Токсико-екологічна характеристика омайту (пропаргіту)

Размещено на http://www.allbest.ru

Размещено на http://www.allbest.ru

Вступ

Актуальність теми. Практично кожне господарство по виробництву сільськогосподарської продукції використовує пестициди. Витрати на хімічну обробку рослин з метою їх захисту від шкідників, хвороб і бур'янів відшкодовуються в одинадцятикратному розмірі за рахунок отримання кращого урожаю як за кількісними, так і за якісними показниками (Лісовий М.П., 2003; Кундиев Ю.И., 2000; Болотова Т.М., 2004). Проте хімізація сільського господарства призводить до накопичення і циркуляції в біосфері токсичних речовин (Чибураев В.И., 2003; Проданчук Н.Г., 2001; Клисенко М.А., 1999). Пестициди являють собою біологічно активні сполуки і, навіть в невеликих кількостях, є потужним фактором впливу на організм тварин, людини і довкілля в цілому (Петюх Г.П., 2005; Гуфрій Д.Ф., Гунчак В.М., Коцюмбас І.Я., 2004). У зв'язку з цим, для визначення ступеня небезпечності та встановлення максимально допустимих рівнів токсичних речовин необхідне проведення досліджень з вивчення механізму дії пестицидів, їх гострої і хронічної токсичності, персистенції у довкіллі тощо (Чибураев В.И., 2003; Куцан О.Т., 2005; Мельничук С.Д., Хмельницький Г.О., Якубчак О.М., 2005).

Омайт (пропаргіт) за хімічною структурою є ефіром сірчистої кислоти один. Він широко використовується в Україні і добре зарекомендував себе в боротьбі з кліщами-фітофагами. Особливої значимості препарат набув в АР Крим (Чабан В., 1996). Лише у 2003 р. тут було використано 1,8 тонн омайту.

Незважаючи на тривалий час і великі об'єми застосування пестициду в сільському господарстві нашої держави й інших країн, існує ряд суперечливих питань щодо його токсичних властивостей.

Вважають, що омайт (пропаргіт) відноситься до малотоксичних речовин. Однак показники токсичності пестициду в роботах різних дослідників відрізняються в два і більше разів (Мельников Н.Н., 1987; Седокур Л.К., 1986; Kiplinger G.R., 1993). Не повністю розкрито характер і не описано механізми дії препарату. При дослідженні токсикокінетики більша увага приділялась біотрансформації та виведенню омайту з організму. Проте майже не має даних щодо його розподілення та накопичення в органах і тканинах тварин. Недостатньо вивчено персистенцію пестициду на рослинах, що обробляються, хоча ці дані є необхідною умовою для визначення рівня небезпеки акарициду для диких і свійських тварин, обґрунтування максимально допустимих рівнів у кормах і продуктах харчування.

Методики визначення залишкових кількостей омайту в Україні розроблені для продуктів рослинництва, води, повітря та ґрунту. На жаль, вони не можуть бути використані для детекції препарату в об'єктах тваринного походження, що унеможливлює діагностування отруєння цим акарицидом, здійснення контролю за показниками безпечності продуктів тваринництва й інших об'єктів ветеринарного нагляду.

У зв'язку з цим, проведення токсикологічних досліджень з вивчення кінетичних властивостей омайту (пропаргіту) і впливу його на організм тварин, розробка методів визначення залишкових кількостей пестициду в об'єктах тваринного походження і дослідження характеру його розподілення в довкіллі є актуальними напрямками наукових досліджень.

Мета і задачі дослідження. Мета досліджень - вивчити токсичні властивості омайту та характер його персистенції в деяких об'єктах довкілля.

Для розв'язання цієї мети були поставлені наступні задачі:

· розробити методику визначення залишкових кількостей омайту (пропаргіту) в об'єктах тваринного походження (м'ясо, жир, внутрішні органи, молоко, яйця) і експериментально встановити її валідаційні характеристики;

· дослідити цитотоксичність пестициду для перещеплюваних культур клітин;

· вивчити токсикокінетичні властивості омайту після одноразового перорального уведення пестициду щурам і курям;

· визначити параметри токсичності препарату для щурів за умов його перорального уведення;

· вивчити вплив омайту на процеси перекисного окиснення ліпідів після одноразового перорального уведення його курям;

· вивчити токсичні властивості омайту при аплікації його на шкіру кролів;

· дослідити динаміку вмісту залишкових кількостей омайту в об'єктах довкілля після проведення дворазової обробки рослин.

1. Матеріали і методи досліджень

Робота виконана в лабораторії токсикологічного моніторингу Центру токсикологічних досліджень Інституту експериментальної і клінічної ветеринарної медицини УААН упродовж 2002-2005 років.

Для проведення досліджень використовували омайт, 57 % к.е. (реєстраційне посвідчення А 00402). Стандартні розчини пестициду готували в гексані з концентрацією діючої речовини 1; 10 і 100 мкг/см3. В дослідах на тваринах використовували водні емульсії токсиканту.

При розробці методики визначення пестициду в об'єктах тваринного походження для детекції омайту (пропаргіту) обрали способи газорідинної та тонкошарової хроматографії. Для вилучення препарату з матриці досліджуваного об'єкту відпрацьовували методи його екстракції органічними розчинниками. Очищення екстрактів проводили шляхом фільтрації, виморожування, перерозподілу в системі розчинників, що не змішуються, та за допомогою хроматографії на колонках.

