомо, що нікотин захищає від апоптозу нейрони і Т-лімфоцити. Вважають, що цей ефект опосередкований 7-вмісними нАХР. Ми вивчили вплив нікотину на виживання клітин лінії DT40, яка є визнаною моделлю для вивчення апоптозу. Клітини розсівали в однаковій щільності, 2,5Ч105 клітин/мл, і культивували протягом 4 днів за присутності або у відсутності 10 мкМ нікотину. В результаті в пробі без нікотину було нараховано 2,5Ч107, а в пробі з нікотином - 1,2Ч108 клітин. Аналіз методом проточної цитофлуориметрії показав, що серед клітин, які культивувались без нікотину, живих залишилось лише близько 1,3%, в той час, як в присутності нікотину вижило близько 30% клітин. За нашими даними, клітини DT40 ефективно зв'язували ФІТЦ-мічений кобратоксин, тобто містили багато поверхневих 7 нАХР. Це дає підставу вважати, що нікотин підтримував виживання клітин DT40 саме діючи на 7-вмісні нАХР. Клітинна лінія DT40 походить із попередників В-лімфоцитів. Саме пре-В лімфоцити мишей, нокаутних за генами нАХР, сильніше підлягали апоптозу, ніж відповідні клітини мишей дикого типу. Крім того, нікотин збільшував кількість В-лімфоцитів в кістковому мозку, але не селезінці мишей, що вживали його з питною водою (Skok et al., 2006). Ми також не знайшли захисного ефекту нікотину для клітин, що походять із зрілих В-лімфоцитів: мієломи X63-Ag8, гібридом SP-2/0 та 1D6 і лімфоми Ramos. Ці дані свідчать, що нікотин сприяє виживанню незрілих В-лімфоцитів в процесі їх селекції, що може зберігати потенційно автореактивні клітини і підвищувати ризик автоімунних захворювань. Як відомо, паління є фактором ризику для розвитку багатьох автоімунних хвороб, таких як ревматоїдний артрит, системна червона вовчанка, біліарний цироз та анкілозний спондиліт (Costenbader and Karlson, 2005; Symmons, 2005; Gershwin et al., 2005; Ward et al., 2005). Наші дані свідчать, що одним із молекулярних механізмів такої залежності може бути стимуляція нАХР В-лімфоцитів, що розвиваються.

В наведених вище експериментах міцне прикріплення до дна культурального флакону було характерним для клітин у стані спокою, з низьким рівнем нАХР. З іншого боку, інтенсивність ділення вивчених нами гібридом 1D6 і SP-2/0 залежала від їх контактів з підложкою. Ми показали, що 5-денне позбавлення клітин можливості прикріпитися шляхом обертання в кліностаті або вібрації зупиняло їхній поділ і зменшувало адгезивні властивості. При цьому клітини дещо збільшувались у розмірі, підвищували вміст внутрішньоклітинного Са2+ і змінювали спектр експресованих глікозаміногліканів - молекул, що відповідають за контакти клітин між собою і з навколишнім середовищем. Повернені в нормальні умови культивування, клітини починали швидко ділитися. Це означало, що позбавлення адгезивних контактів зупиняло клітини в пре-мітотичній фазі клітинного циклу і примушувало їх шукати можливості прикріпитися одна до одної, змінюючи спектр молекул адгезії. За таких умов кількість нАХР на поверхні клітин не змінювалась, однак вони ставали нечутливими до дії нікотину (рис.9).

Такі дані узгоджувались із описаною десенситизацією нАХР нервових клітин за підвищення концентрації внутрішньоклітинного Cа2+ і означали, що функціонування нАХР В-лімфоцитів залежить від стану клітин, зокрема їх адгезивних контактів. Цей факт може означати, що in vivo В-лімфоцити, які щільніше контактують із середовищем, що їх оточує (наприклад, в лімфоїдних органах), є більш чутливими до нікотину, ніж ті, що циркулюють в кровотоці. Такий висновок особливо важливий з огляду на опубліковані дані про накопичення нікотину в органах і тканинах курців у значно більшій концентрації, ніж визначається в крові (Rowell P.P. et al., 1983; Sastry B.V. et al., 1995). Вплив споживання нікотину на розвиток лімфоцитів в кістковому мозку, тимусі і селезінці був показаний експериментально (Skok M. et al., 2006).