При проведенні валідації методики дотримувались вимог стандарту ISO 17025 і визначали такі параметри, як: специфічність, точність, лінійність, відтворюваність, межа визначення та детектування, збереженість пестициду в стандартному розчині та в досліджуваній матриці.

Для вивчення цитотоксичності омайту використовували культури клітин нирки вівці (ПО-2) і нирки зеленої мавпи (Vero). Ступінь токсичності визначали на нефіксованих культурах під малим збільшенням мікроскопу. Враховували цілісність моношару, ступінь його ураження, характер розміщення клітинних елементів, кількість клітин з округленою цитоплазмою.

З метою вивчення впливу омайту на мітотичний режим культури клітин вирощували у пеніцилінових флаконах на накривних скельцях, які виймали після 24-, 48-, 72-, 96- і 120-годинного інкубування в термостаті. Клітини фіксували сумішшю льодяної оцтової кислоти і абсолютного етилового спирту у співвідношенні 1:3. Фіксовані клітини фарбували за загально прийнятою методикою гематоксиліном Каррачі (Белоконь В.С. и др., 1993). При мікроскопічному дослідженні враховували кількість клітин в стані мітотичної активності, наявність і характер патологічних мітозів, відношення різних фаз мітозу.

Визначення середньолетальної дози омайту для щурів за умови одноразового перорального уведення проводили згідно з методичними рекомендаціями “Токсикологічний контроль нових засобів захисту тварин” (1997). Обчислювали ЛД50 методом найменших квадратів з використанням пробіт-аналізу в модифікації В.Б. Прозоровського (1962), а похибку - методом Miller'a і Tainter'a (1944).

Токсикокінетику омайту в організмі ссавців і птиці після одноразового перорального уведення вивчали на моделі щурів і курей. Вміст залишкових кількостей пестициду в органах і тканинах через 4 години, 1; 3; 7; 14; 21 і 28 діб після уведення препарату визначали способом газорідинної хроматографії за розробленою нами методикою. Додатково, з метою вивчення шляхів виведення пестициду з організму ссавців, від щурів, після уведення їм омайту, щодоби збирали кал і сечу, які досліджували на наявність залишкових кількостей препарату.

Токсичність омайту для птиці вивчали в умовах гострого експерименту при одноразовому пероральному уведенні препарату в дозах 300 і 600 мг/кг курям породи Хайсекс білий масою тіла 800-1000 г. За птицею вели спостереження, встановлювали строки появи і характер клінічних ознак отруєння, після забою оцінювали патологоанатомічні зміни внутрішніх органів. Крім того, проби крові та печінки отруєної птиці відбирали для проведення гематологічних і біохімічних досліджень.

Для вивчення дерматотоксичності омайту використовували кролів чорно-вогняної породи масою тіла 2,5-3,3 кг. Препарат у формі 0,2 % водної і 57 % концентрат емульсії наносили на ділянку шкіри розміром 4х6 см в ділянці стегна в дозі 2 і 570 мг/кг маси тіла, відповідно. Спостереження за дослідними тваринами тривали впродовж 21 доби, при цьому враховували загальний стан піддослідних кролів, кількість корму та води, що споживались, глибину і характер уражень шкіри в місці аплікації пестициду, а також строки загибелі або видужання тварин. Кров для проведення гематологічних і біохімічних досліджень відбирали з вушної вени на 1, 3, 7 і 14 добу після аплікації омайту.

Для оцінки впливу досліджуваного пестициду на організм курей і кролів використовували наступні гематологічні тести: кількість еритроцитів визначали фотометричним методом на КФК-2 (Заболоцкий В.Т., 1965), кількість лейкоцитів підраховували у камері Горяєва, вираховували лейкоформулу (Кондрахін І.П., 1985), концентрацію загального гемоглобіну встановлювали за допомогою ацетонціангідридного методу (Строев Е.А., 1986).

З біохімічних параметрів в плазмі крові дослідних тварин визначали активність трансаміназ із використанням комерційних наборів ТОВ НВП “Філісіт-Діагностика” (Україна, 2005 р.); вміст холестерину - за методом Ілька (Клисенко И.П., 1985), а загальних ліпідів - за реакцією з сульфофосфованіліновим реактивом. Про інтенсивність процесів вільнорадикального перекисного окиснення судили за рівнем дієнових кон'югатів і малонового діальдегіду, які визначали в плазмі крові і печінці (Мешкова Н.П., 1979; Гаврилова В.Б., 1983). Активність каталази визначали за реакцією з молібдатом амонію (Королюк М.А., 1988). Для оцінки загальної антиоксидантної активності плазми використовували модельну систему, що являє собою суспензію ліпопротеїдів жовтка курячих яєць (Келебанов Г.И., 1988). Стійкість мембран еритроцитів до перекисного гемолізу визначали за методом Ягера (Jager F.C., 1968) та за реакцією з лимонною кислотою.

Вивчення персистенції омайту в об'єктах довкілля проводили в умовах приватного господарства Дергачівського району Харківської області після дворазової обробки яблунь і винограду пестицидом у дозах, рекомендованих виробником. Проби рослин і ґрунту відбирали кожні сім днів упродовж 14 тижнів. Визначення вмісту залишкових кількостей пестициду проводили способом газорідинної хроматографії за розробленою нами методикою. Всього за дослідний період було проаналізовано 44 проби ґрунту, 158 проб листя і трави та 41 пробу плодів (яблука, виноград, полуниця). Період, за який вміст залишкових кількостей омайту на рослинах зменшувався вдвічі, визначали шляхом математичної моделі кінетичного процесу першого порядку (Голубев А.А. и др., 1973).

Статистичний аналіз отриманих резулитатів проводили за допомогою редактора електронних таблиць Excel 2000.

2. Результати досліджень

Розробка методики визначення омайту (пропаргіту) в об'єктах тваринного походження та її валідація. Існуючі в Україні методики визначення залишкових кількостей омайту в рослинах, воді та ґрунті мають ряд недоліків, пов'язаних з технікою виконання робіт і неможливістю прямого їх використання для аналізу біосубстратів. Тому, ми мали розробити економну та чутливу методику визначення залишкових кількостей омайту в об'єктах тваринного походження.

Відпрацьовували два шляхи детекції пестициду: способом газорідинної і тонкошарової хроматографії.

У першому випадку визначення пестициду проводили на газорідинному хроматографі з детектором постійної швидкості рекомбінації “Цвет-500”. Скляну колонку приладу довжиною один метр заповнювали хроматоном inerton-super /0,16-0,20/ з нанесеною рідинною фазою SE-30 у кількості 5 %. Як газ-носій використовували азот особливої чистоти. Шляхом експериментального підбору різних режимів роботи хроматографу визначили, що оптимальними для детекції омайту є наступні температури робочих термостатів: випарювача - 250°С, колонки - 240°С, детектору - 260°С, та швидкість подачі газу на колонку 30 см3 за хвилину. Мінімальна кількість омайту (пропаргіту), що детектується, при цьому дорівнювала 4 нг.

При визначенні пестициду способом тонкошарової хроматографії дослідження були спрямовані на пошук реактиву або суміші реактивів, які б проявляли омайт на хроматографічних пластинках, а також такої рухомої фази розчинників, яка б забезпечувала Rf препарату на рівні 0,7-0,8.

Найбільш придатним для візуалізації омайту виявився спосіб, який базується на подвійній обробці хроматографічних пластинок: спочатку 2 N спиртовим розчином калію гідроксиду з наступним їх прогріванням протягом 7 хвилин при 110°С, а потім ацетоновим розчином солі діазонію. При цьому в лужному середовищі відбувається розклад омайту з утворенням спиртів, які окислюються сіллю діазонію до альдегідів, а альдегіди у свою чергу реагують з залишками солі діазонію з утворенням забарвлених продуктів. За результатами наших досліджень найкращим реактивом для виявлення пестициду з солей діазонію був стійкий синій Б. Омайт проявлявся у вигляді плям жовтого кольору на темно-фіолетовому фоні. При обробці пластинок стійким червоним В або ГГ межа в забарвленні плям препарату і фоном була менш чіткою.

При визначенні рухомої системи спочатку перевіряли різні розчинники в чистому вигляді: гексан, бензол, ацетон, хлороформ та ефір. При цьому встановили, що Rf омайту в гексані дорівнювало нулю, тобто препарат залишався на лінії старту. В ацетоні і ефірі препарат піднімався за фронтом розчинника. Rf омайту в хлороформі і бензолі становило 0,45 і 0,64, відповідно, причому плями препарату були вертикально розтягнуті. Таким чином, жоден з вище зазначених розчинників не відповідав висунутим до рухомої фази вимогам. Тому випробували суміші розчинників: гексан-ефір у співвідношенні 1:1; 3:2 і гексан-ацетон у співвідношенні 1:1; 3:2. При цьому встановили, що Rf омайту в сумішах гексан-ефір 3:2 і гексан-ацетон 1:1 дорівнювало 0,82 і 0,96, відповідно, тобто було завелике. А в сумішах гексан-ефір 1:1 і гексан-ацетон 3:2 коливалось від 0,68 до 0,76. Проте при хроматографуванні в системі гексан-ефір плями омайту були горизонтально розтягнутими і мали вигляд овалу, а в системі гексан-ацетон - плями за формою наближались до кола. Тобто оптимальною рухомою системою для визначення омайту виявилась суміш гексану й ацетону в співвідношенні 3:2. Межа детектування омайту тонкошаровою хроматографію при цьому складала 1 мкг.

У подальшій роботі наші зусилля були спрямовані на розробку способу вилучення пестициду із матриці, що досліджується, очищення та концентрування екстрактів. Як матрицю використовували м'ясо, молоко, жир, жовток курячого яйця. Оптимальним екстрагентом омайту виявився ацетон, який забезпечував максимальне вилучення внесеного препарату з біосубстратів. Проте разом з препаратом в екстракт переходили і такі небажані компоненти, як ліпіди, каротиноїди тощо.