Результати наших досліджень свідчать, що рецептори, експресовані на клітинах В-лімфоцитарного походження є чутливими до дії нікотину, подібно до нАХР нервових клітин. Більше того, вони підлягають десенситизації за умов підвищення концентрації внутрішньоклітинного кальцію, що теж є характерним для нАХР нейронів. Таким чином, рецептори В-лімфоцитів за своїми властивостями не відрізняються від рецепторів нервових клітин. Очевидно також, що вживання нікотину (паління) змінює кількість нАХР на поверхні В-лімфоцитів і, відповідно, їх чутливість до ендогенного, природного агоністу (ацетилхоліну). Результати експериментів з мієломою Х63-Ag8 та з щурами, що вживали нікотин, свідчать про те, що клітини здатні також знижувати кількість рецепторів, щоб запобігти токсичній дії нікотину.

Нікотинові рецептори є іонними каналами. Іони кальцію, для яких проникні нейрональні субтипи нАХР, особливо 7-вмісні, є медіаторами багатьох внутрішньоклітинних сигнальних процесів. Вважають, що нікотин, який діє через 7 нАХР, впливає саме на Са2+ сигналінг в лімфоцитах. З іншого боку, показаний зв'язок нАХР з тирозиновими кіназами, незалежними від Са2+. Ми поставили запитання, чи є відкриття іонного каналу необхідним для передачі проліферативного сигналу в клітинах гібридоми. Для цього було вивчено вплив на проліферацію клітин специфічного блокатору відкритого каналу нАХР бензогексонію. Як показано на рис. 10, бензогексоній дозозалежно пригнічував проліферативну активність в присутності нікотину.

Ці дані свідчили про те, що проліферативний сигнал, який генерується в клітинах гібридоми за дії нікотину, потребує відкриття іонного каналу. З іншого боку, в деяких випадках, активація нАХР-залежних процесів, напевно, відбувалась без відкриття каналу. Так, ми спостерігали посилення проліферації клітин DT40 під дією наномолярних доз -кобратоксину. Згідно літературних даних, -бунгаротоксин захищав клітини від апоптозу, подібно до нікотину (De Rosa et al., 2005), а антитіла проти нАХР стимулювали проліферацію клітин SP-2/0 (Калашник та ін., 2000). Аналіз цих даних дозволив нам дійти висновку, що принаймні не всі сигнальні процеси, які запускаються в досліджених нами клітинах при активації нАХР (дії нікотину), пов'язані із катіонами, які потрапляють в клітину крізь іонний канал. Частина із них може запускатися за рахунок конформаційних перетворень молекули нАХР при зв'язуванні агоністів, антагоністів або специфічних антитіл. Ці результати вказують на те, що класичний іонний канал може передавати в клітину інформацію і нетрадиційним для себе шляхом, подібно до, наприклад, антиген-специфічних рецепторів лімфоцитів. Можливо, таким шляхом в деяких клітинах діє і нікотин. Наприклад, в клітинах DT40 стимуляція проліферації відбувалась за надто високих доз нікотину, які скоріше призводили до десенситизації, ніж до активації нАХР.

В результаті проведеної роботи визначено, що нікотин є важливим регулятором життєдіяльності клітин В-лімфоцитарного походження. Він прискорює проліферацію клітин, що діляться, і сприяє їх виживанню в умовах дефіциту поживних факторів (перенаселенні). Як показано на моделі гібридоми, трансформованої клітинної лінії, що продукує антитіла, стимуляція мітотичного циклу запобігає синтезу і секреції антитіл. Ці дані добре узгоджуються із описаним дефіцитом сироваткових імуноглобулінів на фоні вираженого лімфоцитозу у людей, що палять тютюн. Результати роботи дають пояснення цьому феномену, показуючи, що нікотин прямо впливає на клітини В-лімфоцитарних ліній через експресовані на них ацетилхолінові рецептори нікотинового типу.