Очищення проб проводили у декілька етапів. Спочатку ацетоновий екстракт відфільтровували у чистий флакон крізь паперовий фільтр і звільняли від жирових домішок шляхом їх виморожування при температурі мінус 18 - 20єС впродовж однієї години. На цьому етапі для кращого очищення до екстрактів додавали дистильовану воду в співвідношенні 4:1, відповідно. Далі з водно-ацетонового розчину омайт переводили в гексан. Доочищення гексанового реекстракту проводили за допомогою хроматографії на розподільчих колонках. Як сорбент виступав оксид алюмінію ІІ ступеня активності. Нами було встановлено, що при внесенні в хроматографічну колонку 9-10 см3 гексанового реекстракту омайт повністю адсорбується на оксиді алюмінію. Після чого достатньо внести лише 3 см3 суміші гексан-ацетону 19:1, щоб елюювати його з колонки. Таким чином, відбувається концентрування препарату та забезпечується достатньо якісне очищення екстрактів від коекстрактивних речовин для проведення подальшої ідентифікації препарату способами газорідинної або тонкошарової хроматографії.

Після розробки методики визначення залишкових кількостей омайту (пропаргіту) в об'єктах тваринного походження були проведені експериментальні дослідження зі встановлення її валідаційних параметрів. Як біологічну матрицю використовували молоко, в яке штучно вносили відому кількість пестициду.

Встановлено, що розроблена методика є специфічною, точною, лінійною та відтворюваною. Межа визначення омайту способом газорідинної хроматографії дорівнює 0,028 мг/кг, а способом тонкошарової - 0,645 мг/кг. В стандартному гексановому розчині омайт не руйнується впродовж чотирьох тижнів, проте оптимальними умовами його зберігання є посуд з темного скла і температура плюс 4єС та мінус 20єС. При цьому максимально припустимий термін зберігання зразків молока для дослідження на вміст омайту в умовах морозильної камери побутового холодильнику (при температурі мінус 20єС) становить один тиждень.

Наукова новизна означених в методиці способів детекції омайту захищена деклараційними патентами України на винахід: деклараційний пат. № 20031212176 Україна, 7 G01N33/00 “Спосіб визначення омайту(пропаргіту) в біологічних об'єктах”; деклараційний пат. № 20031213026 Україна, 7 G01N33/00 “Спосіб виявлення омайту (пропаргіту) на тонкошарових хроматограмах”.

На основі проведених досліджень оформлено “Методичні вказівки щодо визначення омайту (пропаргіту) в об'єктах тваринного походження (м'ясо, жир, молоко, яйце) способами газорідинної та тонкошарової хроматографії”, які затверджені Державним департаментом ветеринарної медицини Міністерства аграрної політики України (наказ № 53 від 30 червня 2005 р.) і рекомендовані для використання у практиці ветеринарної медицини.

Дослідження цитотоксичної дії омайту на перещеплюваних культурах клітин. Визначення токсичності омайту in vitro проводили на перещеплюваних культурах клітин нирки вівці (ПО-2) та нирки зеленої мавпи (Vero). Пестицид вносили до живильного середовища в десятикратних розведеннях від 2000 до 0,2 мкг/см3. За результатами наших спостережень, при внесенні розчину омайту в живильне середовище культури ПО-2 в дозі 2000 мкг/см3 відбувалось округлення, роз'єднання клітин моношару і відторгнення їх з поверхні скла. При зменшенні дози в десять разів лише поодинокі округлені клітини залишились прикріпленими до поверхні скла культуральних посудин через 24 години після внесення препарату. При дозі омайту 20 мкг/см3 більше ніж 40-50 % клітин залишились живими, але більшість з них відторгалась на 2-3 добу після початку досліду. При дозі 2 мкг/см3 омайт спричиняв появу віконець у моношарі культури на 3-ю добу після внесення та сприяв швидкому старінню клітин. В дозі 0,2 мкг/см3 були помічені лише поодинокі круглі клітини з ознаками інтоксикації на фоні маси нормальних. Така ж картина токсичного впливу пестициду спостерігалась і на культурі Vero, але вона виявилась більш чутливою до дії омайту. Середньотоксичні дози для культур клітин Vero і ПО-2 склали, відповідно, 2 і 20 мкг/см3 живильного середовища.

Узагальнюючи отримані результати, зазначимо, що вплив омайту на перещеплювані культури клітин ПО-2 і Vero характеризувався як явищами вакуолізації, балоноподібної дистрофії та токсигенного лізису клітин, так і мітогенним ефектом.

Вивчення токсичних властивостей омайту на щурах при одноразовому пероральному уведенні. Для вивчення клінічної картини гострого отруєння та визначення середньолетальної дози щурам одноразово перорально уводили омайт в дозах 1100; 1200; 1300; 1400; 1500; 1600 і 1700 мг/кг маси тіла.

Одразу після уведення пестициду у щурів спостерігали нетривале збудження, що виявлялось неспокоєм, безперервним пересуванням по клітці і перериванням підстилки з тирси. Через декілька хвилин збудження змінювалось пригніченням: тварини скупчувались, мало рухались. Дихання щурів було прискореним, поверхневим, а у окремих особин, яким уводили омайт у дозі 1600 і 1700 мг/кг, з хрипами. Від корму тварини не відмовлялись, проте поїдали його значно менше, ніж щури контрольної групи.

На другу добу після уведення омайту у більшості піддослідних щурів відмічали криваві виділення з носа і у кутках очей. Шерстяний покрив на медіальній поверхні грудних кінцівок був забруднений кров'ю, що пов'язано з “вмиванням” мордочки. Також реєстрували порушення з боку сечовивідної системи, що характеризувались полакіурією. У більшості випадків тварини скупчувались, але деякі щури, настовбурчившись, сиділи окремо від інших.

Загибель піддослідних тварин відбувалась здебільшого протягом першого тижня після уведення омайту, особливо на другу та третю доби.

При патологоанатомічному розтині загиблих тварин відмічали наступну картину. Всі кровоносні судини організму були кровонаповненими, кров - темна, незгорнута. В ділянці задніх кінцівок під шкірою часто спостерігали крововиливи. Серце збільшене, кровонаповнене, поряд з кров'ю, яка не згорнулась, були згустки. Шлунок сильно здутий, як правило, з виразками або геморагічним запаленням слизової оболонки. Вмістиме шлунку мало виражений запах, властивий омайту. Печінка з вісцеральної поверхні у декількох місцях мала жовто-коричневі плями некрозу. Кишки, як тонка, так і товста, також здуті з ознаками запалення. Загибель тварин спричинювалась асфіксією або зупинкою серця.

Проаналізувавши рівень летальності щурів у кожній групі за методом пробіт-аналізу, встановили, що ЛД50 омайту для щурів за перорального уведення складає 1293,0 ± 39,5 мг/кг, ЛД16 і ЛД84 - 1148,0 і 1438,0 мг/кг, відповідно.

Таким чином, згідно з гігієнічною класифікацією віднесли досліджуваний пестицид до малотоксичних речовин.

Токсикокінетика омайту в організмі щурів після перорального уведення препарату в дозі 600 мг/кг маси тіла характеризувалась поступовим, упродовж одного тижня, зменшенням його концентрації в шлунку (табл. 1).

Таблиця 1. Динаміка накопичення омайту в органах і тканинах щурів після одноразового перорального уведення в дозі 600 мг/кг маси тіла (Mm, n=4)

При цьому у перші чотири години після уведення омайту в організм мало місце, так зване, динамічне розподілення пестициду, яке визначається інтенсивністю кровообігу в органах. У цей строк свого максимального значення концентрація омайту набувала в крові, серці, легенях, нирках і в мозку. Надалі відбувався перерозподіл препарату і накопичення його в м'язовій та жировій тканинах, де він перебував довше місяця.

Щодо виведення пестициду з організму, то за результатами наших досліджень основним шляхом елімінації був травний канал. При цьому максимальна концентрація омайту в фекаліях спостерігалась на першу й третю доби і складала 34,42 3,1 і 19,20 0,8 мг/кг, відповідно. Виведення препарату з сечею у щурів відбувалось незначною мірою та спостерігалось не в усіх дослідних тварин.

Вивчення токсичних властивостей омайту на курях за умов одноразового перорального уведення. Вивчення токсикокінетики пестициду та його впливу на інтенсивність процесів перекисного окиснення ліпідів в організмі курей проводили за умов одноразового перорального уведення омайту в дозах 300 і 600 мг/кг маси тіла.

За нашими спостереженнями динаміка вмісту залишків пестициду у вмістимому м'язового шлунку була схожою у курей обох дослідних груп. Так, максимальний вміст препарату визначали через одну добу після уведення. На 3-ю добу рівень його зменшувався майже на 99,8%. Надалі цей процес уповільнювався і, таким чином, на 14-ту добу досліду у вмістимому шлунку реєстрували невеликі кількості омайту (табл. 2).

Відмітимо, що через 4-и години від початку досліду залишкові кількості пестициду виявлялись майже в усіх органах і тканинах організму: серці, нирках, легенях, білих і червоних м'язах. Причому у курей, яким омайт уводили в дозі 300 мг/кг, рівень його вмісту у м'язах був максимальним, і в подальші строки препарат у цих тканинах не виявляли. У курей, яким уводили 600 мг омайту на кілограм маси тіла, максимальний вміст залишкових кількостей пестициду в м'язовій тканині спостерігали на першу добу досліду. А вже на 3-ю добу рівень омайту в білих м'язах був меншим за межу визначення методу, а в червоних - препарат виявляли у невеликих кількостях ще на 3-тю й 7-му добу.

Через одну добу після уведення максимального значення концентрація омайту набула у серці, легенях, нирках і жирі птиці в обох дослідних групах. Причому жирова тканина містила найбільшу кількість омайту.

Основним шляхом виведення пестициду був шлунково-кишковий тракт. Терміни евакуації акарициду з калом залежали від уведеної дози - чим вище доза, тим пізніше спостерігався пік виведення. Так, максимальна концентрація омайту у вмістимому товстої кишки була відмічена у курей, яким пестицид уводили в дозі 300 мг/кг, через 4-и години після уведення, а у курей, що отримали 600 мг діючої речовини на кілограм маси тіла, - через одну добу.

В цілому пестицид з організму птиці піддавався елімінації досить швидко. Вже на сьому добу після уведення вміст його у внутрішніх органах і тканинах був меншим за межу визначення методу. Винятком став лише травний канал: у вмістимому шлунку і товстої кишки знаходили залишкові кількості дослідного препарату впродовж всього дослідного періоду.

Таблиця 2. Динаміка накопичення омайту в органах і тканинах курей після одноразового перорального уведення в дозі 300 і 600 мг/кг маси тіла (M m, n=4)

Вмістимому товстої кишки була відмічена у курей, яким пестицид уводили в дозі 300 мг/кг, через 4-и години після уведення, а у курей, що отримали 600 мг діючої речовини на кілограм маси тіла, - через одну добу.