Наявність принаймні двох субтипів нАХР на клітинах досліджених ліній, природно, ставила запитання, який із них переважно опосередковує ефект нікотину і передає про-проліферативний сигнал. В мозку найбільш високоафінними до нікотину є рецептори субтипу 42. З іншого боку, саме з 7-вмісними нАХР пов'язують про-проліферативні і анти-апоптичні властивості як в нейронах, так і в ряді незбудливих клітин (Wright S.C. et al., 1993; Uckun F.M. et al., 1996; Zhu D.M. et al., 2002; Mai H. et al., 2003; De Rosa M.J. et al., 2005). Використання 7-специфічних токсинів як для визначення експресії нАХР, так і в функціональних тестах, дозволило нам дійти висновку, що в більшості досліджених моделей саме 7-вмісні нАХР відповідні за регуляцію проліферації і апоптозу. Такі дані узгоджуються із результатами, отриманими з клітинами нокаутних мишей, де саме відсутність 7-субодиниці нАХР запобігала поширенню пулу В-лімфоцитів як в кістковому мозку, так і в селезінці (Skok et al., 2006).

Загалом, описані результати визначають молекулярну основу впливу нікотину на клітини В-лімфоцитарного походження і пояснюють механізм патогенного впливу паління на гуморальну ланку імунної системи.

ВИСНОВКИ

В результаті виконання дисертаційної роботи встановлено, що нікотин впливає на базові життєві функції клітинних ліній В-лімфоцитарного походження, діючи на експресовані ними нікотинові ацетилхолінові рецептори.

Клітини досліджених ліній: мієломи X63-Ag8, гібридом SP-2/0, 1D6 і лімфом DT40, Ramos, - експресують 4(2) і 7(4)-вмісні нАХР, причому кількість і спектр представлених на поверхні субтипів відрізняється у клітин різного видового походження. За своїми властивостями нАХР клітин В-лімфоцитарних ліній подібні до нАХР нервових клітин: їх експресія є чутливою до нікотину, а десенситизація відбувається при підвищенні концентрації внутрішньоклітинного кальцію. Нікотин впливає на кількість нАХР, експресованих на поверхні клітин В-лімфоцитарних ліній, здійснюючи їх ап- або даун-регуляцію, що залежить від функціонального стану клітин. Чутливість клітин до дії нікотину залежить як від кількості нАХР, так і від їх функціональної активності, на яку зокрема впливають адгезивні контакти клітин.

Нікотин сприяє проліферації і виживанню за несприятливих умов клітин В-лімфоцитарних ліній і опосередковано впливає на продукцію антитіл гібридомою. Механізм передачі проліферативного сигналу в клітинах досліджених ліній потребує відкриття іонного каналу або конформаційних змін в молекулі рецептору.

Отримані дані свідчать на користь про-проліферативної ролі нікотину для В-лімфоцитів, що може пояснити розвиток лімфопроліферативних захворювань і зниження кількості сироваткових імуноглобулінів у людей, що палять цигарки.

ПЕРЕЛІК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Skok M.V., Kalashnik E.N., Koval L.N., Tsetlin V.I., Utkin Y.N., Changeux J.-P., Grailhe R. Functional nicotinic acetylcholine receptors are expressed in B lymphocyte-derived cell lines // Mol. Pharmacol. - 2003. - Vol.64, № 4. - P.885-889. (Дисертант проводила дослідження по вивченню поверхневої експресії нАХР на клітинних лініях методом клітинного ІФА та впливу нікотину і специфічних токсинів на проліферацію та антитіло-продукцію клітинами гібридоми, приймала участь у обговоренні результатів).