При вивченні токсичної дії омайту на організм птиці було встановлено, що пестицид посилює інтенсивність процесів перекисного окиснення ліпідів. Це проявляється підвищенням вмісту первинних і вторинних продуктів окиснення в плазмі крові і печінці отруєної птиці вже через 4 години після уведення препарату. Непрямим доказом активації процесів пероксидації було підвищення чутливості мембран еритроцитів до дії кисню і лимонної кислоти, що проявилося збільшенням відсотку гемолізу відповідних клітин в реакції Ягера та цитрат-індукованого. Крім того, в печінці спостерігали вірогідне підвищення активності каталази. Водночас різке зменшення активності цього ферменту в печінці курей, яким уводили омайт у дозі 600 мг/кг, на 14 добу досліду з одночасним збільшенням вмісту дієнових кон'югатів і малонового диальдегіду може свідчити про виникнення стадії декомпенсації процесів пероксидації.

Резерви антиоксидантної системи крові оцінювали за реакцією із застосуванням жовткових ліпопротеїдів. Було встановлено, що рівень антиоксидантної активності плазми крові відразу після уведення омайту зменшувався, проте такий стан в організмі птиці тривав недовго, і вже на першу добу досліду активність захисної системи відновлювалась до рівня контрольних показників.

Таким чином, можна стверджувати, що у дослідних курей, яким уводили омайт у дозах 300 і 600 мг/кг маси тіла, відбувалось посилення процесів перекисного окиснення ліпідів і нетривале порушення стану ендогенної антиоксидантної системи. Причому, ці зміни мали виражену залежність від дози препарату.

Вивчення токсичних властивостей омайту за умов аплікації його на шкіру кролів. Вивчення дерматотоксичності омайту проводили на кролях за умов нанесення його на шкіру в дозах 2 і 570 мг/кг маси тіла у формі емульсій з концентраціями діючої речовини 0,2 % і 57 %, відповідно. Встановлено, що при аплікації 0,2 % водної емульсії на обробленій ділянці шкіри утворюється велика кількість дрібних везикул, які впродовж 3-4 діб лопаються з утворенням ерозій, або підсихають в тонкі кірочки. На 7-10 добу вся шкіра у місці нанесення була вкрита сухими, порепаними білувато-жовтими кірочками. На 17-у добу місце аплікації омайту почало заростати шерстю.

За умов нанесення на шкіру комерційної 57 % концентрат емульсії омайту у кролів спостерігали пригнічений стан, зменшення апетиту, розлади з боку травного каналу, зниження маси тіла. Два кролі з цієї групи загинули на 16 і 17 добу після аплікації пестициду. На патологоанатомічному розтині відмічали крайові некрози печінки і збільшені сірого кольору нирки. На обробленій ділянці спостерігали почервоніння шкіри, інтенсивність якого поступово зменшувалась. Шкіра при цьому набула зморшкуватого вигляду і дедалі ставала більш щільною. На 15-16 добу вона порепалась і почала відпадати великими шматками, під нею спостерігали новий ніжний місцями з ерозіями епітелій рожево-червоного кольору. Шерсть на обробленій ділянці почала рости на 28-30 добу від початку досліду.

Біохімічними дослідженнями було встановлено активацію процесів перекисного окиснення ліпідів. Так, в плазмі крові реєстрували підвищення вмісту дієнових кон'югатів на 10,2-68,5 % у тварин, яким омайт наносили на шкіру в дозі 2 мг/кг, і на 36,2-143,0 % у тварин, яким аплікацію препарату робили в дозі 570 мг/кг. Також впродовж всього періоду спостереження відмічали зростання концентрації малонового диальдегіду. На 14 добу досліду цей показник перевищував контрольний в 1,8 раз у кролів першої групи та майже в 4 рази у тварин другої групи. Рівень активності каталази у кролів обох дослідних груп через одну добу після нанесення пестициду вірогідно підвищувався більше, ніж на 20 %. Проте, якщо у тварин першої групи він залишався стало вищим за контрольні показники впродовж всього досліду, то у кролів другої групи на 14 добу активність цього ферменту стрімко зменшувалась до рівня меншого за контроль. Різке підвищення вмісту дієнових кон'югатів і малонового диальдегіду та зменшення активності каталази на 14 добу у кролів, яким препарат наносили в дозі 570 мг/кг, свідчили про розвиток стадії декомпенсації окислювальних процесів.

Із отриманих нами результатів витікає, що омайт характеризується високою подразнюючою дією на шкіру і виявляє шкірно-резорбтивні властивості. Останнє проявляється посиленням процесів перекисного окиснення ліпідів і порушенням стану ендогенної антиоксидантної системи, причому ці зміни носять виражений дозозалежний характер.

Вивчення динаміки вмісту залишкових кількостей омайту в об'єктах довкілля після обробки винограду і яблунь. Вивчення характеру розподілу пестицидів в об'єктах довкілля та встановлення строків їх персистенції є необхідною умовою для регламентування норм і термінів обробки рослин, оцінки загальної екологічної небезпеки, що спричинюється їх застосуванням, обґрунтування максимально допустимих рівнів.

Аналіз наявності залишкових кількостей омайту в довкіллі після дворазової обробки яблунь і виноградників у дозах, рекомендованих виробником, показав, що первинна концентрація пестициду і динаміка її зменшення в досліджуваних об'єктах були різними.

У ґрунті залишкові кількості омайту знаходили перші п'ять тижнів після обробки. Їх концентрація постійно коливалась, що могло бути пов'язано з кліматичними умовами, рясними опадами та фізико-хімічними властивостями ґрунту.

Листя винограду на 7-му добу після обробки містили омайт в концентрації 0,61 мг/кг. Вміст залишкових кількостей пестициду зменшувався поступово протягом п'яти тижнів.

Первинна концентрація омайту в листях яблуні становила 3,74 мг/кг. Динаміка її зменшення мала два піки зростання вмісту залишкових кількостей акарициду, що, на нашу думку, можна пояснити сезонним підсиханням листя. На 14-ту добу досліджень листя яблуні містили 0,98 мг/кг омайту.

В листях полуниці та траві, які росли в безпосередній близькості один до одного та до яблунь, що обробляли, концентрація досліджуваного препарату на 7-му добу після обробки була різною. Важливо відмітити, що вміст пестициду в листі полуниці перевищував його вміст у листі яблуні, яка була цільовою рослиною. На нашу думку, цей факт може бути обумовленим особливостями будови поверхні листя (площа, кількість волосків тощо), а також темпами їх росту.

Що стосується плодів, то в полуниці пестицид у вищих за МДР (0,05 мг/кг) концентраціях знаходили впродовж усього періоду плодоношення (перші три тижні дослідження). В яблуках омайт виявляли у слідових кількостях лише в шкірці, віджимки і сік пестициду не містили. В плодах винограду вже на четвертий тиждень дослідження були виявлені лише сліди омайту. Припускаємо, що таке швидке зменшення вмісту омайту в яблуках і винограді відбувалось, в основному, за рахунок відносних втрат, що були обумовлені ростом плодів.

Період, за який концентрація омайту зменшувалась вдвічі, розраховували графічно за допомогою математичної моделі кінетичного процесу першого порядку. Визначили, що Т1/2 для листя винограду становить 10,2 доби, для листя яблуні - 47,5 діб, а для листя полуниці - 17,5 діб.

Висновки

1. У дисертації представлені дані з вивчення токсико-екологічної характеристики омайту (пропаргіту): розроблено методику визначення залишкових кількостей омайту в об'єктах тваринного походження; визначено ступінь токсичності омайту (пропаргіту) для лабораторних тварин; вивчено токсикокінетику в організмі щурів і курей, цитотоксичні властивості та шкірно-резорбтивну дію, вплив на інтенсивність процесів перекисного окиснення ліпідів; проаналізовано особливості персистенції пестициду в об'єктах довкілля після обробки яблунь і винограду у виробничих умовах.

2. Розроблена методика визначення залишкових кількостей омайту (пропаргіту) в об'єктах тваринного походження (м'ясо, жир, внутрішні органи, молоко, яйця) базується на вилученні пестициду з проби ацетоном, очищенні екстрактів способами фільтрації, виморожування та перерозподілу в гексан, доочищенні й концентруванні на хроматографічних колонках з оксидом алюмінію та подальшій ідентифікації пестициду газорідинною або тонкошаровою хроматографією. Межа детектування досліджуваного пестициду газорідинною хроматографією складає 4 нг, тонкошаровою - 1 мкг. Валідаційні характеристики методики відповідають вимогам стандарту ISO 17025.

3. Омайт є токсичним для культури клітин ПО-2 та високотоксичним для культури клітин Vero: клітини виживали і лишалися прикріпленими до скляної поверхні при максимальній дозі пестициду 20 і 2 мкг/см3, відповідно. Вплив пестициду характеризуєтьсяся явищами вакуолізації, балоноподібної дистрофії та токсигенного лізису клітин. В концентраціях 0,02 і 0,2 мкг/см3 живильного середовища препарат спершу стимулює, а потім пригнічує проліферативні процеси в перещеплюваних культурах клітин, що супроводжується достовірним збільшенням кількості патологічних мітозів.

4. Середньолетальна доза омайту для білих щурів при пероральному уведенні складає 1293,0±39,5 мг/кг, ЛД16 і ЛД84 - 1148,0 і 1438,0 мг/кг, відповідно, що дає змогу за гігієнічною класифікацією віднести омайт до малотоксичних речовин.

5. Основними клінічними ознаками гострого отруєння щурів омайтом є пригнічення, порушення з боку сечовивідної системи (полакіурія), шлунково-кишкового тракту (несформовані калові маси), а також назальна та окулярна кровотечі. Патологоанатомічні зміни характеризуються сильним здуттям шлунку з ураженнями слизової оболонки виразкового характеру, легеневим серцем та застійними явищами в органах і тканинах організму.

6. Токсикокінетика омайту в організмі щурів за умови одноразового перорального уведення в дозі 600 мг/кг маси тіла характеризується поступовим зменшенням його концентрації у вмістимому шлунка та накопиченням у м'язовій та жировій тканинах, де він перебуває довше місяця. Виведення незміненого пестициду відбувається переважно з калом, в якому максимальна концентрація омайту спостерігається на першу і третю добу після уведення - 34,43,1 і 19,20,8 мг/кг, відповідно.

7. Омайт в організмі курей за умов одноразового перорального уведення в дозах 300 і 600 мг/кг маси тіла через 4 години розподіляється майже в усіх органах і тканинах організму; через одну добу його концентрація набуває максимального значення в мозку, серці, легенях, нирках і жирі, при цьому найбільше залишкових кількостей пестициду містить жирова тканина (на рівні 3,3210,363 і 5,9730,667 мг/кг, відповідно уведеної дози). Основним шляхом виведення омайту з організму курей є травний канал. Максимум евакуації спостерігається через 4 години після уведення пестициду у дозі 300 мг/кг і через одну добу після уведення у дозі 600 мг/кг.

8. Токсичний вплив омайту на організм птиці за умов одноразового перорального уведення в дозах 300 і 600 мг/кг маси тіла характеризується посиленням інтенсивності процесів перекисного окиснення ліпідів, що виявляється вірогідним підвищенням концентрації дієнових кон'югатів і малонового диальдегіду в плазмі крові і печінці, а також активацією ферментативної та неферментативної ендогенних антиоксидантних систем. Дія пестициду при цьому має прямий дозозалежний ефект.

9. Омайт є сильно подразнюючою речовиною: аплікація на шкіру 0,2 % водної та 57 % концентрат емульсії призводить до розвитку патологічних процесів за типом екзематозного дерматиту та сухої гангрени, відповідно. Активація процесів вільнорадикального окиснення ліпідів і порушення функцій антиоксидантної системи організму за умов нанесення на шкіру омайту в дозах 2 і 570 мг/кг свідчать про резорбтивну дію пестициду і носіть прямий дозозалежний характер.

10. Моніторинг залишкових кількостей омайту в довкіллі при його використанні у виробничих умовах показав, що пестицид у листях яблуні і винограду зберігається впродовж 14 тижнів. Період зменшення концентрації омайту вдвічі складає для листя винограду 10,2 доби, для листя яблуні - 47,5 діб, для листя полуниці - 17,5 діб.

Пропозиції для практики.

1. Методичні вказівки щодо визначення омайту (пропаргіту) в об'єктах тваринного походження (м'ясо, жир, молоко, яйце) способами газорідинної та тонкошарової хроматографії (затверджені Головою Державного департаменту ветмедицини Міністерства аграрної політики України, наказ № 53 від 30 червня 2005 р.).

2. Діагностика отруєння тварин омайтом повинна включати аналіз анамнестичних даних, клінічних симптомів і патологоанатомічних змін; при цьому необхідно обов'язково проводити визначення наявності залишкових кількостей пестициду у вмістимому шлунку і товстого кишечнику, а також в пробах м'язової і жирової тканини. При постановці зажиттєвого діагнозу для дослідження на вміст препарату слід відбирати проби калу хворих тварин.

3. Профілактичні заходи з попередження отруєння омайтом сільськогосподарських тварин повинні передбачати ретельне дотримання правил безпеки при зберіганні та транспортуванні пестициду, недопущення контакту з тваринами під час проведення обробки рослин, а також, з урахуванням результатів моніторингу залишкових кількостей акарициду в довкіллі, запобігання випасу тварин на оброблених ділянках та на прилеглих територіях протягом 21 доби.

4. Результати дисертаційної роботи рекомендуємо використовувати для подальшої науково-дослідної роботи та включати в програму дисципліни “Токсикологія” для студентів факультетів ветеринарної медицини вищих навчальних закладів ІІІ і ІV рівнів акредитації.

Література

1. Герілович І.О. Вивчення хроматографічних властивостей омайту при розробці способу визначення його в продуктах тваринного походження // Вет. мед.: Міжвідомчий тематичний науковий збірник. - 2004. - Вип. 83. - С. 39-42.

2. Герілович І.О. Спосіб визначення омайту в продуктах тваринного походження методом тонкошарової хроматографії // Вет. мед.: Міжвідомчий тематичний науковий збірник. - 2004. - Вип. 84. - С. 208-212.

3. Малінін О.О., Куцан О.Т., Герілович І.О. Динаміка вмісту залишкових кількостей омайту в об'єктах довкілля після обробки винограду і яблунь // Вет. мед.: Міжвідомчий тематичний науковий збірник. - 2005. - Вип. 85. - С. 728-732.

4. Герілович І., Герілович А. Визначення цитотоксичної дії омайту на культурах клітин // Вет. мед. України. - 2005. - № 8. - С. 42-44.

5. Герілович І.О. Гостра токсичність омайту для білих щурів // Вісник аграрної науки. - 2005. - № 9. - С. 78-80.

6. Малинін О.О., Куцан О.Т., Герілович І.О. Токсикокінетичні властивості омайту після перорального уведення // Вісник Білоцерківського державного аграрного університету. - 2005. - Вип. 33. - С. 159-165.

7. Герілович І.О. Щодо аспектів дерматотоксичності омайту для кролів // Науково-технічний бюлетень Інституту біології тварин і ДНДІ ветпрепаратів і кормових добавок. - Львів, 2005. - Вип. 6. - № 3. - С. 100-106.

8. Патент 70032 А Україна, 7G01N33/00. Спосіб визначення омайту (пропаргіту) в біологічних об'єктах / І.О. Герілович, О.О. Малинін, О.Т. Куцан (Україна). - № 20031212176; Заявлено 23.12.2003; Опубл. 15.09.2004, Бюл. 9. - 3с.

Размещено на Allbest.ru